KR20140142733A - Egfl7 표적화 및/또는 결합 폴리펩타이드, 그리고 신생혈관생성을 저해하는 방법 - Google Patents

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Abstract

EGFL7 또는 그의 수용체를 표적화하고/하거나 그에 결합함으로써, EGFL7 신생혈관생성촉진 활성을 저감시키는 폴리펩타이드가 제공된다. 이와 같이 해서, 폴리펩타이드는, 일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성과 연루된 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암의 치료에 유용하다.

Description

EGFL7 표적화 및/또는 결합 폴리펩타이드, 그리고 신생혈관생성을 저해하는 방법{EGFL7 TARGETING AND/OR BINDING POLYPEPTIDES AND METHODS FOR INHIBITING ANGIOGENESIS}
본 발명은 신생혈관생성(angiogenesis)에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 EGF-유사 도메인 7(EGFL-7) 상호작용 폴리펩타이드, 및 신생혈관생성을 저해하기 위하여 이러한 폴리펩타이드를 이용하는 방법뿐만 아니라, 병리학적 신생혈관생성과 연루된 병태의 치료, 진단 및 영상화(imaging) 방법에 관한 것이다.
혈관 공급의 개발은, 특히 배아 및 종양 등과 같은 활성적으로 성장하고 있는 조직에서, 많은 생리학적 및 병리학적 과정을 위한 기본적인 요건이다. 이러한 조직은, 신생혈관생성으로 알려져 있는 복합적이지만 규칙적인 이벤트를 통해 새로운 혈관형성을 촉진시키는 신생혈관생성 촉진 인자를 생성함으로써 적절한 혈관 공급을 위한 필요를 충족시킨다. 종양 성장의 경우에, 신생혈관생성은 과다형성으로부터 종양형성으로의 이행을 위하여 그리고 종양의 성장과 전이를 위한 영양분을 제공하기 위하여 중요한 것으로 여겨진다. 이와 같이 해서, 신생혈관생성은 종양이 약 1㎜를 초과하는 직경으로 성장하는 것을 가능하게 하고 또한 전이성 종양 세포의 보급과 후속의 재집락화를 위한 경로의 제공을 가능하게 한다.
따라서, 신생혈관생성은 암에서의 중요한 바이오마커 및 치료적 표적으로서 출현하고 있다. 현재의 비침습적 혈관 영상화 접근법의 대부분은 혈관 밀도를 예측할 수 있지만, 전립선암에서의 종양 혈관계의 최근의 포괄적인 분석은, 미세혈관 밀도가 임상적 인자를 조정한 후에 암-특이적 사망률과 연관되지 않은 것으로 결론지어졌다. 그러나, 혈관의 형상과 크기는 고도로 예측적인 바, 대부분의 불규칙적인 형상의 혈관을 지니는 남성이 17.1배 이상으로 치명적인 질환을 발병할 가능성이 있다(Mucci et al., 2009, J Clin Oncol, 27:5627-33).
혈관 발달 과정은 치밀하게 조절된다. 오늘날까지, 세포를 둘러싸는 것에 의해 생기는 상당한 수의 분자, 주로 분비되는 인자는, 내피 세포 분화, 증식, 이동 및 합체를 끈 모양 구조로 조절하는 것으로 밝혀져 있었다. 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 신생혈관생성을 자극하는데 그리고 혈관 투과성을 유발하는데 관여하는 주된 인자로서 확인된 바 있다. 항-VEGF 단클론성 항체 혹은 기타 VEGF 작용의 저해제는 종양 및 각종 안구내 신생혈관 장애의 치료를 위한 유망한 후보이다. 이러한 항체는, 예를 들어, EP 제817,648호, 제WO 1998/45331호 및 제WO 1998/45332호에 기재되어 있다.
또한, 세포외 기질(extracellular matrix: ECM)-관련 단백질 지정(associated protein designated) 표피 성장 인자-유사 7(EGFL7)는 내피 세포에 의해 발현되고 또한 신생혈관생성에서 역할을 지니는 것으로 판명되었다(Parker et al., 2004, Nature, 428:754-758; Nichol and Stuhlmann, 2012, 119:1345-1352). 일부는 종양의 치료를 위하여 저해성 항-EGFL7 단클론성 항체의 사용을 제안한 반면(미국 제2007/0031437호, 미국 제2009/0297512호, 미국 제2010/0203041호 및 미국 제2010/0285009호), 다른 일부는 종양의 치료를 위하여 EGFL7의 활성을 증대시키기 위하여 EGFL7의 효능제(agonist)의 사용을 제안하였다(미국 특허 제7,947,278호).
혈관 형상과 크기를 추정함에 있어서 그리고 EGFL7을 표적화하는 상이한 접근법들을 확인하는 것을 도울 수 있는 대안적인 영상화 접근법에 대한 요구가 여전히 있다.
본 발명은, 양상들에 있어서, EGFL7 또는 그의 수용체를 표적화하고/하거나 이에 결합함으로써 EGFL7 신생혈관생성촉진 활성(pro-angiogenic activity)을 감소시키는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 이와 같이 해서, 폴리펩타이드는, 일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성과 연루된 질환, 장애 또는 병태, 예를 들어, 암의 치료에서 유용하다.
EGFL7은 활성적인 신생혈관생성을 받고 있는 내피에서 특이적으로 발현된다. 따라서, EGFL7에 결합하거나 이와 상호작용하는 폴리펩타이드는 또한, 일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성으로 고통받고 있는 대상체를 영상화하는 방법에서 용도를 발견하고 있다. 다른 양상에 있어서, 이러한 폴리펩타이드는 또한 표적화된 항혈관신생 요법(anti-angiogenic therapy)을 위한 표적화 모이어티로서 유용하다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 약제학적 제제에 직접 혹은 간접적으로 부착시킴으로써, 폴리펩타이드는 활성적인 신생혈관생성 구역으로 약제학적 제제를 전달하는 것을 도울 수 있으므로, 해당 약제학적 제제를 목적으로 하는 영역으로 표적화할 수 있다.
종양에서의 EGFL7의 존재는 또한 예후를 예고할 수도 있고, 따라서 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 또한, 다른 양상에 있어서, 암으로 고통받고 있는 대상체에서 예후를 예측하는 방법에서 유용하다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 또한, 양상들에서, 병리학적 신생혈관생성과 연루된 암 또는 기타 질환, 장애 또는 병태를 스크리닝 및/또는 진단하는 방법에서의 용도를 발견하고 있다.
일 양상에 따르면, EGFL7의 도메인과 상호작용하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7의 C-말단 도메인과 상호작용하거나, 또는 폴리펩타이드는 EGFL7의 노치 결합 도메인(Notch binding domain)의 외부에서 EGFL7와 상호작용한다.
일 양상에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성을 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 보존성 아미노산 치환을 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14) 또는 RSPGLAPARPRYA(서열번호 15)를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 약 8 내지 약 300개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 250개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 200개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기 또는 약 12 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14) 또는 RSPGLAPARPRYA(서열번호 15)로 이루어져 있다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 HMYFLLGH(서열번호 5) 또는 GSLLVHSFQQLG(서열번호 6)이다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 나노몰 친화도로 EGFL7에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7에 특이적으로 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7의 이합체화 도메인에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7 수용체 결합을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7 활성을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 관형성(tubulogenesis)을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 이동을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 유착을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 신생혈관생성을 조절한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일 양상에 있어서, 표지는 핵 의학 기술을 이용해서 검출 가능하다. 일 양상에 있어서, 표지는 가돌리늄이다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 대상체 내의 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위하여 상기 약제학적 제제에 커플링된다. 일 양상에 있어서, 약제학적 제제는 항-VEGF 항체이다. 일 양상에 있어서, 약제학적 제제는 나노입자를 통해서 상기 폴리펩타이드에 커플링된다.
다른 양상에 따르면, 서열 HMYFLLGH, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 90% 동일성을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 95%, 99% 또는 100% 동일성을 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 보존성 아미노산 치환을 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 약 8 내지 약 300개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 200개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 20개의 아미노산 잔기 또는 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH로 이루어져 있다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 나노몰 친화도로 EGFL7에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7에 특이적으로 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7의 이합체화 도메인에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7 수용체 결합을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7 활성을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 관형성을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 이동을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 유착을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 신생혈관생성을 조절한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일 양상에 있어서, 표지는 핵 의학 기술을 이용해서 검출 가능하다. 일 양상에 있어서, 표지는 가돌리늄이다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 대상체 내의 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위하여 해당 약제학적 제제에 커플링된다. 일 양상에 있어서, 약제학적 제제는 항-VEGF 항체이다. 일 양상에 있어서, 약제학적 제제는 나노입자를 통해서 폴리펩타이드에 커플링된다.
