KR20170008058A - 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물, 혈관신생 관련 질환 또는 망막질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체는 유리체강 내 국소 주사 시, 혈관내피세포성장인자와 현저히 우수한 결합력을 나타내어 혈관신생을 억제할 수 있는바, 망막 및 맥락막 혈관신생 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 치료제 등의 제조에 용이하게 사용될 수 있다.

Description

나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 및 이의 용도{Compositions comprising nanoparticle-protein complex based on vitreous as an active ingredient for inhibiting angiogenesis, and uses thereof}
본 발명은 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 상기 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물, 혈관신생 관련 질환 또는 망막질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 조직이나 장기에 신규의 혈관을 제공하는 생물학적 과정으로, 구체적으로는 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 생성되는것을 의미하여 성장 후 체내에서 혈관이 생성되는 근본적인 과정이다. 신생혈관이 생성되는 과정은 매우 복잡하고 정교하나, 요약하면 다음과 같다. 첫째, 혈관 신생을 위한 자극이 기존의 혈관에 전달되면 혈관이 팽대하고 막투과도가 증가한다. 둘째, 팽대된 혈관을 통하여 피브린이 혈관 밖으로 빠져나와 혈관 주위의 세포질 기질에 침적된다. 셋째, 기존 혈관의 기저막을 분해하기 위한 효소가 활성화되며, 기저막이 파괴되어 그 사이로 내피세포가 혈관을 빠져나와 주위 세포의 기질에서 증식하고 이동한다. 마지막으로, 일렬로 배열한 내피세포들이 맥관을 이룸으로써 새로운 혈관을 생성하게 된다.
혈관이 신생되는 과정은 다양한 음성 및 양성 조절인자들에 의해 엄격히 조절되고 있는데 이러한 혈관 신생이 정상적으로 조절되지 못하면 암, 류마티스성 관절염, 당뇨병성 망막병증 등 여러 가지 질환들이 야기된다. 특히 이러한 병적 혈관신생(pathological angiogenesis)이 망막에서 발생하는 경우 이는 망막부종, 망막 또는 유리체 출혈, 그리고 망막박리를 일으키게 된다. 또한 망막에서의 혈관 신생은 미숙아 망막병증, 당뇨망막병증 및 노인성 황반변성의 주요 원인이 된다.
한편, 나노입자들(NPs)은 산업적으로 그리고 생의학적 목적으로 광범위하게 사용되어오고 있다. 특히, 약물 전달, 유전자 전달, 세포 내 영상, 광선치료와 같은 생체의학 분야에서 촉망되는 도구로서 사용되어 왔으며, 특히 금이나 실리카 나노소재는 합성과 작용의 용이성, 화학적 안정성, 생체 적합성, 및 조정 가능한 광학적 및 전기적 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있다.
최근에는 금 또는 은 나노입자가 혈관내피세포성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor)에 의해 유도되는 혈관신생을 저해하는 것이 알려졌으며, 이를 이용한 혈관신생 억제제를 개발하려는 연구들이 시도되고 있다. 그러나 나노입자를 치료에 이용하기 위해서는 나노입자의 독성에 대한 세심한 평가와 독성을 최소로 하는 노력이 요청된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 기관 특이적으로 망막 및 맥락막 혈관신생 억제에 좋은 효과를 가지면서, 낮은 독성을 나타내는 나노입자 치료제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체가 혈관내피세포성장인자와 현저히 우수한 결합력을 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 나노입자는 금 또는 실리카일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 나노입자는 20-100 nm의 직경을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 혈관신생은 미숙아 망막병증, 증식성 망막병증, 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 황반부종(DME, Diabetic Macular Edema), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy) 또는 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy)에 수반할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유리체 기반 단백질은 비트린(vitrin), secreted frizzled-related protein 2, 혈청 알부민(serum albumin), 레티놀결합단백질 3(retinol-binding protein 3), 및 alpha-crystallin A chain로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택될 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 망막질환은 미숙아 망막병증, 당뇨병성 황반부종(DME, Diabetic Macular Edema), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy), 연령관련 황반변성(Age-related macular degeneration), 및 증식성 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 망막 질환 치료에 적합한 단백질 스크리닝 방법을 제공한다:
(1) in vitro에서 유리체에 나노입자를 주입하는 단계;
(2) 상기 나노입자와 상기 유리체 내 단백질과의 복합체를 분리하는 단계;
(3) 상기 복합체와 혈관내피세포성장인자(VEGF)를 결합시키는 단계; 및
(4) 상기 혈관내피세포성장인자와 결합하는 복합체를 선별하는 단계.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 억제방법을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 혈관신생억제 용도를 제공한다.
본 발명은 상기 약학적 조성물의 망막 질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체는 유리체강 내 국소 주사 시, 혈관내피세포성장인자와 현저히 우수한 결합력을 나타내어 혈관신생을 억제할 수 있는바, 망막 및 맥락막 혈관신생 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 치료제 등의 제조에 용이하게 사용될 수 있다.
