CN110981941A - 生物模拟肽和生物可降解的递送平台 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物模拟肽和生物可降解的递送平台。公开了具有抗血管生成和抗肿瘤发生特性的模拟肽及其用于治疗癌症、眼部疾病,诸如年龄相关性黄斑变性,和其他血管生成依赖性疾病的方法。更具体地,公开了包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF的分离的肽,所述分离的肽展现出在内皮细胞增殖、迁移、附着和管形成测定中的抗血管生成活性,在体外人乳腺癌细胞中的抗迁移活性,体内乳腺癌异种移植物模型和年龄相关性黄斑变性模型中的抗血管生成活性和抗肿瘤发生活性。所述分离的肽还展现出抗淋巴管生成和直接抗肿瘤发生特性。
Description
本申请是申请日为2014年6月9日,申请号为201480043222.X,发明名称为“用于治疗血管生成依赖性和淋巴管生成依赖性疾病的生物模拟肽和生物可降解的递送平台”的申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年6月7日提交的美国临时申请号61/832,290的权益,其通过引用以其整体并入本文。
联邦政府资助的研究或开发
本发明根据由美国国立卫生研究院(the National Institutes of Health)给予的R21 CA 131931和R01 CA 138264在美国政府支持下做出。美国政府在本发明中拥有某些权利。
电子提交的材料的通过引用并入
本申请包含序列表。该序列表已作为名称为“111232-0029l_ST25.txt”的ASCII文本文件经EFS-Web以电子形式提交。该序列表大小为1,966字节,且创建日期为2014年6月9日。该序列表在此通过引用以其整体并入。
技术领域
本申请涉及但不限于用于治疗血管生成依赖性和淋巴管生成依赖性疾病的生物模拟肽和生物可降解的递送平台。
背景
癌症是美国和世界其他地区的重要的公共卫生问题。目前,在美国1/4死亡数是由于癌症。血管生成在大部分类型的癌症的肿瘤生长和转移中起重要的作用。特别地,其重要性已在美国最常诊断出的女性恶性肿瘤乳腺癌中被证实。抗血管生成疗法作为单一疗法或与其他疗法组合是有希望的并且正在临床前和临床研究两者中被紧张地研究。抗VEGF疗法显示了临床试验中的早期希望;然而,尽管在2008年抗VEGF抗体贝伐单抗(Genentech/Roche)经美国食品与药物管理局(FDA)批准与化疗组合用于乳腺癌,在2011年11月,FDA撤销了乳腺癌适应症,因为其未显示总存活益处。
治疗乳腺癌和其他癌症,以及眼部增殖性疾病,诸如年龄相关性黄斑变性的抗血管生成疗法的开发正在进行中。淋巴管生成在癌症转移中还起重要作用(Holopainen等人,2011)。迄今为止,肽类药物未被批准用于治疗癌症或其他血管生成依赖性疾病和淋巴管生成依赖性疾病。
肽已被用作多种疾病的治疗剂并且最近在靶向肿瘤的临床应用中被研究用于成像或治疗(Folkman,2010;Senger等,1983;Leung等,1989;Carmeliet,2005;Carmeliet和Jain,2000;Carmeliet和Jain,2011;Rosea等,2011)。模拟肽是生物学上模拟生物分子上的活性决定簇的肽。通常,由于肽特异性靶向结合、穿透细胞的能力和给予不同应用的灵活性的修饰方便性,肽作为疗法是有吸引力的工具(Carmeliet和Jain,2000;Folkman,2006)。另外,由于它们以高度特异性结合其靶它们毒性较低且它们生产低廉。
然而,使肽成为有吸引力的候选者的特性中的一些也有其缺点。尽管肽可与细胞受体特异性相互作用,有时这些相互作用可以是低亲和力的。另外,目前肽由于其短的半衰期和减少的生物利用度作为治疗剂的使用受限。
修饰肽以增加其生物利用度的尝试包括肽的非天然氨基酸置换、聚乙二醇化及肽以纳米粒子和微米粒子递送。
概述
本发明公开的主题提供了用于治疗与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病、紊乱或功能障碍的肽组合物、方法和试剂盒。本发明公开的肽组合物和方法在一些方面抑制在多种疾病或紊乱中起关键作用的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生。因此,在一些方面,本发明公开的主题的组合物和方法允许预防或减少牵涉细胞、组织或器官的血管、淋巴管或肿瘤形成。
在一些方面,本发明公开的主题提供了分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
在其他方面,本发明公开的主题提供了组合物,所述组合物包含药学上可接受的载体和有效量的分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
在另外的方面,本发明公开的主题提供了试剂盒,所述试剂盒包含分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
在仍另外的方面,本发明公开的主题提供了纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
在一些方面,本发明公开的主题提供了用于抑制牵涉细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的方法,所述方法包括:使所述细胞与足以抑制牵涉所述细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的量的分离的肽接触,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列。
在一些其他方面,本发明公开的主题提供了用于治疗患有与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的受试者,或预防或延迟受试者发展与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的方法,所述方法包括:将分离的肽以足以治疗、延迟或预防所述受试者中所述疾病的量施用至所述受试者,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列。
本发明公开的主题的某些方面在上文已被列举,其全部或部分由本发明公开的主题所解决,其他方面当结合本文以下作为最好描述的所附实施例和图考虑时,随着描述进行将变得明显。
具体地,本申请提供了以下内容:
1.一种分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID No:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
2.一种组合物,所述组合物包含药学上可接受的载体和有效量的项目1所述的分离的肽。
3.一种试剂盒,所述试剂盒包含来自项目1的分离的肽。
4.一种纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含来自项目1的分离的肽。
5.如项目4所述的纳米粒子或微米粒子,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PLGA和/或PLGA-PEG。
6.如项目5所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进PLGA和/或PLGA-PEG纳米粒子或微米粒子的按质量计约2%至约5%的所述分离的肽。
7.如项目5所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进PLGA和/或PLGA-PEG纳米粒子或微米粒子的按质量计约6%至约10%的所述分离的肽。
8.如项目4所述的纳米粒子或微米粒子,其中所述纳米粒子或微米粒子包含聚(β-氨基酯)(PBAE)和/或PBAE-PEG。
9.如项目8所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进所述PBAE和/或PBAE-PEG纳米粒子或微米粒子的按质量计约1%至约5%的所述分离的肽。
10.如项目8所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进PBAE和/或PBAE-PEG纳米粒子或微米粒子的按质量计约6%至约10%的所述分离的肽。
11.如项目4所述的纳米粒子或微米粒子,其中所述纳米粒子或微米粒子包含聚(β-氨基酯)(PBAE)、PLGA和PEG的组合。
12.如项目11所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进包含聚(β-氨基酯)(PBAE)、PLGA和PEG的组合的粒子的按质量计约1%至约5%的所述分离的肽。
13.如项目11所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进包含聚(β-氨基酯)(PBAE)、PLGA和PEG的组合的粒子的按质量计约6%至约10%的所述分离的肽。
14.一种用于抑制牵涉细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的方法,所述方法包括:
使所述细胞与足以抑制牵涉所述细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的量的分离的肽接触,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID No:1)至少85%同一的氨基酸序列。
15.如项目14所述的方法,其中接触所述细胞导致牵涉所述细胞的附着、迁移、增殖和/或管形成的抑制。
16.如项目14所述的方法,其中所述细胞选自由以下组成的组:内皮细胞、微血管细胞和淋巴细胞。
17.如项目14所述的方法,其中所述细胞被发现在脂肪组织中,并且所述方法减少或防止肥胖。
18.如项目14所述的方法,其中所述细胞是移植的细胞,并且所述方法在移植所述细胞之后减少或防止组织和/或器官排斥。
19.如项目14所述的方法,其中所述分离的肽在接触所述细胞之前被负载到或负载进纳米粒子或微米粒子。
20.如项目19所述的方法,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PLGA和/或PLGA-PEG。
21.如项目19所述的方法,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PBAE和/或PBAE-PEG。
22.如项目19所述的方法,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PBAE、PLGA和PEG。
23.一种用于治疗患有与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的受试者或预防或延迟受试者发展与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的方法,所述方法包括:
将包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID No:1)至少85%同一的氨基酸序列的分离的肽以足以治疗、延迟或预防所述受试者中所述疾病的量施用至所述受试者。
24.如项目23所述的方法,其中所述受试者是人。
25.如项目23所述的方法,其中所述受试者非人类。
26.如项目23所述的方法,其中所述疾病包括瘤形成。
27.如项目26所述的方法,其中所述瘤形成包括实体瘤。
28.如项目26所述的方法,其中所述瘤形成包括癌症。
29.如项目28所述的方法,其中所述癌症选自由以下组成的组:乳腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、眼癌、肾细胞癌、肝细胞癌、头部癌和颈部癌。
30.如项目23所述的方法,其中所述方法抑制肿瘤内或肿瘤周围的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生。
31.如项目30所述的方法,其中所述肿瘤是原发性肿瘤或建立的转移性肿瘤。
32.如项目23所述的方法,其中所述方法抑制手术期间和/或手术后的淋巴管生成、血管生成和/或肿瘤发生。
33.如项目28所述的方法,其中所述方法抑制转移的建立或抑制所述癌症的进一步转移。
34.如项目28所述的方法,其中所述方法抑制肿瘤细胞通过血管系统和/或淋巴管系统的播散。
35.如项目23所述的方法,其中所述疾病与眼部血管生成或糖尿病性视网膜病有关。
36.如项目35所述的方法,其中与眼部血管生成有关的疾病选自由以下组成的组:年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、新生血管性青光眼、增殖性糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变。
