KR20190066040A - Tie2 신호전달을 활성화시키기 위한 화합물 및 방법 - Google Patents

Tie2 신호전달을 활성화시키기 위한 화합물 및 방법 Download PDF

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KR20190066040A
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니란잔 비. 판데
아담 미란도
알렉산더 에스. 포펠
조던 제이. 그린
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아스클리픽스 테라퓨틱스, 인크.
더 존스 홉킨스 유니버시티
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Abstract

본 발명은, 각종 양상 및 실시형태에 있어서, 1종 이상의 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드를 투여함으로써 Tie2-관련 혈관 투과성을 치료하기 위한 방법을 포함하고, 1종 이상의 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드를 포함하는 Tie2-관련 혈관 투과성을 치료하기 위한 조성물을 포함한다. 이러한 펩타이드는 안지오포이에틴 2(Ang2)의 Tie2 작용제 활성도를 촉진시킬 수 있고, 이에 의해서 혈관 및/또는 림프관을 안정화시킬 수 있다.

Description

Tie2 신호전달을 활성화시키기 위한 화합물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 10월 4일자로 출원된 미국 가출원 제62/403,786호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초 출원의 전체 내용은 참고로 본 명세서에 원용된다.
연방 지원 연구 하에 행해진 발명에 대한 권리의 진술
본 발명은 국립 보건원에 의해 R01CA138264 및 1R21EY026148 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 소정의 권리를 갖는다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해서 ASCII 형식으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 2017년 10월 1일자로 작성된 상기 ASCII 사본은 ASX-002PC-SequenceListing_ST25.txt라는 명칭이고 크기가 13,204 바이트이다.
Tie2 수용체 타이로신 키나제 신호전달 경로, 및 이의 리간드인 안지오포이에틴1(Angiopoietin1: Ang1) 및 안지오포이에틴2(Ang2)는, 혈관 투과성(vascular permeability)을 조절한다. 혈관 투과성은 망막 정맥 폐쇄(retinal vein occlusion: RVO), 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema: DME), 습성 연령-관련 황반변성(습성 AMD), 및 배경형 당뇨병성 망막병증(background diabetic retinopathy: DR)뿐만 아니라 기타 많은 병태를 지닌 환자를 비롯하여 황반 부종을 지닌 환자에서 절충된다. Tie2는 또한 특히 염증 동안 림프관 온전성(lymphatic vessel integrity)을 조절할 수 있다.
Ang1은 Tie2에 결합하고, 혈관을 안정화시키는 하류 신호전달 및 인산화를 자극시킨다. Ang2는 Tie2의 인산화를 저감시키는 Tie2 결합에 대해서 Ang1와 경쟁하고, 따라서 내인성 Tie2 길항제로서 작용한다. 허혈성 또는 저산소성 망막은 높은 수준의 Ang2를 생성하고, VEGF 수준의 것과 같은 Ang2 수준은 DME 환자의 눈에서 증가된다. Ang2는 VEGF에 대한 망막 혈관의 반응성을 증가시키고 혈관 누출 및 신생 혈관형성을 촉진시킨다.
Ang2는 또한 특히 Ang1 수준이 낮은 경우 Tie2의 약한 작용제로서 작용할 수 있다. 구체적으로는, 외인성 Ang2는 외인성 Ang1보다 더 적은 역가 및 더 낮은 친화도를 갖지만, Tie2 및 내피 세포(EC) 내 이동촉진(promigratory), 생존촉진(pro생존) PI3K/Akt 경로를 활성화시킨다. EC는 Ang1이 아니라 Ang2를 생성한다. 이 내인성 Ang2는 Tie2, 포스파티딜이노시톨 3-키나제, 및 Akt 활성도를 유지하고, 이것은 EC 생존, 이동 및 튜브 형성을 촉진시킨다.
Tie2 활성화의 회복은, 황반 부종, DME, 및 기타 병태를 비롯한, 부종 및 혈관 온전성과 연관된 병태에서 유익을 제공할 수 있었다.
각종 양상 및 실시형태에 있어서, 본 발명은, 1종 이상의 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드를 투여함으로써, Tie2-관련 혈관 투과성을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 펩타이드는 안지오포이에틴 2(Ang2)의 Tie2 작용제 활성도를 촉진시킬 수 있고, 이에 따라서 혈관 및/또는 림프관을 안정화시킬 수 있다. 각종 실시형태에 있어서, 생체모방 펩타이드는, 특히, 황반 부종, 습성 AMD와 같은 병태의 치료, 및 종양 성장 또는 전이의 치료 또는 예방과 같은 병태의 치료를 위하여 전달될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병태는 VEGF 차단 요법 또는 키나제 저해제 요법에 대한 난치성 또는 단지 부분-반응성이다. 예를 들어, 생체모방 펩타이드는 혈관신생, 림프관신생, 및/또는 부종의 유의한 저감이 관찰되지 않았던 성공하지 못한 VEGF 차단 요법 후 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 VEGF 차단 요법에 대한 대체로서 또는 이와 병용하여 투여된다. Tie2 신호전달을 활성화시킴으로써, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 VEGF-봉쇄 요법에서, 또는 VEGF 차단 요법 단독에서는 관찰될 수 없는 치료적 유익을 제공한다.
콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드는 IV형 콜라겐의 α5 원섬유로부터 유래된다. 펩타이드는 몇몇 실시형태에 있어서 α5β1 및 αVβ3 인테그린을 표적화할 수 있고, 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 간세포 성장 인자 수용체(HGFR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR) 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 비롯한 다수의 수용체를 통한 신호전달을 저해할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드는 또한 안지오포이에틴 2의 Tie2 작용제 활성도를 촉진시키고, 이에 의해서 혈관 및/또는 림프관을 안정화시킨다.
생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는, 예를 들어, 다양한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 사용해서, 전신 전달에 의해 또는 이환된 조직에의 국소 전달을 위하여 제형화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는, 1개 이상의 분해성 연쇄를 가진 재료를 포함할 수 있는 중합체성 나노입자 또는 마이크로입자 담체와 제형화된다. 펩타이드는 입자의 표면에 접합될 수 있거나, 또는 지속 방출(서방성)을 위하여 입자 내에 캡슐화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 생체모방 펩타이드에 공유 결합되는 조절 가능한 크기의 폴리(락트산-코-글리콜산) 폴리에틸렌 글리콜(PLGA-PEG) 블록 공중합체를 포함한다. 입자는 순환 특성, 생체내 분포(biodistribution), 표면 특성의 조절을 비롯한 분해 속도론을 포함하는 목적하는 약력학적 이점을 제공하도록 설계될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 Tie2-관련 병태의 치료를 위하여 캡슐화된 활성제를 더 포함한다. 예를 들어, 입자는 장기 작용성 약물 데포를 제공하기 위하여 또는 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제의 지속 방출을 제공하기 위하여 유효량의 생체모방 펩타이드를 캡슐화하는 마이크로입자일 수 있다.
소정의 양상에 있어서, 본 발명은 환자에서 Tie-2-관련 혈관 투과성 또는 림프관 온전성과 연관된 병태를 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 Tie2-의존적 혈관 투과성 또는 림프관 온전성을 저감시키는데 유효한 양으로 환자에게 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드, 또는 이의 입자 제형을 투여하는 단계를 포함한다. Tie2 활성화의 회복은 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종(DME), 및 급성 또는 만성 염증을 특징으로 하는 병태를 포함하는 기타 병태를 비롯한, 부종 또는 혈관 투과성과 연관된 병태에서 치료적 유익을 제공한다. Tie2-관련 병태는 특히 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 습성 AMD, 배경형 당뇨병성 망막병증, 암(종양 성장 또는 전이를 저감, 늦춤 또는 예방 목적을 포함), 인플루엔자, 출혈열, 대뇌 말라리아, 알츠하이머병, 급성 호흡 곤란 증후군, 폐부종, 천식, 호흡기세포 융합 바이러스, COPD, SARS, 폐렴, 패혈증을 포함한다.
본 발명의 다른 양상 및 실시형태는 다음의 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.
도 1은 AXT107(도 1에서 SP2043으로 식별됨)이 Tie2 신호전달 경로를 활성화시키기 위하여 Ang2의 작용제 활성도를 촉진시키는 것을 도시한다.
도 2a는, Tie2 및 하류 효과기 STAT3, Akt 및 Erk1/2의 인산화를 나타내는 Ang2 및 AXT107로 처리된 미세혈관 내피 세포(microvascular endothelial cell: MEC) 용해물의 웨스턴 블롯을 도시하며, GAPDH는 장입 대조군으로서 사용되었다. 도 2b는 도 2a에 개시되고 장입 대조군에 대해서 조정되고 Ang2-단독 대조군과 비교하여 제시된 웨스턴 블롯의 농도계 분석을 예시한 그래프를 도시한다. 일원 ANOVA; N=3; *, *** Ang2-단독 대조군에 비해서 각각 p ≤ 0.05 및 0.001.
도 3a는 다양한 농도의 AXT107에서 15분 동안 PBS(좌측 칼럼) 또는 200 ng/㎖ Ang2(우측 칼럼) 중 0.1% BSA로 처리되고 포스포-Tie2(Y992)(녹색) 및 DAPI(청색)로 염색된 MEC 단일층의 면역형광 화상을 나타낸다. 백색 화살표는 연결(junctional) Tie2를 나타낸다. 도 3b는 각종 성장 인자와 100μM AXT107 또는 DMSO 비히클로 처리되고 X-100-가용성 풀(pool) 및 트라이톤(Triton) X-100-불용성 풀로 분획화된 MEC 용해물의 웨스턴 블롯을 포함한다. 도 3c는 도 3b에 개시된 웨스턴 블롯의 농도계 분석을 예시한 그래프이고; 각 막대는 동일한 성장 인자의 대응하는 비히클 대조군과 비교하여, 가용성(좌측 막대) 및 불용성(우측 막대)으로 분리된 AXT107-처리된 샘플의 변화 퍼센트를 나타낸다. 도 3d는 Tie2에 대해서 면역침강되고 포스포-Tie2(상부)에 대해서 또는 총 Tie2(하부)에 대해서 블롯팅된 트라이톤 X-100-분획화된 용해물의 웨스턴 블롯의 대표적인 화상(n=3)이다.
도 4a 및 도 4c는 각종 성장 인자와 100μM AXT107 또는 DMSO 비히클로 처리되고 트라이톤 X-100-가용성 풀 및 트라이톤 X-100-불용성 풀로 분획화되고, 인테그린 α5(a)에 대해서 면역블롯팅되고 또는 인테그린 β1(c)에 대해서 면역블롯팅된 MEC 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 4b 및 도 4d는 각각 도 4a 및 도 4c로부터의 밴드의 농도계 분석을 예시한 그래프이며; 각 막대는 동일한 성장 인자의 대응하는 비히클 대조군과 비교하여, 가용성(좌측 막대) 및 불용성(우측 막대)으로 분리된 AXT107-처리된 샘플의 변화 퍼센트를 나타낸다. 도 4e는 인테그린 α5에 대해서 면역침강되고 인테그린 α5(상부)에 대해서 또는 인테그린 β1(하부)에 대해서 블롯팅된 X-100-분획화된 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 4f는 비히클로 또는 100μM AXT107로 처리된 MEC 단일층에서 α5 인테그린과 β1 인테그린 간의 상호작용을 도시한 Duolink™ 검정의 대표적인 화상의 현미경사진을 도시하고, 도 4g는 임의 면적당 상호작용을 정량화한 그래프이다. 도 4h 및 도 4i는 Tie2에 대해서 면역침강되고 α5 인테그린에 대해서 블롯팅된 트라이톤 X-100-분획화된 용해물의 웨스턴 블롯의 대표적인 화상(n=3)이며; 도 4h에서의 세포는 200 ng/㎖의 Ang2로 처리되고 도 4i에서의 세포는 성장 인자로 처리되지 않았다. N=3.
도 5a는 각종 농도의 AXT107에서 3시간 동안 200 ng/㎖ Ang2로 처리된 MEC 단일층으로부터의 VE-카드헤린(Cadherin)의 대표적인 웨스턴 블롯을 도시하고; GAPDH는 장입 대조군으로서 포함된다. 도 5b는 200 ng/㎖ Ang2 및 각종 농도의 AXT107로 처리되고 항체 표적화 VE-카드헤린(녹색), F-액틴(적색) 및 DAPI(청색)으로 염색된 MEC 단일층의 면역형광 화상의 현미경사진을 나타내고, 병합 영역은 황색으로 표시되며; 화살표는 VE-카드헤린 분포의 전이를 나타내는 대표적인 영역을 나타낸다. 도 5c는 세포당 F-액틴 커버리지의 평균 면적을 정량화하는 그래프이고; 일원 ANOVA; N=3; *, ** Ang2 단독 대조군에 대해서 각각 p ≤ 0.05 및 0.01. 도 5d는 200 ng/㎖ Ang2와 각종 농도의 AXT107로 처리되고 pMLC2에 대해서 블롯팅된 MEC로부터의 용해물의 대표적인 웨스턴 블롯을 도시하며, GAPDH는 장입 대조군으로서 사용되었다. 도 5e는 도 5d에 도시된 데이터의 농도계 분석을 도시한 그래프이고; 일원 ANOVA; N=3; Ang2-단독 대조군에 대해서 *** p ≤ 0.001. 도 5f는 실시예 5에 기재된 내피관통 투과성 검정의 개략도이다. 도 5g는, 나타낸 경우, 성장 인자 및 AXT107로 처리 후의 반투과성 기질 상에 플레이팅된 MEC 단일층을 가로지르는 FITC-덱스트란(40 kDa) 이동의 정량화를 도시한 그래프이다. 스튜던트의 양측 t-시험; N≥7; * p ≤ 0.05.
도 6은 Tie2의 AXT107-매개 활성화를 위한 모델을 포함한다.
각종 양상 및 실시형태에 있어서, 본 발명은 1종 이상의 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드(들)를 투여함으로써 Tie2-관련 혈관 또는 림프관 투과성을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이러한 펩타이드는 안지오포이에틴 2(Ang2)의 Tie2 작용제 활성도를 촉진시킬 수 있고, 이에 의해서 혈관 및/또는 림프관을 안정화시킬 수 있다.
콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드는 IV형 콜라겐의 α5 원섬유로부터 유래된다. 예시적인 펩타이드는 LRRFSTAPFAFIDINDVINF(서열번호 1)의 아미노산 서열, 또는 이의 유도체를 포함하거나, 이것으로 이루어지거나 또는 이것으로 본질적으로 이루어진다. 펩타이드는 α5β1 및 αVβ3 인테그린을 표적화할 수 있고, 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 간세포 성장 인자 수용체(HGFR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR) 및 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 비롯한 다수의 수용체를 통한 신호전달을 저해할 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드는 또한 안지오포이에틴 2의 Tie2 작용제 활성도를 촉진시키고, 이에 의해서 혈관 및/또는 림프관을 안정화시킨다.
콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드는 US　9,056,923(이의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것을 포함한다. 예를 들어, 펩타이드는 이하의 개시내용에 따라서 아미노산 서열 LRRFSTXPXXXXNINNVXNF(서열번호 2)를 포함하는 펩타이드를 포함하되, 여기서 X는 표준 아미노산 또는 비유전적으로 암호화된 아미노산이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 7번 위치에서의 X는 M, A 또는 G이고; 9번 위치에서의 X는 F, A, Y 또는 G이며; 10번 위치에서의 X는 M, A, G, D-알라닌(dA), 또는 노르류신(Nle)이고; 11번 위치에서의 X는 F, A, Y, G, 또는 4-클로로페닐알라닌(4-ClPhe)이며; 12번 위치 및 18번 위치에서의 X는 독립적으로 2-아미노부티르산(Abu), G, S, A, V, T, I, L, 또는 알릴글리신(알릴Gly)으로부터 선택된다. 각종 실시형태에 있어서, 펩타이드는 약 30개 이하의 아미노산, 또는 약 25개 이하의 아미노산, 또는 약 24개의 아미노산, 또는 약 23개의 아미노산, 또는 약 22개의 아미노산, 또는 약 21개의 아미노산, 또는 약 20개의 아미노산을 함유한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 서열번호 2의 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산이 결실된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 아미노산 서열 LRRFSTAPFAFIDINDVINF(서열번호 3), 또는 이의 유도체를 포함한다. 서열번호 3의 펩타이드는 또한 AXT107로 또는 SP2043으로 지칭된다. 서열번호 3의 펩타이드의 유도체는, 몇몇 실시형태에 있어서 13번 및 16번 위치에서 Asp가 유지되지만, 서열번호 3에 관하여 1 내지 5개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실(예컨대, 일괄적으로 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 치환, 삽입, 또는 결실)을 갖는 펩타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 서열 DINDV는 유도체에서 유지된다. 서열번호 3의 아미노산 치환은 선택적으로 서열번호 1의 대응하는 위치에서 X에 의해 점유된 위치에서 있을 수 있다. 즉, 펩타이드는 서열번호 4: LRRFSTXPXXXXDINDVXNF의 아미노산 서열을 가질 수 있되, 여기서 X는 표준 아미노산 또는 비유전적 암호화된 아미노산이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 7번 위치에서의 X는 M, A 또는 G이고; 9번 위치에서의 X는 F, A, Y 또는 G이며; 10번 위치에서의 X는 M, A, G, D-알라닌(dA), 또는 노르류신(Nle)이고; 11번 위치에서의 X는 F, A, Y, G, 또는 4-클로로페닐알라닌(4-ClPhe)이며; 12번 위치 및 18번 위치에서의 X는 독립적으로 2-아미노부티르산(Abu), G, S, A, V, T, I, L, 또는 알릴글리신(알릴Gly)으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 아미노산 치환은 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 펩타이드의 임의의 위치에서 이루어지며, 독립적으로 보존적 또는 비보존적 치환으로부터 선택될 수 있다. 이들 또는 다른 실시형태에 있어서, 펩타이드는 (일괄적으로) 어느 한쪽 또는 양쪽 말단에 부가된 1 내지 10개의 아미노산을 포함한다. N- 및/또는 C-말단은 선택적으로 다른 화학기(아민 또는 카복시 이외의 것, 예컨대, 아마이드 또는 싸이올)에 의해 점유될 수 있고, 그리고 본 명세서에서 더욱 상세하게 설명되는 바와 같이, PEG 또는 PLGA-PEG 공중합체를 비롯한 기타 모이어티의 접합(conjugation)에 유용할 수 있다.
보존적 치환은, 예를 들어, 연루된 아미노산 잔기의 극성, 전하, 크기, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 20개의 유전적으로 암호화된 아미노산은 다음의 6가지 표준 아미노산 군으로 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr; Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "보존적 치환"은 위에서 나타낸 6가지 표준 아미노산 군 중 동일 군 내에 나열된 또 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다. 예를 들어, Glu에 의한 Asp의 교환은 이렇게 변형된 폴리펩타이드에서 하나의 음성 전하를 유지한다. 또한, 글리신 및 프롤린은 α-나선을 교란시키는 그들의 능력에 기초하여 서로 대체될 수 있다. 상기 6개의 군 내의 몇몇 바람직한 보존적 치환은 이하의 하위군 내에서의 교환이다: (i) Ala, Val, Leu 및 Ile; (ii) Ser 및 Thr; (iii) Asn 및 Gln; (iv) Lys 및 Arg; 및 (v) Tyr 및 Phe.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "비-보존적 치환"은 위에서 나타낸 6가지 표준 아미노산 군 (1) 내지 (6)의 상이한 군에 나열된 다른 아미노산에 의한 아미노산의 교환으로서 정의된다.
각종 실시형태에 있어서, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 약 8 내지 약 30개의 아미노산, 또는 약 10 내지 약 20개의 아미노산의 펩타이드이고, 서열번호 1 또는 3의 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 연속하는 아미노산을 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 적어도 1개, 적어도 2개 또는 적어도 3개의 D-아미노산을 함유한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는, 선택적으로 2-아미노부티르산(Abu), 노르류신(Nle), 4-클로로페닐알라닌(4-ClPhe) 및 알릴글리신(알릴Gly)으로부터 선택되는, 1 내지 약 5개(예컨대, 1, 2 또는 3개)의 비유전적 암호화된 아미노산을 함유한다.
본 개시내용에 따른 예시적인 생체모방 펩타이드는 하기를 포함한다:
LRRFSTMPFMF(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 5),
LRRFSTMPAMF(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 6),
LRRFSTMPFAF(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 7),
LRRFSTMPFMA(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 8),
LRRFSTMPF(Nle)F(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 9),
LRRFSTMPFM(4-ClPhe)(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 10),
LRRFSTMPFMFSNINNVSNF(서열번호 11),
LRRFSTMPFMFANINNVANF(서열번호 12),
LRRFSTMPFMFININNVINF(서열번호 13),
LRRFSTMPFMFTNINNVTNF(서열번호 14),
LRRFSTMPFMF(AllyGly)NINNV(AllyGly)NF(서열번호 15),
LRRFSTMPFMFVNINNVVNF(서열번호 16),
LRRFSTMPFdAFININNVINF(서열번호 17),
LRRFSTMPFAFININNVINF(서열번호 18),
LRRFSTAPFAFININNVINF(서열번호 19),
LRRFSTAPFdAFIDINDVINF(서열번호 20),
LRRFSTAPFAFIDINDVINW(서열번호 21),
dLRRdLRRFSTAPFAFIDINDVINF(서열번호 22),
LRRFSTAPFAFIDINDVINdF(서열번호 23),
dLRRFSTAPFAFIDINDVINdF(서열번호 24),
F(Abu)NINNV(Abu)N(서열번호 25),
FTNINNVTN(서열번호 26),
FININNVINF(서열번호 27),
FSNINNVSNF(서열번호 28),
FANINNVANF(서열번호 29),
F(AllyGly)NINNV(AllyGly)NF(서열번호 30),
FVNINNVVNF(서열번호 31),
FIDINDVINF(서열번호 32),
FIDINDVINW(서열번호 33),
FTDINDVTN(서열번호 34),
A(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 35), 또는
(4-ClPhe)(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 36).
생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 고상 합성과 같이 잘 알려진 수법을 이용해서 화학적으로 합성되고 정제될 수 있다. US 9,051,349(이는 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨) 참조.
펩타이드는 몇몇 실시형태에 있어서 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로, 또는 다른 성분과 복합체화되거나 또는 특정 조직에의 표적화된 또는 지속적 전달을 위하여 입자 내에 캡슐화되어 제공될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 약제학적으로 허용 가능한 염으로서 제형화된다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예로써, 아세테이트, 벤젠설포네이트, 베실레이트, 벤조에이트, 바이카보네이트, 바이타트레이트, 브로마이드, 에테트산칼슘, 칸실레이트, 카보네이트, 시트레이트, 에테테이트, 에디실레이트, 에스톨레이트, 에실레이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루타메이트, 글리콜릴아르사닐레이트, 헥실레졸시네이트, 하이드라바민, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드록시나프토에이트, 아이오다이드, 이세티오네이트, 락테이트, 락토바이오네이트, 말레이트, 말레에이트, 만델레이트, 메실레이트, 뮤케이트, 납실레이트, 나이트레이트, 파모에이트(엠보네이트), 판토테네이트, 포스페이트/다이포스페이트, 폴리갈락투로네이트, 살리실레이트, 스테아레이트, 서브아세테이트, 석시네이트, 설페이트, 탄네이트, 타트레이트 또는 테오클레이트를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 기타 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000)]에서 찾을 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 아세테이트, 벤조에이트, 브로마이드, 카보네이트, 시트레이트, 글루코네이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 말레에이트, 메실레이트, 납실레이트, 파모에이트(엠보네이트), 포스페이트, 살리실레이트, 석시네이트, 설페이트 또는 타트레이트를 포함한다.
생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스 용액, 인간 혈청 알부민, 리포솜, 하이드로겔, 마이크로입자 및 나노입자를 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아닌 각종 약제학적으로 허용 가능한 담체를 사용해서, 국소 또는 전신 전달을 위하여 제형화될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 유효량의 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 약 0.1 내지 약 50㎎/용량, 또는 몇몇 실시형태에 있어서, 약 0.5 내지 약 25㎎/용량, 약 1 내지 약 10㎎/용량, 또는 약 1 내지 약 5㎎/용량, 또는 약 1 내지 약 3㎎/용량의 범위 내일 것이다. 정확한 용량은, 예를 들어, 투여 경로, 화합물이 투여되는 형태, 및 치료될 의학적 병태 및/또는 환자에 좌우될 것이다. 각종 실시형태에 있어서, 펩타이드는 날마다, 주마다 또는 월마다 1 내지 3회(예컨대, 매일, 매주 또는 매월 1회), 또는 몇몇 실시형태에 있어서, 단지 2개월마다 1회, 또는 단지 3개월마다 1회 또는 단지 4개월마다 1회 투여된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는, 예를 들어, 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 습성 연령-관련 황반변성(습성 AMD), 또는 당뇨병성 망막병증의 치료를 위하여, 유리체내 주사에 의해 투여된다. 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제를 포함하는 조성물은 VEGF 차단 요법 또는 키나제 저해제 요법에 대해 난치성 또는 단지 부분-반응성인 병태의 치료를 위하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체모방 펩타이드는 성공하지 못한 VEGF 차단 요법 후에 투여될 수 있고/있거나, (다른 제제 없이) 주된 1차 요법으로서 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 약 100㎍ 내지 약 1000㎍의 용량으로, 또는 몇몇 실시형태에 있어서, 약 200㎍ 내지 약 800㎍의 용량으로, 또는 약 400 내지 약 800㎍의 용량으로 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드의 용량은 약 200㎍, 약 400㎍, 약 500㎍, 약 600㎍, 약 800㎍, 또는 약 1㎎이다. 펩타이드 용량은 월 1회, 2개월마다, 또는 3개월마다 1회, 4개월마다 1회, 또는 6개월마다 1회 투여될 수 있다. 네이키드 펩타이드는 유리체내 주사 시 데포를 형성할 수 있으므로, 투약 빈도는 실질적으로 입자로의 제형과 함께 또는 이것 없이 저감될 수 있다. 마이크로입자를 가진 제형은 훨씬 덜 빈번한 투약을 초래할 수 있고, 몇몇 실시형태에 있어서 제형은, 수개월에 걸친 후속의 지속 방출과 함께 초기 용량의 활성제를 제공하도록 유리 단백질 및 캡슐화된 단백질 둘 다를 포함한다. 마이크로입자 제형의 부재에서도, 약 월 1회, 또는 2개월마다, 또는 3개월마다 1회의 빈도에서의 유리체내 주사가 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드 제형은 1㎎ 내지 약 10㎎의 용량의 펩타이드 제제, 또는 몇몇 실시형태에 있어서, 약 1㎎ 내지 5㎎의 용량의 펩타이드, 또는 몇몇 실시형태에 있어서, 1㎎ 내지 3㎎의 용량의 펩타이드 제제를 캡슐화는 마이크로입자를 포함한다.
생체모방 펩타이드는 전신 및 국소 또는 국부 투여를 포함하는 각종 투여 방식을 위하여 제형화될 수 있다. 기술 및 제형은 일반적으로 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000)]에서 발견할 수 있다. 생체이용률을 원조하기 위하여, 본 개시내용의 조성물은 항체 Fc 도메인 또는 알부민 아미노산 서열과의 융합과 같은 폴리에틸렌 글리콜 또는 기타 PK-증대 접합체에 접합되거나 나노- 또는 마이크로-입자로 전달될 수 있다. 이 제제는, 예를 들어, 시간조절- 또는 지속 방출 형태로 전달될 수 있다. 제형 및 투여를 위한 기술은 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) Lippincott, Williams & Wilkins (2000)]에서 찾을 수 있다. 적합한 경로는 경구, 협측, 흡입 스프레이에 의한, 설하, 직장, 경피, 질, 경점막, 코 또는 장관 투여; 근육내, 피하, 척수내 주사뿐만 아니라, 척수강내, 직접적인 심실내, 정맥내, 낭내, 흉골내, 활막내, 간내, 병소내, 종양내, 두개내, 복강내, 비강내 또는 안구내(예컨대, 유리체내) 주사를 비롯한 비경구 전달, 또는 다른 전달 방식을 포함할 수 있다.
주사를 위하여, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 수성 용액, 예컨대, 생리학적으로 양립성 완충액, 예컨대, 행크 용액, 링거액, 또는 생리 식염수 완충액 중에 조제되고 희석될 수 있다.
경점막 투여를 위하여, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다.
조성물은 경구 투여에 적합한 용량으로 당업계에 잘 알려진 약제학적으로 허용 가능한 담체를 사용해서 용이하게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제가 치료될 대상체(예컨대, 환자)에 의한 경구 섭취를 위하여 정제, 환제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있게 한다.
코 또는 흡입 전달을 위해, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제될 수 있고, 그리고 예를 들어, 가용화, 희석, 또는 분산 물질, 예컨대, 식염수, 보존제, 예를 들면, 벤질 알코올, 흡수 증진제 및 플루오로카본의 예를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.
몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 중합체성 나노입자 또는 마이크로입자 담체와 함께 조제된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 마이크로입자 또는 나노입자는 하나 이상의 분해성 연쇄, 예컨대, 에스터 연쇄, 이황화 연쇄, 아마이드 연쇄, 무수물 연쇄, 그리고 효소적 분해에 감수성인 연쇄를 갖는 물질을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 마이크로입자 또는 나노입자는 폴리(락트산-코-글리콜산)(PLGA), 폴리(베타-아미노 에스터)(PBAE), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 폴리(아크릴산)(PAA), 폴리-3-하이드록시부티레이트(P3HB) 및 폴리(하이드록시부티레이트-코-하이드록시발레르산염)으로 이루어진 군으로부터 선택된 생분해성 중합체 또는 중합체의 블렌드를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 PLGA와 PBAE의 블렌드를 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 당해 분야에서 이용되는 비분해성 중합체, 예컨대, 폴리스타이렌이 공중합체 시스템을 생성하기 위하여 상기로부터의 분해성 중합체 또는 중합체들과 배합된다. 따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, 비분해성 중합체는 생분해성 중합체와 배합된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 본 발명은 PLGA-PEG 공중합체 및 접합된 생체모방 펩타이드를 포함하는 나노입자를 제공한다. 접합된 펩타이드는 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 펩타이드일 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 나노입자의 표면에 접합된 추가의 약물 및 표적화제(targeting agent)를 함유한다. 예를 들어, 나노입자는 PLGA-PEG-X 및 PLGA-PEG-Y 중합체로 만들어질 수 있되, 여기서 X는 생체모방 펩타이드이고 Y는 다른 약물 또는 표적화제이다. 표적화제는 조직 선택적 표적화제일 수 있거나, 또는 암세포를 포함하는 목적하는 세포 유형에 대해서 선택적일 수 있다. (접합된 펩타이드, 그리고 선택적으로 추가의 표적화제를 갖는) 이들 실시형태에서 나노입자는 위에서 설명된 바와 같은 고형 종양을 포함하고, 그리고 교모세포종 또는 유방암(삼중-음성 유방암 포함)을 포함하는 암의 치료에서 이용될 수 있다.
기타 표적 결합제(대안적인 인테그린-결합 모이어티 포함)가 부가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있고, 이들은 항체 및 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 표적 결합을 위한 각종 형식은 단일-도메인 항체, 재조합 중쇄-단독 항체(VHH), 단일-사슬 항체(scFv), 상어 중쇄-단독 항체(VNAR), 마이크로단백질(시스테인 매듭 단백질, 크노틴(knottin)), DARPin, 테트라넥틴, 애피바디(Affibody); 트랜스바디, 안티칼린, 아드넥틴(AdNectin), 아필린, 미소체(Microbody), 펩타이드 앱타머, 필로머, 스트라도바디, 맥시바디, 에비바디, 피노머, 아르마딜로 반복 단백질, 쿠니츠 도메인, 아비머, 아트리머, 프로바디, 이뮤노바디, 트리오맙, 트로이바디, 펩바디, 백시바디, 유니바디(UniBody), 듀오바디(DuoBody), Fv, Fab, Fab', F(ab')2, 펩타이드 모방 분자, 또는 합성 분자, 또는 미국 특허 번호 또는 미국 공개 번호 US 7,417,130, US 2004/132094, US 5,831,012, US 2004/023334, US 7,250,297, US 6,818,418, US 2004/209243, US 7,838,629, US 7,186,524, US 6,004,746, US 5,475,096, US 2004/146938, US 2004/157209, US 6,994,982, US 6,794,144, US 2010/239633, US 7,803,907, US 2010/119446, 및/또는 US 7,166,697(이들의 내용은 그들의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것들을 포함한다. 또한 문헌[Storz MAbs. 2011 May-Jun; 3(3): 310-317] 참조.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 펩타이드, 또는 이의 유도체, 또는 위에서 기재된 바와 같은 기타 결합제에 공유 결합되는, 조절 가능한 크기의 폴리(락트산-코-글리콜산) 폴리에틸렌 글리콜(PLGA-PEG) 블록 공중합체로부터 합성된다. 접합된 중합체와 접합되지 않은 중합체의 임의의 비율의 혼합물은 표면 상에 표적화제의 목적하는 밀도를 갖는 나노입자를 생성하는데 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 생체모방 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열(AXT107로 또는 SP2043로 지칭됨)을 포함한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 입자에 접합된 펩타이드는 서열번호 1 내지 36의 아미노산 서열, 또는 이의 유도체를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서 나노입자는 PLGA-PEG-펩타이드 접합체로부터 형성되거나, 또는 다른 실시형태에 있어서, 펩타이드는 사전 형성된 입자에 접합된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "나노입자"는, 1㎚ 내지 1000㎚ 사이의 임의의 정수값(약 1, 2, 5, 10, 20, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500 및 1000㎚ 그리고 이들 사이의 모든 범위 및 분율 정수 포함)을 비롯한, 약 1㎚ 내지 약 1000㎚의 범위의 적어도 하나의 치수를 갖는 입자를 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 예컨대, 약 50 내지 약 100㎚의 직경의 적어도 하나의 치수를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 약 70 내지 100㎚의 입자를 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 마이크로입자이다. 용어 "마이크로입자"는 적어도 약 1마이크로미터(㎛)의 범위의 적어도 하나의 치수를 갖는 입자를 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "입자"는 나노입자 및 마이크로입자를 포함하는 것을 의미한다.
입자는 순환 특성, 생체내 분포 및 분해 속도론을 비롯한 목적하는 약력학적 이점을 제공하도록 설계될 수 있다. 이러한 파라미터는 특히 크기, 표면 전하, 중합체 조성물, 리간드 접한 화학 및 펩타이드 접합 밀도를 포함한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 PLGA 중합체 코어, 그리고 PLGA-PEG 공중합체의 PEG 부분에 의해 형성된 친수성 외피를 갖는데, 여기서 PLGA-PEG 중합체의 부분은 펩타이드의 말단 부착을 갖는다. 친수성 외피는 작용기에 관하여 비활성인 에스터-말단캡 PLGA-PEG 중합체, 예컨대, PLGA-PEG-MeOH 중합체를 더 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 접합되지 않은 중합체의 일부 또는 전부는 표면 특성의 미세 조정을 제공하기 위해 다른 말단기(예컨대, 카복시)를 갖는다.
본 명세서에 기재된 펩타이드는 임의의 이용 가능한 과정을 이용하여 입자에 화학적으로 접합될 수 있다. 펩타이드 접합을 위한 작용기는 PEG-COOH, PEG-NH2, PEG-SH를 포함한다. 예컨대, 문헌[Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, New York, 1996] 참조. 활성화 작용기는 알킬 및 아실 할로젠화물, 아민, 설피드릴, 알데하이드, 불포화 결합, 하이드라자이드, 아이소사이안산염, 아이소싸이오사이안산염, 케톤, 그리고 화학 결합을 위해 활성화되는 것으로 알려진 다른 기를 포함한다. 대안적으로, 펩타이드는 소형 분자-커플링 시약의 이용을 통해 접합될 수 있다. 커플링 시약의 비제한적 예는 카보다이이미드, 말레이미드, N-하이드록시석신이미드 에스터, 비스클로로에틸아민, 이작용성 알데하이드, 예를 들면, 글루타르알데하이드, 무수물 등을 포함한다.
예시적인 실시형태에 있어서, 나노입자는 (PLGA 중합체의 LA:GA비 및/또는 분자량을 조절함으로써) 생체내에서 특정한 생분해율에 대해 조정될 수 있는 코어(PLGA)를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, PLGA는 5/95, 10/90, 15/85, 20/80, 25/75, 30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 50/50, 55/45, 60/40, 65/35, 70/30, 75/25, 80/20, 85/15, 90/10 또는 95/5의 L/G의 조성을 비롯하여, 20:1 내지 1:20의 LA:GA비에 기초한다. PLGA는 이의 에스터 연쇄의 가수분해에 의해 분해된다. PLGA의 분해를 위해 필요한 시간은 단량체의 비율과 관련된다: 글리콜라이드 단위의 함량이 높을수록, 지배적으로 락타이드 단위와 비교하여 분해에 필요한 시간이 더 짧다. 또한, (유리 카복실산과는 대조적으로) 에스터로 단부-캐핑된 중합체는 더 긴 분해 반감기를 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, PLGA 중합체는, 조정가능한 입자 크기를 제공하기 위해, 약 10K 내지 약 70K의 범위, 예컨대, 약 20K, 약 25K, 약 30K, 약 40K, 약 50K, 약 60K, 또는 약 70K의 분자량을 갖는다. 중합체의 PEG 부분은 일반적으로 2K 내지 5K의 범위이다. 각종 실시형태에 있어서, PLGA-PEG-펩타이드와 접합되지 않은 PLGA-PEG의 비는 약 1:20 내지 약 20:1, 예컨대, 약 1:15 내지 약 15:1, 또는 약 1:10 내지 약 10:1, 또는 약 1:5 내지 약 5:1, 또는 약 1:2 내지 약 2:1의 범위이다. 몇몇 실시형태에 있어서, PLGA-PEG-펩타이드와 접합되지 않은 공중합체의 비는 약 1:1이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 적어도 50%의 중합체는 접합된 펩타이드를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 약 50 내지 약 200㎚의 범위 내, 또는 약 50 내지 약 100㎚의 범위 내의 크기(평균 직경)를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 약 -5㎷ 내지 약 -40㎷의 범위 내, 몇몇 실시형태에 있어서, 약 -10㎷ 내지 약 -30㎷(예컨대, 약 -20, 약 -25, 또는 약 -30㎷)에서 탈이온수에서 제타 전위를 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 캡슐화된 활성제를 더 포함하는데, 이것은 플루, 알츠하이머병, 출혈열, 대뇌 말라리아, 종양 성장 또는 전이, 및 본 명세서에 기재된 기타의 것들을 비롯하여 미세혈관 또는 림프관 누출을 특징으로 하는 병태와 같은, Tie2-관련 병태의 치료를 위하여 본 명세서에 개시된 활성제일 수 있다. 이들 실시형태에 있어서, 나노입자는 활성제의 지속 방출을 제공한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 활성제는, 화학요법제, 예컨대, 아미노글루테티마이드, 암사크린, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 바이칼루타마이드, 블레오마이신, 부세레린, 부설판, 캄프토테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 사이프로테론, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 다이에네스트롤, 다이에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 엑세메스탄, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로유라실, 플루옥시메스테론, 플루타마이드, 젬시타빈, 제니스테인, 고세렐린, 하이드록시유레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 이리노테칸, 이로노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타마이드, 노코다졸, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 수라민, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토스테론, 싸이오구아닌, 싸이오테파, 티타노센 이염화물, 토포테칸, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈 중 1종 이상이다.
나노입자가 몇몇 실시형태에 있어서 실질적으로 구형인 반면, 나노입자는 선택적으로 비구형일 수 있다.
물질이 생물학적 시스템과 어떻게 상호작용하는지에 영향을 줄 수 있는 다양한 물리적 특성 및 화학적 특성이 있다. 마이크로입자- 및 나노입자-기반 물질의 경우에, 물질의 선택, 크기 분포 및 입자의 모양 분포는 모두 입자의 활성에 영향을 주는 결정적인 파라미터이다. 입자의 크기 및 형상 둘 다는 입자가 신체의 다양한 세포와 상호작용하는 방식에 영향을 줄 수 있는 것으로 이전에 제시되었다. 예를 들어, 입자의 형상은 다양한 세포 유형이 입자를 얼마나 잘 흡수할 수 있는지에 영향을 줄 수 있는데, 여기서 타원체형 입자는 통상 구형 입자보다 세포가 흡수하기 더욱 어렵다. 따라서, 입자의 형상을 신장시키는 것은, 예컨대, 면역계 세포에 의한 입자의 원치 않는 흡수를 감소시키고, 이에 의해서 체내에서 입자의 반감기를 연장시킬 수 있다. 입자 크기는 또한 세포가 입자를 흡수하고 입자와 상호작용하는 능력에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 입자 기반 시스템의 활성도의 최적화는 입자의 크기 및 형상 분포를 조정함으로써 달성될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자의 치수 및/또는 해당 입자를 신장시키기 위한 과정은 WO 2013/086500(이는 그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에 개시된 바와 같다.
특정 실시형태에 있어서, 3-차원 마이크로입자 또는 나노입자는 장형 타원체를 포함하되, 여기서 x-축을 따른 치수 (a)는 y-축을 따른 치수 (b)보다 크고, y-축을 따른 치수 (b)는 z-축을 따른 치수 (c)와 실질적으로 동등하고, 따라서 장형 타원체는 방정식 a > b = c로 기재될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 타원체는 3-축 타원체인데, 여기서 x-축을 따른 치수 (a)는 y-축을 따른 치수 (b)보다 크고, y-축을 따른 치수 (b)는 z-축을 따른 치수 (c)보다 크고, 따라서 3-축 타원체는 방정식 a > b > c로 기재될 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 타원체는 편평 타원체인데, 여기서 x-축을 따른 치수 (a)는 y-축을 따른 치수 (b)와 동등하고, y-축을 따른 치수 (b)는 z-축을 따른 치수 (c)보다 크고, 따라서 편평 타원체는 방정식 a = b > c로 기재될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 개시된 비대칭 입자는, a = b = c인 실시형태를 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에 있어서, 마이크로입자 또는 나노입자는 약 1.1 내지 약 5의 범위의 애스펙트비(aspect ratio)를 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 애스펙트비는 약 5 내지 약 10의 범위를 갖는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 애스펙트비는 약 1.5 내지 약 3.5의 범위를 갖는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 약물 카고(drug cargo)(예컨대, 본 명세서에 기재된 펩타이드 및/또는 또 다른 제제)를 캡슐화하는 마이크로입자이다. 이들 실시형태에 있어서, 입자는 표면에 접합된 펩타이드를 함유할 수 있거나 또는 함유하지 않을 수도 있다. 이들 실시형태에 있어서, 입자는 펩타이드의 지속 방출을 제공하는 장기 작용성 약물 데포를 제공할 수 있다. 예시적인 입자 형식은 WO 2014/197892(참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것들을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 입자는 폴리(베타-아미노 에스터)(PBAE)를 혼입하지 않고, 따라서 중합체는 PLGA-PEG 블록 공중합체로 본질적으로 이루어진다. 이들 입자는 안구내 주사를 위하여, 예를 들어, 황반변성(예컨대, 습성 또는 건성 연령-관련 황반변성) 또는 당뇨병성 황반 부종을 위한 치료로서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 카고는 활성제의 조합이 원하는 부위로 전달되도록 허용한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 나노입자는 암의 치료를 위하여 투여된다. 이들 또는 다른 실시형태에 있어서, 입자는 1㎛ 내지 500㎛의 범위, 예컨대, 약 1㎛ 내지 약 250㎛의 범위의 크기(평균 직경)를 갖는다. 입자는, 지속된 펩타이드 또는 약물 방출의 지속 기간에 따라, 약 1일 1회 내지 약 6개월마다 1회, 또는 약 주 1회 또는 약 월 1회 주사될 수 있다.