도 1은 20 또는 100nm의 직경을 갖는 금 및 실리카 나노입자의 TEM 이미지를 나타낸 것이다.
도 2는 20nm의 직경을 갖는 금 나노입자(Au20)와 코로나를 형성한 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 나타낸 것이다.
도 3은 20nm의 직경을 갖는 실리카 나노입자(Si20)와 코로나를 형성한 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 나타낸 것이다.
도 4는 100nm의 직경을 갖는 금 나노입자(Au100)와 코로나를 형성한 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 나타낸 것이다.
도 5는 100nm의 직경을 갖는 실리카 나노입자(Si100)와 코로나를 형성한 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 나타낸 것이다.
도 6은 도 2 내지 도 5의 결과를 종합하여 나노입자와 코로나를 형성한 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 나타낸 것이다.
도 7은 물에서 혈관내피세포성장인자에 대한 나노입자와 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체 간의 결합력을 비교하기 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 유리체 내에서 혈관내피세포성장인자에 대한 나노입자와 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체 간의 결합력을 비교하기 위한 실험의 개략적인 과정을 나타낸 것이다.
도 9 물 및 유리체 내에서 혈관내피세포성장인자에 대한 나노입자와 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체 간의 결합력을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 In vitro에서 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체의 생체 내 혈관신생 억제 효과를 확인한 것이다.
도 11은 In vivo에서 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체의 혈관신생 억제 효과를 확인한 것이다.
본 발명자들은 망막 및 맥락막 혈관신생을 조절할 수 있는 방법에 대하여 연구 노력한 결과, 유리체강 내 주사를 통한 나노입자의 국소 주사 시, 유리체 기반 단백질과 복합체(corona)를 형성하고, 이러한 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체가 혈관내피세포성장인자와 현저히 우수한 결합력을 나타냄을 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "혈관신생"은 혈관이 새로 형성되는 과정, 즉, 새로운 혈관이 세포, 조직 또는 기관 내로 발생되는 것을 지칭하는 것이며, "신생혈관"은 혈관신생 과정을 통해 새로 생성된 혈관을 의미한다. 본 발명에서 "혈관신생"과 "신생혈관"은 상호 호환적으로 기재할 수 있다.
또한, 본 발명에서, 상기 혈관신생은, 미숙아 망막병증, 증식성 망막병증, 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 황반부종(DME, Diabetic Macular Edema), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy) 또는 만성염증(chronic inflammation)에 수반하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈관신생이 질병을 유발하거나 진행시키는 임의의 질환에 수반되는 것일 수 있다.
본 발명에서 "나노입자(nanoparticle)"란, 나노 단위의 직경을 가지는 다양한 물질의 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 나노크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지는 않으나, 직경이 100 nm 이상으로 커질 경우 나노 입자로서의 특성이 소멸될 수 있는바, 20-100nm의 직경을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 나노입자의 종류로는 금 나노입자 또는 실리카 나노입자를 사용할 수 있지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "유리체 기반 단백질"이란, 나노입자와 결합하여 복합체를 형성할 수 있는 유리체 내 단백질을 의미하며, 상기 유리체 기반 단백질의 종류에는 이에 제한되는 것은 아니지만, Vitrin, Secreted frizzled-related protein 2, Serum albumin, Retinol-binding protein 3, Alpha-crystallinA chain, Beta-crystallin S, Beta-crystallin B2, Latent-transforming growth factor beta-binding protein 2, Complement C4-A, Alpha-enolase, Beta-crystallin B1, Spondin-1, Calsyntenin-1, Gelsolin, Retinal dehydrogenase 1, Beta-crystallinA2, Collagen alpha-1(II) chain, Actin, cytoplasmic 1, EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1, Opticin 등이 있으며, 바람직하게는 비트린(vitrin), secreted frizzled-related protein 2, 혈청 알부민(serum albumin), 레티놀결합단백질 3(retinol-binding protein 3), 및 alpha-crystallin A chain로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 한편, 상기 비트린(vitrin), secreted frizzled-related protein 2, 혈청 알부민(serum albumin), 레티놀결합단백질 3(retinol-binding protein 3), 및 alpha-crystallin A chain은 각각 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 이에 한정되지 않고 상기 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물에 유효성분으로 포함되는 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체는 혈관내피세포성장인자와의 결합력이 우수하여 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 나노입자와 결합하는 상위 5개의 유리체 기반 단백질을 확인하고(실시예 1 참조), 상기 5개의 단백질과 나노입자를 배양하여 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 형성한 후(실시예 2 참조), 이의 혈관신생억제 효과를 확인한 결과, 나노입자와 비교할 때, 물에서는 혈관내피세포성장인자와의 결합력이 큰 차이가 없는 반면, 유리체 내에서는 나노입자 단독 처리군에 비해 현저히 우수한 혈관내피세포성장인자와의 결합력을 나타냄을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, in vitro 또는 in vivo에서 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체의 혈관신생 억제 효과 확인한 결과, 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체가 in vitro 또는 in vivo 모두에서 우수한 혈관신생 억제효과를 나타냄을 확인하였다(실시예 4 참조).