37.如项目23所述的方法,其中所述分离的肽在施用至所述受试者之前被负载到或负载进纳米粒子或微米粒子。
38.如项目37所述的方法,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PLGA和/或PLGA-PEG。
39.如项目37所述的方法,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PBAE和/或PBAE-PEG。
40.如项目37所述的方法,其中所述纳米粒子或微米粒子包含PLGA、PBAE和PEG。
41.如项目38所述的方法,包含被负载到或负载进包含PLGA的PLGA纳米粒子或微米粒子的按质量计约2%至约5%的所述分离的肽。
42.如项目38所述的方法,包含被负载到或负载进包含PLGA的PLGA纳米粒子或微米粒子的按质量计约1%至约10%的所述分离的肽。
43.如项目40所述的方法,包含被负载到或负载进包含PBAE的PBAE纳米粒子或微米粒子的按质量计约1%至约10%的所述分离的肽。
44.如项目23所述的方法,其中所述分离的肽与至少一种其他抗血管生成剂组合被施用。
45.如项目44所述的方法,其中所述至少一种其他抗血管生成剂选自由以下组成的组:阿柏西普、兰尼单抗、贝伐单抗,及其组合。
附图简述
由此已用一般术语描述本发明公开的主题,现将参考附图,其不一定按比例绘制,且其中:
图1的A-C示出了使用SP2043肽(SEQ ID NO:1)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖(图A)、附着(图B)和迁移(图C);
图2的A-C示出了使用SP2043肽(SEQ ID NO:1)与人视网膜内皮细胞(HREC)的附着(图A)、增殖(图B)和迁移(图C);
图3的A-D示出了使用CM对照(图A)和SP2043肽(SEQ ID NO:1)(25μM SP2043肽;图B)的HUVEC管形成测定(tube formation assay);和使用对照(Ctrl;图C)和SP2043肽(SEQID NO:1)(25μM SP2043肽;图D)的微血管内皮细胞(MEC)管形成测定;
图4示出了在本文和附图中还称为SEQ.1的SP2043肽(SEQ ID NO:1)对淋巴管内皮细胞(LEC)附着的影响;
图5示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对淋巴管内皮细胞(LEC)管形成的影响;
图6的A-B示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对微血管内皮细胞(MEC;图A)和淋巴管内皮细胞(LEC;图B)的肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子(IGF 1)的体外信号传导的影响;
图7示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SUM149以及雌激素受体阳性细胞系MCF-7的增殖的影响;
图8示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对MDA-MB-231细胞内肝细胞生长因子(HGF)信号传导的影响;
图9示出了33天内SP2043肽(SEQ ID NO:1)对SCID小鼠内MDA-MB-231原位肿瘤生长(ip,腹腔内注射)的影响;
图10的A-B示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)(图B)对体内c-Met磷酸化和血管生成的影响(图A,对照);
图11的A-G示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对血管生成的影响,如通过用于免疫组织化学(IHC)的凝集素染色和用于体内淋巴管生成的LYVE-1染色所见:用凝集素染色的对照(图A)和用LYVE-1染色的对照(图B);用凝集素染色的SP2043肽(SEQ ID NO:1)(图C)和用LYVE-1染色的SP2043肽(SEQ ID NO:1)(图D);对照和SP2043肽(SEQ ID NO:1)(图E);以及使用凝集素(图F)和LYVE-1(图G)的像素密度;
图12的A-B示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对MDA-MB-231-luc肿瘤在肿瘤条件介质预处理的转移模型中的多个器官中转移的影响,这通过来自肿瘤细胞的光子通量得到(图A),以及SP2043肽(SEQ ID NO:1)对MDA-MB-231-luc肿瘤至淋巴结的转移的影响,如通过对于人细胞的存在通过波形蛋白抗体染色所见(图B);
图13的A-E示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)与在CNV模型中的阿柏西普(图A-B)相比,和与在rho-VEGF小鼠模型中的对照(图C-E)相比,对新血管形成的影响;
图14示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对激光诱导的CNV模型中小鼠眼睛新血管系统的影响;
图15的A-B示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对Tet/视蛋白(Opsin)/VEGF小鼠模型中血管渗漏(vascular leakage)的影响;
图16示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对兔眼睛中VEGF介导的血管通透性的影响;
图17示出了聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid))(PLGA)微米粒子中负载的SP2043肽(SEQ ID NO:1)(2%)的代表性实例;PLGA以65/35的L:G比,MW=40-75kDa来使用。比例尺为10微米;
图18的A-B示出了:(图A)负载2%和5%SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA微米粒子和大小(sizing);数目平均粒子分布(Num.Avg)和体积平均粒子分布(Vol.Avg)被指明(平均值+SD);和(图B)负载2%和5%SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA微米粒子的ζ电势(表面电荷);
图19示出了来自PLGA微米粒子的SP2043的标记的肽类似物在生理条件下原位的控释;
图20示出了在PLGA微米粒子中没有任何标记或修饰的SP2043肽(SEQ ID NO:1)在生理条件下的原位控释(以下图32中所示方法);
图21示出了掺入按重量计2%SP2043(左)和按重量计5%SP2043(右)的PLGA微米粒子的SEM图。PLGA在该实施例中以85/15的L:G比,MW=190-240kDa来使用。比例尺为10微米;
图22示出了使用包封进纳米粒子PLGA 65/35中的SP2043肽(SEQ ID NO:1)。椭球形纳米粒子(左)和球形纳米粒子(右);
图23示出了包封SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA 85/15微米粒子对激光诱导小鼠模型中脉络膜新血管形成后小鼠眼睛中消退的影响(示出了2周数据);
图24示出了包含SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA 85/15微米粒子对激光诱导的湿性AMD小鼠模型中新血管形成随时间的影响;
图25示出了包含SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA 65/35微米粒子对激光诱导的湿性AMD小鼠模型中新血管形成随时间的影响;
图26示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)对兔模型中新血管形成抑制的影响。在玻璃体内注射进兔眼睛之后第34天的数据;
图27示出了在rho/VEGF转基因小鼠中的包封SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA(85/15);
图28示出了与其他抗血管生成剂组合的SP2043肽(SEQ ID NO:1)对小鼠中激光诱导的脉络膜新血管形成模型的影响;
图29示出了聚合物诸如PBAE对SP2043肽(SEQ ID NO:1)自组装成约100-nm纳米粒子的能力的影响。聚合物447指(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪封端的聚(1,4-丁二醇二丙烯酸酯-共-4-氨基-1-丁醇)且聚合物657指(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪封端的聚(1,6-己二醇二丙烯酸酯-共-5-氨基-1-戊醇)(B6-S5-E7)。+/-指有或没有SP2043肽(SEQ ID NO:1)。当SP2043肽(SEQ ID NO:1)与聚合物一起自组装时,粒径较大且纳米粒子浓度较大;
图30示出了包封SP2043的PLGA纳米粒子和PLGA-PEG纳米粒子;
图31的A-B示出了系统静脉内注射的包含SP2043肽(SEQ ID NO:1)的纳米粒子或游离肽对在肿瘤以及其他器官内积累的影响。图A示出了每一器官的积累且图B示出了总积累。在两个图中,术语“裸的”指游离肽,而术语“球形”、“椭球形”和“PEG”即聚乙二醇,指包含SP2043肽(SEQ ID NO:1)的纳米粒子的三种不同的类型;且
图32的A-B示出了通过使用电泳和用SimplyBlue染色(图A)随后通过质谱法(图B)定量本发明公开的肽的方法。图A包含以下样品:泳道1,标志物;泳道2,4μg SP2043肽(SEQID NO:1)阳性对照;泳道3,在PBS介质中的4μg SP2043肽(SEQ ID NO:1);泳道4,在FBS介质中的4μg SP2043肽(SEQ ID NO:1)。
详述
本发明公开的主题现将参考附图在下文中被更充分描述,其中示出本发明公开的主题中的一些而非全部实施方案。同样的数字始终指相同的要素。本发明公开的主题可以以许多不同的形式来体现并且不应该被解释为限于本文阐述的实施方案;相反,提供这些实施方案使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上,本文阐述的本发明公开的主题的许多修饰和其他实施方案将为本发明公开的主题所属技术领域的技术人员想到具有上述说明和相关附图中呈现的教导的益处。此外,应该理解,本发明公开的主题不限于公开的具体实施方案且修饰和其他实施方案旨在被包括在所附权利要求书的范围内。
I.来源于IV型胶原的模拟肽
对于某些疾病,相比于其他类型的疗法,肽通常提供许多优势,由于它们是无免疫原性的、因为它们以高度特异性结合至其靶而毒性较低,并且生产成本低廉。参见,例如,国际PCT专利公布号WO 2008/085828和国际PCT专利申请公布号WO 2007/033215,其每个通过引用以其整体并入本文。本发明公开的肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性,其可导致某些疾病中总存活率的增加。例如,本发明公开的肽可有益于癌症患者并可有助于治疗眼部增殖性疾病,诸如年龄相关性黄斑变性和糖尿病性视网膜病变。
通常,本发明公开的肽被表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQID No:2)的基序。表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXNINNVXNF(SEQ ID No:4)的基序的肽已在国际公布WO 2012/079088(通过引用以其整体并入本文)中被公开。该基序通过做出pentastatin-1肽中的置换来确定。WO 2012/079088出版物公开了,在一些实施方案中,SEQ ID No:3中由X指示的位置可以是变化的并且所得的肽还可用于,且在一些实施方案中更好用于抑制血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生,以及其用于治疗这些病的受试者,而SEQ ID No:3中其他位置可以是不变的以保留抑制特征。在其他实施方案中,发现了在以下位置上的X可以具有SEQ ID No:3中以下置换:位置7可以是M、A或G;位置9可以是F、A、Y或G;位置10可以是M、A、G、dA或Nle;位置11可以是F、A、Y、G或4-ClPhe;位置12和位置18可以是Abu、G、S、A、V、T、I、L或AllyGly。在一个实施方案中,公开了表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFININNVINF(SEQ ID No:3;还称为SP2036)的基序的肽。