소정의 양상에 있어서, 본 발명은 환자에서 Tie-2-관련 혈관 투과성 또는 림프관 온전성을 연루된 병태를 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 Tie-2-의존적 혈관 또는 림프관 투과성을 저감시키는 데 유효한 양으로 환자에게 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드, 또는 이의 나노입자 제형을 투여하는 단계를 포함한다. Tie2 활성화의 회복은 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종(DME), 및 급성 또는 만성 염증을 특징으로 하는 병태를 비롯한 기타 병태를 포함하는 부종 또는 혈관 투과성과 연관된 병태에서 치료적 유익을 제공한다. Tie2-관련 병태는 특히 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 습성 AMD, 배경형 당뇨병성 망막병증, 암(종양 성장 또는 전이를 저감시키거나, 늦추거나 또는 예방하기 위한 것을 포함), 인플루엔자, 출혈열, 대뇌 말라리아, 알츠하이머병, 급성 호흡 곤란 증후군, 폐부종, 천식, 호흡기세포 융합 바이러스, SARS, 폐렴, 패혈증을 포함한다.
각종 실시형태에 있어서, 생체모방 펩타이드는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 차단 또는 저해제 요법에 대해 난치성 또는 단지 부분-반응성인 병태(황반 부종, 습성 AMD, 종양 성장 또는 전이를 포함)를 위하여 전달될 수 있다. VEGF를 차단하는 약제학적 제제는, 혈관신생을 늦추거나 차단하기 위하여 투여되는, 아플리베르셉트, 베바시주맙, 라니비주맙 및 라무시루맙, 및 유사한 제제를 포함한다. VEGF-매개 생물학적 활성을 표적화하는 기타 제제는 키나제 저해제, 예컨대, 파조파닙, 소라페닙, 수니티닙, 액시티닙(axitinib), 포나티닙, 렌바티닙, 반데타닙, 레고라페닙 및 카보잔티닙을 포함한다.
아플리베르셉트는 습성 황반변성(EYLEA)의 치료를 위한, 그리고 전이성 결장직장암을 위한 (ZALTRAP)로서의 생물약제학적 약물이다. 아플리베르셉트는 VEGF의 저해제이고, 인간 IgG1 면역글로불린의 Fc 부분에 융합되는, 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인으로부터의 혈관 내피 성장 인자(VEGF)-결합 부분으로 이루어진 재조합 융합 단백질이다. 아플리베르셉트는 VEGF를 순환시키기 위하여 결합되고 혈관 내피 성장 인자 아형 VEGF-A 및 VEGF-B의 활성을 저해하는, "VEGF 트랩"과 같이 작용할 뿐만 아니라, 각각 맥락막모세혈관층 또는 종양에서 새로운 혈관의 성장을 저해하는 태반 성장 인자(PGF)에 결합한다.
베바시주맙(AVASTIN)은 새로운 혈관의 성장을 늦추는 약물인 혈관신생 저해제이다. 베바시주맙은 VEGF-A를 저해함으로써 혈관신생을 차단하는 재조합 인간화된 단클론성 항체이다. 베바시주맙은 결장암, 폐암(예컨대, NSCLC), 신장암, 난소암, 유방암 및 교모세포종을 포함하는 소정의 전이성 암을 치료하기 위하여 투여된다. 베바시주맙은 또한 AMD 및 당뇨병성 망막병증을 포함하는 안 질환의 치료를 위하여 사용될 수 있다.
라니비주맙(LUCENTIS)은 단클론성 항체 단편(Fab)이고, 습성 AMD의 치료를 위하여 투여된다. 약물은 약 월 1회 유리체내로(눈의 유리체액 내로) 주사된다. 라니비주맙은 베바시주맙과 유사한 VEGF A를 저해함으로써 혈관신생을 저해하는 단클론성 항체이다.
따라서, 몇몇 실시형태에 있어서, VEGF 저해제는 단클론성 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하거나, 또는 인간 VEGF 수용체s 1 및/또는 2의 세포외 도메인을 포함한다. 예를 들어, 생체모방 펩타이드는 성공하지 못한 VEGF 차단 요법 후, 즉, 혈관신생, 림프관신생, 및/또는 부종의 저감이 관찰되지 않은 경우에 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 VEGF 차단 요법에 대한 대안예로서 투여된다. 더욱 추가의 실시형태에 있어서, 펩타이드는 VEGF 차단 요법과 동시에, 전에 또는 후에 VEGF 차단 요법과 병용하여 투여된다. Tie2 신호전달을 활성화시킴으로써, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 VEGF 봉쇄 요법, 또는 VEGF 차단 요법 단독으로는 관찰될 수 없는 치료적 유익을 제공한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 황반변성을 지닌다. 황반변성은 유체 및 단백질 침착물이 눈의 황반(망막의 황색 중앙 영역) 상에 또는 하에 수집될 경우 일어나고, 후막화되고 팽윤을 초래한다. 황반 부종의 원인은 만성 또는 비제어된 제2형 당뇨병(예컨대, 당뇨병성 망막병증)을 포함하되, 여기서 망막의 것을 포함하는 말초 혈관은 망막 내로 유체를 누출시킨다. 기타 원인 및/또는 연관된 장애는 연령-관련 황반변성(AMD), 만성 포도막염, 죽상동맥경화증, 고혈압 및 녹내장을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는, 허혈 및 부종으로 인한 망막에 대한 수개의 손상 및 실명을 초래할 수 있는 망막 정맥 폐쇄를 지니거나 또는 이의 위험이 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 VEGF 차단 요법과 병용하여 또는 이의 대안예로서 펩타이드 또는 이의 입자 제형의 안구내 주사를 받는다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 플루를 지니거나 또는 이의 위험이 있다. 인플루엔자("플루")는 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 감염성 질환이다. 증후군은 고열, 콧물, 인후염, 근육 통증, 두통, 기침 및 피로를 포함한다. 이들 증상은 전형적으로 바이러스에 노출 후 2일에 시작된다. 감염은 인후, 가래 또는 코를 바이러스의 존재에 대해서 시험함으로써 확인될 수 있다. 항바이러스성 약물, 예컨대, 뉴라미니다제 저해제(예컨대, 특히 오셀타미비어)는 인플루엔자를 치료하는데 사용되었고, 이는 보통의 유익을 제시한 한편, 유익성을 제공하기 위해 감염 초기에(예컨대, 증상이 나타난 직후에) 이용되어야 한다. 인플루엔자를 가진 사람 중에서 대략 33%는 무증상성이다. 인플루엔자의 증상은 감염 후 약 1 내지 2일에 상당히 갑작스럽게 시작될 수 있다. 통상, 첫 번째 증상은 오한 또는 오한 감각이지만, 열병 또한 감염 초기에 통상적이다. 항바이러스성 치료는, 비록 때때로 근소한 유익성을 제공하긴 하지만, 바이러스 내성의 위험을 안고 있는데, 이것은 강력한 유행성 균주에서 특히 문제가 될 수 있을 것이다.
바이러스를 치료하는 매력적인 대안예는 숙주 반응을 치료하는 것인데, 이것은 약물에 대한 내성을 야기할 가능성이 훨씬 적고, 그리고 병의 더욱 진행된 병기의 치료를 허용함에 있어서 더욱 큰 효능창을 제공할 수 있다. 숙주에 의한 주된 반응 중에서 한 가지는, 때때로, 호흡 부전으로 이어지는 폐 미세혈관 누출 및 폐 손상을 유발하는 염증 반응이다. 미세혈관 누출을 저해하는 항부종성제는 플루의 증상을 개선할 수 있었다.
몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물은 먼저 플루 증후군의 외관 전에 투여된다. 예를 들어, 환자는 환자 샘플 내 바이러스의 존재를 검출하는 실험실 시험을 이용해서 플루를 지니는 것으로 진단될 수 있거나, 또는 환자는 바이러스에 노출된 후에 플루의 위험이 있다. 노출은 감염된 그리고/또는 증상을 보이는 개체와 밀접한 접촉에 의해 결정될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 최초 플루 증상이 나타난 후에 먼저 투여된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 최초 플루 증상의 출현 후에 1 내지 4일(예컨대, 1 또는 2일) 이내에 투여된다. 본 발명의 이 양상에 따르면, 펩타이드는 인플루엔자 바이러스와 연관된 폐 내 부종을 저감시키고, 이에 의해서 증상 및/또는 병태의 중증도를 개선한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 병의 전체 길이는 1, 2, 3, 4일 이상만큼 저감될 수 있고/있거나, 중증도 및 불편함이 실질적으로 저감될 수 있다.
플루를 지니거나 이의 위험이 있는 환자의 치료를 위하여, 본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 1일 약 1 내지 약 5회, 예컨대, 1일 약 1 내지 약 3회 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 폐에 예를 들어 분말 또는 용액 에어로졸로 국소 투여되거나, 또는 다른 실시형태에 있어서, 전신 투여된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드는 인플루엔자에 대해서 활성인 1종 이상의 항바이러스제와 투여되거나, 또는 대안적으로 별도의 약물 제형으로서 또는 공동-제형화된 제품으로서 1종 이상의 항염증제와 함께 투여된다. 예시적인 항바이러스제는 Tamiflu®(오세타미비어 포스페이트), Relenza®(자나미비어), Rapivab(페라미비어), 아만타딘 및 라만타딘을 포함한다. 항염증제는 NSAID, 예컨대, 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜 및 나프록센을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 알츠하이머병의 치료를 위하여 또는 이의 진행을 늦추기 위하여 투여된다. 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)은 정상적인 뉴런 기능 및 정보 처리에 필수적인 뇌 내로 혈액-유래된 산물, 병원체 및 세포의 진입을 제한한다. 사후 조직 분석은 알츠하이머병에서 BBB 손상을 지시한다. 그러나, BBB 파괴의 타이밍은 여전히 찾기 어렵다. 살아있는 인간 뇌에서 영역 BBB 투과성을 정량하는 높은 공간 및 시간 분해능을 갖는 진전된 동적 조영-증강된 MRI는 알츠하이머병에서 초기에 영향을 받는 학습 및 기억에 결정적인 영역인 해마에서 연령-의존적 BBB 파괴를 제시하였다. 이들 데이터는 BBB 파괴가 노화 인간 뇌에서 해마에서 시작되는 초기 사건이고, 그리고 인지 장애에 기여할 수 있다는 것을 시사한다. 따라서, 혈액-뇌 장애 및 결과적인 증가된 투과성을 저해하는 제제는 알츠하이머병의 진행을 늦출 수 있었다. 본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 조성물의 투여는, 몇몇 실시형태에 있어서, 혈액-뇌 장벽의 온전성을 유지함으로써, 알츠하이머병의 개시 또는 진행을 늦추거나 또는 예방한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 알츠하이머병의 치료를 위한 적어도 1종의 추가의 제제에 의한 치료를 받는 중이고, 이것은 아세틸콜린에스터라제 저해제(타크린, 리바스티그민, 갈란타민 및 도네페질) 또는 메만틴으로부터 선택될 수 있다.
알츠하이머병, 특히 초기 질환의 잠재적인 증상을 보이는 환자의 치료를 위하여, 본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 질환의 개시 또는 진행을 늦추기 위하여 1일 약 1 내지 약 5회, 예컨대, 1일 약 1 내지 약 3회 투여될 수 있다. 초기 질환은 종종 학습 및 기억의 손상 증가로서 관찰될 수 있고, 이것은 궁극적으로 결정적인 진단을 초래한다. 일부에서, 언어, 실행 기능, 지각(실인증), 또는 움직임의 이행(실행증)에서의 어려움이 기억 문제보다 더욱 두드러진다. 언어 문제는 구어 및 문어의 전반적인 궁핍화를 야기하는 축소되는 어휘 및 감소된 단어 유창성을 특징으로 한다.
다른 실시형태에 있어서, 환자는 출혈열 또는 증후군을 지니거나 또는 이의 위험이 있으며, 이는 출혈성 바이러스에 의해 초래된다. 이들 중에서 가장 악명 높은 것은 에볼라 및 마르부르크 바이러스이다. 출혈은 또한 뎅기열 또는 라사열을 지닌 사람들에서 일어난다. 에볼라에서, 이러한 출혈성 증후군은 그 질환에서 다소 후기에, 전형적으로 사망 전 24 내지 48시간에 발생한다. 출혈이 있는 사례는 극적일 수 있고, 그리고 신체의 코, 입 및 다른 구멍으로부터 발생할 수 있다. 출혈을 야기하는 기전은 광범위한 아웃라인에서 알려져 있다: 바이러스는 간에 의해 생산되는 응고 인자의 상향조절을 유발하고, 응고 인자의 증가된 숫자는 응괴가 작은 혈관에서 형성되도록 하고, 간에 의해 생산된 응고 인자의 공급은 간이 바이러스에 의한 공격 하에 있기 때문에 고갈되고, 과다활성화된 면역계는 혈관이 출혈을 시작하도록 유발하는 염증성 단백질의 생산을 증가시키고, 응고 인자의 비효용성은 출혈이 저지될 수 없다는 것을 의미한다. 많은 사망자가 심지어 출혈 없이도 발생하지만, 출혈이 있는 환자는 매우 높은 사망률을 갖는다. 증상이 먼저 나타난 후 투여된 제제는, 만약 그렇지 않았다면, 계속 진행하여 출혈성 증후군을 나타내었을 환자에서 미세혈관계로부터 출혈을 중지 또는 저감시킬 수 있었다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 에볼라 바이러스 또는 마르부르크 바이러스를 지닌다. 예를 들어, 환자는 출혈열의 초기 징후, 예컨대, 열 및 출혈에 대한 증가된 감수성 및/또는 얼굴 및 흉부의 홍조, 작은 적색 또는 자주색 스팟(점상 출혈)을 지닐 수 있다. 출혈열의 다른 징후 및 증상은 권태감, 근육 통증, 두통, 구토 및 설사를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 에볼라 바이러스 또는 다른 출혈열 바이러스의 존재는 환자 샘플에서 확인된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 출혈열의 치료를 위한 적어도 1종의 항바이러스제 또는 항염증제, 예컨대, 정맥내 리바비린으로 치료를 받고 있다. 출혈열을 지니거나 또는 이의 위험이 있는 환자의 치료를 위해, 본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 질환의 진행을 늦추기 위해, 1일 약 1 내지 약 5회, 예컨대, 1일 약 1 내지 약 3회 투여될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 환자는 대뇌 말라리아(CM)를 지니거나 이의 위험이 있다. CM은 열대열원충(Plasmodium falciparum) 말라리아의 가장 치명적인 합병증 중 한 가지이고, 그리고 말라리아-관련된 사망의 큰 분율을 차지한다. 세계 보건 기구(WHO)는, CM을 무성 열대열원충(P. falciparum) 기생충 혈증의 존재에서 그리고 뇌병증의 다른 원인의 존재 없이, 저혈당증에 대한 발작 또는 교정의 종결 후 적어도 1시간에서 존속하는 혼수(고통스러운 자극의 위치를 찾아내는 능력 없음 또는 블랜타이어(Blantyre) 혼수 점수 ≤ 2)로서 규정한다. CM-관련 사망 중에서 최대 75%가 입원 24시간 이내에 일어난다. 다중모드 자기 공명 기술, 예컨대, 영상화, 확산, 관류, 혈관조영술, 분광법은 혈액-뇌 장벽 붕괴 및 출혈을 비롯한 혈관 손상이 CM에서 일어난다는 것을 제시하였다. 이들 효과는 염증성 과정에 기인하는 것으로 생각된다. Penet 등(J Neurosci. 2005 Aug 10;25(32):7352-8)은 CM의 마우스 모델을 이용하여, 주요 부종 형성뿐만 아니라 감소된 뇌 관류가 CM에서 일어나고, 그리고 높은-에너지 인산염의 감소 및 상승된 뇌 락트산염으로 허혈성 대사 프로파일을 동반한다는 것을 제시하였다. 이들은 또한 혈관조영술을 이용하였는데, 주요 혈류역학 기능장애에 대한 설득력 있는 증거를 제공하였다. 중요하게는, 이들은 부종이 대뇌 동맥을 압박하여, 궁극적으로 사망 원인인 혈류의 붕괴를 차후 야기함으로써 허혈을 더욱 악화시킨다는 것을 발견하였다. 이들 지견은 염증성 및 허혈성 병변의 공존을 증명하고, 그리고 실험적 대뇌 말라리아의 치명적인 결과에서 부종의 주요 역할을 입증한다. 뇌에서 부종 및/또는 허혈을 저해하는 제제는 이들 환자의 치료를 향상시키기 위해 기생충을 직접적으로 표적으로 하는 항-말라리아 제제와 병용하여 이용될 수 있었다. 몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 클로로퀸, 메플로퀸, 독시사이클린, 또는 아토바쿠온 및 프로구아닐 염산염의 조합물(말라론(Malarone))로부터 선택된 항-말라리아 요법을 제공받는다.