다른 양상에 따르면, 서열 GSLLVHSFQQLG, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 90% 동일성을 포함하는 폴리펩타이드가 제공되되, 여기서 상기 폴리펩타이드는 약 12 내지 약 250개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 GSLLVHSFQQLG, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 95%, 99% 또는 100% 동일성을 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 보존성 아미노산 치환을 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 GSLLVHSFQQLG를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 약 12 내지 약 200개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 20개의 아미노산 잔기 또는 약 12 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 서열 GSLLVHSFQQLG로 이루어져 있다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 나노몰 친화도로 EGFL7에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7에 특이적으로 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7의 이합체화 도메인에 결합한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7 수용체 결합을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 EGFL7 활성을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 관형성을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 이동을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 세포 유착을 조절한다. 일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 신생혈관생성을 조절한다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함한다. 일 양상에 있어서, 표지는 핵 의학 기술을 이용해서 검출 가능하다. 일 양상에 있어서, 표지는 가돌리늄이다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드는 대상체 내의 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위하여 해당 약제학적 제제에 커플링된다. 일 양상에 있어서, 약제학적 제제는 항-VEGF 항체이다. 일 양상에 있어서, 약제학적 제제는 나노입자를 통해서 상기 폴리펩타이드에 커플링된다.
다른 양상에 따르면, DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14), RSPGLAPARPRYA(서열번호 15) 및 그의 생물학적으로 활성적인 변종으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드가 제공된다.
일 양상에 있어서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 해당 핵산을 포함하는 벡터, 및 해당 벡터를 포함하는 세포가 제공된다.
다른 양상에 있어서, 상기 폴리펩타이드, 핵산 또는 세포를, 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항신생혈관제(anti-angiogenic agent), 예컨대, 항-VEGF 항체와 함께 포함하는 조성물 또는 약제(medicament)가 제공된다.
다른 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성을 치료하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성을 치료하기 위한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태이다. 일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성은 암이다.
다른 양상에 있어서, 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 스크리닝하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 검출 가능한 표지를 포함하는 폴리펩타이드를 투여하는 단계 및 상기 대상체를 영상화하여 상기 표지를 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 암시하는 것다.
다른 양상에 있어서, 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 스크리닝하기 위한 본 명세서에 기재된 검출 가능한 표지를 포함하는 폴리펩타이드의 용도가 제공되되, 여기서 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 암시하는 것이다.
일 양상에 있어서, 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서의 병리학적 신생혈관생성의 진단이다. 다른 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태이다. 일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성은 암이다.
다른 양상에 있어서, 암 예후를 예측하는 방법이 제공되되, 상기 방법은 암을 지닌 대상체에게 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 투여하는 단계 및 대상체에서의 폴리펩타이드의 존재를 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 대상체에서의 폴리펩타이드의 존재는 대상체에서의 폴리펩타이드의 부재에 비해서 나쁜 예후를 예고하는 것이다.
다른 양상에 있어서, 대상체에서 암 예후를 예측하기 위한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 용도가 제공되되, 여기서 대상체에서의 폴리펩타이드의 존재는 대상체에서의 폴리펩타이드의 부재에 비해서 나쁜 예후를 예고하는 것이다.
다른 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성으로 고통받는 환자에서의 표적화된 약물 전달 방법이 제공되되, 상기 방법은 대상체에게 본 명세서에 기재된 약제학적 제제와 연관된 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함한다.
다른 양상에 있어서, 표적화된 약물 전달 병리학적 신생혈관생성으로 고통받는 환자에서 표적화된 약물 전달을 위한, 본 명세서에 기재된 약제학적 제제와 연관된 폴리펩타이드의 용도가 제공된다.
일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태이다. 일 양상에 있어서, 병리학적 신생혈관생성은 암이다.
본 발명의 기타 특성 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 실시형태들을 나타내는 특정 실시예는 단지 예시로서 부여되는 것으로 이해할 필요가 있는데, 그 이유는 본 발명의 정신과 범위 내에서 각종 변경과 수정이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
본 발명은 도면을 참조하여 다음의 설명으로부터 더욱 이해될 것이다, 여기서,
도 1은 재조합체 EGFL7 단백질에 대한 고친화도 결합 펩타이드에 대해 OBOC 펩타이드 라이브러리를 선별하기 위한 고효율 전략을 도시한 도면. (a) 비드 상의 비드 접근의 개략적 표현. 항-GST 항체를 통해 단백질 A/G-코팅된 자성 비드에 정제된 재조합체 GST-EGFL7 단백질을 결합시키고, 무작위 8-아미노산 펩타이드를 나타내는 텐타겔(TentaGel) 비드의 라이브러리와 혼합하였다. (b) 표면 상에 자성 비드를 강하게 보유한 고친화도 펩타이드를 나타내는 텐타겔을 자성을 사용하여 단리시켰다. (c) EGFL7-양성 HT1080-tdTomato 세포 및 EGFL7-음성 HT1080-GFP 세포를 사용하는 2차 세포-기반 선별의 개략적 표현. COPAS Biosort 기기(유니온 바이오메트리카(Union Biometrica))를 사용하여 양성 히트 비드(positive hit bead)를 단리시키고, MALDI TOF MS/MS를 사용하여 비드 상에서 펩타이드를 서열분석하였다.
도 2는 재조합체 EGFL7 단백질에 대한 고친화도 결합 펩타이드의 정제(purification) 및 동정을 도시한 도면. (a) 재조합체 GST-EGFL7 단백질의 정제를 나타내는 은-염색 겔(좌). (b) 용리된 분획에 다클론성 항-EGFL7 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. (c) 자성 비드 상에 대한 정제된 EGFL7 단백질의 컨쥬게이션을 확인하는 웨스턴 블롯 분석. (d) 세포 표면 상에 나타낸 EGFL7에 대해 고친화도를 지니는 펩타이드를 확인하기 위한 2차 세포-기반 선별 접근. 다클론성 항-EGFL7 항체를 사용하여 MDA435-GFP 및 HT1080-tdT-EGFL7v5 세포에서의 EGFL7의 발현을 확인하는 웨스턴 블롯 분석(우). 적색 HT1080-tdT 세포(+ EGFL7)와 강하게 관련되지만, 녹색 MDA435-GFP 세포(- EGFL7)와 상호작용을 거의 하지 않는 예시적 히트 비드의 형광 현미경 이미지.
도 3은 서열 GSLLVHSFQQLG(LCE71/LCE77) 및 HMYFLLGH(LCE72/LCE78)가 EGFL7을 발현시키는 인간 내피 세포에 결합되고, 과량의 미표지 펩타이드에 의해 차단된다는 것을 도시한 도면(p>0.001).
도 4는 GSLLVHSFQQLG 및 HMYFLLGH이 대조군(FLAG 펩타이드 및 H2O)과 비교하여 VEGF 및 FGF의 존재에서 매트리겔(Matrigel) 상에서 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC) 발아 및 관형성을 저해하였다는 것을 입증하는 시험관내 신생혈관생성 검정을 도시한 도면. 발아 수준을 HUVEC에 의해 형성된 분지점의 수를 계측함으로써 정량화하였다.
도 5는 GSLLVHSFQQLG 및 HMYFLLGH이 닭 장뇨막(chicken chorioallantoic membrane: CAM) 모델을 사용하여 신생혈관생성이 유의하게 저해되었다는 것을 입증하는 생체내 신생혈관생성 검정을 도시한 도면. HT1080 세포를 섬유 메시 중에서 배양시켜 CAM으로부터 메시 상으로 혈관의 점증(recruitment)을 자극하였다. 신생혈관생성 수준을 가시적 혈관을 포함하는 메시 내에서 그리드의 백분율을 계측함으로써 정량화하였다(화살표에 의해 표시함).
도 6은 유세포분석에 의해 평가한 HUVEC에 의한 플루오레세인-표지된 E7-p72 펩타이드(HMYFLLGH) 흡수를 도시한 도면. (a) 엑손 5를 표적화하는 siRNA를 사용하는 EGFL7의 녹다운을 나타내는 웨스턴 블롯 분석. (b) 음성 siRNA(대조군) 또는 EGFL7 siRNA 중 하나로 처리한 세포 HUVEC에 의한 FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH) 흡수의 유세포 분석. (c) 평균 세포 형광을 나타내는 그래프.