이러한 실험결과로부터, 본 발명에 따른 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체는 혈관신생을 억제함으로써 혈관신생 관련 질환, 특히 망막 및 맥락막 혈관신생 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용할 수 있음을 알 수 있다.
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환 또는 망막 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환 또는 망막 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 "혈관신생 관련 질환"은 상기한 바와 같은 신생혈관 형성이 비정상적으로 진행되어 야기되는 질환을 의미하며, 미숙아 망막병증, 증식성 망막병증, 연령관련 황반변성(age-related macular degeneration), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy) 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "망막 질환"은 망막에 병변이 발생하는 질환으로서, 미숙아 망막병증, 당뇨병성 황반부종(DME, Diabetic Macular Edema), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy), 연령관련 황반변성(Age-related macular degeneration), 및 증식성 망막병증 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 바람직하게는 유리체강 내 주사 방식으로 적용될 수 있고, 유리체강 내 주사에 적합한 약제학적 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환 또는 망막 질환 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 망막 질환 치료에 적합한 단백질 스크리닝 방법을 제공한다:
(1) in vitro에서 유리체에 나노입자를 주입하는 단계;
(2) 상기 나노입자와 상기 유리체 내 단백질과의 복합체를 분리하는 단계;
(3) 상기 복합체와 혈관내피세포성장인자(VEGF)를 결합시키는 단계; 및
(4) 상기 혈관내피세포성장인자와 결합하는 복합체를 선별하는 단계.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 나노입자에 결합하는 유리체 기반 단백질 확인
1-1. 나노입자 준비
유리체 단백질과의 결합을 위한 나노입자는 각각 20 및 100nm의 직경을 갖는 금 및 실리카 나노입자를 준비하였다. 상기 나노입자들의 구체적인 정보 및 TEM 이미지를 각각 표 1 및 도 1에 나타내었다.
Au20 Au100 Si20 Si100
Diamter (nm) 18.99 ± 1.37 8.42 ± 7.24 20.72 ± 1.48 2.28 ± 4.78
Hydrodynamicdiameter (nm) 24.66 ± 0.83 112.16 ± 8.53 19.79 ± 0.70 130.04 ± 3.71
Zeta potential (mV) -45.26 ± 1.46 -43.54 ± 0.41 -52.96 ± 6.86 -45.94 ± 3.62
1-2. 나노입자와 유리체 단백질 결합
상기 실시예 1-1을 통해 준비된 직경 20 nm의 금(Au20)과 실리카(Si20) 나노입자 및 직경 100 nm의 금(Au100)과 실리카(Si100) 나노입자(1 x 1011개) 각각을 170 μg의 단백질을 보유한 유리체(vitreous)와 microcentrifuge tube 안에서 4℃ 조건으로 20 rpm의 회전을 가하여 6시간 동안 배양하였다. 이후 15,000 rpm 조건에서 20분 간 원심분리하여 침전물을 획득하였고, 이후 증류수로 2회 세척하여 비특이적으로 결합한 단백질을 제거하였다. 이때 침전물은 유리 나노입자 및 단백질이 결합된 나노입자를 포함한다. 이를 30 μL의 Laemmli buffer에 부유시키고, 100℃에서 3분 간 가열하여 나노입자와 단백질의 분리를 유도하였다. 이후 15,000 rpm 조건에서 1분 간 원심분리하여 상층액을 사용하여 단백질체 분석하여, 각 나노입자와 코로나를 형성한 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 확인하였고, 그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다. 더욱이, 상기 결과를 모두 종합하여 상위 20개의 유리체 기반 단백질을 확인하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 나노입자와 코로나를 형성하는 상위 5개의 유리체 기반 단백질은 순서대로 vitrin, secreted frizzled-related protein 2, serum albumin, retinol-binding protein 3, alpha crystallin A chain임을 확인할 수 있었고, 각 상대적 양은 11.25, 6.80, 5.44, 4.85, 4.23%였다.
실시예 2. 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체 형성
상기 실시예 1-2에 의해 확인된 상위 5개의 유리체 기반 단백질이 각각 50 ng, 25 ng, 25 ng, 25 ng 및 25 ng으로 이루어진 총 150 ng의 단백질 (SALVAR complex)을 준비하여 1 x 109개의 나노입자와 4℃에서 20 rpm의 회전을 가하여 1시간 동안 배양하여 나노입자-유리에 기반 단백질 복합체를 형성하였다.
실시예 3. 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체의 혈관 신생 억제 효과 확인
금 및 실리카 나노입자의 경우, 물 또는 세포배양액에서 혈관내피세포성장인자와 결합하는 현상이 알려져 있는바, 이러한 나노입자와 비교할 때, 본 발명에 따른 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체가 물 또는 세포배양액에서 혈관내피세포성장인자와 효과적으로 결합하는지를 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 실시하였다.