이들 실시형태에 있어서, 펩타이드는 대뇌 말라리아를 지닌 환자에서 혈관 뇌 장벽 및 혈관 온전성을 유지한다. 대뇌 말라리아를 지니거나 이의 위험이 있는 환자의 치료를 위하여, 본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 약제학적 조성물은 질환의 진행을 늦추고/늦추거나 사망을 예방하기 위하여 1일 약 1 내지 약 5회, 예컨대, 1일 약 1 내지 약 3회 투여될 수 있다.
다른 양상에 있어서, 본 발명은 화학요법을 위하여 종양 혈관을 정상화하거나, 또는 종양 성장 또는 전이를 예방하거나 또는 늦추는 것을 비롯하여 암을 치료하는 방법을 제공한다. 혈관신생은 암을 치료하기 위한 약물 표적으로서 광범위하게 보였다. VEGF 및 이의 수용체 VEGFR2는 혈관신생의 중요한 매개체이다. 베바시주맙, 인간 VEGF를 봉쇄하는 항체뿐만 아니라, 아플리베르셉트 및 라니비주맙, 및 VEGFR2를 저해하는 소분자 타이로신 키나제 저해제는, 각종 유형의 암에 대한 치료로서 투여되어 왔다. 이의 잘 알려진 신생혈관 유발 효과 이외에, VEGF는 또한 수지상 세포의 성숙을 저해함으로써 면역 억제제로서 작용한다. 종양은 신생혈관을 유인할 뿐만 아니라, 성숙 면역 세포의 숫자를 감소시키고 림프구 내피 트래피킹을 조절함으로써 면역계를 억제하기 위해 VEGF를 생산하는 것으로 생각된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 암은 아플리베르셉트, 베바시주맙, 라니비주맙, 라무시루맙, 파조파닙, 소라페닙, 수니티닙, 액시티닙, 포나티닙, 렌바티닙, 반데타닙, 레고라페닙 및 카보잔티닙을 비롯한, 이러한 제제(예컨대, 이러한 제제 중 1종 이상에 의한 치료 후)에 비반응성이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 암은 생식선 종양, 중추신경계의 종양, 유방암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁암, 폐암, 난소암, 고환암, 갑상선암, 별아교세포종, 신경교종, 췌장암, 위암, 간암, 결장암, 흑색종(진행된 흑색종 포함), 신장암, 방광암, 식도암, 후두암, 이하선암, 담도암, 직장암, 자궁내막암, 편평세포암종, 선암종, 소세포 암종, 신경모세포종, 중피종, 부신피질 암종, 상피 암종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 작은 원형 세포 종양, 내분비 종양, 유잉 육종 패밀리 종양, 생식 세포 종양, 간모세포종, 간세포 암종, 림프종, 흑색종, 비-횡문근육종 연조직 육종, 골육종, 말초 원시 신경외배엽 종양, 망막모세포종, 횡문근육종 및 윌름스 종양으로부터 선택된 육종, 암종 또는 고형 종양 암이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 암은 비소세포 폐암, 흑색종, 전립선암, 전이성 신장 세포암이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 암은 삼중-음성 유방암(TNBC), 소세포 폐암(SCLC), 교모세포종, 또는 간암이다.
각종 실시형태에 있어서, 환자는 초기 암(예컨대, I기 또는 II기)을 지닐 수 있거나, 또는 말기(III기 또는 IV기)에 있을 수 있다. I기 암은 신체의 한 부분에 국재화된다. II기 암은, III 기 암이 그러한 것처럼, 국부 진행된다. 암이 II기 또는 III기로서 지정되는지의 여부는 암의 특정한 유형에 의존할 수 있다. 예를 들어, II기는 횡격막의 단지 한쪽 측면에서만 이환된 림프절을 나타낼 수 있고, 반면 III기는 횡격막 위아래에서 이환된 림프절을 나타낸다. 따라서, II기 및 III기에 대한 특정한 기준은 진단에 따라 다르다. IV기 암은 종종 다른 장기로 또는 신체 전체를 통해서 전이되거나 또는 확산된다. 펩타이드 또는 이의 입자 제형은, I 또는 II기 암의 진행을 예방하거나, 또는 진행을 늦추거나, 또는 III기 또는 IV기 암의 추가의 진행을 저해시키기 위하여 투여될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 암은 비절제성 간암과 같은 비절제성이다. 비절제성 암은 전이 병소의 수로 인해서 또는 수술 위험 부위이기 때문에 수술적으로 제거할 수 없는 악성 종양이다.
몇몇 실시형태에 있어서, 병태는 암에 대한 화학요법 전에 혈관 투과성이다. 예를 들어, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제의 요법(예컨대, 1 내지 10회 용량)은, 종양 혈관 및/또는 종양 미세 환경을 정상화시키기 위하여, 암 화학요법을 받기 전 적어도 1주 또는 적어도 2주에 투여될 수 있다. 예시적인 화학요법제는, 특히, 아미노글루테티마이드, 암사크린, 아나스트로졸, 아스파라기나제, 바이칼루타마이드, 블레오마이신, 부세레린, 부설판, 캄프토테신, 카페시타빈, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 콜히친, 사이클로포스파마이드, 시프로테론, 시타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 다이에네스트롤, 다이에틸스틸베스트롤, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에스트라다이올, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 엑세메스탄, 필그라스팀, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루오로유라실, 플루옥시메스테론, 플루타마이드, 젬시타빈, 제니스테인, 고세렐린, 하이드록시유레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 인터페론, 이리노테칸, 이로노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로르에타민, 메드록시프로게스테론, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타마이드, 노코다졸, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파마이드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 수라민, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스토스테론, 싸이오구아닌, 싸이오테파, 티타노센 이염화물, 토포테칸, 트라스투주맙, 트레티노인, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 생체모방 펩타이드 또는 펩타이드 제제는 몇몇 실시형태에 있어서 종양내를 비롯한 비경구 투여에 의해 투여된다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 림프관염(림프관의 염증) 및 림프부종(일부 수술 절차의 부작용일 수 있는, 조직내 림프액의 만성 풀링(pooling))을 비롯한, 림프관 기능 장애와 연루된 염증성 병태를 지닌다. 림프계는 체내에서 3가지 주된 기능, 즉, 과잉의 간질액 및 단백질을 전신 순환에 배수; 세포 기전과 체액 기전 둘 다에 의한 면역 반응의 조절; 및 내장으로부터의 지질의 흡수를 수행한다. 림프관 장애는 악성 종양, 선천성 기형, 흉부 및 복부 수술, 외상 및 전염병 후에 목격된다. 많은 림프관 장애는 수술실 및 중환자실에서 접하게 된다. 펩타이드의 투여는 림프관 온전성을 회복하거나, 또는 지속된 감쇠의 예방을 도울 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 병태는 모세혈관 누출 증후군이다. 전신 모세혈관 누출 증후군은 유체와 단백질이 모세 혈관 밖으로 누출되어 주변 조직으로 유입되어서, 위험한 저혈압을 유발하는 병태이다. 공격은 며칠 동안 빈번하게 지속되어 응급 치료가 필요하다.
몇몇 실시형태에 있어서, 병태는 패혈증이다. 패혈증은 감염에 대한 신체의 반응이 자체 조직과 장기를 손상시킬 때 생기는 생명을 위협하는 병태이다. 패혈증은 감염에 의해 촉발된 면역 반응에 의해 초래된다. 감염은 가장 일반적으로 박테리아이지만, 곰팡이, 바이러스 또는 기생충에서 유래될 수 있다. 주된 감염의 통상의 개소는 폐, 뇌, 요로, 피부 및 복부 장기를 포함한다. 패혈증은 보통 수액 및 항생제로 치료된다. 질환 중증도는 부분적으로 사망의 위험이 높은 결과를 결정한다. 펩타이드의 투여는 혈관의 온전성을 회복시키거나, 또는 이의 지속적 감쇠를 예방하여 병태를 개선시키는 것을 도울 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 병태는 급성 또는 만성 폐 염증, 예컨대, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 급성 폐손상(ALI), 만성 천식, 또는 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD)와 연루된다. 이러한 실시형태에 있어서, 펩타이드 조성물은 흡입에 의해 국소 투여될 수 있거나 또는 전신 투여될 수 있다.
급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)은 폐 내 광범위 염증을 특징으로 하고, 외상, 폐렴 및 패혈증과 같은 병리에 의해 촉발될 수 있다. ARDS는 폐의 급성 손상에 의해 유발된 폐부종의 한 형태로, 폐의 모세 혈관과 가스 교환을 담당하는 미세한 공기 주머니의 범람을 초래한다. ARDS에서, 이러한 변화는 심부전에 연유하지 않는다. 임상 증후군은 폐렴, 호산구성 폐렴, 특발성 기질화 폐렴, 급성 섬유소 기질화 폐렴 및 미만성 폐포 손상(DAD)을 포함하는 병리학적 소견과 연관된다. 그 중에서, ARDS와 가장 통상적으로 연관된 병리는 DAD이며, 이는 폐 조직의 미만성 염증을 특징으로 한다. 조직에 촉발되는 손상은 대개 국소 상피 세포 및 내피 세포에 의해 분비되는 화학적 신호 및 다른 염증성 매개체의 초기 방출을 야기한다. 패혈증에 의해 초래된 것과 같은 염증은 내피 기능장애, 모세 혈관으로부터의 유체 누출 및 폐로부터의 유체의 손상된 배수를 유발한다. 상승된 흡기 산소 농도가 이 단계에서 종종 필요하게 되고, 면역 세포에서 '호흡 파열'을 용이하게 할 수 있다. 이차적인 단계에서, 내피 기능장애는 세포와 염증성 삼출물이 폐포로 들어가게 한다. 이 폐부종은 폐포 모세혈관 공간의 두께를 증가시켜, 산소가 혈액에 도달하기 위해 확산되어야 하는 거리를 증가시켜서, 가스 교환을 방해하여 저산소증을 초래하고 호흡 작용을 증가시키며 결과적으로 공기공간(airspace)의 섬유화를 유도한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는 선택적으로 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD)와 연관된 비-심장성 폐부종을 지닌다.
몇몇 실시형태에 있어서, 병태는 혈관부종 또는 두드러기이다. 혈관부종은 진피, 피하 조직, 점막 및 점막하 조직의 급속한 팽윤이다. 일반적으로 두드러기(hive)로 알려진 두드러기(urticaria)는 상부 진피에서 발생한다. 혈관부종이 빠르게 진행되는 사례는 기도의 막힘과 질식이 발생할 수 있는 응급 상황이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드의 투여는 증상의 중증도를 저감시킬 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 환자는, 선택적으로 면역 요법의 부작용인 혈관 누출 증후군을 지닌다. 모세혈관 증후군은 모세혈관을 둘러싸고 있는 내피 세포가 며칠 동안 분리되어 순환계로부터 간질 세포로의 누출을 허용하여 위험한 저혈압증(저혈압), 혈액농축 및 저알부민혈증을 유발하는 자기 역전(self-reversing) 에피소드를 특징으로 한다.
본 개시내용의 소정의 양상에 있어서, 본 발명은, 입자 제형을 포함하는, 제형의 펩타이드 조성물을 생성한다. 펩타이드는 서열번호 5 내지 36으로부터 선택된 서열을 갖는 유도체 펩타이드를 포함하는, 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제형은 단위 용량당 100㎍ 내지 약 1000㎍의 펩타이드 제제를 포함하고 선택적으로 입자로의 캡슐화를 수반하지 않는다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제형은 단위 용량당 약 1㎎ 내지 약 10㎎(또는 몇몇 실시형태에서는 1 내지 5㎎ 또는 1 내지 3㎎)을 포함하고, 선택적으로 유리 펩타이드와 함께 입자 캡슐화를 포함할 수 있다. 캡술화 및 유리 펩타이드 둘 다를 제공하는 제형은 (예컨대, 100㎍ 내지 약 1000㎍의 범위 내에서) 초기 용량을 제공할 수 있는 한편, 캡슐화된 펩타이드는 수 개월(예컨대, 3 내지 6개월 이상)에 걸친 지속 방출을 제공한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 펩타이드 제제는 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 서열을 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 달리 명확하게 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
달리 구체적으로 기술되거나 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "또는"은 포괄적이며 "또는"과 "및" 둘 다를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 구체적으로 기술되거나 문맥으로 명백하지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "약"은 당업계에서의 통상의 허용 범위 내, 예를 들어, 플러스 또는 마이너스 10% 이내로서 이해된다.
본 발명은 이하의 비제한적인 실시예에 따라서 더욱 기술될 것이다.
실시예
Ang-Tie 신호전달에 대한 인테그린의 조절 기능이 예시적인 인테그린-결합, 생체모방 펩타이드인 AXT107을 사용하여 이하에 예에서 기술된다. AXT107은 IV형 콜라겐 내 서열로부터 유래된 20량체 펩타이드이다. AXT107은 인테그린 α5β1에 그리고 인테그린 αvβ3에 타이트하게 결합하고 적어도, 성장 인자 수용체인 VEGFR2, cMet, PDGFRβ 및 IGF1R의 활성도를 방해한다(Lee et al., Sci Rep. 2014; 4:7139).