도 7은 인간 내피 세포에서의 E7-p72 펩타이드(HMYFLLGH)의 흡수가 EGFL7 발현에 의존한다는 것을 도시한 도면. (a) EGFL7의 siRNA 표적화 엑손 5를 사용하는 EGFL7의 녹다운을 나타내는 웨스턴 블롯 분석. (b) 음성 siRNA(대조군) 또는 EGFL7 siRNA 중 하나로 처리한 HUVEC에 의한 FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH) 흡수의 유세포 분석(n = 10 000). (c) (b)에서의 유세포 분석 실험으로부터 평균 세포 형광을 도시하는 그래프.
도 8은 인간(서열번호 1), 마우스(서열번호 2), 제노퍼스(xenopus)(서열번호 3) 및 제브라피시(서열번호 4)로부터 유래된 EGFL7의 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 9는 (a) LCE71(GSLLVHSFQQLG) 및 (b) LCE72/E7-p72(HMYFLLGH) 펩타이드가 지시된 생체내 신생혈관생성 검정(DIVAA)을 사용하여 마우스에서 신생혈관생성을 저해한다는 것을 도시한 도면. 막대 그래프는 각 그룹으로부터의 혈관반응기(angioreactor) 관(n = 8)에서 관찰된 신생혈관생성 백분율을 나타낸다. 앤지오리액터를 기저막 추출물(basement membrane extract: BME)로 채웠다. HT1080 세포를 첨가하여 신생혈관생성을 자극하였다. BME(-ve)는 세포 없이 BME만을 함유하는 음성 대조군이다. 일원분산분석(one-way ANOVA) 및 투키 사후검정(tukey post hoc test)을 사용하여 모든 통계를 수행하였다.
도 10은 LCE71(GSLLVHSFQQLG)이 인간 내피 세포의 부착 특성을 변경시지 않는다는 것을 도시한 도면. (a) LCE71(200μM)이 Flag 또는 스크램블 펩타이드와 비교하여 EA.hy926 내피 세포의 세포 유착 특성을 변경시키지 않는다는 것을 나타내는 세포 유착 검정. siRNA를 사용하는 EA.hy926 세포에서의 EGFL7의 녹다운은 세포 유착을 유의하게 감소시켰다(p < 0.01). 세포핵을 훽스트(Hoechst) 염료로 염색하고, 볼로시티(Volocity) 소프트웨어(버전 6.1.2, 임프로비전(Improvision))를 사용하여 영상화하고, 계측하였다. 일원분산분석(one-way ANOVA) 및 투키 사후검정을 사용하여 모든 통계를 수행하였다. (b) 유리 커버슬립 상에서 병소 유착 형성을 나타내는 EA.hy926 세포의 빈쿨린(Vinculin) 염색. 좌측 패널: 빈쿨린(오렌지색) 및 DAPI(파랑색). 우측 패널: 빈쿨린(오렌지색), WGA 원형질막 균주(녹색) 및 DAPI (파랑색)의 합쳐진 이미지. 스케일바, 10㎛.
도 11은 LCE71(GSLLVHSFQQLG)로 처리 시 HUVEC에서의 프로파일링 RTK 활성화를 도시한 도면. (a) 대조군 Flag 또는 LCE71(GSLLVHSFQQLG) 펩타이드(200μM) 중 하나로 4시간 동안 처리한 HUVEC로부터의 용해물과 함께 인큐베이션시킨 49가지 상이한 항-인간 RTK 항체(알앤디 시스템즈(R&D systems))를 나타내는 어레이 막. 항-포스포-HRP 항체와 함께 인큐베이션한 다음 향상된 화학발광을 이용한 처리에 의해 인산화된 RTK를 검출하였다. (b) 포스포-RTK 어레이 좌표(좌) 및 그의 각각의 RTK(우측 표). (c) LCE71(GSLLVHSFQQLG) 펩타이드로 처리 시 HUVEC에서 RTK의 활성화 프로파일을 나타내는 폭포 플롯. (a)로부터의 각 스팟의 평균 신호 강도를 볼로시티(버전 6.1.2, 퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 정량화하였다. LCE71-처리막으로부터 얻은 값을 Flag-처리막으로부터 얻은 값에 대해 정규화하였다.
도 12는 HUVEC에서 Axl 및 VEGFR 1 RTK의 인산화가 LCE71로 치료시 감소된다는 것을 도시한 도면. (a) HUVEC를 Flag(대조군) 또는 LCE71 펩타이드(200μM) 중 하나로 4시간 동안 처리하였다. 단백질 A/G 아가로스 상에 결합된 4G10 항-포스포 항체를 사용하여 면역침전을 수행하였다. 항-Axl, 항-VEGFR1 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. (b) (a)에서 나타낸 웨스턴 블롯으로부터 얻은 각 밴드의 평균 신호 강도를 나타내는 막대 그래프. 볼로시티 소프트웨어(버전 6.1.2, 퍼킨엘머사(PerkinElmer))를 사용하여 정량화를 수행하였다. 세포 용해물로부터 얻은 값을 GAPDH에 대해 정규화하였다.
도 13을 합성된 [68Ga]DOTA-LCE71/LCE72([68Ga]DOTA-GSLLVHSFQQLG/HMYFLLGH)의 방사화학적 순도를 도시한 도면. HPLC 조건: 이동상: 아세토나이트릴/H2O, TFA 0.1%에 의해 구배 10/90 내지 90/10(v/v), 10분, 유속: 1.5㎖/분, 선파이어(Sunfire) RP 분석 칼럼; 크로마토그래피: 유속 계측(검정색); UV(254㎚, 적색).
도 14는 상이한 섬유육종, 인간 전립선, 및 유방암 세포주에 의해 확립된 누드 마우스에서 고형 종양을 처리하기 위한 EGFL7 상호작용 펩타이드의 잠재력을 평가하는 흐름도를 도시한 도면.
본 발명은 EGFL7에 결합되고/되거나 상호작용하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. EGFL7은 활성 신생혈관생성을 겪은 종양 및 다른 조직의 내피에서 상향조절된 단백질이다. EGFL7 발현은, 예를 들어 악성 뇌교종, 간세포 암종 및 비소세포 폐암에서 불량한 예후와 상관관계가 있으며, 임상적으로 적절한 신생물 및 전이에 대한 바이오마커이다.
본 명세서에서, 신생혈관생성을 저해하기 위해 EGFL7 활성을 조절하고/하거나 결합된 신규한 폴리펩타이드의 동정 및 특성규명이 기재된다. 폴리펩타이드는 신규한 '비드 상의 비드' 접근을 사용하여 조합적 펩타이드 라이브러리를 선별함으로써 동정된 다음, 시험관내 및 생체내 항-혈관형성 활성에 대해 시험되었다. 폴리펩타이드는 플루오레세인 염료에 컨쥬게이션되었고, EGFL7-발현 세포에서의 특이적 흡수 및 내재화를 통해 EGFL7 발현을 효과적으로 영상화하는 것으로 발견되었다.
달리 정의되지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 예를 들어, 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)]을 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 참조로서 포함된다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에 정의한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "EGFL7"은 EGFL7 및 EGFL7 변종의 천연 폴리펩타이드 또는 돌연변이체 폴리펩타이드 서열을 지칭한다.
"천연 서열 EGFL7"은 그의 제조방법 또는 종에 상관없이, 천연으로부터 유래된 EGFL7과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 EGFL7은 자연적으로 생기는 인간 EGFL7, 뮤린 EGFL7, 제노퍼스 EGFL7, 제브라피시 EGFL7 또는 어떤 다른 종으로부터의 EGFL7의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 전형적인 전장 천연 서열 인간 EGFL7 아미노산 서열은 서열번호 1에서 제시된다. 천연 서열 마우스 EGFL7 아미노산 서열은 서열번호 2에서 제시되고, 천연 서열 제노퍼스 EGFL7은 서열번호 3에서 제시되며, 천연 서열 제브라피시 EGFL7은 서열번호 4에서 제시된다. 이들 서열은 도 8에 나타낸다. 이러한 천연 서열 EGFL7은 천연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합체 및/또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어 "천연 서열 EGFL7"은 구체적으로는 자연적으로 생기는 프레프로, 프로 및 성숙 형태 및 절단된 형태의 EGFL7, 자연적으로 생기는 변종 형태, 및 자연적으로 생기는 대립유전자 변종을 포함한다.