本发明公开的肽被表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQ IDNo:2)的基序,其在位置13和16不同于先前公开的SEQ ID No:4(表1)。在特定的实施方案中,公开了表征为具有包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQIDNo:1;还称为SP2043和SEQ.l)的基序的肽,其在位置13和16不同于先前公开的SEQ ID No:3(还称为SP2036)(表1)。本文公开了位置13和16上的天冬氨酸的置换导致这样的肽,所述肽疏水性更低,但仍可用于抑制牵涉细胞、组织或器官的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生,以及其用于治疗这些病的受试者。另外,由于该肽疏水性更低,更容易产生。
表1.代表性肽
SEQ ID NO:1 | LRRFST A P FAFI DINDV INF | SP2043 |
SEQ ID NO:2 | LRRFST X P XXXX DINDVXNF | |
SEQ ID NO:3 | LRRFST A P FAFI NINNV INF | SP2036 |
SEQ ID NO:4 | LRRFST X P XXXX NINNV XNF |
A.代表性实施方案
在特定的实施方案中,分离的肽包含氨基酸序列LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ IDNO:1)。
在一些实施方案中,肽包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQ ID NO:2),且其中X是任何氨基酸。X可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。
在其他实施方案中,肽包含氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF(SEQ ID NO:2),其中X在位置7上是M、A或G;X在位置9上是F、A、Y或G;X在位置10上是M、A、G、dA或Nle;X在位置11上是F、A、Y、G或4-ClPhe;X在位置12和位置18上是Abu、G、S、A、V、T、I、L或AllyGly。在该实施方案中在X残基上的每个置换已被测试(如在国际PCT专利申请公布号WO 2012/079088中所示,其通过引用以其整体并入本文,或在本文以下提供的实施例中示出)或是测试的氨基酸的保守氨基酸置换。
在一些实施方案中,本发明公开的肽具有数个X残基,其可以是任何氨基酸,无论天然或非天然(X7、X9、X10、X11、X12和X18)。就天然氨基酸而言,意指自然界中存在的那些氨基酸,诸如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。就非天然氨基酸而言,意指自然界中不存在,但可被掺入多肽链中的氨基酸。非天然氨基酸包括但不限于:2-氨基丁酸(Abu)、正亮氨酸(Nle)、4-氯苯丙氨酸(4-ClPhe)、烯丙基甘氨酸(AllyGly)和其他非天然氨基酸,诸如Ma(2003)中详述的那些。本领域已知的氨基酸类似物可被应用于本发明公开的主题。
“肽”或“蛋白”包含一连串由肽键连接在一起的至少三个氨基酸。术语“蛋白”和“肽”可互换使用。肽可以指单独的肽或肽的集合。另外,本发明公开的肽中的氨基酸中的一个或更多个可通过以下来修饰:例如,通过添加化学实体诸如碳水化合物基团,磷酸基团,法呢基团(farnesyl group),异法呢基团(isofarnesyl group),脂肪酸基团,用于缀合、官能化或其他修饰的衔接物等。在一些实施方案中,肽的修饰导致更稳定的肽(例如,体内更大的半衰期)。在其他实施方案中,其他修饰可包括肽环化,D-氨基酸掺入,缀合至N-末端和C-末端的其他分子,荧光探针、生物分子诸如聚(乙二醇)、靶向配体等的缀合,复古反转(retro-inversion)等。修饰应该基本上都不干扰所期望的肽生物活性。
就“IV胶原来源的肽”而言,意指包含C-N-X(3)-V-C或P-F-X(2)-C或LX(2)FX(3)PFX(2)CNX(4)CNX胶原基序的肽。如需要,肽包含位于天然存在的氨基酸序列中该基序的羧基末端或氨基末端的侧翼的至少约5个、10个、20个、30个、40个、50个或更多个氨基酸。IV型胶原来源的肽包括,例如,pentastatin-1、抑瘤蛋白和靶向RGD。就“改变”而言,意指基因或多肽的序列或修饰(例如,翻译后修饰)中相对于内源性野生型参考序列的改变。
就“分离的肽”而言,意指已从其天然伴随的组分分离的本发明公开的肽。通常,当肽按重量计至少60%从蛋白和与之天然缔合的天然存在的有机分子释放时,其是分离的。优选地,制剂是按重量计至少75%、更优选地至少90%、且最优选地至少99%本发明公开的肽。分离的肽可通过如下来获得:例如,通过从天然来源提取,通过表达编码这样的肽的重组核酸;或通过化学合成蛋白。纯度可通过任何适当的方法来测量,例如,柱层析,聚丙烯酰胺凝胶电泳,或通过HPLC分析。
就“基本同一的”而言,意指展现出与参考氨基酸序列(例如,本文描述的任何一个氨基酸序列)或核酸序列至少50%同一性的肽、多肽或核酸分子。优选地,这样的序列在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列至少60%、更优选地80%或85%、且甚至更优选地90%、95%或甚至99%同一。
SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2的“功能变体”包括功能片段和/或功能融合肽。本发明公开的序列的功能变体指如下分离的和/或重组肽,所述分离的和/或重组肽具有由SEQID NO:1或SEQ ID NO:2编码的肽的至少一种特性、活性和/或功能特征,诸如展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性,其可导致某些疾病中总存活率的增加。通常,由本发明公开的主题所包含的本发明公开的肽的片段或部分包括具有相对于由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2编码的肽的氨基酸(即,一个或更多个氨基酸)的缺失(即,一个或更多个缺失)(诸如N-末端、C-末端或内部缺失)的那些。还预期了其中仅连续的氨基酸已被缺失或其中非连续氨基酸已被缺失的片段或部分。通常,本发明公开的肽的突变体或衍生物包括天然或人工变体,相差一个或更多个连续或非连续氨基酸残基的添加、缺失和/或置换,或其中一个或更多个残基被修饰的修饰的肽,以及包含一个或更多个修饰的残基的突变体。
通常,SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体:其具有如下氨基酸序列:所述氨基酸序列在变体长度上与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少约80%同一、至少约81%同一、至少约82%同一、至少约83%同一、至少约84%同一、至少约85%同一、至少约86%同一、至少约87%同一、至少约88%同一、至少约89%同一、至少约90%同一、至少约91%同一、至少约92%同一、至少约93%同一、至少约94%同一、至少约95%同一、至少约96%同一、至少约97%同一、至少约98%同一、或至少约99%同一。
通常,具有与本发明公开的序列同一百分比的氨基酸序列具有在变体长度上与本发明公开的序列至少约80%同一、至少约81%同一、至少约82%同一、至少约83%同一、至少约84%同一、至少约85%同一、至少约86%同一、至少约87%同一、至少约88%同一、至少约89%同一、至少约90%同一、至少约91%同一、至少约92%同一、至少约93%同一、至少约94%同一、至少约95%同一、至少约96%同一、至少约97%同一、至少约98%同一、或至少约99%同一。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。在其他实施方案中,本发明公开的主题提供了组合物,所述组合物包含药学上可接受的载体和有效量的分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。在另外的实施方案中,本发明公开的主题提供了试剂盒,所述试剂盒包含分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。在仍另外的实施方案中,本发明公开的主题提供了纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含分离的肽,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列,其中所述肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
此外,本发明公开的肽可被修饰以使它们不易蛋白水解。例如,它们可被截短至最小有效的序列。这样的截短对限制结合至其他受体是重要的,所述结合至其他受体将稀释有效浓度,以及导致不期望的副作用。这样的截短还开辟了从多个短肽创造单个多峰肽的可能性,每一个短肽通过不同的机制靶向血管生成、淋巴管生成和肿瘤发生。多峰治疗对减少药物耐受性的发生率是非常重要的,由于当被同时来自多方面攻击时肿瘤将能够成功安置耐受性是不太可能的。
另外,具有不同序列的本发明公开的肽可一起用于一种组合物或方法。可存在组合物或方法,其中多种类型的本发明公开的肽允许更好预防或减少血管生成、血管通透性、肿瘤发生和/或淋巴管生成。因此,用单多峰肽代替组合物,组合物可包含未共价键合在一起的多种类型的分离的肽。
此外,在一些实施方案中,本发明公开的肽是三氟乙酸(TFA)盐。然而,对于用于人类,TFA盐可被修饰为乙酸盐或其他药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”旨在包括用相对无毒的酸或碱制备的活性组合物的盐,取决于本文所述组合物上发现的特定取代基部分。当本公开内容的组合物包含相对酸性的官能团时,碱加成盐可通过使这样的组合物的中性形式与足量的所期望的碱(纯的或在适合的惰性溶剂中)接触来获得。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐,或类似的盐。当本公开内容的组合物包含相对碱性的官能团时,酸加成盐可通过使这样的组合物的中性形式与足量的所期望的酸(纯的或在适合的惰性溶剂中)接触来获得。药学上可接受的酸加成盐的实例包括来源于如下无机酸的那些:如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸(monohydrogencarbonic)、磷酸、一氢磷酸(monohydrogenphosphoric)、二氢磷酸(dihydrogenphosphoric)、硫酸、一氢硫酸(monohydrogensulfuric)、氢碘酸或亚磷酸等,以及来源于如下相对无毒有机酸的盐:如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸(p-tolylsulfonic)、柠檬酸、酒石酸、甲基磺酸等。还包括了氨基酸诸如精氨酸等的盐,以及有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见,例如,Berge等,“Pharmaceutical Salts”,Journal of Pharmaceutical Science,1977,66,1-19)。本公开内容的某些特定的组合物包含碱性官能团和酸性官能团两者,其允许组合物被转化为碱加成盐或酸加成盐。
另外,通过将肽缀合至某些组合物增加肽的半衰期是可能的。例如,将肽缀合至催化抗体或至聚合物,诸如聚乙二醇(PEG),以增加其半衰期和/或促进自组装成粒子是可能的。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了组合物,所述组合物包含药学上可接受的载体和有效量的本发明公开的肽,或其功能变体。在其他实施方案中,本发明公开的主题提供了试剂盒,所述试剂盒包含本发明公开的分离的肽或其功能变体。肽的量可广泛变化,但通常量足以进行本发明公开的方法中的至少一个。
如本文所用,“药学上可接受的载体”旨在包括,但不限于,水、盐水、葡聚糖溶液、人血清白蛋白、脂质体、水凝胶、微米粒子和纳米粒子。这样的介质和试剂用于药物活性组合物的用途是本领域熟知的,并且因此将各自以有效水平掺入组合物的另外的实例和方法不需要在本文讨论。这样的组合物还可包含涂层、抗细菌剂和/或真菌剂,以及是生物学上可耐受的任何其他成分。