본 명세서에 기재된 바와 같이, AXT107은 Ang2 및 Tie2와 연루된 신규한 기전에 의해 혈관 누출을 저해하는 것으로 판명되었다. AXT107은 내피 세포에서 Tie2, Akt 및 Stat3의 증가된 인산화를 유발하는 Ang2의 작용제 활성도를 강력하게 촉진시켜서 혈관의 내피 세포 간의 강벽을 강화시킨다. AXT107은 IGF1R과 β1 인테그린의 상호작용을 방해하여, 시험관내에서 VEGFR2 분해를 증대시키고 생체내 신생혈관의 성장 및 투과성을 저해한다.
이하의 실시예는 예시적인 인테그린-결합, 생체모방 펩타이드에 의한 처리가 시험관내 및 생체내 둘 다에서 Tie2를 향한 Ang2의 정상적으로 약한 작용제 활성도를 강화시키고, 구체적으로는, EC 생존 및 작병 기능과 연관된 하류 표적을 활성화시키는 것을 입증한다. 기계론적으로, AXT107 처리는 α5 인테그린과 β1 인테그린을 해리시키고, EC-EC 접합부에서의 Tie2의 전좌 및 활성화와 F-액틴 및 VE-카드헤린의 재편성을 통한 감소된 단층 투과성을 초래한다.
실시예 1: AXT107은 Ang2의 작용제 활성도를 강력하게 촉진시킨다
Tie2 수용체 타이로신 키나제 신호전달 경로 및 이의 리간드인 안지오포이에틴1(Ang1) 및 안지오포이에틴2(Ang2)는 망막 정맥 폐쇄(RVO), 당뇨병성 황반 부종(DME), 습성 연령-관련 황반변성(습성 AMD) 및 배경형 당뇨병성 망막병증(DR)을 지닌 환자를 비롯하여 황반 부종을 지닌 환자에서 손상된 혈관 투과성을 조절한다. Ang1은 Tie2에 결합하여 인산화 및 하류 신호전달을 자극시켜 혈관을 안정화시킨다(1,2). Ang2는 Tie2 결합에 대해서 Ang1과 경쟁하여 Tie2의 인산화를 저감시키고, 이에 따라서 내인성 Tie2 길항제로서 작용한다(3). 허혈성 또는 저산소성 망막은 높은 수준의 Ang2를 생성하고(4), VEGF 수준의 것과 같은 Ang2 수준은 DME 환자의 눈에서 증가된다(5). Ang2는 VEGF에 대한 망막 혈관의 반응성을 증가시키고, 혈관 누출 및 신생 혈관형성을 촉진시킨다(6-9). 이들 결과는, Tie2 활성화의 회복이 황반 부종, DME 및 기타를 비롯한 부종과 연관된 병태에서 유익을 제공할 수 있었음을 시사한다.
Tie2는 또한 특히 염증 동안 림프관 온전성을 제공할 수 있다. 구체적으로는, Tie2의 인산화를 증대시키는 분자는 잠재적으로 염증 동안 림프관 기능장애를 치료하는데 사용될 수 있었다(10).
다른 데이터는, 특히 Ang1 수준이 낮을 경우 Ang2가 또한 Tie2의 약한 작용제로서 작용하는 것을 시사한다(11). 외인성 Ang2는 외인성 Ang1보다는 더 적은 역가 및 더 낮은 친화도를 갖지만, Tie2 및 내피 세포(EC)에서의 이동촉진, 생존촉진 PI3K/Akt 경로를 활성화시킨다. EC는 Ang1이 아니라 Ang2를 생성한다. 이 내인성 Ang2는 Tie2, 포스파티딜이노시톨 3-키나제, 및 Akt 활성도를 유지시키고, EC 생존, 이동 및 튜브 형성을 촉진시킨다.
AXT107은, VEGF, PDGF, HGF 및 IGF1을 비롯한 다수의 혈관신생촉진 경로로부터의 신호전달을 저해하는 인테그린-결합 항혈관신생 생체모방 펩타이드이고; 이것은 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드의 하나의 부류를 나타낸다. 이들 경로의 저해는 신생 혈관형성을 저해하고, VEGF 경로의 저해는 특히 혈관 누출을 저해한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, AXT107은 Ang2 및 Tie2와 연루된 새로운 기전에 의해서 혈관 누출을 저해하는 것으로 판명되었다. 통상, VEGF 수준과 Ang2 수준은 둘 다 DME를 지닌 환자에서 증가되고, 이들은 신생 혈관형성 및 혈관 투과성을 대등하게 촉진시킨다. 도 1에 도시된 바와 같이, AXT107(도면에서 SP2043으로서 식별됨)은 Ang2의 작용제 활성도를 강력하게 촉진시켜서 내피 세포에서 Tie2, Akt 및 Stat3의 증가된 인산화를 초래하여 혈관에서 내피 페소 간의 장벽을 강화시킨다.
인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)의 합류 단층은 하룻밤 EBM-2로 기아된 혈정이었다. 0, 10, 32 및 100μM의 농도의 AXT107로 90분 처리 후에, 세포를 1mM 오쏘바나듐산나트륨으로 15분 동안 처리하였다. 다음에 세포를 200ng/㎖의 안지오포이에틴-2(Ang-2)로 15분 동안 처리하였다. 세포 용해 후, 용해물을 pTie2(Y992), pSTAT3(Y705) 및 pAkt(S473)에 대해서 면역블롯팅하였다.
이 결과는, AXT107 및 이 부류와는 다른 펩타이드가 VEGF 및 다른 혈관신생촉진 성장 인자를 동시에 저해함으로써 그리고 작용제로서의 Ang2의 역가를 증가시켜서 Tie2의 인산화를 촉진시킴으로써 DME 및 황반 부종의 다른 형태를 지닌 환자에서 혈관 누출을 저해할 수 있었음을 시사한다. 이것은 또한 혈관 투과성이 암, 인플루엔자, 출혈열, 대뇌 말라리아, 및 Tie2 신호전달의 활성도를 증대시킴으로써 부종이 주된 기여 인자인 기타의 것들과 같이 중요할 수 있는 기타 질환에도 적용된다.
참고 문헌
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실시예 2: AXT107은 Ang2에 의한 Tie2의 활성화를 강화시킨다
이 실시예에서, Ang-Tie 신호전달에 대한 인테그린의 조절 기능은 예시적인 인테그린-결합, 생체모방 펩타이드인 AXT107을 사용해서 조사하였다.
Tie2 신호전달에 대한 인테그린 저해제 AXT107의 효과를 조사하기 위하여, 파이브로넥틴-코팅된 접시 상의 미세혈관 내피 세포(MEC)의 합류 단일층을 각종 농도의 AXT107로 처리하고 나서, Tie2 리간드인 Ang1 또는 Ang2에 노출시켰다. Ang1 단독은 Tie2의 인산화를 유도한 반면(데이터 제시 생략), Ang2는 자체로 대수롭지 않은 효과를 나타내었다(도 2a 및 도 2b).
놀랍게도, AXT107 처리는 Ang1 활성도에 상당한 영향을 미치지 못했지만(데이터 제시 생략), Tie2 인산화의 유의한 용량-의존적 증가가 AXT107 및 Ang2와 병용하여 처리된 세포에서 관찰되었다(도 2a, 첫째줄 및 도 2b, 맨위 좌측 그래프). 하류의, 생존촉진 효과기 STAT3 및 Akt의 인산화는 또한 Ang2 및 AXT107 처리에 의해 증가되었다(도 2a, 둘째줄 및 셋째줄, 및 도 2b, 맨위 우측 그래프 및 맨아래 좌측 그래프). 그러나, 증식-연관 인자 Erk1/2의 인산화는 모든 시험된 병태에서 일정한 채로 있었다(도 2a, 넷째줄 및 도 2b, 맨아래 우측 그래프). 모든 경우에 대해서, Tie2 및 하류 표적의 총 단백질 수준은 변하지 않은 채로 있었고(데이터 제시 생략), 인산화는 어느 하나의 리간드의 부재 시에도 펩타이드 단독에 의해 영향을 받지 않았다.
AXT107에 의한 인테그린 저해는 수용체 인산화 및 많은 RTK, 예컨대, VEGFR2, c-Met, IGF1R 및 PDGFRβ에 대한 하류 신호를 유의하게 감소시킬 뿐만 아니라, 증가된 수용체 분해를 통해서 총 수용체 수준을 감소시킨다(Lee et al., Sci Rep. 2014; 4:7139). 이와 대조적으로, AXT107은 시험관내 및 생체내 둘다에서 Ang2에 의해 Tie2의 활성화를 명확하게 강화시키고, Tie2의 총 수준에 영향을 미치지 않으며, 이는 수용체의 증가된 분해가 다른 RTK에서처럼 Tie2에 대해서 일어나지 않는 것을 시사한다.
이들 데이터는, 예시적인 인테그린-결합, 생체모방 펩타이드에 의한 처리가 Tie2를 향한 Ang2의 통상 약한 작용제 활성도를 강화시키거나, 또는 Ang2를 Tie2 길항제에서 작용제로 전환시키는 것을 입증한다. 따라서, AXT107은, 내피 세포(EC) 생존 및 장벽 기능과 연관된 하류 표적을 특이적으로 활성화시킨다.
실시예 3: AXT107에 의해 매개된 Tie2 세포 분포의 변화는 수용체 활성화에 영향을 미친다
AXT107이 Akt 및 STAT3의 Ang2-매개 인산화를 강화시키지만 ERK1/2 인산화를 강화시키지 않는다는 발견은, AXT107이 세포-세포외 기질(cell-extracellular matrix: ECM) 계면에서 Tie2 분자보다는 오히려 연결 Tie2를 특이적으로 활성화시키는 것을 시사한다. 그와 같이, 후속의 실험은 EC-ECM 계면에서보다 오히려 면역형광 현미경을 사용해서 MEC 단일층 내 세포-세포 연결부에서의 AXT107의 효과를 평가한다.
AXT107은 매질에 첨가된 경우 펩타이드 복합체로 자기-조립되는 것으로 판명되었고; 이 거동은 마우스 눈에서 관찰된 데포와 유사하다(데이터 제시 생략). Ang2 단독으로 처리된 샘플에서(도 3a, 맨윗줄), 포스포-Tie2는 세포 표면을 가로질러 약한 반점 분포에서 지배적으로 발견되었다. Ang2 및 AXT107로 처리된 샘플은 세포-세포 연결부를 따른 증가된 전체적인 형광 강도 및 AXT107 펩타이드 복합체와 공동-국재화된 커다란 클러스터로 재분배된 포스포-Tie2를 지녔다(도 3a, 아래 세 줄). 이들 포스포-Tie2의 커다란 클러스터는, 세포가 없는 영역에서 또는 2차 항체 단독으로 처리된 웰에서 펩타이드 복합체에 대해서 녹색 형광 신호가 관찰되지 않았으므로 예상밖으로 시험된 항체와 AXT107 펩타이드 복합체 간의 비특이적 상호작용의 결과이다(데이터 제시 생략). 이전의 보고는, Tie2의 Ang2의 활성화에서 클러스팅의 중요성을 강조했으며, Ang2에 의한 Tie2 인산화 및 혈관 안정성 및 정지의 하류 효과기의 활성화의 강화를 설명할 수 있다.
EC-EC 연결부에서의 Tie2는 트라이톤 X-100-기반 용해 완충액에 불용성이지만 세포의 표면에 걸쳐서 분포된 경우 가용성인 액틴-풍부 복합체를 형성한다. 따라서, MEC 단일층을 AXT107, Ang1 및 Ang2의 각종 조합으로 처리하고, 세포 용해물을 트라이톤 X-100-기반 용해 완충액 중에서의 그들의 용해도에 의해 분별시켰다. VEGF165를 포함하는 실험은 또한 VEGFR2 신호전달이 종종 Tie2의 활성도를 저지하기 때문에 수행되었다. 각 실험에서, 100μM AXT107이 더 낮은 농도의 AXT107에 대해서 명백한 결과를 제공하였으므로 사용되었다.
(도 3a에 도시된 바와 같은) 면역형광 검정으로부터의 관찰과 일관되게, 증가된 양의 Tie2가 AXT107로 처리된 용해물의 불용성 분획에서 발견되었고; 이 증가된 양은 특정 성장 인자 처리와는 독립적이었다(도 3b 및 도 3c). 유사한 결과는 또한 연결 Tie2의 활성화를 위하여 필수적인 것으로 최근 제시된 보조-수용체인 Tie1에 대해서 관찰되었다(데이터 제시 생략)(Korhonen et al., J Clin Invest. 2016; 126(9):3495-3510).
다음에, 실험은 불용성 분획에 대한 Tie2의 재배치가 Ang2에 의한 Tie2의 활성화에 중요한지의 여부를 결정하기 위하여 수행되었다. Tie2는 AXT107와 함께 또는 이것 없이 Ang2에 노출된 분획화된 MEC 용해물로부터 면역침강되었고, 이어서 포스포-Tie2에 대해서 면역블롯팅되었다. 흥미롭게도, 인산화는 펩타이드-처리된 샘플의 불용성 분획에서만 관찰되었다(도 3d).
이들 데이터는 AXT107 펩타이드에 의한 처리가 EC-EC 연결부에 대한 Tie2의 전좌 및 Tie2의 활성화를 초래하는 것을 입증한다.
실시예 4: AXT107은 α5 및 β1 인테그린 소단위들 간의 상호작용을 교란시킨다
α5β1-인테그린 헤테로다이머 및 αvβ3-인테그린 헤테로다이머는 AXT107의 주된 표적이다. Tie2를 조절하기 위한 인테그린-매개 기전의 가능성을 조사하기 위하여, α5 인테그린 소단위에 대해서 면역블롯팅된 분획화된 MEC 용해물은 α5 인테그린 소단위의 부분이 AXT107로 처리된 샘플에서 불용성 분획에 재배치된 것으로 드러났고(도 4a 및 도 4b); 이 결과는 두 Tie2(도 3d) 및 Tie1(데이터 제시 생략)에 대해서 관찰된 것과 유사하다.