"EGFL7 변종"은 천연 서열 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 변형 및/또는 치환에 의해 인간, 뮤린, 제노퍼스 및 제브라피시 EGFL7 각각에 대해 서열번호 1 내지 4에서 시작되는 것과 같은 천연 서열 EGFL7 폴리펩타이드의 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 활성적인 EGFL7 폴리펩타이드이다. EGFL7 변종은 일반적으로 서열번호 1의 인간 EGFL7과 같은 천연 서열 EGFL7과 100% 미만의 서열 동일성을 가진다. 그러나 보통, 생물학적으로 활성적인 EGFL7 변종은 자연적으로 생기는 EGFL7, 예컨대 서열번호 1의 인간 EGFL7의 아미노산 서열과 적어도 약 70% 아미노산 서열 동일성, 전형적으로는 적어도 약 75%, 더 전형적으로는 적어도 약 80%, 훨씬 더 전형적으로는 적어도 약 85%, 훨씬 더 전형적으로는 적어도 약 90%, 및 훨씬 더 전형적으로는 1% 증분으로 적어도 약 95% 내지 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 지니는 아미노산 서열을 가질 것이다. EGFL7 변종은 대응하는 천연 서열 EGFL7 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하는 적어도 3개의 아미노산의 펩타이드 단편을 포함한다. EGFL7 변종은 또한 EGFL7 폴리펩타이드를 포함하되, 하나 이상의 아미노산 잔기는 천연 EGFL7 서열의 N- 또는 C-말단 또는 그 내에 첨가된다. EGFL7 변종은 또한 다수의 아미노산 잔기가 결실되거나, 선택적으로 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 EGFL7 폴리펩타이드를 포함한다. EGFL7 변종은 또한, 예를 들어 자연적으로 생기는 아미노산이 아닌 모이어티로 치환에 의해 또는 비자연적으로 생기는 아미노산을 생성하는 아미노산 잔기를 변형함으로써 공유적으로 변형될 수 있다. EGFL7 변종은 헤파린 결합 도메인을 포함할 수 있다.
"아미노산 서열 동일성%"는 서열을 정렬하고, 필요하다면, 갭을 도입해서 최대 서열 동일성%을 달성한 후, 그리고 서열 동일성의 부분으로서 어떤 보존적 치환을 고려하지 않고, 본 발명의 폴리펩타이드와 같은 관심 대상의 서열에서의 잔기와 동일한 후보 서열 내 아미노산 잔기의 백분율로서 본 명세서에서 정의된다. 후보 서열 내로 N-말단, C-말단 또는 내부 확장, 결실 또는 삽입 중 어떤 것도 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주지 않는 것으로 해석될 것이다. "BLAST"와 같은 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램이 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 명세서의 목적에 대해 "활성인" 또는 "활성"은 천연 또는 자연적으로 생기는 EGFL7의 생물학적 및/또는 면역학적 활성을 지칭하되, "생물학적" 활성은 천연 또는 자연적으로 생기는 EGFL7에 의해 야기되는 생물학적 기능(저해적 또는 자극적)을 지칭한다.
따라서, "EGFL7" 또는 "단리된 EGFL7"과 함께 사용될 때 "생물학적으로 활성적인" 또는 "생물학적 활성"은 천연 서열 EGFL7의 효과기 기능을 나타내거나 또는 공유하는 EGFL7 폴리펩타이드를 의미한다. EGFL7의 하나의 생물학적 활성은 혈관형성을 촉진하는 그의 능력이다. EGFL7의 다른 생물학적 활성은 내피 세포 이동 및 부착의 촉진을 포함한다. 전형적으로, EGFL7 생물학적 활성은 관형성을 조절하는 능력이다.
"생물학적으로 활성적인" 또는 "생물학적 활성"은 변종 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드와 함께 사용될 때, 변종 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드가 모 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열의 효과기 기능을 나타내거나 또는 공유한다는 것을 의미한다. 변종 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열의 생물학적 활성은 모 EGFl7 상호작용 폴리펩타이드에 비해 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
용어 "저해하다" 또는 "저해적"은 EGFL7의 기능 또는 활성이 감소되거나, 제한되거나, 차단되거나 또는 중화되는 것을 의미한다. 이들 용어는 EGFL7의 그의 수용체에 대한 결합을 포함하여 EGFL7 기능 또는 활성에서의 완전한 또는 부분적 저해를 포함한다.
"EGFL7 수용체"는 EGFL7과 결합하고, EGFL7의 생물학적 특성을 매개하는 분자이다.
"단리된"은 그의 공급원으로부터 정제되거나 또는 재조합체 또는 합성 방법에 의해 제조되거나 또는 정제된 분자를 지칭한다. 정제된 폴리펩타이드는 다른 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 실질적으로 없다.
본 명세서에서 "실질적으로 없는"은 다른 공급원 단백질과 함께 오염물질이 약 5% 미만, 전형적으로는 약 2% 미만, 더 전형적으로는 약 1% 미만, 훨씬 더 전형적으로는 약 0.5% 미만, 가장 전형적으로는 약 0.1% 미만임을 의미한다. "본질적으로 순수한" 단백질은 조성물의 전체 중량을 기준으로 적어도 약 90중량%의 단백질, 조성물의 전체 중량을 기준으로 전형적으로는 적어도 약 95중량%, 더 전형적으로는 적어도 약 90중량%, 훨씬 더 전형적으로는 적어도 약 95중량%, 및 훨씬 더 전형적으로는 적어도 약 99중량%의 단백질을 포함하는 조성물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "치료" 또는 "요법"은 유리한 또는 원하는 임상적 결과를 얻기 위한 접근이다. 본 발명의 목적에 대해, 유리한 또는 원하는 임상적 결과는 검출 가능하든 검출 가능하지 않든, 증상의 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않은) 상태, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이든 또는 전체적이든)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "치료" 및 "요법"은 또한 치료 또는 요법을 받지 않는다면 예상되는 생존에 비해 연장된 생존을 의미할 수 있다. 따라서, "치료" 및 "요법"은 장애의 병리를 변경시키는 의도로 수행된 개입이다. 구체적으로, 치료 또는 요법은 세포 변성 또는 손상의 병리, 예컨대 암 치료에서 종양 세포의 병리를 직접 예방하거나, 늦추거나 또는 달리 감소시킬 수 있거나, 또는 다른 치료적 제제에 의해 세포를 치료 또는 요법에 더 민감하게 만들 수 있다.
용어 "치료적 유효량", "유효량" 또는 "충분량"은 포유류, 예를 들어 인간을 포함하는 대상체에 투여될 때 원하는 결과를 달성하는데 충분한 양, 예를 들어 암을 치료하는데 유효한 양을 의미한다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 유효량은 대상체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 투약량 및 치료 요법은 당업자에 의해 이해되는 바와 같은 최적의 치료적 반응을 제공하도록 조절될 수 있다.
게다가, 치료적 유효량에 의한 대상체의 치료 요법은 1회 투여로 이루어질 수 있거나, 또는 대안적으로 일련의 적용을 포함한다. 치료 기간의 길이는 다양한 인자, 예컨대 질병의 중증도, 대상체의 연령, 폴리펩타이드의 농도, 폴리펩타이드에 대한 환자의 반응 또는 이들의 조합에 의존한다. 또한 치료를 위해 사용되는 폴리펩타이드의 유효한 투약량이 특정 치료 요법 과정에 걸쳐 증가되거나 또는 감소될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 투약량에서의 변화는 당업계에 공지된 표준 진단 검정에 의해 야기되거나 명확하게 될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는, 양상에서, 통상적인 항암제, 방사선 요법, 호르몬 요법, 생물 요법 및/또는 외과적 종양 절제에 의해 치료 전에, 치료 동안 또는 치료 후에 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "대상체"는 동물계, 전형적으로는 포유류의 어떤 구성원을 지칭한다. 용어 "포유류"는 인간, 기타 고등 영장류, 가축 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물 또는 애완 동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지, 염소, 토끼 등을 포함하는 포유류로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 전형적으로, 포유류는 인간이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 비조절 세포 성장을 특징으로 하는 포유류에서의 생리학적 병태를 지칭하거나 또는 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이러한 암의 더 구체적인 예는 편평세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종을 포함), 복막암, 간세포암, 위 또는 위암(위장암을 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장 또는 세포암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암종 및 다양한 유형의 두경부암뿐만 아니라 B-세포 림프종(저등급/비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL); 소림프구성(small lymphocytic: SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역아세포 NHL; 고등급 림프모구 NHL; 고등급 소 비절단 세포 NHL; 큰 덩어리(bulky disease) NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함); 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL); 급성 림프모구 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수아구성 백혈병; 및 이식후 림프증식성 장애(post-transplant lymphoproliferative disorder: PTLD)뿐만 아니라 모반증과 관련된 비정상 혈관 증식, 부종(예컨대 뇌종양과 관련된 것) 및 메이그스 증후군을 포함한다.