3-1. 물에서 혈관내피성장인자와의 결합력 비교
물에서 나노입자에 혈관내피세포 성장인자를 결합시키는 경우와 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우를 비교하였고, 해당 실험에 대한 개략적인 과정을 도 7에 나타내었다.
즉, 나노입자 또는 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 혈관내피세포성장인자와 4℃에서 20 rpm의 회전을 가하여 6시간 동안 배양하였다. 배양 후 15,000 rpm 조건에서 20분 간 원심분리하여 나노입자 또는 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체와 결합한 혈관내피세포성장인자를 침전시켜, 유리된 혈관내피세포성장인자를 상층액에서 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay)을 통해 측정하여 혈관내피세포성장인자의 결합력을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 물에서 나노입자에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우("Bare" 그룹)와 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우("SALVAR" 그룹) 간의 혈관내피 세포성장인자와의 결합력은 큰 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
3-2. 유리체 내에서 혈관내피성장인자와의 결합력 비교
유리체 내에서 나노입자에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우와 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우를 비교하였고, 해당 실험에 대한 개략적인 과정을 도 8에 나타내었다.
물 대신에 유리체를 사용하였다는 점을 제외하곤, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법을 실시하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 유리체 내에서 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우("SALVAR+Vitreous" 그룹)가 나노입자에 혈관내피세포성장인자를 결합시키는 경우("Vitreous" 그룹)에 비하여 현저히 우수한 혈관내피세포성장인자와의 결합력을 나타냄을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체가 생체 내에서 우수한 치료효과를 보일 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. In vitro에서 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체의 생체 내 혈관신생 억제 효과 확인
20 ng/mL의 혈관내피세포성장인자를 혈관내피세포에 처리할 시 혈관신생 과정을 대표하는 혈관내피세포의 증식이나 관 형성을 촉진함이 알려져 있다. 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체 투여가 혈관내피세포성장인자에 의한 in vitro 혈관신생 과정을 억제함을 확인하기 위하여 혈관내피세포 증식(proliferation) 및 관 형성(tube formation) 시험을 시행하였다. 혈관내피세포 증식 시험은 0.3% 젤라틴(gelatin)이 코팅된 plate의 각 well에 2,000개의 혈관내피세포를 1일 간 배양하고, 이후 혈관내피세포성장인자, 나노입자, 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체, 및 bevacizumab을 조건에 따라 처리한 후 48시간 동안 혈관내피세포의 증식 정도를 비교하는 방식으로 진행하였다. 혈관내피세포의 증식 정도는 trypan blue 염색 후 직접 세포의 수를 측정하는 방식과, water soluble tetrazolium salt-1 처리 후 450 nm의 흡광도를 측정하는 방식으로 추정하였다. 관 형성 시험은 Matrigel이 코팅된 plate의 각 well에 100,000개의 혈관내피세포와 혈관내피세포성장인자, 나노입자, 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체, 및 bevacizumab을 조건에 따라 처리한 후 12시간 후 혈관내피세포의 관 형성 정도를 비교하는 방식으로 진행하였다. 50배 확대된 화면에서 형성된 관(tube)의 숫자를 확인하여 정량적인 비교를 시행하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체("SALVAR mixture")를 투여한 경우에, in vitro 혈관내피세포 증식 및 관 형성 시험에서 bevacizumab에 준하는 우수한 혈관신생 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 5. In vivo에서 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체의 혈관신생 억제 효과 확인
생쥐에서 레이저 유도 맥락막 신생혈관 모델을 만들고, 나노입자 또는 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 유리체강 내 주사하여 효과를 확인하였다. 생쥐의 망막에 400 mW의 세기로 50 ms 지속시간의 diode 레이저를 조사하면 망막층과 맥락막층 사이의 Bruch 막의 파괴가 일어나는데, 레이저 조사 후 나노입자(109개/mL, 1 μL), 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체(109개/mL, 1 μL), 항 혈관내피세포성장인자 항체(1 μg)를 유리체강 내로 주사하고, 레이저 조사 후 7일째에 맥락막 신생혈관의 형성 정도를 면역형광 염색을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체("Au20+SALVAR mixture")를 투여한 경우에, 생체 내에서도 항 혈관내피세포성장인자 항체에 준하는 우수한 혈관신생 억제효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> SNU R&DB FOUNDATION KOREA RESEARCH INSTITUTE OF STANDARDS AND SCIENCE <120> Compositions comprising nanoparticle-protein complex based on vitreous as an active ingredient for inhibiting angiogenesis, and uses thereof <130> MP15-046 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 678 <212> PRT <213> Vitrin <400> 1 Met Arg Thr Val Val Leu Thr Met Lys Ala Ser Val Ile Glu Met Phe 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Val Thr Gly Val His Ser Asn Lys Glu Thr Ala Lys 20 25 30 Lys Ile Lys Arg Pro Lys Phe Thr Val Pro Gln Ile Asn Cys Asp Val 35 40 45 Lys Ala Gly Lys Ile Ile Asp Pro Glu Phe Ile Val Lys Cys Pro Ala 50 55 60 Gly Cys