通常,活性剂或药物递送装置的“有效量”指引起所期望的生物响应所需的量。如将由本领域普通技术人员所理解的,试剂或装置的有效量可取决于这样的因素而变化:如所期望的生物学终点、待递送的试剂、包封基质的组成、靶组织等。
通常,本发明公开的试剂盒包含一些或所有组分、试剂、供应品等以实践根据本发明公开的主题的方法。在包含根据本发明公开的主题的分离的肽或或其功能变体的试剂盒中,该试剂盒通常包含预防、延迟、减少或治疗与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的有效量的肽。在一个实施方案中,试剂盒包含至少一个容器(例如小瓶、管或安瓿),所述至少一个容器(例如小瓶、管或安瓿)包含本发明公开的主题的分离的肽。通常,一种或多种分离的肽将在一个或更多个容器中来供给,每个容器包含允许血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的改变发生的有效量的分离的肽。
B.代表性的生物可降解递送平台
在一些实施方案中,当负载至纳米粒子或微米粒子上或负载进入纳米粒子或微米粒子中,或以其他方式与纳米粒子或微米粒子缔合时,本发明公开的肽是有效的。因此,在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含本发明公开的肽或其功能变体。
在特定实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和/或PLGA-聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中,按质量计约2%至约5%的分离的肽被负载到或进入PLGA和/或PLGA-PEG纳米粒子或微米粒子。在又其他实施方案中,按质量计约6%至约10%的分离的肽被负载到或进入PLGA和/或PLGA-PEG纳米粒子或微米粒子。
此外,在其他实施方案中,适合于与本发明公开的主题一起使用的某些聚合物制剂、微米粒子、纳米粒子等在以下中被公开:国际PCT专利申请公布号WO/2012/0128782为“Multicomponent Degradable Cationic Polymers.”国际PCT专利申请公布号WO/2012/0114759为“Peptide/Particle Delivery Systems,”国际PCT专利申请公布号WO/2014/066811为“Bioreducible Poly(beta-amino ester)s for siRNA Delivery,”和国际PCT专利申请公布号WO/2014/066898为“A Layer-by-Layer Approach to Co-deliver DNA andsiRNA via AuNPs:a Potential Platform for Modifying Release Kinetics,”,全部属于Green等,且其每个通过引用以其整体并入本文。
如本文所用的,术语“聚(β-氨基酯)(PBAE)”可指通式的化合物:
其中:
n是从1至10,000的整数;
R包含选自由以下组成的组中的二丙烯酸酯的主链:
R’包含来源于选自由以下组成的组中的化合物的侧链:
R”包含来源于选自由以下组成的组中的化合物的末端基团:
在这样的实施方案中,聚合物组合物可被指定为,例如,B6-S5-E7或657,其中R是B6,R’是S5,且R”是E7。
因此,在一些实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含聚(β-氨基酯)(PBAE)和/或PBAE-PEG。在特定实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含被负载到或进入PBAE和/或PBAE-PEG纳米粒子或微米粒子的按质量计约1%至约5%的分离的肽。在又其他实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含被负载到或进入PBAE和/或PBAE-PEG纳米粒子或微米粒子的按质量计约6%至约10%的分离的肽。
在又其他实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含聚(β-氨基酯)(PBAE)、PLGA和PEG的组合。在特定实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含被负载到或进入包含聚(β-氨基酯)(PBAE)、PLGA和PEG的组合的粒子的按质量计约1%至约5%的分离的肽。在仍其他实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含被负载到或进入包含聚(β-氨基酯)(PBAE)、PLGA和PEG的组合的粒子的按质量计约6%至约10%的分离的肽。
如本文所用的,术语“纳米粒子”指如下粒子:所述粒子具有在约1nm至约1000nm的范围内的至少一个维度,包括在1nm和1000nm之间的任何整数值(包括约1、2、5、10、20、50、60、70、80、90、100、200、500和1000nm以及在中间的所有整数和整数之间的分数)。在一些实施方案中,纳米粒子具有至少一个维度,例如,约100nm的直径。在一些实施方案中,纳米粒子具有约200nm的直径。在其他实施方案中,纳米粒子具有约500nm的直径。在又其他实施方案中,纳米粒子具有约1000nm(1μm)的直径。在这样的实施方案中,粒子还可称为“微米粒子”。因此,术语“微米粒子”包括具有在约1微米(μm),即1×10-6米至约1000μm的范围内的至少一个维度的粒子。如本文所用的术语“粒子”旨在包括纳米粒子和微米粒子。在一些实施方案中,微米粒子是在1-5μm之间。在其他实施方案中,微米粒子是3-10μm。在一些其他实施方案中,微米粒子是10-20μm。在另外的实施方案中,微米粒子和纳米粒子呈球形形状。在又另外的实施方案中,微米粒子和纳米粒子具有非球形形状。在一些实施方案中,粒子具有长轴与短轴的纵横比在2和10之间的椭球形状。
在一些实施方案中,三维微米粒子或纳米粒子包含具有以下特征中的一个或更多个的材料:(i)一个或更多个可降解的键;(ii)拉伸模量;和(iii)玻璃化转变温度,其使得包含三维微米粒子或纳米粒子的材料在室温和/或体温下是固体。在其他实施方案中,可降解的键选自由以下组成的组:酯键、二硫键、酰胺键、酸酐键和易受酶促降解的键。
在特定实施方案中,微米粒子或纳米粒子包含选自由以下组成的组的生物可降解聚合物或聚合物的共混物:聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(β-氨基酯)(PBAE)、聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA),聚乳酸(PLA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)和聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)。在其他实施方案中,本领域使用的不降解的聚合物,诸如聚苯乙烯与来自以上的可降解的一个聚合物或多个聚合物共混合以创造共聚物系统。因此,在一些实施方案中,不可降解的聚合物与生物可降解的聚合物共混合。
如本文所用的,“生物可降解的”组合物是如下那些:当其被导入细胞中时,通过细胞机器或通过水解被分解成细胞可重复使用或处理而对细胞没有显著毒性作用的组分(即,当在体外将该组分添加至细胞时少于约20%的细胞被杀死)。组分优选地不引起体内炎症或其他副作用。在某些优选的实施方案中,被依赖分解生物可降解的组合物的化学反应未被催化。
在一些其他实施方案中,微米粒子或纳米粒子是生物相容的。如本文所用的术语“生物相容的”,旨在描述对细胞无毒的组合物。如果它们在体外加入至细胞导致小于或等于20%的细胞死亡,且它们在体内的施用不引起炎症或其他这样的副作用,则组合物是“生物相容的”。
本领域普通技术人员将理解,适合于与本发明公开的方法一起使用的纳米粒子和微米粒子可存在于多种形状,包括,但不限于,球状体、棒条体、圆盘形、锥体、立方体、圆柱体、纳米螺旋体(nanohelixes)、纳米弹簧、纳米环、棒条形粒子、箭头状粒子、泪滴状粒子、四角锥体形粒子、棱柱形粒子,以及多个其他几何形状和非几何形状。
C.一般术语
为了清楚起见,其他一般术语描述如下。序列同一性通常使用序列分析软件来测量(例如,the Genetics Computer Group,University of Wisconsin BiotechnologyCenter,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705的序列分析软件包BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)。这样的软件通过对各种置换、缺失和/或其他修饰分配同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守置换通常包括在以下组内的置换:甘氨酸、丙氨酸;缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸;天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺;丝氨酸、苏氨酸;赖氨酸、精氨酸;和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中,BLAST程序可与指示密切相关序列的e-3和e-100之间的概率评分一起使用。
在两个核酸序列或多肽序列的上下文中“序列同一性”或“同一性”包括参考如下两个序列中的残基:当在指定的比较窗上比对最大相应时所述两个序列是相同的,且可考虑添加、缺失和置换。当序列同一性百分比关于蛋白使用时,应当认识到,不相同的残基位置通常因保守氨基酸置换的不同而不同,其中氨基酸残基被置换为具有相似化学特性(例如,电荷或疏水性)的其他氨基酸残基并因此无毒改变分子的功能特性。当序列在保守置换方面不同时,序列同一性百分比可被向上调整以校正置换的保守性。因这样的保守置换不同而不同的序列被称为具有序列相似性。用于做出该调整的方法是本领域技术人员熟知的。通常,这涉及对保守置换评分作为部分错配而不是完全错配,由此增加序列同一性百分比。因此,例如,当相同的氨基酸被给予评分1,且非保守置换被给予评分零时,保守置换被给予零和1之间的评分。保守置换的评分,例如,根据Meyers和Miller,ComputerApplic.Biol.Sci.,4:11-17,1988的算法来计算,例如,如在程序PC/GENE中实现的(Intelligenetics,Mountain View,Calif,USA)。
“序列同一性百分比”意指通过在比较窗上比较两个最佳比对序列确定的值,其中多核苷酸序列在比较窗中的部分与用于两个序列的最佳比对的参考序列(其不包括添加、置换或缺失)相比可包括添加、置换或缺失(即,缺口)。百分比如下计算,通过确定两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目,以产生匹配位置的数目,将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目,并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。
在多核苷酸的上下文中术语“基本同一性”或以其多种语法形式的“同源性”意指多核苷酸包含如下序列,所述序列使用利用标准参数描述的一种比对程序与参考序列相比具有期望的同一性,例如,至少60%同一性,优选地至少70%序列同一性,更优选地至少80%,仍更优选地至少90%且甚至更优选地至少95%。本领域技术人员将认识到,这些值可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等被适当地调整,以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的基本同一性通常意指至少60%、更优地选至少70%、80%、85%、90%、且甚至更优选地至少95%的序列同一性。
“参考序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体;例如,全长cDNA或基因序列或的区段,或完整cDNA或基因序列。对于多肽,参考多肽序列的长度将通常是至少约5个、10个或15个氨基酸,优选地至少约20个氨基酸,更优选地至少约25个氨基酸,且甚至更优选地约35个氨基酸,约50个氨基酸,约100个氨基酸或约150个氨基酸。
II.治疗血管生成依赖性疾病和淋巴管生成依赖性疾病的方法
A.代表性实施方案