"화학치료제"는 암의 치료에서 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료적 제제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파, 사이톡산(CYTOXAN)(상표명) 사이클로스포스파마이드; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보퀀, 메투레도파 및 유레도파; 에틸렌이민 및 알트레타민을 포함하는 메틸라멜라민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포라마이드, 트라이에틸렌티오포스포라마이드 및 트라이메틸롤로멜라민; 아세토게닌, 예컨대 불라타신 및 불라타시논; 캄토테신, 예컨대 토포테칸; 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 및 그의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사체; 크립토피신, 예컨대 크립토피신 1 및 크립토피신 8; 돌라스타틴; 듀오카마이신, 예컨대 합성 유사체 KW-2189 및 CB1-TM1; 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사코딕타인스; 스폰기스타틴; 질소 머스터드, 예컨대 클로람뷰실, 클로르나파진, 클로로포스파마이드, 에스트라무스틴, 이포스파마이드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파마이드, 유라실 머스터드; 나이트로소유레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 엔다이인 항생제, 예를 들어 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 감마1I 및 칼리케아마이신 오메가I1, 다이네마이신 A를 포함하는 다이네마이신, 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트, 에스페라마이신, 네오카르지노스타틴 클로모포르 및 관련된 클로모단백질 엔다이인 항생제 크로모포르; 아클라시노마이신; 악티노마이신; 오트라마이신; 아자세린; 블레오마이신; 칵티노마이신; 카라비신; 카르미노마이신; 카르지노필린; 클로모마이신; 닥티노마이신; 다우노루비신; 데토루비신; 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신; 모폴리노-독소루비신, 사이아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신을 포함하는, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(상표명) 독소루비신; 에피루비신; 에소루비신; 이다루비신; 마셀로마이신; 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴 및 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플유리딘, 에노시타빈 및 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄 및 테스톨락톤; 항부신성, 예컨대 아미노글루테티마이드, 미토탄 및 트라이로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프로리닌산; 아세글라톤; 알도포스파마이드 글라이코사이드; 아미노레불린산; 에닐유라실; 암사크린; 베스트라뷰실; 비스아트렌; 에다트라사이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티니움 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페네메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라자이드; 프로카바진; PSK(상표명) 폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테뉴아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2"-트라이클로로트라이에틸아민; 트라이코테센, 예컨대 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘; 유레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴;미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 탁소이드, 예컨대 탁솔(TAXOL)(상표명) 파클리탁셀, 아브락산(ABRAXANE)(상표명) 무크레모포(Cremophor-free), 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형, 탁소테르(TAXOTERE)(상표명) 및 도세탁셀; 클로람뷰실; 겜자르(GEMZAR)(상표명) 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 배위 복합체, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파마이드; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)(상표명) 비노렐빈; 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸, 예컨대 CPT-11; 토포아이소머라제 저해제, 예컨대 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 상기 중 어떤 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
또한 이 정의에 종양에 작용하는 호르몬을 조절하거나 또는 저해하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 예를 들어, 타목시펜(놀바덱스(NOLVADEX)(상표명) 타목시펜을 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 페어스톤(FARESTON) 토레미펜을 포함하는, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM); 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타네를 저해하는 아로마타제 저해제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티마이드, 메가제(MEGASE)(상표명) 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)(상표명) 엑세메스탄, 포메스탄, 파드로졸, 리비솔(RIVISOR)(상표명) 보로졸, 페마라(FEMARA)(상표명) 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)(상표명) 아나스트로졸; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타마이드, 닐루타마이드, 바이칼루타마이드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 뿐만 아니라 트록사시타빈(1,3-다이옥솔란 뉴클레오사이드 사이토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 특히 비정상 세포 증식과 연루된 신호처리 경로에서 유전자의 발현을 저해하는 것, 예를 들어, PKC-알파, Ralf 및 H-Ras; 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 저해제(예를 들어, 앤지오자임(ANGIOZYME)(상표명) 리보자임) 및 HER2 발현 저해제; 항체, 예컨대 항-VEGF 항체(예를 들어, 아바스틴(AVASTIN)(상표명) 항체); 백신, 예컨대 유전자 치료 백신, 예를 들어, 알로벡틴(ALLOVECTIN)(상표명) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(상표명) 백신, 및 박시드(VAXID)(상표명) 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)(상표명) rIL-2; 루토테칸(LURTOTECAN)(상표명) 토포이모머라제 1 저해제; 아바렐릭스(ABARELIX)(상표명) rmRH; 및 상기 중 임의의 것의 약제학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 이 정의에 포함된다.
"안구내 신생혈관성 질병"은 안구 신생혈관화를 특징으로 하는 질병이다. 안구내 신생혈관성 질병의 예는, 증식성 망막병증, 맥락막 신생혈관화(choroidal neovascularization: CNV), 연령-관련 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD), 당뇨병성 및 기타 허혈-관련 망막병증, 당뇨병성 황반부종, 병리학적 근시, 폰 히펠 린도우병, 눈의 히스토플라스마증, 중심성 망막 정맥 폐색(Central Retinal Vein Occlusion: CRVO), 각막 신생혈관화, 및 망막 신생혈관화를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
하나 이상의 추가적인 치료적 제제"와 조합한" 투여는 동시(동시 발생적) 및 어떤 순서로 연이은 투여를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "담체"는 사용되는 투약량 및 농도에 노출된 세포 또는 포유류에 대해 비독성인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다. 종종 약제학적으로 허용 가능한 담체는 수성 pH 완충용액이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스콜브산을 포함하는 항산화제; 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로뷸린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 알기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 기타 글루코스, 만노스 및 덱스트린을 포함하는 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당 알코올, 예컨대 만니톨 및 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)(상표명), 폴리에틸렌 글리이콜(PEG 및 플루로닉스(PLURONICS)(상표명)를 포함한다.
"리포솜"은 포유류와 같은 대상체에 대해 약물(예컨대, 화학치료제)의 전달에 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀의 성분은 생물학적 막의 지질 배열과 유사하게 보통 이중층 형성으로 배열된다.
본 출원의 범주를 이해하는데, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "포함하는" 및 이의 파생어는 언급된 특징, 구성요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 구체화하는 개방형 용어인 것으로 의도되지만, 다른 언급되지 않은 특징, 구성요소, 성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하지 않는다. 앞서 언급한 것은 또한 용어 "포함하는", "갖는" 및 이들의 파생어와 같은 유사한 의미를 갖는 단어에 적용한다. 최종적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "실질적으로", "약" 및 "대략"과 같은 정도의 용어는 결과가 유의하게 변화되지 않도록 변형된 용어의 편차의 합리적인 양을 의미한다. 이들 정도의 용어는 이런 편차가 그것이 변형하는 단어의 의미를 부인하지 않는다면, 변형된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로서 해석되어야 한다.
폴리펩타이드
본 발명은 EGFL7과 상호작용하고, 따라서 EGFL7의 기능 및/또는 활성을 조절하는 폴리펩타이드를 포함한다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 전형적으로 EGFL7에 결합하고, EGFL7에 보조-인자의 결합을 조절하거나, EGFL7 폴리펩타이드의 적절한 폴딩을 조절하거나, EGFL7의 번역후 처리를 조절하거나, EGFL7의 그의 수용체에 대한 결합을 조절하거나, 또는 EGFL7 이합체화 또는 다이머화를 조절함으로써 작용한다. 또한 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 EGFL7의 구조적 모방체일 수 있다.