Gln Asp Pro Lys Tyr His Val Tyr Gly Thr Asp Val Tyr Ala 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Ser Val Cys Gly Ala Ala Val His Ser Gly Val Leu Asp 85 90 95 Asn Ser Gly Gly Lys Ile Leu Val Arg Lys Val Ala Gly Gln Ser Gly 100 105 110 Tyr Lys Gly Ser Tyr Ser Asn Gly Val Gln Ser Leu Ser Leu Pro Arg 115 120 125 Trp Arg Glu Ser Phe Ile Val Leu Glu Ser Lys Pro Lys Lys Gly Val 130 135 140 Thr Tyr Pro Ser Ala Leu Thr Tyr Ser Ser Ser Lys Ser Pro Ala Ala 145 150 155 160 Gln Ala Gly Glu Thr Thr Lys Ala Tyr Gln Arg Pro Pro Ile Pro Gly 165 170 175 Thr Thr Ala Gln Pro Val Thr Leu Met Gln Leu Leu Ala Val Thr Val 180 185 190 Ala Val Ala Thr Pro Thr Thr Leu Pro Arg Pro Ser Pro Ser Ala Ala 195 200 205 Ser Thr Thr Ser Ile Pro Arg Pro Gln Ser Val Gly His Arg Ser Gln 210 215 220 Glu Met Asp Leu Trp Ser Thr Ala Thr Tyr Thr Ser Ser Gln Asn Arg 225 230 235 240 Pro Arg Ala Asp Pro Gly Ile Gln Arg Gln Asp Pro Ser Gly Ala Ala 245 250 255 Phe Gln Lys Pro Val Gly Ala Asp Val Ser Leu Gly Leu Val Pro Lys 260 265 270 Glu Glu Leu Ser Thr Gln Ser Leu Glu Pro Val Ser Leu Gly Asp Pro 275 280 285 Asn Cys Lys Ile Asp Leu Ser Phe Leu Ile Asp Gly Ser Thr Ser Ile 290 295 300 Gly Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gln Lys Gln Leu Leu Ala Asp Val Ala 305 310 315 320 Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro Ala Gly Pro Leu Met Gly Val Val Gln 325 330 335 Tyr Gly Asp Asn Pro Ala Thr His Phe Asn Leu Lys Thr His Thr Asn 340 345 350 Ser Arg Asp Leu Lys Thr Ala Ile Glu Lys Ile Thr Gln Arg Gly Gly 355 360 365 Leu Ser Asn Val Gly Arg Ala Ile Ser Phe Val Thr Lys Asn Phe Phe 370 375 380 Ser Lys Ala Asn Gly Asn Arg Ser Gly Ala Pro Asn Val Val Val Val 385 390 395 400 Met Val Asp Gly Trp Pro Thr Asp Lys Val Glu Glu Ala Ser Arg Leu 405 410 415 Ala Arg Glu Ser Gly Ile Asn Ile Phe Phe Ile Thr Ile Glu Gly Ala 420 425 430 Ala Glu Asn Glu Lys Gln Tyr Val Val Glu Pro Asn Phe Ala Asn Lys 435 440 445 Ala Val Cys Arg Thr Asn Gly Phe Tyr Ser Leu His Val Gln Ser Trp 450 455 460 Phe Gly Leu His Lys Thr Leu Gln Pro Leu Val Lys Arg Val Cys Asp 465 470 475 480 Thr Asp Arg Leu Ala Cys Ser Lys Thr Cys Leu Asn Ser Ala Asp Ile 485 490 495 Gly Phe Val Ile Asp Gly Ser Ser Ser Val Gly Thr Gly Asn Phe Arg 500 505 510 Thr Val Leu Gln Phe Val Thr Asn Leu Thr Lys Glu Phe Glu Ile Ser 515 520 525 Asp Thr Asp Thr Arg Ile Gly Ala Val Gln Tyr Thr Tyr Glu Gln Arg 530 535 540 Leu Glu Phe Gly Phe Asp Lys Tyr Ser Ser Lys Pro Asp Ile Leu Asn 545 550 555 560 Ala Ile Lys Arg Val Gly Tyr Trp Ser Gly Gly Thr Ser Thr Gly Ala 565 570 575 Ala Ile Asn Phe Ala Leu Glu Gln Leu Phe Lys Lys Ser Lys Pro Asn 580 585 590 Lys Arg Lys Leu Met Ile Leu Ile Thr Asp Gly Arg Ser Tyr Asp Asp 595 600 605 Val Arg Ile Pro Ala Met Ala Ala His Leu Lys Gly Val Ile Thr Tyr 610 615 620 Ala Ile Gly Val Ala Trp Ala Ala Gln Glu Glu Leu Glu Val Ile Ala 625 630 635 640 Thr His Pro Ala Arg Asp His Ser Phe Phe Val Asp Glu Phe Asp Asn 645 650 655 Leu His Gln Tyr Val Pro Arg Ile Ile Gln Asn Ile Cys Thr Glu Phe 660 665 670 Asn Ser Gln Pro Arg Asn 675 <210> 2 <211> 295 <212> PRT <213> Secreted frizzled-related protein 2 <400> 2 Met Leu Gln Gly Pro Gly Ser Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ser His 1 5 10 15 Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Pro Asp 20 25 30 Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro Ala Asn Leu Gln 35 40 45 Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu 50 55 60 Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ala Trp Ile 65 70 75 80 Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys 85 90 95 Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Gln 100 105 110 Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gln Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val 115 120 125 Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg 130 135 140 Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ser Ser Asp His 145 150 155 160 Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys Glu Ala Cys Lys 165 170 175 Asn Lys Asn Asp Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr Leu Cys Lys Asn 180 185 190 Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr Tyr Ile Asn Arg 195 200 205 Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr Ile Tyr Lys Leu 210 215 220 Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val Leu Trp Leu Lys 225 230 235 240 Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp Ile Asn Ala Pro 245 250 255 Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu Val Ile Thr Ser 260 265 270 Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys Arg Ile Ser Arg 275 280 285 Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys 290 295 <210> 3 <211> 609 <212> PRT <213> Albumin <400> 3 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 1 5 10 15 Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 35 40 45 Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val 50 55 60 Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 100 105 110 Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln 115 120 125 His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 130 135 140 Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 145 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 180 185 190 Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 195 200 205 Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys 210 215 220 Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240 Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255 Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270 Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile 275 280 285 Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300 Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320 Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335 Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350 Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365 Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380 Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400 Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys 405 410 415 Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu 420 425 430 Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 450 455 460 Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 465 470 475 480 Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 485 490 495 Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 500 505 510 Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 515 520 525 Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 530 535 540 Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys 545 550 555 560 Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 565 570 575 Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 580 585 590 Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly 595 600 605 Leu <210> 4 <211> 1247 <212> PRT <213> Retinol-binding protein 3 <400> 4 Met Met Arg Glu Trp Val Leu Leu Met Ser Val Leu Leu Cys Gly Leu 1 5 10 15 Ala Gly Pro Thr His Leu Phe Gln Pro Ser Leu Val Leu Asp Met Ala 20 25 30 Lys Val Leu Leu Asp Asn Tyr Cys Phe Pro Glu Asn Leu Leu Gly Met 35 40 45 Gln Glu Ala Ile Gln Gln Ala Ile Lys Ser His Glu Ile Leu Ser Ile 50 55 60 Ser Asp Pro Gln Thr Leu Ala Ser Val Leu Thr Ala Gly Val Gln Ser 65 70 75 80 Ser Leu Asn Asp Pro Arg Leu Val Ile Ser Tyr Glu Pro Ser Thr Pro 85 90 95 Glu Pro Pro Pro Gln Val Pro Ala Leu Thr Ser Leu Ser Glu Glu Glu 100 105 110 Leu Leu Ala Trp Leu Gln Arg Gly Leu Arg His Glu Val Leu Glu Gly 115 120 125 Asn Val Gly Tyr Leu Arg Val Asp Ser Val Pro Gly Gln Glu Val Leu 130 135 140 Ser Met Met Gly Glu Phe Leu Val Ala His Val Trp Gly Asn Leu