在一些实施方案中,本发明公开的肽展现出抗血管生成、抗淋巴管生成、抗肿瘤发生和/或抗血管通透性特性。血管生成是指起源于现有的血管的新血管的生长。淋巴管生成是指淋巴管以被认为与血管发育或血管生成相似的方法从头或从预先存在的淋巴管的形成。肿瘤发生是指肿瘤的形成。血管通透性是指允许物质的选择性交换的微血管壁(包括毛细血管壁)的属性。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了用于抑制牵涉细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的方法。该方法包括使细胞与以足以抑制该细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的量的本发明公开的分离的肽或其功能变体接触。细胞的接触可导致牵涉该细胞的附着、迁移、增殖和/或管形成的抑制。在特定的实施方案中,细胞是内皮细胞。
在其他实施方案中,用于抑制牵涉细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的方法包括使该细胞与以足以抑制牵涉该细胞的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的量的分离的肽接触,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列。在另外的实施方案中,接触细胞导致牵涉该细胞的附着、迁移、增殖和/或管形成的抑制。在特定的实施方案中,细胞选自由以下组成的组:内皮细胞、微血管细胞和淋巴细胞。在其他实施方案中,细胞被发现在脂肪组织中,并且该方法减少或防止肥胖。在仍其他实施方案中,细胞是移植的细胞,并且该方法在细胞移植之后减少或防止组织和/或器官排斥。就“细胞移植”而言,它意指该细胞从一个身体被移动至另一个身体。
在一些实施方案中,分离的肽在接触细胞之前被负载到或负载进纳米粒子或微米粒子。在其他实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含PLGA和/或PLGA-PEG。
本发明公开的主题的方法可在体内被实践,作为用于治疗涉及血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的疾病或紊乱的治疗方法,或作为预防血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生的预防方法。同样地,该方法可在体外被实践作为研究血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生对细胞的影响的研究工具。该方法还可被离体实践用于治疗或研究目的。
“接触”意指导致本发明公开的主题的至少一种分离的肽物理接触至少一个细胞的任何行动。因此,它可包括使细胞暴露于足以导致至少一种分离的肽与至少一个细胞接触的量的分离的肽。该方法可通过如下体外或离体被实践:通过在受控环境诸如培养皿或管中引入,且优选地混合分离的肽和细胞。该方法可在体内实践,在该情况下接触手段使受试者中的至少一个细胞暴露于本发明公开的主题的至少一种分离的肽,诸如经由任何适合的途径将分离的肽施用至受试者。根据本发明公开的主题,接触可包括在远离待接触的细胞的位点使分离的肽引入、暴露等,并允许受试者的身体机能,或天然(例如,扩散)或人为引入(例如,旋转)的流体的运动,导致分离的肽和细胞接触。
在一些实施方案中,本发明公开的主题提供了用于治疗患有与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的受试者,或预防或延迟受试者发展与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的方法,该方法包括:以足以治疗、延迟或预防受试者中疾病的量将本发明公开的分离的肽或其功能变体施用至受试者。
在特定的实施方案中,本发明公开的主题提供了用于治疗患有与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的受试者,或预防或延迟受试者发展与血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生相关的疾病的方法,所述方法包括:将分离的肽以足以治疗、延迟或预防所述受试者中所述疾病的量施用至所述受试者,所述分离的肽包含与LRRFSTAPFAFIDINDVINF(SEQ ID NO:1)至少85%同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中,受试者是人。在其他实施方案中,受试者非人类。
代表性疾病包括是血管生成依赖性疾病、淋巴管生成依赖性疾病、肿瘤发生依赖性疾病和或血管通过性依赖性疾病的那些。因此,在一些实施方案中,疾病是癌症。在其他实施方案中,癌症选自由以下组成的组:乳腺癌、肺癌、成胶质细胞瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、头部癌和颈部癌。在仍其他实施方案中,方法抑制在肿瘤内或周围的血管生成、淋巴管生成、血管通透性和/或肿瘤发生。在另外的实施方案中,肿瘤是原发性肿瘤或建立的转移性肿瘤。在仍另外的实施方案中,方法抑制转移的建立或抑制癌症的进一步转移。在其他实施方案中,方法抑制肿瘤细胞通过血管系统和/或淋巴管系统播散。
在一些实施方案中,方法抑制手术期间淋巴管生成、血管生成和/或肿瘤发生,以减少或防止肿瘤再生长和转移。在其他实施方案中,该方法抑制手术后,在原发性肿瘤的手术完全或部分切除之后的淋巴管生成、血管生成和/或肿瘤发生,从而减少或防止肿瘤再生长和转移。因此,在一些实施方案中,方法抑制手术期间和/或手术后的淋巴管生成、血管生成和/或肿瘤发生。
在仍另外的实施方案中,方法抑制淋巴管生成,从而减少或预防在例如以皮肤移植物、骨移植物和其他组织和器官移植之后的组织和器官排斥。
在一些实施方案中,方法抑制脂肪组织中的血管生成和/或淋巴管生成,从而减少或防止肥胖。
在一些实施方案中,疾病涉及眼部血管生成或糖尿病性视网膜病。在其他实施方案中,疾病选自由以下组成的组:年龄相关性黄斑变性、黄斑水肿、新血管形成性青光眼、增殖性糖尿病性视网膜病变和早产儿视网膜病变。
在另外的实施方案中,分离的肽在施用至受试者之前被负载到或负载进纳米粒子或微米粒子。在仍另外的实施方案中,纳米粒子或微米粒子包含PLGA和/或PLGA-PEG。在其他实施方案中,按质量计约2%至约5%的分离的肽被负载到或进入PLGA纳米粒子或微米粒子。在又其他实施方案中,按质量计约6%至约10%的分离的肽被负载到或进入PLGA和/或PLGA-PEG纳米粒子或微米粒子。
在一些实施方案中,分离的肽与至少一种其他抗血管生成剂组合被施用。在特定实施方案中,至少一种其他抗血管生成剂选自由以下组成的组:阿柏西普、兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐单抗,及其组合。在某些实施方案中,本发明公开的主题提供了分离的肽在治疗与血管生成、淋巴管生成、肿瘤发生和/或血管通透性相关的疾病中的用途。用途是特别用于抑制血管生成、淋巴管生成、肿瘤发生和/或血管通透性的体内治疗或预防方法。某些实施方案提供了分离的肽在制备用于医疗用途的组合物,诸如药物或治疗组合物中的用途。通常,分离的肽的用途是其与其他物质组合以制备医学组合物。
根据本公开内容的肽在宽的剂量范围内有效。例如,在治疗成年人中,每天从0.01至1000mg、从0.5至100mg、从1至50mg和每天从5至40mg的剂量是可使用的剂量的实例。非限制性剂量是每天10至30mg。确切的剂量将取决于施用途径、其中化合物被施用的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。
B.一般术语
就“疾病”而言意指损害或干扰细胞、组织或器官的正常机能的任何状况、功能障碍或紊乱。
在动物中的“癌症”是指拥有致癌细胞的典型特征的细胞的存在,致癌细胞的典型特征例如,不受控制的增殖、专门化功能的损失、永生、显著转移潜能、抗凋亡活性的显著增加、快速生长和增殖速率以及某些特征形态和细胞标志物。在一些情况下,癌细胞将呈肿瘤的形式;这样的细胞可局部存在于动物内,或在血流中循环作为独立的细胞,例如,白血病细胞。
就“血管形成”而言意指动态过程,其包括一个或多个血管发育和/或成熟的步骤,诸如血管生成、血管发生、不成熟的血管网的形成、血管重塑、血管稳定化、血管成熟、血管分化或功能性血管网络的建立。
就“血管生成”而言意指起源于干细胞、成血管细胞或其他前体细胞的新血管的发育。
就“血管稳定性”而言意指血管网络的保持。
就“瘤形成(neoplasia)”而言,意指由以下引起或导致以下的疾病:不适当高水平的细胞分裂、不适当地低水平的凋亡或两者。实体瘤、造血系统紊乱和癌症是瘤形成的实例。
如本文所用的“肿瘤”是指所有的赘生性细胞生长和增殖,不论恶性或良性,以及所有的癌前和癌变细胞和组织。
如本文所用的,术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”、“治疗(treatment)”等是指减少或改善紊乱和/或与其其相关的症状。将理解,尽管不排除,治疗紊乱或状况不要求紊乱、状况或与其相关的症状完全被消除。
如本文所用的,术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”、“预防(prevention)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等是指减少受试者发展紊乱或状况的概率,所述受试者不具有,但处于发展紊乱或状况的风险或易于发展紊乱或状况。
就“减少”而言意指如通过领域已知的标准方法诸如本文中描述的那些方法检测的参数(例如,血管形成)的减少。如本文所用,减少包括10%的变化,优选地25%的变化,更优选地40%的变化,并且甚至更优选地50%或更大的变化。
通过本发明公开的方法在其许多实施方案中治疗的受试者期望地是人受试者,尽管应该理解,本文描述的方法关于所有脊椎动物物种是有效的,所述所有脊椎动物物种旨在被包括在术语“受试者”中。因此,“受试者”可包括用于医疗目的,诸如用于现存状况或疾病的治疗或用于状况或疾病的发作的预防性治疗的人受试者,或用于医疗目的、兽医目的或发育目的的动物受试者。适合的动物受试者包括哺乳动物,哺乳动物包括但不限于,灵长类动物,例如人、猴、猿等;牛科动物,例如,家牛、公牛等;羊(ovine),例如,绵羊(sheep)等;如羊(caprine),例如,山羊(goat)等;猪类(porcines),例如,猪、畜牧猪(hogs)等;马科动物(equines),例如,马、驴、斑马等;猫科动物,包括野生猫和家养猫;犬类(canine),包括狗;兔类动物,包括家兔、野兔等;和啮齿类动物,包括小鼠、大鼠等。动物可以是转基因动物。在一些实施方案中,受试者是人,包括但不限于,胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成年受试者。此外,“受试者”可包括患有或怀疑患有状况或疾病的患者。因此,术语“受试者”和“患者”在本文可互换地使用。
在治疗和/或诊断应用中,本公开内容的组合物可被配制用于多种施用模式,包括全身施用及局部外用或局部施用。技术和制剂通常可发现于Remington:The Science andPractice of Pharmacy(第20版)Lippincott,Williams&Wilkins(2000)中。为了有助于生物利用度,本公开内容的组合物可以以纳米粒子或微米粒子来递送。
药学上可接受的盐通常是本领域普通技术人员熟知的,并且可包括,例如,但不限于,乙酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)、苯磺酸盐(besylate)、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、溴化物、依地酸钙、carnsylate、碳酸盐、柠檬酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基胺基苯吡酸盐、己基间苯二酚盐、海巴明、氢溴酸盐、盐酸盐、羟基萘甲酸盐、碘化物、羟乙基磺酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐或茶氯酸盐。其他药学上可接受的盐可发现于,例如,Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版)Lippincott,Williams&Wilkins(2000)中。药学上可接受的盐包括,例如,乙酸盐、苯甲酸盐、溴化物、碳酸盐、柠檬酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、磷酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐,或酒石酸盐。