EGFL7은 신호처리 서열, 카복시-말단(매트릴린-유사) 도메인, 노치 결합 도메인, 이합체화 도메인 및 아미노-말단 도메인을 포함하는 몇몇 도메인을 함유한다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 전형적으로 EGFL7, 예컨대 카복시-말단 도메인 또는 이합체화 도메인의 특이적 도메인에 결합한다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 노치 도메인에 결합하고, 따라서 EGFL7에 대한 노치의 조절을 통해 그의 작용을 발휘할 수 있다. 그러나, 전형적으로는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 노치 결합 도메인의 바깥쪽에 결합하고, 노치 결합에 영향을 미치지 않는다. 구체적 양상에서, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 노치 결합과 독립적으로 작용한다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열의 예는 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHP(상표명)(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14) 및 RSPGLAPARPRYA(서열번호 15) 및 이의 생물학적으로 활성적인 변종을 포함한다. 이들 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합하거나 상호작용하고, 신생혈관생성을 저해하는 것으로 나타났다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열은 서열번호 5 내지 15 중 어느 하나의 서열 또는 이의 생물학적으로 활성적인 변종으로 이루어질 수 있거나, 또는 서열번호 5 내지 15 중 어느 하나의 서열 또는 이의 생물학적으로 활성적인 변종을 포함할 수 있다. 이들 서열 및/또는 다른 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열의 조합이 또한 사용될 수 있고, 함께 상승적으로 또는 상가적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 포함하는 서열은 다수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있지만, 그들은 전형적으로 적어도 약 3개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 300개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 250개, 약 8 내지 약 200개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 100개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 50개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 30개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 20개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 16개 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 12개 아미노산 잔기, 또는 약 12 내지 약 16개 아미노산 잔기를 포함하고, 이들 범위 내에서 어떤 하나의 숫자 증분은 예를 들어, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16 아미노산 잔기와 같이 본 명세서에서 구체적으로 고려된다.
생물학적으로 활성적인 변종은 EGFL7 상호작용 활성을 보유하는 서열번호 5 내지 13의 어떤 변종 서열을 포함한다. 변종 서열의 EGFL7 상호작용 활성은 서열번호 5 내지 13의 모 서열의 상호작용 활성과 동일할 수 있거나, 또는 모 서열에 비해 증가되거나 또는 감소될 수 있다.
예를 들어, 서열 Ac-GSLLVHSFQQLG와 같은 아세틸화된 서열이 고려되되, "Ac"는 폴리펩타이드의 아세틸화를 나타낸다. 예를 들어, 이들 서열 내에서 보존성 아미노산 치환이 고려된다. 보존성 아미노산 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 라이신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 아이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 소아미노산(글라이신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 그룹 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경하지 않는 아미노산 치환은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[H. Neurath and R. L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York]에 기재되어 있다. 가장 흔히 생기는 치환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly이다.
따라서, 독립적으로, HMYFLLGH 내 히스티딘 잔기 중 하나 또는 둘 다는 아르기닌 또는 라이신으로 치환될 수 있고; 메티오닌 잔기는 글라이신, 알라닌, 세린 또는 트레오닌으로 치환될 수 있으며; 티로신 잔기는 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환될 수 있고; 페닐알라닌 잔기는 티로신 또는 트립토판으로 치환될 수 있으며; 류신 잔기 중 하나 또는 둘 다는 아이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있고; 글라이신 잔기는 알라닌, 세린, 트레오닌 또는 메티오닌으로 치환될 수 있었으며; 또는 이들의 조합이다.
유사하게, 독립적으로 GSLLVHSFQQLG 내 글라이신 잔기 중 하나 또는 둘 다는 알라닌, 세린, 트레오닌 또는 메티오닌으로 치환될 수 있고; 세린 잔기 중 하나 또는 둘 다는 글라이신, 알라닌, 트레오닌 또는 메티오닌으로 치환될 수 있으며; 류신 잔기 중 어느 하나 이상은 아이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있고; 발린 잔기는 류신 또는 아이소류신으로 치환될 수 있으며; 히스티딘 잔기는 아르기닌 또는 라이신으로 치환될 수 있고; 페닐알라닌 잔기는 티로신 또는 트립토판으로 치환될 수 있으며; 글루타민 잔기 중 하나 또는 둘 다는 아스파라긴으로 치환될 수 있었고; 또는 이들의 어떤 조합이다.
서열번호 7 내지 13의 서열 변종이 유사하게 결정될 수 있었다.
대안적으로, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열 내에서 아미노산 변화는 폴리펩타이드의 물리-화학적 특성이 변경되는 특성을 가진다. 예를 들어, 아미노산 변화는 폴리펩타이드의 열적 안정성을 개선시키고, 기질 특이성을 변경시키며, pH 최적을 변화시키는 것 등을 할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 중 어떤 하나 이상은 좌회전형 또는 우회전형일 수 있다. 또한 라세미 혼합물이 사용될 수 있다.
모 폴리펩타이드에서 생물학적 활성을 위해 필요한 아미노산은 당업계에 공지된 절차에 따라, 예컨대 부위지정 돌연변이유발에 따라 동정될 수 있다(본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085]). 생물학적 상호작용의 활성 부위는 또한 추정적 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 함께 핵자기 공명, 결정학, 전자회절 또는 광친화성 표지와 같은 기법에 의해 결정되는 바와 같이 구조의 생리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 문헌[de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; 및 Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64]을 참조하며, 이들 각각은 그의 전문에 본 명세서에 참조로서 포함된다. 생물학적 활성에 필요한 아미노산의 동일성은 또한 모 폴리펩타이드에 관한 폴리펩타이드와의 동일성 분석으로부터 추론될 수 있다.
돌연변이유발, 재조합 및/또는 셔플링(shuffling)의 공지된 방법들, 이어서, 적절한 선별 절차, 예컨대 문헌[Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156]; 제WO 95/17413호; 또는 제WO 95/22625호(이들 각각은 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함됨)에 의해 개시된 것들을 사용하여 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 이루어지고, 시험될 수 있다. 사용될 수 있는 다른 방법은 오류 유발 PCR, 파지 디스플레이(예를 들어, 문헌[Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837]; 미국 특허 제5,223,409호; 및 제WO 92/06204호, 이들 각각은 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함됨), 및 영역 지정 돌연변이유발(문헌[Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; 및 Ner et al., 1988, DNA 7: 127], 이들 각각은 본 명세서에 그의 전문이 참조로서 포함됨)을 포함한다.
돌연변이유발/셔플링 방법은 고효율, 자동화된 선별 방법과 병용하여 숙주 세포에 의해 발현되는 클로닝된, 돌연변이유발 폴리펩타이드의 활성을 검출할 수 있다(전문이 참조로서 포함되는 문헌[Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896]). 활성 폴리펩타이드를 암호화하는 돌연변이유발된 DNA 분자는 당업계의 표준 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 회수되고 빠르게 서열분석될 수 있다. 이들 방법은 폴리펩타이드에서 개개 아미노산 잔기의 중요성을 빠르게 결정하게 한다.
또한 변종 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드에 의해 혼성 폴리펩타이드가 포함되는데, 이때 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 일부가 다른 폴리펩타이드 또는 이의 일부에 대해 N-말단 또는 C-말단에서 융합된다.
변종 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드 또는 절단가능한 융합 폴리펩타이드일 수 있는데, 이때 다른 폴리펩타이드는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에서 융합된다. 융합된 폴리펩타이드는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 다른 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 융합함으로써 생성된다. 융합 폴리펩타이드를 생성하기 위한 기법은 당업계에 공지되어 있으며, 폴리펩타이드를 암호화하는 암호 서열을 결찰시키는 단계를 포함하며, 따라서 이들은 뼈대가 완성되고 융합된 폴리펩타이드의 발현은 동일 프로모터(들) 및 종결자의 제어 하에 있다. 융합 단백질은 또한 인테인(intein) 기법을 사용하여 구성될 수 있는데, 이때 융합은 번역 후에 만들어진다(예를 들어, 문헌[Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; 및 Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779], 이들 각각은 그의 전문일 본 명세서에 참조로서 포함됨).
융합 폴리펩타이드는 융합된 폴리펩타이드 사이에 절단 부위를 추가로 포함할 수 있다. 융합 단백질의 분비 시, 2개의 폴리펩타이드를 방출하는 부위는 절단된다. 절단 부위의 예는 각각 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; 및 Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; 및 Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48]에 개시된 부위를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
전형적으로, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 생물학적으로 활성적인 변종, 예를 들어 HMYFLLGH 또는 GSLLVHSFQQLG는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 약 50% 서열 동일성을 가진다. 더 전형적으로는, 서열 동일성은 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 또한 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. "검출 가능한 표지"는 그의 구체적 기능적 특성 및/또는 화학적 특징에 기인하여 검출될 수 있는 화합물 및/또는 구성요소이며, 이의 사용은 이들이 부착되는 EGFL7 폴리펩타이드가 검출되게하고/하거나 원한다면 추가로 정량화되게 한다.