놀랍게도, β1 인테그린 소단위는 긴 노출 시간 및 높은 항체 농도의 사용에도 불구하고 불용성 분획에서 결코 관찰되지 않았다(도 4c 내지 도 4e). 이것은 AXT107에 의한 처리가 인테그린 헤테로다이머에서 α5 인테그린 소단위와 β1 인테그린 소단위 간의 상호작용을 교란시키는 것을 시사한다. β1 인테그린은 α5 인테그린 소단위와 헤테로다이머화되는 유일한 공지된 β 소단위이므로, 불용성 분획에서 여기서 관찰되지 않았던 α5 소단위는 α5β1 이외의 헤테로다이머 인테그린 쌍으로부터 유래된 것일 가능성은 없다. 불행하게도, 높은 배경은 면역형광에 의한 α5 인테그린 단독의 가시화를 손상시켰다. AXT107이 인테그린 헤테로다이머를 해리시킨다는 예기치 않은 발견을 고려해서, 이 발견은 몇 가지 독립적인 검정에서 확인되었다. 트라이톤 X-100 분획화된 용해물 중 α5 인테그린의 면역침강은, α5 인테그린이 AXT107 처리 후 불용성 분획에서 관찰될 수 없었던 반면, β1과의 상호작용이 단지 가용성 분획에서 발견되었던 것으로 드러났다(데이터 제시 생략). 따라서, Tie2와 헤테로다이머화된 α5β1 인테그린 간의 상호작용은 EC-ECM 계면에서 Tie2를 유지하는 것으로 나타난다. 이것은, Tie2가 α5 소단위의 부재 하에 β1 인테그린과 상호작용하지 않는다는 보고와 일치하며(Cascone et al., J Cell Biol. 2005; 170(6):993-1004); 이들 인테그린 헤테로다이머의 파괴는 EC-EC 연결부에서 그리고 커다란 클러스터에서 Tie2-함유 복합체의 형성을 허용한다.
또한, α5 소단위와 β1 소단위 간의 상호작용의 변화는 형광 현미경법에 의해 뚜렷한 반점으로서 α5 인테그린 소단위와 β1 인테그린 소단위 간의 개별적인 상호작용을 가시화할 수 있는 Duolink™ 기술을 사용해서 더 조사되었다. 트라이톤 X-100 분획화 연구로부터의 결과와 일관되게(도 4a 내지 도 4e), α5 인테그린 소단위와 β1 인테그린 소단위 간의 상호작용은 비히클 단독에 비해서 AXT107로 처리된 단일층에서 유의하게 저감되었다(도 4f 및 도 4g).
최종적으로, α5 인테그린 소단위가 β1 인테그린와의 그의 해리 후 Tie2와 복합체화된 채로 있는지의 여부가 결정되었다. 도 4h 및 도 4i에 도시된 바와 같이, α5 인테그린은 Tie2의 면역침강 후 펩타이드-처리된, 불용성 분획에서 관찰되었다.
이들 데이터는, AXT107 펩타이드에 의한 처리가 헤테로다이머로부터 α5 인테그린 및 β1 인테그린 소단위를 해리시키는 것을 입증한다.
흥미롭게도, β1 인테그린의 넉다운은 Akt 인산화를 감소시키는 것으로 제시되었고; 이것은 α5 인테그린 넉다운 또는 펩타이드 처리로부터의 결과를 제한한다. 가능한 설명으로서, β1은 인테그린의 가장 무차별적이고, 이의 단백질 수중의 감소는, 비교적-특이적 α5 인테그린의 넉다운 또는 인테그린 수준이 일정한 채로 있지만 저해되는 조건과 비교해서, Tie2-의존적 및 Tie2-독립적 둘 다에서 더욱 세포 활성도에 영향을 미칠 수 있다. 종합하면, 이들 지견은 Tie2의 하류에서 신호전달 경로의 우선적인 활성화에서 인테그린의 중요성을 강조한다.
실시예 5: AXT107에 의한 처리는 내피 세포 연결을 강화시키고 협소화시킨다
AXT107이 α5β1 인테그린의 소단위들 간의 상호작용의 교란을 통해서 Tie2의 활성화를 강화시키는 것이 입증되었지만, 이하의 실험은 이 활성도의 기능적 결론을 결정하도록 수행되었다.
Tie2 신호전달은 혈관 투과성의 주된 조절자이고, 이 활성도의 기능장애는 증가된 황반 부종 및 질환 진행에 기여하는 것으로 공지되어 있다. 구체적으로는, Tie2는 인접한 세포 상의 Tie2 수용체와의 트랜스 상호작용의 형성을 통한 세포-세포연결부 및 세포-세포 연결부를 통한 연속적인 VE-카드헤린 복합체의 재편성을 강화시킨다.
Ang1에 의한 Tie2 활성화의 이전의 보고와 일관되게, VE-카드헤린의 총 수준은 3시간의 AXT107 및 Ang2 처리 후에 변하지 않은 채로 유지되었다(도 5a). 그러나, 면역형광 영상화는 VE-카드헤린 연결부의 구조에 명확한 변화를 드러냈다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 낮은 농도에서, VE-카드헤린의 분포는 AXT107의 증가 농도로 점진적으로 더 평활하지만 외관에서 불연속적이고 들쭉날쭉하였다. 이들 연결부의 들쭉날쭉함은 세포 내 액틴의 구조와 관련된다. AXT107 처리 없이(도 5b 좌측 칼럼), 방사상 액틴 섬유는 세포를 가로질러 배열되지만 AXT107의 농도 증가(도 5b 에서의 나머지 칼럼과 비교, 또한 도　5c 참조)에 따라 더 피질로 되었다. 방사상 액틴은 투과성을 증가시키기 위하여 세포를 떨어뜨려 잡아당기도록 기능하는 한편 연결 액틴은 작은 당김에 작용하지 않고 따라서 감소된 혈관 투과성을 초래한다.
Tie2의 인산화는 Rap1-GTPase 경로를 자극시켜서, 액틴 재배열과 연관된 하류 모터 단백질 미오신 경쇄 2(MLC2)의 인산화의 저감을 초래하는 것으로 알려져 있다. 도 5d에 도시된 바와 같이, MLC2의 인산화는 AXT107 및 Ang2에 의한 처리 후에 용량-의존적 방식으로 저감된다.
AXT107에 의한 내피 세포 연결부에서의 VE-카드헤린, 액틴, 및 Tie2의 재편성은 펩타이드에 의한 처리가 세포-세포 상호작용을 안정화시키는 것을 시사한다. 이들 연결부의 온전성은 또한 세포간 개구부의 크기를 제어함으로써 단층 투과성의 조절에 있어서 중요하다. EC 투과성에 대한 AXT107의 효과는 투과성 Transwell® 기질 상에 파종된 MEC 단일층을 가로지르는 FITC-표지된 덱스트란의 내피관통 확산에 의해 더욱 조사되었다. 이 검정의 개략도가 도 5f에 도시되어 있다.
도 5g에 도시된 바와 같이, Ang2 또는 AXT107 단독에 의한 처리는 단층을 가로지르는 FITC-덱스트란 확산에 영향을 미치는 반면, VEGF 처리는 투과성(무의미하지만)을 단독으로 또는 Ang2와 조합하여 증가시키는 것으로 나타내었다. 흥미롭게도, Ang2를 단독으로 또는 VEGF와 조합하여 100μM AXT107로 사전 항온처리된 단일층에 첨가하는 것은, 성장 인자 단독으로 처리된 세포와 비교할 때 상부 챔버 내로의 FITC-덱스트란 확산의 유의한 감소를 나타내었다. 유사하지만 무의미한 경향이 또한 펩타이드의 존재 유무에서 VEGF에서 처리된 단일층 사이에서 관찰되었다.
이들 데이터는 AXT107 펩타이드에 의한 처리가 F-액틴 및 VE-카드헤린의 재편성을 통한 감소된 단층 투과성을 초래하는 것을 입증한다.
Tie2 신호전달의 조절에서의 인테그린 상호작용의 중요성은 자연적 기전이 이것을 위하여 유기체 내에서 존재할 수 있는 것을 시사한다. 연골 올리고머 기질 단백질(cartilage oligomeric matrix protein: COMP)-Ang1에 의한 EC의 처리는 Tie2의 연결 재배치를 유도하는 것으로 제시되었는데, 이것은 아직 알려지지 않은 기전을 통해서 β1 인테그린으로부터 Tie2의 해리를 자극시킬 수 있는 것을 시사한다. 흥미롭게도, Ang1 및 Ang2의 C-말단의 차이는 β1 인테그린과의 그들의 상호작용을 변경시켜서, 결과적으로 단지 Ang2에 의해서 활성화될 수 있는 것으로 판명되었다.
이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 본 명세서에 개시된 데이터는, Tie2의 AXT107-매개 활성화를 위한 모델을 제공한다. 도 6의 맨 위에 예시된 바와 같이, AXT107의 부재 시, (1) Ang2는 EC-ECM 계면에서 인테그린 α5β1 헤테로다이머와 복합되어 Tie2를 약하게 활성화시키고, 이것은 (2) 증식 신호(예컨대, ERK1/2)를 우선적으로 활성화시킨다. (3) 활성 MLC 키나제(MLCK)는 MLC3을 활성화시키고, 세포 내 방사상 액틴 스트레스 섬유의 형성 및 EC-EC 세포 연결부에서의 장력을 초래한다. 그러나, AXT107의 존재 시, 도 6의 하부에서, (4) α5 인테그린은 β1 인테그린으로부터 분리시키고 (5) 연결부를 가로질러 커다란 복합체 및/또는 트랜스-상호작용을 형성하도록 Tie2와 함께 EC-EC 연결부로 이동한다. (6) 이들 복합체는 Tie2의 인산화를 강화시키고 (7) Akt- 및 STAT3-매개 생존 경로를 활성화시킨다. 또한, (8) MLC 포스파타제는 RAP1 또는 RAC1 경로를 통해서 활성화되어, MLC2 활성도의 저감, 피질 액틴의 증가 및 연결부의 안정화를 초래한다.
실시예 6: 생체내 , 예시적인 인테그린 -결합 생체모방체는 Tie2 인산화를 강화시킨다
생체내 Tie2 활성화에 대한 AXT107의 효과를 조사하기 위하여, 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity: ROP) 마우스 모델을 사용하였다. 이 시스템에서, P7 새끼(pup)를 5일 동안 75% O2 중에 배치하고, 정상 산소 상태로의 새끼의 복귀 시 고산소혈증으로부터의 망막 모세혈관 밀도의 손실 및 신생 혈관형성의 신속한 유도를 유발시킨다. 여기서, 펩타이드의 생체내 전위는 눈 혈관 모델을 이용해서 입증되었다. 유리체 중 Ang2의 증가된 수준은 각종 망막증에서 혈관 누출 및 황반 부종에 기여한다.
이하의 예시적인 방법 및 물질이 상기 실시예에서 사용되었다.
세포 배양 및 시약
인간 진피 미세혈관 내피 세포(Lonza)를 EBM-2MV 배지(Lonza)에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지시키고, 2 내지 7회 통과를 통해서 사용하였다. 해당하는 경우, 세포는 보충물 없는 EBM-2 배지(Lonza)에서 기아시킨 혈청이었다. FITC-덱스트란 투과성 검정을 위하여, 페놀 레드-무함유 배지는 자가-형광을 피하기 위하여 사용하였다. AXT107은, 고상합성에 의해 New England Peptide사에서 제조되었고, 동결건조되고, 100% DMSO에 용해되었다. 희석 후, 바람직하게는, DMSO 농도는 0.25%를 초과하지 않았다.
웨스턴 블롯팅
Ang1/2 신호전달 조사를 위하여, 세포 배양 접시(10㎝ 직경)를 5 ㎍/㎖ 파이브로넥틴(FN1; Sigma-Aldrich, 미주리주의 세인트루이스 소재)으로 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 이어서, FN1 용액을 흡입에 의해 제거하고, 5x106 미세혈관 내피 세포(MEC; Lonza, 메릴랜드주 워커스빌 소재)를 EGM-2MV 배지(Lonza)에 플레이팅하고, 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 세포를 혈청-무함유 EGM-2 베이스 배지(Lonza)에서 16시간 동안 혈청 기아시켰다. AXT107(0 내지 100μM, 표시된 바와 같음)을 이어서 각 배양액에 첨가하고, 37℃에서 75시간 동안 항온처리하였다. 이어서 배양액을 1mM 바나듐산나트륨(New England Biolabs, 매사추세츠주 입시치 소재)으로 15분 동안 처리하여 포스포-Tie2 신호를 증대시키고 나서 추가로 15분 동안 200 ng/㎖ 안지오포이에틴(R&D Systems, 미네소타조 미니애폴리스 소재)으로 자극시켰다. 이어서, 세포를 얼음에 옮기고, Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 빙랭 둘베코의 인산염-완충 식염수(dPBS)로 2회 세척하고, 500㎕의 1x 청색 로딩 완충액(Blue Loading Buffer)(Cell Signaling, 매사추세츠주 댄버스 소재)에 스크레이핑함으로써 수집하였다. 이어서, 용해물 샘플을 초음파 처리하고, 비등시키고, SDS-PAGE에 의해 용해시켰다. 특정 단백질은 1차 항체: Cell Signaling - 포스포-Tie2(Y992)(Cat#: 4221), Tie2(Cat#: 7403), 포스포-Stat3(Y705)(Cat#: 4113), Stat3(Cat#: 4904), 포스포-Akt(S473)(Cat#: 4058), Akt (Cat#: 9272), 포스포-p44/42 MAPK (T202/Y204)(Cat#: 4370), p44/42 MAPK(Cat#: 4695); BD Transduction Laboratories - β1 인테그린(Cat#: 610467); Millipore - α5 인테그린(Cat#: AB1928)를 이용해서, 웨스턴 블롯에 의해 식별하고, HRP-접합된 염소 항-토끼 및 양 항-마우스 2차 항체(GE healthcare)로 검출하였다.
트라이톤 X-100 분획화
트라이톤 X-100 가용성 분획과 불용성 분획의 단리는 앞서 기재된 절차(예컨대, 문헌[Lampugnani et al., J Cell Biol. 1995; 129(1):203-217] 참조)에 대한 변형을 이용해서 수행하였다. FN1-코팅된 6-웰 플레이트에 2.5x106개 세포를 파종하고, 위에서 기재된 바와 같이 48시간 동안 배양하였다. 이어서, 배양액을 100μM AXT107 또는 DMSO 비히클로, 그리고 15분 동안 1mM 바나듐산나트륨으로 처리된 EBM-2 배지에서 90분 동안 혈청 기아시켰다. 이어서, 세포를 100 ng/㎖ VEGFA, 400 ng/㎖ Ang2, 또는 PBS 중 하나로 15분 동안 자극시켰다. 이어서 플레이트를 얼음에 옮기고, Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 냉 dPBS로 2회, 그리고 EBM-2 배지로 2회 세척하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 가끔 교반하면서 200㎕의 트라이톤 X-100 추출 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5; 150mM NaCl; 2mM CaCl2; 1% NP-40; 1% 트라이톤 C-100; 및 프로테아제 저해제 칵테일(Cell Signaling, Cat#: 5871)) 중에서 4℃에서 얼음 위에서 30분 동안 항온처리하였다. 추출 완충액을 온화하게 수집하고, 12,000 x g에서 5분 동안 원심분리시켰다. 이어서, 상청액을 125㎕의 3x 청색 로딩 염료(Blue Loading Dye)로 혼합하고, 비등시키고, -20℃에서 트라이톤 X-100 가용성 분획으로서 저장하였다. 나머지 불용성 분획을 세척 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.5; 150mM NaCl; cOmplete™ Mini 프로테아제 저해제 정제(Roche))으로 2회 세척하고, 375㎕의 1x 청색 로딩 염료에 스크레이핑으로 수집하고 나서, 위에서 기재된 바와 같이 원심분리 및 비등시켰다. 이 용해물을 트라이톤 X-100 불용성 분획으로서 -20℃에서 저장하였다. 샘플은 위에서 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 분석하였다.