取决于被治疗的具体状况,这样的试剂可被配制成液体或固体剂型且被全身或局部施用。试剂可例如,以本领域技术人员已知的时间-或持续-低释放形式被递送。用于配制和施用的技术可发现于Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版)Lippincott,Williams&Wilkins(2000)中。适合的途径可包括口服、含服,通过吸入喷雾,舌下、直肠、经皮、阴道、经粘膜、经鼻或肠施用;非肠道递送,包括肌内、皮下、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、静脉内、关节内、胸内、滑膜内、肝内、病灶内、颅内、腹腔内、鼻内或眼内注射或其他递送模式。
对于注射,本公开内容的试剂可在水溶液中,诸如在生理学上兼容的缓冲液诸如Hank氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液中来配制和稀释。对于这样的经粘膜施用,在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透液。这样的渗透液通常是本领域熟知的。
使用药学上可接受的惰性载体将用于实践本公开内容的本文公开的组合物配制为适用于全身施用的剂量在本公开内容的范围内。随着载体和适合的制造实践的适当选择,本公开内容的组合物,特别是配制为溶液的那些,可被非肠道施用,诸如通过静脉注射。组合物可使用本领域熟知的药学上可接受的载体容易地被配制成适合于口服施用的剂量。这样的载体使得本公开内容的组合物被配制为片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液等,用于被治疗的受试者(例如,患者)口服摄入。
对于经鼻或吸入递送,本公开内容的试剂还可通过本领域技术人员已知的方法来配制,并且可包括,例如,但不限于,增溶、稀释、或分散物质的实例诸如,盐水、防腐剂,诸如苄醇、吸收促进剂和碳氟化合物。
适用于本公开内容中使用的药物组合物包括其中活性成分以实现其预期的目的有效量被包含的组合物。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内,特别是根据本文提供的详细公开内容。
除了活性成分以外,这些药物组合物可以含包含有助于将活性组分加工成可被药学上使用的制剂的赋形剂和助剂的适合的药学上可接受的载体。用于口服施用配制的制剂可呈片剂、锭剂、胶囊或溶液的形式。
用于口服用途的药物制剂可通过如下获得:将活性组分与固体赋形剂结合,任选地研磨所得混合物,并且如需要在添加适合的助剂之后加工颗粒混合物,以获得片剂或糖衣丸芯。适合的赋形剂是,特别是填充剂诸如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇;纤维素制剂,例如,玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠(scC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP:聚维酮)。如需要,可添加崩解剂,诸如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐诸如藻酸钠。
糖衣丸芯被提供适合的涂层。为了该目的,可使用浓缩的糖溶液,其可任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇(PEG)和/或二氧化钛、漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或颜料添加至片剂或糖衣丸涂层用于辨识或表征活性化合物剂量的不同组合。
可口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊,以及由明胶和增塑剂,诸如甘油或山梨醇制成的软的密封胶囊。推入配合胶囊可包含与填充剂诸如乳糖,粘合剂诸如淀粉和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中,活性组合物可被溶解或悬浮于适合的液体,诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇(PEG)中。另外,可添加稳定剂。
尽管本文中采用了特定术语,但它们仅用于一般的和描述性的意义,而非用于限制的目的。除非另外定义,否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本发明描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
根据长期以来的专利法惯例,在该申请包括权利要求书中当使用术语“一(a)”“一(an)”和“该(the)”时,指“一个或更多个”。因此,例如,提及“受试者(a subject)”包括多个受试者,除非上下文清楚地是意思相反的(例如,多个受试者)等等。
贯穿该说明书和权利要求书,术语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”被用于在非排他性含义,除非当上下文另有要求时。同样地,术语“包括(include)”和其语法变体旨在非限制,使得列表中项目的列举不排除可被取代或添加至所列项目的其他类似的项目。
为了该说明书以及所附的权利要求书的目的,除非另有说明,在所有的实例中,在说明书和权利要求书中使用的所有表示量、大小、维度、比例、形状、制剂、参数、百分比、数量、特征、及其它数值的数字要理解为由术语“约”修饰,即使术语“约”可能未明确地与该值、量或范围一起出现。因此,除非相反地指示,在以下说明书和所附的权利要求书中列出的数值参数不是精确的且不需要是精确的,但是如所期望的可以是接近的和/或更大或更小,反映了公差、转换因子、四舍五入、测量误差等,以及本领域技术人员已知的其它因素,取决于旨在通过目前公开的主题获得的期望特性。例如,当术语“约”指值时能够用意在于包括与特定的量在一些实施方案中±100%、在一些实施方案中±50%、在一些实施方案中±20%、在一些实施方案中±10%、在一些实施方案中±5%、在一些实施方案中±1%、在一些实施方案中±0.5%、以及在一些实施方案中±0.1%的差异,因为这样的差异对于进行所公开的方法或采用所公开的组合物是适当的。
此外,当术语“约”与一个或更多个数字或数值范围关联使用时,应理解为指所有此类数字,包括范围内的所有数字以及通过延伸所列出的数值以上和以下的边界来涉及的修改。通过端点描述的数值范围包括归入该范围的所有数字例如全部的整数,包括其分数(例如,1至5的描述包括1、2、3、4和5,以及其分数,例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及在该范围内的任何范围。
实施例
以下实施例已被包括以提供本领域普通技术人员用于实践本发明公开的主题的代表性实施方案的指导。根据本公开内容和本领域技术人员的一般水平,本领域技术人员可以理解,以下实施例旨在仅是示例性的,且许多变化、修改和改变可被应用而不偏离本发明公开的主题的范围。以下实施例通过说明的方式而非通过限制的方式来提供。
实施例1
材料和方法
细胞培养中细胞的生长。对于细胞培养中细胞的生长,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、微血管内皮细胞(MEC)和淋巴管内皮细胞(LEC)购自Lonza并根据制造商的建议使用用Bullet试剂盒(EGM-2,Lonza)补充的内皮细胞基础培养基(EBM-2)来保持。将MEC和LEC在微血管内皮细胞生长培养基-2(EGM-2MV,Lonza)中繁殖。乳腺癌细胞、MDA-MB-231由Zaver Bhujwalla博士(JHMI,Radiology and Oncology)来提供。将细胞在用10%FBS和抗生素(1%青霉素/链霉素)补充的RPMI-1640培养基(Gibco,Carlsbad,CA)中繁殖。将细胞在37℃和5%CO2的标准条件下保持并且所有使用的细胞的传代数在2和7之间。
肽合成。肽使用固态合成法来合成且被供给为具有酰胺化的C-末端和在N-末端的胺的TFA盐(New England Peptide,Gardner,MA)。肽的纯度为>95%,并且供应商提供的产品表征(MALDI-TOF、HPLC/MS和HPLC追踪)作为MW和纯度精度的证明。肽由于它们的疏水性被增溶于5%DMSO和水中。溶解的肽的pH被检查,且结果为约pH 7。对于所有实验,将DMSO%保持在以最终DMSO百分比(<0.2%)的无毒阈值(通过DMSO对细胞的毒性曲线确定的),其用作所有实验中的对照。
增殖测定。使用WST-1(Roche,11644807001)增殖试剂的基于比色的增殖测定使用HREC细胞、HUVEC细胞和乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7和SUM149来进行。将2000个细胞/孔铺板在96孔板中,并允许其附着过夜。在接下来的一天,将培养基用包含肽或用于对照的等同DMSO媒介物的完全补充培养基来替换。三天后,将包含肽的培养基用包含WST-1试剂的无血清EBM-2培养基代替并且根据制造商的建议将板孵育四小时。通过测量450nm处的吸光度在Victor V荧光板阅读器(Perkin Elmer,MA)上阅读颜色的变化,颜色的变化是由于起因于四唑鎓盐(tetrazolium salt)WST-1被线粒体琥珀酸-四唑鎓还原酶切割的甲臜染料。创建了活细胞百分比的剂量响应曲线(与未处理但在具有0.2%DMSO的完全培养基中孵育的细胞相比)。测定以至少两个独立的重复进行,并且每一个重复使用一式三份的三个实验来进行。
迁移测定。肽的抑制电势使用基于电阻抗的实时迁移测定系统(RT-CIM,ACEABiosciences,CA)来测量。CIM16孔板(Roche,05665817001)包括由微多孔(8μm)聚碳酸酯膜分隔的顶部室和底部室。该膜用纤维连接蛋白(20μg/mL)来涂覆,且将在有或没有肽的无血清培养基中的45,000个细胞/孔添加至顶部隔室。将具有趋化物(chemoattractant)的培养基(即完全补充的EBM-2)添加至室的底部隔室,并将板在37℃下孵育20小时。传感器集成在膜监测器的底侧并当细胞移动通过该膜时连续记录阻抗变化。RT-CIM技术允许通过监测来源于测量的阻抗的细胞指数容易定量细胞迁移。测定以至少两个独立的重复进行,并且每一个重复使用一式二份的两个实验来进行。乳腺癌细胞MDA-MB-231由于其薄的细长的表型,不适合于RT-CIM型实验,因此迁移的抑制使用划痕型测定(wound healing typeassay)来研究。该测定使用Oris Pro迁移测定(Platypus Technologies,CMA1.101)来进行。简言之,将在完全培养基中的25,000个细胞/孔添加至包含阻断细胞迁移至孔的中心区域的阻塞物的96孔板。允许细胞附着4小时,在其之后去除阻塞物。将细胞用PBS洗涤一次,并将有或没有化合物的完全补充培养基添加至孔。18小时之后,将细胞用钙黄绿素AM(0.5μg/mL)(Invitrogen,CA)染色,并且迁移至孔的中心的细胞使用Nikon显微镜(Eclipse T-100)进行成像;图像用安装在Nikon显微镜上的CCD Sensicam(Cooke Company,MI)来获取。迁移进先前受限区域中的细胞的检测是可能的,由于在板的底部添加检测掩模(detectionmask),其阻碍未迁移的测量细胞。
划痕测定。乳腺癌细胞MDA-MB-231由于其薄的细长的表型,不适合于RT-CIM型实验,因此迁移的抑制使用划痕型测定来研究。该测定使用Oris Pro迁移测定(PlatypusTechnologies,CMA 1.101)来进行。简言之,将在完全培养基中的25,000个细胞/孔添加至包含阻断细胞迁移至孔的中心区域的阻塞物的96孔板。允许细胞附着4小时,在其之后去除阻塞物。将细胞用PBS洗涤一次,并将有或没有化合物的完全补充培养基添加至孔。18小时之后,将细胞用钙黄绿素AM(0.5μg/mL)(Invitrogen,CA)染色,并且迁移至孔的中心的细胞使用Nikon显微镜(Eclipse T-100)进行成像;图像用安装在Nikon显微镜上的CCDSensicam(PCO-TECH,有限公司,Romulus,MI)来获取。迁移进先前受限区域中的细胞的检测是可能的,由于在板的底部添加检测掩模,其阻碍未迁移的测量细胞。
附着测定。与迁移测定相似,肽在细胞附着中的抑制活性使用RT-CIM技术来评估。在这种情况下,将25,000个细胞/孔在肽的存在或不存在下铺板于16孔的E-板(Roche,Basel Switzerland)中。附着通过测量电阻抗的变化经时间(3小时)进行监测,电阻抗是细胞对电极附着的直接测量。测定以至少两个独立的重复进行,并且每一个重复使用一式二份的两个实验来进行。