폴리펩타이드 진단은 일반적으로 핵영상화 기법과 같은 다양한 영상화 기법을 사용하여 검출되는, 시험관내 진단에서 사용을 위한 것 및/또는 생체내 진단 프로토콜에서 사용을 위한 것의 두 분류 내에 속한다. 영상화를 위해 사용되는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 EGFL7의 활성을 조절하는 조절 펩타이드일 수 있거나 또는 그들은 어떤 생물학적 활성을 갖지 않을 수도 있고, 단순히 EGFL7에 결합될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
다수의 적절한 영상화제는 폴리펩타이드에 대한 이들의 부착을 위한 방법과 같이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,021,236호; 제4,938,948호; 및 제4,472,509호를 참조하며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨). 사용된 영상화 모이어티는, 예를 들어 상자성 이온; 방사성 동위원소; 형광 색소; NMR-검출 가능한 물질; 또는 X-레이 영상화-검출 가능 물질이 사용될 수 있다.
상자성 이온의 경우에, 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이터븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 터븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및/또는 어븀(III)이 예로서 포함되고, 가돌리늄이 전형적으로 사용된다. 다른 내용, 예컨대 X-레이 영상화에서 유용한 이온은 란타늄(III), 금(III), 납(II) 및 특히 비스무트(III)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
치료적 및/또는 진단적 적용을 위한 방사성 동위원소의 경우에 211아사타틴, 11탄소, 14탄소, 51크롬, 36염소, 57코발트, 58코발트, 64구리, 67구리, 152유로퓸, 18플루오린, 67갈륨, 68갈륨, 3수소, 123요오드, 125요오드, 111인듐, 59철, 32인, 186레늄, 188레늄, 75셀레늄, 35황, 99m 테크네튬 및/또는 90이트륨이 예로서 포함된다. 125요오드는 특정 실시형태에서 종종 사용되며, 99m 테크네튬 및/또는 111인듐이 그의 저에너지 및 안정성에 기인하여 긴 범위 검출을 위해 종종 사용된다. 방사성 표지된 폴리펩타이드는 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 생성될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 요오드화나트륨 및/또는 요오드화칼륨 및 화학적 산화제, 예컨대 차아염소산나트륨, 또는 효소적 산화제, 예컨대 락토퍼옥시다제와 접촉에 의해 요오드화될 수 있다. 폴리펩타이드는, 예를 들어 제1 주석 용액에 의해 퍼테크네이트를 환원시키고, 환원된 테크네튬을 세파덱스(Sephadex) 칼럼 상에 킬레이트화하며, 이 칼럼에 폴리펩타이드를 적용하는 것에 의한 리간드 교환 방법에 의해 99m 테크네튬으로 표지될 수 있다. 대안적으로, 직접적 표지 기법은, 예를 들어 퍼테크네이트, 환원제, 예컨대 SNCl2, 완충 용액, 예컨대 나트륨-칼륨 프탈레이트 용액 및 폴리펩타이드를 인큐베이션시키는 것에 의한 직접적 표지 기법이 사용될 수 있다. 폴리펩타이드에 대해 금속 이온으로서 존재하는 방사성동위원소에 결합을 위해 종종 사용되는 중개 작용기는 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산(DTPA), 에틸렌 다이아민테트라아세트산(EDTA) 또는 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)이다. 폴리펩타이드는 보결분자단 방법을 사용하여 플루로린-18로 표지되고, 이에 의해 소분자는 우선 방사성표지된 다음, 펩타이드에 결합되며, 예를 들어, [18플루오린]-플루오로벤조산이 제조된 다음, 펩타이드의 아미노기에 결합된다.
검출 가능한 표지로서 사용을 위해 고려되는 형광 표지는, 예를 들어, 알렉사(Alexa) 350, 알렉사 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-(상표명)R, BODIPY-TRX, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), Cy3, Cy5, 6-FAM, 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트(FITC), HEX, 6-JOE, 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린 500, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루(Pacific Blue), REG, 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red), 레노그라핀(Renographin), ROX, TAMRA, TET, 테트라메틸로다민, 및/또는 텍사스 레드(Texas Red)를 포함한다. 전형적으로, 형광 표지는 플루오레세인이다.
본 발명에서 사용을 위해 고려되는 폴리펩타이드/검출 가능한 표지 컨쥬게이트의 다른 분류는 주로 시험관내에서 사용을 위해 의도되는 것을 포함하며, 여기서 폴리펩타이드는 색원체 기질과 접촉시 색이 있는 산물을 만드는 효소(효소 태그)에 및/또는 2차적 결합 리간드에 결합된다. 적합한 효소의 예는 유레아제, 알칼린 포스파타제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 하이드로젠 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 2차적 리간드는 바이오틴 및/또는 아비딘 및 스트렙타비딘 화합물이다. 이러한 표지의 사용은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호 및 제4,366,241호에 기재되어 있고; 이들 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
아지도기를 함유하는 분자는 또한 저강도 자외선에 의해 만들어진 반응성 나이트렌 중간체를 통해 폴리펩타이드에 공유적 결합을 형성하기 위해 사용될 수 있다(Potter & Haley, 1983). 특히, 퓨린 뉴클레오타이드의 2- 및 8-아지도 유사체는 조질의 세포 추출물 내 뉴클레오타이드 결합 단백질을 동정하기 위해 부위지정 광프로브로서 사용되었다(문헌[Owens & Haley, 1987; 및 Atherton et al., 1985], 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨). 2- 및 8-아지도 뉴클레오타이드는 또한 정제된 단백질의 뉴클레오타이드 결합 도메인을 맵핑하기 위해 사용되었고(Khatoon et al., 1989; King et al., 1989; 및 Dholakia et al., 1989), 폴리펩타이드 결합제로서 사용될 수 있다.
폴리펩타이드의 그의 검출 가능한 표지에 대한 부착 또는 컨쥬게이션을 위해 당업계에 몇몇 방법이 공지되어 있다. 일부 부착 방법은, 예를 들어 유기 킬레이트제, 예컨대 다이에틸렌트라이아민펜타아세트산 무수물(DTPA); 에틸렌트라이아민테트라아세트산; N-클로로-p-톨루엔설폰아마이드; 및/또는 폴리펩타이드에 부착된 테트라클로로-3α-6α-다이페닐글라이콜우릴-3을 사용하는 금속 킬레이트 복합체의 사용을 수반한다(예를 들어, 미국 특허 제4,472,509호 및 제4,938,948호, 이들 각각은 전문이 본 명세서에 참조로서 포함됨). 폴리펩타이드는 또한 글루타르알데하이드 또는 페리오데이트와 같은 결합제의 존재에서 효소와 반응될 수 있다. 플루오레세인 마커와의 컨쥬게이션은 이들 결합제의 존재에서 또는 아이소티오사이아네이트와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 검출 가능한 표지는 또한 메틸-p-하이드록시벤즈이미데이트 또는 N-숙신이미딜-3-(4-하이드록시페닐)프로피오네이트와 같은 링커를 사용하여 폴리펩타이드에 결합될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 미국 특허 제4,938,948호 참조).
EGFL7은 활성 신생혈관생성을 겪는 조직에서 특이적으로 발현되기 때문에, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 해당 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위해 화학치료제와 같은 약제학적 제제에 결합될 수 있다. 이런 방법으로, 약제학적 제제는, 예를 들어 종양과 같이 활성 신생혈관생성을 겪는 신체 영역에만 전달될 수 있다. 어떤 약제학적 제제 또는 화학치료제가 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드에 결합될 수 있다. 일 양상에 있어서, 화학치료제는 항-VEGF 항체와 같은 항신생혈관제이다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 대상체의 신체 내에서 발현된 EGFL7의 영역에 약제학적 제제를 표적화하기 위해 리포솜, 나노캡슐, 마이크로입자, 미소구체, 나노입자, 지질 입자, 소포 등을 통해 약제학적 제제에 결합될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 제제는 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노구체 또는 나노입자에서 캡슐화된 전달을 위해 제형화될 수 있고, 예를 들어 EGFL7 상호작용 펩타이드의 적어도 일부는 발현된 EGFL7과 상호작용을 위해 노출된다.
리포솜의 형성 및 용도는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Couvreur et al., FEBS Lett. 1977 Dec. 15; 84(2):323-6; Couvreur, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988; 5(1):1-20; Lasic, Trends Biotechnol. 1998 July; 16(7):307-21; Gabizon & Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1988 September; 85(18):6949-53; Allen and Chonn, FEBS Lett. 1987 Oct. 19; 223(1):42-6]; 미국 특허 제5,741,516호 참조). 추가로, 잠재적 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 검토되었다(문헌[Takakura, Nippon Rinsho, 1998 March; 56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 August; 35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3):233-61]; 미국 특허 제5,567,434호; 미국 특허 제5,552,157호; 미국 특허 제5,565,213호; 미국 특허 제5,738,868호 및 미국 특허 제5,795,587호, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨).