풀-다운 변동(pull-down variation)을 위하여, 불용성 분획을 대신에 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(Cell Signaling) 및 5mM EDTA로 처리된 RIPA 완충액(Sigma)에 수집하였다. 용해물을 간단히 초음파처리하고, 엔드-오버-엔드(end-over-end) 혼합하면서 항-Tie2(Cell Signaling, Cat#: 4224) 또는 항-α5 인테그린(Millipore; Cat#: AB1928)로 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 20㎕의 Protein Agarose A/G 비즈(Santa Cruz)를 첨가하고, 샘플을 또 다른 시간 동안 항온처리하였다. 비즈를 1,500 x g 및 4℃에서 원심분리에 의해 수집하고, PBS로 4회 세척하고, SDS-기반 청색 로딩 염료(Cell Signaling)에 재현탁시키고, 비등시키고, SDS-PAGE에 의해 용해시켰다.
면역형광
절반 웰 크기를 가진 유리-바닥, 96-웰 플레이트를 10 ㎍/㎖ FN1로 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 이어서, FN1 용액을 흡입에 의해 제거하고, 플레이트에 EGM-2MV 배지 중 4x103 MEC를 파종하였다. 24시간 후에, 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS로 1회 세척하고 죽은 세포를 제거하고, 세포를 추가로 24시간 동안 성장시켰다. 3시간 지속 처리(즉, VE-카드헤린)를 위하여, 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS로 2회 세척하고, EBM-2에서 90분 동안 혈청 기아시켰다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 200 ng/㎖ Ang2 또는 PBS 및 다양한 농도의 AXT107 또는 DMSO를 함유하는 100㎕의 EBM-2 배지에서 3시간 동안 처리하였다. 15분-처리된 샘플(즉, 포스포-Tie2)에 대해서, 세포를 165분 동안 EBM-2 배지에서 혈청 기아시키고, EBM-2 중 다양한 농도의 AXT107 또는 DMSO로 90분 동안 배양시키고, 최종적으로 펩타이드가 보충된 PBS 또는 200 ng/㎖ Ang2로 15분 동안 자극시켜 동일 농도를 유지시켰다. 이들 시간은, 두 처리 절차가 동일 시간에 완료되도록 선택하였다. 이어서, 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 냉 dPBS로 2회 세척하고, 15분 동안 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 이어서, 포르말린 용액을 제거하고, 웰을 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 차단 완충액(5% 정상 염소 혈청; Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS 중 0.3% 트라이톤 X-100)에서 차단시키고, 항체 희석 완충액(1% BSA; Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS 중 0.3% 트라이톤 X-100) 중에서 1:150으로 희석된 포스포-Tie2(Y992)(R&D Systems; Cat#: AF2720) 또는 VE-카드헤린(Cell Signaling; Cat#: 2500)에 대해서 1차 항체로 16시간 동안 염색하였다. 이어서, 웰을 dPBS로 3회 세척하고, 항체 희석 완충액 중에서 1:300으로 희석된 Alexafluor 488-접합된 염소 항-토끼 2차 항체(Cell Signaling; Cat#: 4412)로 1시간 동안 항온처리하였다. 이어서, 웰을 2회 세척하고, PBS 중에서 1:20으로 희석된 Alexafluor 555-접합 팔로이딘(Cell Signaling; Cat#: 8953)으로 20분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 dPBS에서 재차 2회 세척하고, DAPI로 20분 동안 염색하고, 영상화를 위하여 dPBS로 용액 교환하였다. 세포는 BD 경로 855 시스템(BD pathway 855 system) 및 애토비전 소프트웨어(Attovision software)(BD Biosciences)를 사용하여 영상화하였다.
Duolink 단백질 상호작용 분석
유리 바닥, 96-웰 플레이트를 면역형광 실험에 대해서 위에서 기재된 바와 같이 FN1로 코팅하고, MEC로 파종하였다. 48시간 동안 성장 후에, 세포를 3시간 동안 혈청 기아시키고, 100μM AXT107 또는 DMSO 비히클로 90분 동안 처리하고, Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS로 2회 세척하고, 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS 중 5% 정상 염소 혈청; 0.3% 트라이톤 X-100에서 1시간 동안 차단시키고, 1% BSA 및 0.1% 트라이톤 X-100과 함께 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 PBS 중에서 토끼 항-α5 인테그린 및 마우스 항-β1 인테그린 항체로 4℃에서 하룻밤 항온처리하였다. 상호작용 반점은 제조사의 지시에 따라서 DUOLINK 녹색 검출 시약을 사용해서 발색시키고 BD 경로 855 시스템을 사용해서 검출하였다.
FITC Transwell 투과성 검정
Transwell, 24-웰 삽입물(Corning)을 37℃에서 2시간 동안 7.5㎍/cm2 FN1로 코팅하고, 흡입해내고, 이어서 실온에서 30분 동안 건조시켰다. 이어서, 웰에 100㎕의 EBM-2 배지(페놀 레드 없음)에서 7.5x104 MEC를 파종하고, 실온에서 30분 동안 정치시켰다. 이어서, 1㎖의 EGM-2 배지를 하부 챔버에 첨가하고 상부 챔버에 추가로 200㎕를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 항온처리하고, 그 후 배지를 흡입해내고, 추가의 7.5x104 MEC를 위에서 기재된 바와 같이 각 웰에 파종하였다. 37℃에서 48시간 후에, 배지를 두 챔버로부터 흡입해내고, 세포를 Ca2 + 및 Mg2 +를 함유하는 dPBS에서 2회 세척하였고, 한번은 EBM-2 배지(페놀 레드 없음)로, 그리고 EBM-2 배지에서 기아시킨 혈청을 두 챔버에 2시간 동안 37℃에서 적용하였다. 이 항온처리 후에, 100μM AXT107 또는 등량의 DMSO 비히클을 첨가하고 추가로 90분 동안 항온처리하였다. 이어서, 상부 챔버에서, 세포를 200 ng/㎖ Ang2, 100 ng/㎖ VEGFA 둘 다, 또는 PBS 대조군으로 처리하고, 이어서, 하부 챔버에서, 세포를 25 ㎍/㎖ FITC-덱스트란(40 kDa MW)으로 처리하였다. AXT107을 또한 100μM의 농도로 유지되도록 두 챔버에 첨가하였다. 3시간 후에, 각 웰의 상부 챔버로부터 10㎕를 제거하여 투명한 하부의 96-웰 플레이트에서 90㎕의 물과 혼합하였다. 각 샘플에 대한 형광값은 Perkin Elmer 플레이트 판독기를 사용해서 계산하였다.
참고문헌
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Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
SEQUENCE LISTING <110> AsclepiX Therapeutics, LLC The John Hopkins University <120> COMPOUNDS AND METHODS FOR ACTIVATING TIE2 SIGNALING <130> ASX-002PC <150> US 62/403,786 <151> 2016-10-04 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Leu Arg Arg Phe Ser Thr Ala Pro Phe Ala Phe Ile Asp Ile Asn Asp 1 5 10 15 Val Ile Asn Phe 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> M, A, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> F, A, Y, or G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> M, A, G, D-Alanine, or norleucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> F, A, Y, G, or 4-chlorophenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Aminobutyric acid, G, S, A, V, T, I, L, or Allylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Aminobutyric acid, G, S, A, V, T, I, L, or Allylglycine <400> 2 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<220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> D-Leucine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(20) <223> D-Phenylalanine <400> 24 Xaa Arg Arg Phe Ser Thr Ala Pro Phe Ala Phe Ile Asp Ile Asn Asp 1 5 10 15 Val Ile Asn Xaa 20 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2-Aminobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> 2-Aminobutyric acid <400> 25 Phe Xaa Asn Ile Asn Asn Val Xaa Asn 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 26 Phe Thr Asn Ile Asn Asn Val Thr Asn 1 5 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 27 Phe Ile Asn Ile Asn Asn Val Ile Asn Phe 1 5 10 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 28 Phe Ser Asn Ile Asn Asn Val Ser Asn Phe 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 29 Phe Ala Asn Ile Asn Asn Val Ala Asn Phe 1 5 10 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Allylglycine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Allylglycine <400> 30 Phe Xaa Asn Ile Asn Asn Val Xaa Asn Phe 1 5 10 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 31 Phe Val Asn Ile Asn Asn Val Val Asn Phe 1 5 10 <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 32 Phe Ile Asp Ile Asn Asp Val Ile Asn Phe 1 5 10 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 33 Phe Ile Asp Ile Asn Asp Val Ile Asn Trp 1 5 10 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 34 Phe Thr Asp Ile Asn Asp Val Thr Asn 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2-Aminobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> 2-Aminobutyric acid <400> 35 Ala Xaa Asn Ile Asn Asn Val Xaa Asn Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> 4-chlorophenylalanine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> 2-Aminobutyric acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> 2-Aminobutyric acid <400> 36 Xaa Xaa Asn Ile Asn Asn Val Xaa Asn Phe 1 5 10

Claims (31)

  1. 환자에서 Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성(permeability)과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 콜라겐 IV-유래 생체모방 펩타이드를 Tie-2-의존적 혈관 또는 림프관 투과성을 저감시키는데 유효한 양으로 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 병태는 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 습성 연령-관련 황반변성(습성 AMD), 배경형 당뇨병성 망막병증(background diabetic retinopathy), 암, 인플루엔자, 출혈열, 또는 대뇌 말라리아인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 병태는 종양 성장 또는 전이인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 병태는 림프관 기능장애와 연루된 염증성 병태인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 병태는 암에 대한 화학요법 전에 혈관 투과성인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩타이드는 종양 혈관을 정상화시키는데 유효한 양으로 투여되고 나서, 화학요법을 투여하는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 병태는, 선택적으로 NSCLC 또는 SCLC인 폐암, 간암, 삼중-음성 유방암, 또는 교모세포종인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 병태는 패혈증인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 병태는 모세혈관 누출 증후군인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 병태는, 선택적으로 급성 호흡 곤란 증후군, 만성 천식, 또는 만성 폐쇄성 폐 장애(COPD)인, 폐의 염증성 병태인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 병태는 혈관부종인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 병태는 혈관 누출 증후군인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  13. 제2항에 있어서, 서열번호 1 내지 4의 펩타이드를 포함하는 조성물이, 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, 습성 연령-관련 황반변성(습성 AMD), 또는 배경형 당뇨병성 망막병증을 지닌 환자에게 약 100㎍ 내지 약 1000㎍의 펩타이드의 용량으로 그리고 단지 월 1회의 주사 빈도로 투여되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 주사 빈도는 단지 약 2개월마다인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 주사 빈도는 단지 약 3개월마다인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 펩타이드는 성공하지 못한 VEGF 차단 또는 저해제 요법 후에 투여되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 병태는 VEGF 차단 또는 저해제 요법에 대해 난치성 또는 단지 부분-반응성인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 펩타이드는 성공하지 못한 VEGF 차단 또는 저해제 요법 후에 투여되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 펩타이드는 VEGF 차단 또는 저해제 요법에 대한 대체로서 투여되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 펩타이드는 VEGF 차단 요법과 병용하여 투여되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산의 서열을 포함하는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 콜라겐 IV의 α5 원섬유, 또는 이의 생체모방체로부터 유래되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 펩타이드는,
    LRRFSTMPFMF(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 5),
    LRRFSTMPAMF(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 6),
    LRRFSTMPFAF(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 7),
    LRRFSTMPFMA(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 8),
    LRRFSTMPF(Nle)F(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 9),
    LRRFSTMPFM(4-ClPhe)(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 10),
    LRRFSTMPFMFSNINNVSNF(서열번호 11),
    LRRFSTMPFMFANINNVANF(서열번호 12),
    LRRFSTMPFMFININNVINF(서열번호 13),
    LRRFSTMPFMFTNINNVTNF(서열번호 14),
    LRRFSTMPFMF(AllyGly)NINNV(AllyGly)NF(서열번호 15),
    LRRFSTMPFMFVNINNVVNF(서열번호 16),
    LRRFSTMPFdAFININNVINF(서열번호 17),
    LRRFSTMPFAFININNVINF(서열번호 18),
    LRRFSTAPFAFININNVINF(서열번호 19),
    LRRFSTAPFdAFIDINDVINF(서열번호 20),
    LRRFSTAPFAFIDINDVINW(서열번호 21),
    dLRRdLRRFSTAPFAFIDINDVINF(서열번호 22),
    LRRFSTAPFAFIDINDVINdF(서열번호 23) 또는
    dLRRFSTAPFAFIDINDVINdF(서열번호 24)인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 펩타이드는,
    F(Abu)NINNV(Abu)N(서열번호 25),
    FTNINNVTN(서열번호 26),
    FININNVINF(서열번호 27),
    SNINNVSNF(서열번호 28),
    FANINNVANF(서열번호 29),
    F(AllyGly)NINNV(AllyGly)NF(서열번호 30),
    FVNINNVVNF(서열번호 31),
    FIDINDVINF(서열번호 32),
    FIDINDVINW(서열번호 33),
    FTDINDVTN(서열번호 34),
    A(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 35), 또는
    (4-ClPhe)(Abu)NINNV(Abu)NF(서열번호 36)인, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 나노입자 또는 마이크로입자에 접합되거나 또는 장입되는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 나노입자 또는 마이크로입자는 PLGA-PEG를 포함하는, Tie-2-관련 혈관 또는 림프관 투과성과 연루된 병태를 예방 또는 치료하는 방법.
  27. 펩타이드 또는 이의 입자 제형으로서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 36 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 그리고 선택적으로 서열번호 5 내지 36으로부터 선택된 서열을 갖는 펩타이드인, 펩타이드 또는 이의 입자 제형.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제형은 100㎍ 내지 약 1000㎍의 펩타이드 제제를 포함하는, 펩타이드 또는 이의 입자 제형.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제형은 입자로의 캡슐화를 포함하지 않는, 펩타이드 또는 이의 입자 제형.
  30. 제27항에 있어서, 상기 제형은 용량당 약 1㎎ 내지 약 10㎎을 포함하는, 펩타이드 또는 이의 입자 제형.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제형은, 선택적으로 유리 펩타이드와 함께, 마이크로입자로의 캡슐화를 포함하는, 펩타이드 또는 이의 입자 제형.
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