Met 145 150 155 160 Gly Thr Ser Ala Leu Val Leu Asp Leu Arg His Cys Thr Gly Gly Gln 165 170 175 Val Ser Gly Ile Pro Tyr Ile Ile Ser Tyr Leu His Pro Gly Asn Thr 180 185 190 Ile Leu His Val Asp Thr Ile Tyr Asn Arg Pro Ser Asn Thr Thr Thr 195 200 205 Glu Ile Trp Thr Leu Pro Gln Val Leu Gly Glu Arg Tyr Gly Ala Asp 210 215 220 Lys Asp Val Val Val Leu Thr Ser Ser Gln Thr Arg Gly Val Ala Glu 225 230 235 240 Asp Ile Ala His Ile Leu Lys Gln Met Arg Arg Ala Ile Val Val Gly 245 250 255 Glu Arg Thr Gly Gly Gly Ala Leu Asp Leu Arg Lys Leu Arg Ile Gly 260 265 270 Glu Ser Asp Phe Phe Phe Thr Val Pro Val Ser Arg Ser Leu Gly Pro 275 280 285 Leu Gly Gly Gly Ser Gln Thr Trp Glu Gly Ser Gly Val Leu Pro Cys 290 295 300 Val Gly Thr Pro Ala Glu Gln Ala Leu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Leu 305 310 315 320 Thr Leu Arg Ser Ala Leu Pro Gly Val Val His Cys Leu Gln Glu Val 325 330 335 Leu Lys Asp Tyr Tyr Thr Leu Val Asp Arg Val Pro Thr Leu Leu Gln 340 345 350 His Leu Ala Ser Met Asp Phe Ser Thr Val Val Ser Glu Glu Asp Leu 355 360 365 Val Thr Lys Leu Asn Ala Gly Leu Gln Ala Ala Ser Glu Asp Pro Arg 370 375 380 Leu Leu Val Arg Ala Ile Gly Pro Thr Glu Thr Pro Ser Trp Pro Ala 385 390 395 400 Pro Asp Ala Ala Ala Glu Asp Ser Pro Gly Val Ala Pro Glu Leu Pro 405 410 415 Glu Asp Glu Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Asp Ser Val Phe Gln Val 420 425 430 Ser Val Leu Pro Gly Asn Val Gly Tyr Leu Arg Phe Asp Ser Phe Ala 435 440 445 Asp Ala Ser Val Leu Gly Val Leu Ala Pro Tyr Val Leu Arg Gln Val 450 455 460 Trp Glu Pro Leu Gln Asp Thr Glu His Leu Ile Met Asp Leu Arg His 465 470 475 480 Asn Pro Gly Gly Pro Ser Ser Ala Val Pro Leu Leu Leu Ser Tyr Phe 485 490 495 Gln Gly Pro Glu Ala Gly Pro Val His Leu Phe Thr Thr Tyr Asp Arg 500 505 510 Arg Thr Asn Ile Thr Gln Glu His Phe Ser His Met Glu Leu Pro Gly 515 520 525 Pro Arg Tyr Ser Thr Gln Arg Gly Val Tyr Leu Leu Thr Ser His Arg 530 535 540 Thr Ala Thr Ala Ala Glu Glu Phe Ala Phe Leu Met Gln Ser Leu Gly 545 550 555 560 Trp Ala Thr Leu Val Gly Glu Ile Thr Ala Gly Asn Leu Leu His Thr 565 570 575 Arg Thr Val Pro Leu Leu Asp Thr Pro Glu Gly Ser Leu Ala Leu Thr 580 585 590 Val Pro Val Leu Thr Phe Ile Asp Asn His Gly Glu Ala Trp Leu Gly 595 600 605 Gly Gly Val Val Pro Asp Ala Ile Val Leu Ala Glu Glu Ala Leu Asp 610 615 620 Lys Ala Gln Glu Val Leu Glu Phe His Gln Ser Leu Gly Ala Leu Val 625 630 635 640 Glu Gly Thr Gly His Leu Leu Glu Ala His Tyr Ala Arg Pro Glu Val 645 650 655 Val Gly Gln Thr Ser Ala Leu Leu Arg Ala Lys Leu Ala Gln Gly Ala 660 665 670 Tyr Arg Thr Ala Val Asp Leu Glu Ser Leu Ala Ser Gln Leu Thr Ala 675 680 685 Asp Leu Gln Glu Val Ser Gly Asp His Arg Leu Leu Val Phe His Ser 690 695 700 Pro Gly Glu Leu Val Val Glu Glu Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Val 705 710 715 720 Pro Ser Pro Glu Glu Leu Thr Tyr Leu Ile Glu Ala Leu Phe Lys Thr 725 730 735 Glu Val Leu Pro Gly Gln Leu Gly Tyr Leu Arg Phe Asp Ala Met Ala 740 745 750 Glu Leu Glu Thr Val Lys Ala Val Gly Pro Gln Leu Val Arg Leu Val 755 760 765 Trp Gln Gln Leu Val Asp Thr Ala Ala Leu Val Ile Asp Leu Arg Tyr 770 775 780 Asn Pro Gly Ser Tyr Ser Thr Ala Ile Pro Leu Leu Cys Ser Tyr Phe 785 790 795 800 Phe Glu Ala Glu Pro Arg Gln His Leu Tyr Ser Val Phe Asp Arg Ala 805 810 815 Thr Ser Lys Val Thr Glu Val Trp Thr Leu Pro Gln Val Ala Gly Gln 820 825 830 Arg Tyr Gly Ser His Lys Asp Leu Tyr Ile Leu Met Ser His Thr Ser 835 840 845 Gly Ser Ala Ala Glu Ala Phe Ala His Thr Met Gln Asp Leu Gln Arg 850 855 860 Ala Thr Val Ile Gly Glu Pro Thr Ala Gly Gly Ala Leu Ser Val Gly 865 870 875 880 Ile Tyr Gln Val Gly Ser Ser Pro Leu Tyr Ala Ser Met Pro Thr Gln 885 890 895 Met Ala Met Ser Ala Thr Thr Gly Lys Ala Trp Asp Leu Ala Gly Val 900 905 910 Glu Pro Asp Ile Thr Val Pro Met Ser Glu Ala Leu Ser Ile Ala Gln 915 920 925 Asp Ile Val Ala Leu