管形成抑制测定。还对组合物测试它们抑制血管生成中的关键进程管形成的能力。内皮细胞当被铺板在细胞外基质的提取物上时自发地形成管的网络。该体外测定结合附着和迁移的方面,并且它被常规用于血管生成研究(Oliveira-Ferrer等,2008)。抑制管形成的能力是抗血管生成潜能的综合评估。方案由Arnaoutova等描述(2009)并且其由将HUVEC铺板在基底膜提取物的顶部组成。在37℃下温育之后,细胞本身在管的网络中自然重新排列。因此,将50μL/孔基质胶(BD Biosciences,San Jose,CA)铺板于冷的96孔板中并在37℃下孵育30min用于聚合。将15,000个细胞/孔添加至凝胶的顶部,并在肽的存在或不存在下在完全培养基中孵育19小时。图像使用安装在Nikon显微镜(Eclipse T-100)上的CCDSensicam来捕获。测定以至少两个独立的重复来进行,并且每个重复使用三个实验重复来进行且每孔随机选择的区域的一个图像被获取。
肿瘤异种移植。原位乳腺肿瘤使用人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231在SCID小鼠中发起。将每100μL等分试样单细胞悬液的2×106个细胞注入乳房乳腺脂肪垫中。肿瘤在约14-21天内达到75-100mm3的体积。小鼠以相似肿瘤体积(平均值间差异无统计学差异)随机分组并安排在组(每组8只小鼠)中且治疗开始。将肽以10mg/kg的剂量每天一次腹腔内地(i.p.)施用。肿瘤使用卡尺每四天来测量,且肿瘤体积使用式V=ab2/2来计算,其中“a”是较大直径且“b”是较小直径。
TCM-诱导转移模型。在肿瘤接种之前,无胸腺裸鼠(雌性5-6周,18-20g)用50μLTCM或SFM通过颈背皮下地处理2周。在TCM处理2周之后,MDA-MB-231-luc-D3H2LN肿瘤异种移植物在相同动物中建立;细胞(2×106)与50μL完全培养基(用10%FBS补充的RPMI-1640)和50μL基质胶(高浓度,BD Biosciences)混合,并在麻醉(在PBS中的50mg/kg氯胺酮+5mg/kg乙酰丙嗪,50μL/动物,腹腔内地给药)之后注入动物的上部腹股沟乳腺脂肪垫中。原发性肿瘤大小通过使用卡尺来测量,且体积w使用式:V=0.52×a×b2来计算,其中“a”是肿瘤的长轴,且“b”是肿瘤的短轴。动物在腹腔内注射d-萤光素(Caliper 150mg/kg)之后还使用IVIS Xenogen 200光学成像器(Xenogen,Alameda,CA)被每周成像以追踪先前的肿瘤转移。将100μL D-萤光素(两倍稀释)在腹部的两侧腹腔内给药(总计200μL/动物),以防止i.p.注射失败。在4周之后,将腋和肱LN(淋巴结)、肺和脑收获且浸入D-荧光素溶液中3min,并放置在IVIS成像器中以检测离体转移。萤光素酶介导的光子通量通过使用3D分析(Xenogen)来定量,并且平均光子通量从八个肺、八个脑,和14-16个LN来如前所述获得。如动物显示腹腔内转移,腹部器官,包括胃、脾、肾、肝和肠的离体图像使用IVIS成像器来获得。
脉络膜新血管形成(CNV)的小鼠模型。布鲁赫膜的激光光凝诱导破裂(laserphotocoagulation-induced rupture of Bruch’s membrane)用来生成CNV。简言之,将4-5周龄雌性C57BL/6J小鼠用盐酸赛拉嗪(10mg/kg)和盐酸氯胺酮(50mg/kg)麻醉,且瞳孔用1%托吡卡胺(Alcon Labs,有限公司,Forth Worth,TX,USA)进行散大。532-nm二极管激光器光凝的三次烧伤(75μm光斑尺寸、0.1s持续时间、120mW)使用OcuLight GL光凝固器(Iridex,Mountain View,CA,USA)和手持盖玻片作为接触镜片的裂隙灯递送系统递送至每个视网膜。烧伤在视网膜后极的9、12和3点钟位置来进行。在激光光凝时间产生液泡(其指示布鲁赫膜破裂)是获得CNV中的重要因素,因此,仅其中产生液泡的烧伤被包括在该研究中。处理在激光光凝七天之后开始,并包括在解剖显微镜下用Harvard泵微量注射系统(Harvard Apparatus,Holliston,MA)和牵引玻璃微量移液器(pulled glassmicropipette)玻璃体内注射0.1%SP2043(SEQ ID NO:1)(lμL的体积中的lμg)、1%(1μL的体积中的10μg的SP2043(SEQ ID NO:1))或媒介物。将一些小鼠安乐死用于基线测量。在激光十四天之后,剩余小鼠用来测量CNV在布鲁赫膜破裂部位上的量。在布鲁赫膜破裂两周之后,将小鼠麻醉并灌注了荧光素标记的葡聚糖(2×106平均分子量,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)且脉络膜平片(flat mount)如先前所述来制备。简言之,将眼睛取出,在10%磷酸盐缓冲的福尔马林中固定1h,并将角膜和晶状体取出。将整个视网膜小心地从眼杯(eyecup)剖离,并然后在所有四个象限中由眼杯的边缘至中纬线做出径向切口,并平面安装在Aquamount(Polysciences,Warrington,PA)中。平片通过荧光显微镜法使用Axioskop显微镜(Zeiss,Thornwood,NY,USA)来检查且图像使用3CCD彩色摄像机(IK-TU40A,Toshiba,Tokyo,Japan)和帧获取器(frame grabber)来数字化。Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics,Silver Spring,MD,USA)被用来测量每个CNV病变的区域。统计学比较使用ANOVA和Bonferroni做出。
CNV消退模型。在麻醉小鼠并用1%托吡卡胺散大其瞳孔之后,将C57BL/6J小鼠双眼的布鲁赫膜用激光破裂。七天后,将一些小鼠处死,以建立基线新血管形成。在当时,将1μg SP2043(SEQ ID NO:1)施用在其他小鼠的一只眼睛中且媒介物在对侧眼睛中。七天后,将所有动物灌注荧光素标记的葡聚糖,取出眼睛,解剖视网膜并在作出径向切口之后进行平面安装,并测量荧光。图像使用3色电荷耦合器件(3-color charge-coupled device)摄像机和帧获取器来数字化并且血管过度形成的区域通过图像分析软件来定量。
具有VEGF诱导的新血管形成的转基因小鼠。在出生后的第14天,将半合子rho/VEGF小鼠在一只眼睛中给予眼内注射1μL 5%的DMSO/水,1μL包含0.1μg或1μg SP2043(SEQID No:1)的5%的DMSO/水。眼内注射在解剖显微镜下用Harvard泵微量注射系统(HarvardApparatus,Holliston,MA)和牵引玻璃微量吸液器来完成。在出生后第21天,将每眼视网膜下新血管形成(NV)的总面积定量。简言之,将小鼠麻醉并灌注了1mL包含25mg/mL荧光素标记的葡聚糖(平均分子量2×106,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的PBS。将眼睛取出并在10%磷酸盐缓冲的福尔马林中固定1小时。将角膜和晶状体取出,并且将整个视网膜小心地从眼杯剖离,在所有4个象限中从视网膜的边缘径向切至中纬线,并平面安装在封固剂(Aquamount;Polysciences,Warrington,PA)中以光感受器朝上。视网膜通过荧光显微镜以200×放大倍率来检查,其提供窄的视野深度使得当聚焦于视网膜的外表面上的NV时,剩余视网膜血管不聚焦,允许容易圈定NV。相应于体内视网膜下腔的视网膜外边缘是很容易识别的,并因此存在从一个载玻片至另一个载玻片焦平面的标准化。图像使用3电荷耦合器件(CCD)彩色摄像机和帧获取器数字化。通过使用图像分析软件(Image-Pro Plus;MediaCybernetics,Silver Spring,MD),关于处理组被屏蔽的研究人员允许该软件如先前所述识别和计算每眼视网膜NV的总面积。
小鼠眼睛中的血管通透性:将小鼠在一只眼睛中玻璃体内注入1μg SP2043(SEQID NO:1),且媒介物注入对侧眼睛中,并将媒介物对照注入成年双重转基因Tet/视蛋白/VEGF小鼠的另一个眼睛中。三天后,将小鼠在饮用水中给予2mg/mL强力霉素3天。在当时,将动物麻醉并将其瞳孔散大作为标准眼底镜检查。通过使用Micron II视网膜成像的眼底成像和使用公开的方案的光学相干断层成像检查眼睛,以比较在两个处理下具有视网膜脱离的动物的数目。
兔眼睛中的血管通透性测量:在第0天,将SP2043肽(SEQ ID NO:1;50μg)注入荷兰束带色素兔(Dutch-belted pigmented rabbit)的玻璃体内并将媒介物注入对侧眼睛中。在第3天,将50μg的VEGF(人)注入两只眼睛中。在第10天,将荧光素全身注入兔中并且2h后在视网膜前面5mm至8mm的荧光通过Fluoroton Master FM-2眼荧光光度计来测量。
用于肽制剂的材料:PLGA[聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯);三种配方(formulation)-丙交酯:乙交酯(65:35),MW 40,000-75,000;丙交酯:乙交酯(72:25),MW 76,000-115,000;丙交酯:乙交酯(85:15),MW 190,000-240,000],DCM[二氯甲烷],DMSO[二甲基亚砜]和DMF[N,N二甲基甲酰胺]购自Sigma(St.Louis,MO)。PVA[聚(乙烯醇);Mw 25,000]购自Polysciences(Warrington,PA)。PLGA-PEG[甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙交酯-共-乙交酯);PEG:PLGA 5:20kDa;1:1LA:GA)购自PolySciTech(West Lafayette,IN)。PBAE[聚(β-氨基酯)]如先前所述来合成。NaAc缓冲液(pH=5)[乙酸钠缓冲液]购自Invitrogen(GrandIsland,NY)。
负载肽的PLGA微米粒子:将PLGA首先在试管中以期望的浓度(通常20mg/mL或40mg/mL)溶解于DCM中,并涡旋以充分溶解。将DMSO中的肽储备溶液(通常20mg/mL)用微量移液器吸取至PLGA/DCM溶液中。肽与PLGA的质量比可变化;普通制剂是1:50的肽:PLGA。对于空白的微米粒子,使用移液器等同体积的仅DMSO。将混合物在试管中在冰上超声处理。超声处理用等于约5-10W的“30”的振幅设置进行20秒。将该初级乳剂立刻倒入50mL 1%PVA溶液中并以3.6-3.8krpm均化1分钟。然后将全体积转移至100mL 0.5%PVA溶液,并在化学通风橱中搅拌3小时。进行三个洗涤步骤。对于每个洗涤步骤,将微米粒子溶液在4℃,4krpm下离心5分钟,并然后去除上清液。随后,添加40mL冷冻的水,重悬微米粒子沉淀物并重复洗涤步骤。在最后离心步骤之后,添加5mL的水以重悬样品。将样品快速冷冻在液氮中,并立即放置在冷冻干燥器中。冻干后,所有微米粒子储存在-20℃。
负载肽的PLGA纳米粒子:将PLGA首先在试管中以期望的浓度(通常20mg/mL或40mg/mL)溶解于DCM中,并涡旋以充分溶解。将DMSO中的肽储备溶液(通常20mg/mL)用微量移液器吸取至PLGA/DCM溶液中。肽与PLGA的质量比可变化;普通制剂是1:50的肽:PLGA。对于空白的纳米粒子,使用移液器吸取等同体积的仅DMSO。将混合物在试管中在冰上超声处理。超声处理用等于约5-10W的“30”的振幅设置进行20秒。将该初级乳剂立刻倒入50mL 1%PVA溶液中并以“60”振幅设置超声处理2分钟。然后将全体积转移至100mL 0.5%PVA溶液中,并在化学通风橱中搅拌3小时。进行三个洗涤步骤。对于每个洗涤步骤,将微米粒子溶液在4℃,17krpm下离心10分钟,并然后去除上清液。随后,添加30mL冷冻的水,重悬微米粒子沉淀物并重复洗涤步骤。在最后离心步骤之后,添加5mL的水以重悬样品。将样品快速冷冻在液氮中,并立即放置在冷冻干燥器中。冻干后,所有微米粒子储存在-20℃。
负载肽的PLGA-PEG纳米粒子:首先将PLGA-PEG、PLGA-PEG-马来酰亚胺或缀合至配体的PLGA-PEG以10mg/mL(或其他期望的浓度)溶解于DMF中。然后将肽(2043,2043-IRD800;以20mg/mL在DMF中的储备溶液)添加至PLGA-PEG得到2%(或其他期望的比)的最终肽w/w%。对于空白的纳米粒子,将等同体积的仅DMF添加至PLGA-PEG。将PLGA-PEG/肽/DMF溶液逐滴添加至在搅拌板上旋转的Milli-Q水至1:10有机:水的最终体积比。将混合物在化学通风橱下旋转4小时。粒子使用Amicon Ultra-15离心管(Millipore)在4℃下洗涤两次,每次旋转10min。将浓缩的粒子在4℃下储存于水中,或与不同量的蔗糖(Sigma-Aldrich)冻干。
聚合物-肽复合物:将每种类型的聚合物(PBAE)和肽(SP2043;SEQ ID NO:1)取决于期望的PBAE:2043质量比(从1:1至100:1)以不同的浓度在NaAc缓冲液中稀释。将该PBAE溶液用移液器吸取至2043溶液并在室温下孵育5分钟。粒子通过Nanosight纳米粒子追踪分析、动态光散射和/或透射电子显微镜来表征。
PLGA和PLGA-PEG粒子表征:对于尺寸,微米粒子或纳米粒子首先在水或PBS中被稀释至1mg/mL,并然后通过使用适当的DLS、NTA、SEM或TEM定尺寸。对于载量,将粒子首先溶解于DMSO中。对样品的部分,将DMSO样品添加至更大水体积,以沉淀PLGA。对于标记的肽,Biotek Synergy 2板阅读器被用来测量样品和标记的肽唯一标准的荧光。对于未标记的2043样品,PAGE和银染被用来定量肽。
微米粒子的SEM成像和ImageJ量化:将冻干的粒子放置在碳带(ElectronMicroscopy Sciences,Hatfield,PA)上,并放置在铝制支架(aluminum mount)上。将样品喷溅金钯,并且SEM成像用LEO/Zeiss FESEM(Johns Hopkins School of Medicine)来进行。
实施例2
SP2043肽(SEQ ID NO:1)
发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC;图1)和视网膜内皮细胞(HREC;图2)的增殖、迁移和附着。另外,发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)(25μΜ)抑制HUVEC管形成(图3,图A和B)和微血管内皮细胞(MEC)管形成(图3,图C和D)。此外,发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制淋巴管内皮细胞附着(LEC;图4)和LEC管形成(图5)。
还发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制MEC和LEC细胞中的肝细胞生长因子(HGF)和胰岛素生长因子1(IGF1)的体外信号传导(图6)。另外,发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和SUM149以及雌激素受体阳性细胞系MCF-7的体外增殖(图7)。此外,发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制MDA-MB-231细胞中的HGF信号传导(图8)。
SP2043肽(SEQ ID NO:1)还显示了通过抑制MDA-MB-231原位肿瘤在SCID小鼠中的生长的体内抑制(图9)。在将SP2043肽(SEQ ID NO:1)注入小鼠33天之后,肿瘤的生长被抑制约82%(使用20mg的SP2043/kg用腹腔内注射)。还发现SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制体内c-Met的磷酸化和血管生成(图10)。SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制血管生成(如通过用于免疫组织化学(IHC)的凝集素染色所见)和淋巴管生成(如通过体内LYVE-1染色所见)(图11)。SP2043在肿瘤条件培养基预处理的转移模型中抑制MDA-MB-231-luc肿瘤转移至多个器官,这通过来自肿瘤细胞的光子通量得到(图12A)。SP2043肽(SEQ ID NO:1)还抑制MDA-MB-231-luc肿瘤转移至淋巴结(如对于人细胞的存在通过用波形蛋白抗体染色所见)(图12的B)。
SP2043肽(SEQ ID NO:1)的影响还见于人眼部疾病诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑水肿(ME)和糖尿病性黄斑水肿(DME)的眼模型中。SP2043肽(SEQ ID NO:1)在激光诱导的脉络膜新血管形成(CNV)模型中抑制新血管形成比阿柏西普更有效力(图13的A-B),并在rho VEGF小鼠模型中抑制新血管形成比对照更有效力(图13的C-E)。另外,SP2043肽(SEQ ID NO:1)导致激光诱导的CNV模型中小鼠眼睛新血管系统的消退(图14)此外,SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制Tet/视蛋白/VEGF小鼠模型中血管渗漏(图15的A-B)。此外,SP2043肽(SEQ ID NO:1)抑制兔眼睛中VEGF介导的血管通透性(图16)。
实施例3
在微米粒子中的SP2043肽(SEQ ID NO:1)
本发明公开的分离的肽可被配制于并用于微米粒子或纳米粒子中。将SP2043肽(SEQ ID NO:1)配制到PLGA微米粒子中以能够长期缓释并通过扫描电子显微镜(SEM)成像来示出(2%负载的;图17)。图18的A图示出了负载2%和5%SP2043的PLGA微米粒子的尺寸的一个代表性的实例。微米粒子的尺寸用SEM图像的ImageJ(Rasband,1997-2012)来测量。结果示出了具有SP2043肽(SEQ ID NO:1)的负载不显著影响粒径分布。在一些实施方案中,负载约2%至5%肽的PLGA被用于本发明公开的方法。对于体内使用,按质量计5%SP2043肽(SEQ ID NO:1)相当于在1μL注射的微米粒子溶液中的1μg SP2043肽(SEQ ID NO:1)。负载2%和5%SP2043肽(SEQ ID NO:1)的微米粒子的ζ电势(表面电荷)在Malvern Zetasizer(Malvern Instruments,有限责任公司,Malvern,Worcestershire,UK;图18B)上来测量。结果显示,在对照(空白)和负载肽的微米粒子之间的表面电荷中无显著差异。
SP2043肽(SEQ ID NO:1)的标记的肽类似物从PLGA微米粒子的控释经六个月在原位生理条件(PBS 37℃下;图19)下被观察到。另外,没有任何标签或修饰的SP2043肽(SEQID NO:1)在PLGA微米粒子中在生理条件下的原位控释也被观察到(图20)。
图21示出了,掺入按重量计2%的SP2043肽(SEQ ID NO:1)(左)和按重量计5%2043(右)的PLGA微米粒子的SEM成像。SP2043肽(SEQ ID NO:1)还可被包封进纳米粒子且这些粒子(微米或纳米)可具有不同的非球形,诸如椭球形以及球形(图22)。
包封SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA85/15微米粒子在激光诱导小鼠模型中脉络膜新血管形成后的小鼠眼睛中引起消退(图23)。另外,这些微米粒子在激光诱导的湿性AMD小鼠模型中随时间抑制新血管形成(图24)。包封2043的PLGA85/15微米粒子显示在单玻璃体内注射后体内效力持续至少3个月。
包含SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA 65/35微米粒子在激光诱导的湿性AMD小鼠模型中随时间抑制新血管形成(图25)。新血管形成被SP2043肽(SEQ ID NO:1)的抑制还见于兔模型中(图26)。
图27示出了在rho/VEGF转基因小鼠中的包封SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA(85/15)。图28示出了SP2043肽(SEQ ID NO:1)可与其他抗血管生成剂,诸如阿柏西普组合使用,以增加效应,如在小鼠激光诱导的脉络膜新血管形成模型中所见。
可将聚合物诸如PBAE添加至SP2043以将其自组装成约100nm纳米粒子(图29)。发现当SP2043肽(SEQ ID NO:1)与聚合物一起自组装时,粒径和纳米粒子浓度更大;图30示出了包封SP2043肽(SEQ ID NO:1)的PLGA和PLGA-PEG纳米粒子的效应。
全身静脉注射的包含SP2043肽(SEQ ID NO:1)的纳米粒子或游离肽积累在肿瘤以及其他器官中(图31)。
用于定量SP2043肽(SEQ ID NO:1)的方法包括电泳和用SimplyBlue染色(图32,图A)随后是质谱(图32,图B)。
实施例4
讨论
本发明公开的主题提供了模拟肽,所述模拟肽可用于不同形式的癌症,眼部疾病,诸如年龄相关性黄斑变性,和其他血管生成依赖性疾病和淋巴管生成依赖性疾病。特别地,活性模拟肽SP2043(SEQ ID NO:1)在体外血管生成和淋巴管生成测定中被测试。更具体地,SP2043肽(SEQ ID NO:l)显示在血液内皮细胞增殖、迁移、附着和管形成测定中的抗血管生成活性,以及在乳腺癌异种移植物模型和年龄相关性黄斑变性模型中的体内抗血管生成活性和抗肿瘤发生活性。SP2043肽(SEQ ID NO:1)还具有抗淋巴管生成特性。另外,显示了SP2043肽(SEQ ID NO:1)可被配制于和用于微米粒子或纳米粒子。
参考文献
在说明书中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表示本发明公开的主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献在此通过引用并入,其程度如同每个单独出版物、专利申请、专利和其他参考文献被具体和单独指明通过引用并入的相同程度。将理解,尽管一些专利申请、专利和其他参考文献在本文中被提及,这样的参考文献并不构成任何这些文件形成本领域公知常识的部分的承认。
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尽管出于清楚理解的目的,前述主题已在某些详细内容中通过说明和实例的方式被描述,本领域技术人员将理解某些改变和修饰可在所附权利要求书的范围内被实践。
序列表
<110> 亚历山大·波佩尔
尼兰贾·B·潘迪
艾萨克·李
乔丹·J·格林
朗·B·史牟莉
<120> 生物模拟肽和生物可降解的递送平台
<130> 111232-00291.P12423-02
<150> 61/832,290
<151> 2013-06-07
<160> 4
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于人胶原蛋白IV型蛋白的人工序列
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<213> 人工序列
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<222> (1)..(20)
<223> Xaa是任何天然或非天然的氨基酸
<400> 4
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20
Claims (10)
1.一种分离的肽,所述分离的肽由氨基酸序列LRRFSTXPXXXXDINDVXNF组成,其中X在位置7上是M、A或G;X在位置9上是F、A、Y或G;X在位置10上是M、A、G、dA或Nle;X在位置11上是F、A、Y、G或4-ClPhe;X在位置12和位置18上是Abu、G、S、A、V、T、I、L或AllyGly,且所述氨基酸序列与LRRFSTAPFAFIDINDVINF至少85%相同、任选地具有一个或更多个D-氨基酸,其中所述分离的肽展现出抗血管生成、抗血管通透性、抗肿瘤发生和/或抗淋巴管生成特性。
2.一种组合物,所述组合物包含药学上可接受的载体和有效量的权利要求1所述的分离的肽。
3.一种试剂盒,所述试剂盒包含权利要求1所述的分离的肽。
4.一种纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含权利要求1所述的分离的肽。
5.如权利要求4所述的纳米粒子或微米粒子,其中所述纳米粒子或微米粒子包含聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇。
6.如权利要求5所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇纳米粒子或微米粒子的按质量计2%至5%的所述分离的肽。
7.如权利要求5所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进聚乳酸-羟基乙酸共聚物和/或聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇纳米粒子或微米粒子的按质量计6%至10%的所述分离的肽。
8.如权利要求4所述的纳米粒子或微米粒子,其中所述纳米粒子或微米粒子包含聚(β-氨基酯)和/或聚(β-氨基酯)-聚乙二醇。
9.如权利要求8所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进所述聚(β-氨基酯)和/或聚(β-氨基酯)-聚乙二醇纳米粒子或微米粒子的按质量计1%至5%的所述分离的肽。
10.如权利要求8所述的纳米粒子或微米粒子,所述纳米粒子或微米粒子包含被负载到或负载进聚(β-氨基酯)和/或聚(β-氨基酯)-聚乙二醇纳米粒子或微米粒子的按质量计6%至10%的所述分离的肽。
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