Arg Ala Lys Val Pro Thr Val Leu Gln Thr Ala 930 935 940 Gly Lys Leu Val Ala Asp Asn Tyr Ala Ser Ala Glu Leu Gly Ala Lys 945 950 955 960 Met Ala Thr Lys Leu Ser Gly Leu Gln Ser Arg Tyr Ser Arg Val Thr 965 970 975 Ser Glu Val Ala Leu Ala Glu Ile Leu Gly Ala Asp Leu Gln Met Leu 980 985 990 Ser Gly Asp Pro His Leu Lys Ala Ala His Ile Pro Glu Asn Ala Lys 995 1000 1005 Asp Arg Ile Pro Gly Ile Val Pro Met Gln Ile Pro Ser Pro Glu Val 1010 1015 1020 Phe Glu Glu Leu Ile Lys Phe Ser Phe His Thr Asn Val Leu Glu Asp 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Gly Tyr Leu Arg Phe Asp Met Phe Gly Asp Gly Glu Leu Leu 1045 1050 1055 Thr Gln Val Ser Arg Leu Leu Val Glu His Ile Trp Lys Lys Ile Met 1060 1065 1070 His Thr Asp Ala Met Ile Ile Asp Met Arg Phe Asn Ile Gly Gly Pro 1075 1080 1085 Thr Ser Ser Ile Pro Ile Leu Cys Ser Tyr Phe Phe Asp Glu Gly Pro 1090 1095 1100 Pro Val Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Ser Arg Pro Asp Asp Ser Val Ser 1105 1110 1115 1120 Glu Leu Trp Thr His Ala Gln Val Val Gly Glu Arg Tyr Gly Ser Lys 1125 1130 1135 Lys Ser Met Val Ile Leu Thr Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr Ala Glu 1140 1145 1150 Glu Phe Thr Tyr Ile Met Lys Arg Leu Gly Arg Ala Leu Val Ile Gly 1155 1160 1165 Glu Val Thr Ser Gly Gly Cys Gln Pro Pro Gln Thr Tyr His Val Asp 1170 1175 1180 Asp Thr Asn Leu Tyr Leu Thr Ile Pro Thr Ala Arg Ser Val Gly Ala 1185 1190 1195 1200 Ser Asp Gly Ser Ser Trp Glu Gly Val Gly Val Thr Pro His Val Val 1205 1210 1215 Val Pro Ala Glu Glu Ala Leu Ala Arg Ala Lys Glu Met Leu Gln His 1220 1225 1230 Asn Gln Leu Arg Val Lys Arg Ser Pro Gly Leu Gln Asp His Leu 1235 1240 1245 <210> 5 <211> 173 <212> PRT <213> Alpha-crystallin A chain <400> 5 Met Asp Val Thr Ile Gln His Pro Trp Phe Lys Arg Thr Leu Gly Pro 1 5 10 15 Phe Tyr Pro Ser Arg Leu Phe Asp Gln Phe Phe Gly Glu Gly Leu Phe 20 25 30 Glu Tyr Asp Leu Leu Pro Phe Leu Ser Ser Thr Ile Ser Pro Tyr Tyr 35 40 45 Arg Gln Ser Leu Phe Arg Thr Val Leu Asp Ser Gly Ile Ser Glu Val 50 55 60 Arg Ser Asp Arg Asp Lys Phe Val Ile Phe Leu Asp Val Lys His Phe 65 70 75 80 Ser Pro Glu Asp Leu Thr Val Lys Val Gln Asp Asp Phe Val Glu Ile 85 90 95 His Gly Lys His Asn Glu Arg Gln Asp Asp His Gly Tyr Ile Ser Arg 100 105 110 Glu Phe His Arg Arg Tyr Arg Leu Pro Ser Asn Val Asp Gln Ser Ala 115 120 125 Leu Ser Cys Ser Leu Ser Ala Asp Gly Met Leu Thr Phe Cys Gly Pro 130 135 140 Lys Ile Gln Thr Gly Leu Asp Ala Thr His Ala Glu Arg Ala Ile Pro 145 150 155 160 Val Ser Arg Glu Glu Lys Pro Thr Ser Ala Pro Ser Ser 165 170

Claims (8)

  1. 나노입자와 상기 나노입자의 표면을 둘러싼 유리체 기반 단백질로 이루어진 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 금 또는 실리카인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노입자는 20-100 nm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 혈관신생은 미숙아 망막병증, 당뇨병성 황반부종(DME, Diabetic Macular Edema), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy), 연령관련 황반변성(Age-related macular degeneration) 또는 증식성 망막병증에 수반하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유리체 기반 단백질은 비트린(vitrin), secreted frizzled-related protein 2, 혈청 알부민(serum albumin), 레티놀결합단백질 3(retinol-binding protein 3), 및 alpha-crystallin A chain로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 항의 조성물을 유효성분으로 포함하는 망막 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 망막질환은 미숙아 망막병증, 당뇨병성 황반부종(DME, Diabetic Macular Edema), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 중심성 장액 맥락망막병증 (Central serous (chorio)retinopathy), 연령관련 황반변성(Age-related macular degeneration), 및 증식성 망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 하기 단계를 포함하는 망막 질환 치료에 적합한 단백질 스크리닝 방법:
    (1) in vitro에서 유리체에 나노입자를 주입하는 단계;
    (2) 상기 나노입자와 상기 유리체 내 단백질과의 복합체를 분리하는 단계;
    (3) 상기 복합체와 혈관내피세포성장인자(VEGF)를 결합시키는 단계; 및
    (4) 상기 혈관내피세포성장인자와 결합하는 복합체를 선별하는 단계.
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