리포솜은 수성 매질 중에서 분산된 인지질로부터 형성되고, 다층 동심성 이중층 소포(또한 다층 소포(multilamellar vesicle: MLV)로 칭해짐)를 자발적으로 형성한다. MLV 일반적으로 직경이 25㎚ 내지 4㎛이다. MLV의 초음파처리는 코어에 수성 용액을 함유하는, 직경이 200 내지 500Å의 범위에 있는 소 단층 소포(small unilamellar vesicle: SUV)의 형성을 초래한다.
리포솜은 세포막에 대한 유사성을 보유하며, 본 발명과 관련한 사용을 위해 약제학적 제제용 담체로서 고려된다. 그들은 수용성과 지용성 물질 둘 다로서 크게 적합하며, 즉, 수성 공간에서 그리고 그 자체가 이중층 내에서 각각 포획될 수 있다.
문헌[Couvreur et al. FEBS Lett. 1977 Dec. 15; 84(2):323-6; 및 Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988; 5(1):1-20]의 교시에 추가로, 다음의 정보가 리포좀 제형을 만드는데 이용될 수 있다. 인지질은 지질 대 물의 몰비에 따라서, 수중에서 분산될 때 리포솜 이외의 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비에서, 리포솜이 전형적인 구조이다. 리포솜의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 2가 양이온의 존재에 의존한다. 리포솜은 이온 및 극성 물질에 대해 낮은 투과성을 나타낼 수 있지만, 상승된 온도에서 그의 투과성을 현저하게 변경시키는 상 전이를 겪는다. 상 전이는 겔 상태로서 알려진 조밀하게 채워진 규칙적인 구조로부터 유체 상태로서 알려진 느슨하게 채워진 덜 규칙적인 구조로의 변화를 수반한다. 이는 특징적 상전이 온도에서 일어나며, 이온, 당 및 약물에 대한 투과성의 증가를 초래한다.
온도에 추가적으로, 단백질에 대한 노출은 리포솜의 투과성을 변경시킬 수 있다. 사이토크롬 c와 같은 특정 가용성 단백질은 이중층에 결합하여, 변형시키고, 침투하여, 이에 의해 투과성의 변화를 야기한다. 외관상으로 인지질을 더 치밀하게 채움으로써 콜레스테롤은 단백질의 이러한 침투를 억제한다. 항생제 및 저해제 전달을 위한 가장 전형적인 리포솜 형성은 콜레스테롤을 함유할 것으로 고려된다.
용질을 트랩핑하는 능력은 리포좀마다 다르다. 예를 들어, MLV는 용질의 트랩핑에서 중간 정도로 효율적이지만, SUV는 극도로 비효율적이다. SUV는 크기 분포에서 균질함 및 재현성의 이점을 제공하지만, 크기와 트래핑 효율 간의 절충은 거대 단층 소포(large unilamellar vesicle: LUV)에 의해 제공된다. 이들은 에터 증발에 의해 제조되며, MLV보다 용질 포획에서 3배 내지 4배 더 효율적이다.
리포솜 특징에 추가적으로, 화합물의 포획에서 중요한 결정요인은 화합물 그 자체의 물리화학적 특성이다. 극성 화합물이 수성 공간에서 트랩핑되고, 비극성 화합물이 소포의 지질 이중층에 결합된다. 극성 화합물은 침투를 통해 또는 이중층이 파괴될 때 방출되지만, 비극성 화합물은 그것이 온도에 의해 또는 리포단백질에 노출에 의해 파괴되지 않는다면, 이중층에 연계된 채로 남아있는다. 두 유형 모두 상전이 온도에서 최대 유출 비율을 나타낸다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 리포솜 표면에 결합을 위해 그리고 리포솜 및 그의 약물 내용물을 발현된 EGFL7을 함유하는 신체 내 영역에 보내기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, 약제학적으로 허용가능한 나노캡슐 제형은 안정하고 재생가능한 방법으로 약제학적 제제를 포획하기 위해 사용될 수 있다(문헌[Henry-Michelland et al., J Pharm Pharmacology. 1987 December; 39(12):973-7; Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 December; 24(12):1113-28; Douglas et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1987; 3(3):233-61], 이들 각각은 본 명세서에 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨). 초미립자(크기는 약 0.1㎛)와 같은 세포내 중합체 과부하에 기인하는 부작용을 피하기 위해, 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 예를 들어, 이들 필요조건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-사이아노아크릴레이트 나노입자는 본 발명에서 사용에 대해 고려된다. 이러한 입자는 각각 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 문헌[Couvreur et al., 1980 상기 참조 및 1988, 상기 참조; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 March; 45(2):149-55; Zambaux et al. J Control Release. 1998 Jan. 2; 50(1-3):31-40; Pinto-Alphandry et al., 1995 J Drug Target. 1995; 3(2):167-9] 및 미국 특허 제5,145,684호에 기재된 바와 같이 용이하게 만들어질 수 있다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 조성물로 제형화될 수 있으며, 이는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정제, 애주번트, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 치료적 조성물은 적절한 순도를 갖는 원하는 폴리펩타이드를 선택적인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 안정제(본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)])와 혼합함으로써, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 투약량 및 농도에서 수용인에 대해 비독성이고, 상기 기재한 바와 같다.
이러한 담체의 추가적인 예는 이온 교환체, 알루미나, 알루미나 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예컨대 포스페이트, 글라이신, 솔브산, 솔브산칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분적 글라이세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 인산수소나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이달 실리카, 3규산 마그네슘, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질 및 폴리에틸렌 글라이콜을 포함한다. 폴리펩타이드의 국소적 또는 겔기반 형태를 위한 담체는 다당류, 예컨대 카복시메틸셀룰로스 나트륨 또는 메틸셀룰로스 나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 공중합체, 폴리에틸렌 글라이콜 및 우드왁스 알코올을 포함한다. 모든 투여에 대해, 통상적인 데포 형태가 사용될 수 있다. 이러한 형태는, 예를 들어 마이크로캡슐, 나노캡슐, 리포솜, 플라스터, 흡입 형태, 비강 스프레이, 설하 정제, 및 지속방출 제제를 포함한다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 전형적으로 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 100㎎/㎖의 농도에서 이러한 소포 내에서 제형화될 것이다.
다른 제형은 형성된 물품 내로 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 혼입시키는 것을 포함한다. 이러한 물품은 내피 세포 성장 및 신생혈관생성을 조절하는데 사용될 수 있다. 추가로, 종양 침습 및 전이는 이들 물품에 의해 조절될 수 있다.
생체내 투여를 위해 사용되는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 일반적으로 멸균된다. 이는 동결건조 및 재구성 전에 또는 후에, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는, 전신에 투여된다면, 보통 동결건조된 형태에서 또는 용액 중에 저장될 것이다. 동결건조된 형태로 있다면, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 전형적으로 사용시 적절한 희석제와 재구성을 위한 다른 성분과 조합하여 제형화된다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 액체 제형의 예는 피하 주사를 위한 1회용 바이알 내에 채워진 멸균의 맑고 무색인 비보존 용액이다. 반복된 사용에 적합한 보존된 약제학적 조성물은, 예를 들어 주로 폴리펩타이드의 표시 및 유형에 따라서: EGFL7 상호작용 폴리펩타이드; 용액 중에서 폴리펩타이드의 최대 안정성 범위에서 pH, 전형적으로는 약 4 내지 8을 유지할 수 있는 완충제; 주로 교반-유발된 응집에 대해 폴리펩타이드를 안정시키는 세정제/계면활성제; 페놀, 벤질 알코올 및 벤즈에토늄 할라이드, 예를 들어 클로라이드의 군으로부터 선택된 보존제; 및 물을 함유할 수 있다.
사용된 세정제가 비이온성이라면, 이는, 예를 들어 폴리솔베이트(예를 들어, 폴리솔베이트(POLYSORBATE)(상표명)(트윈(TWEEN)(상표명)) 20, 80 등) 또는 폴록사머(예를 들어, 폴록사머(POLOXAMER)(상표명) 188)를 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제의 사용은 폴리펩타이드의 변성을 야기하는 일 없이 제형이 표면 스트레스를 전단시키도록 노출되게 한다. 추가로, 이러한 계면활성제 함유 제형은 폐 투약에서 사용되는 것과 같은 에어로졸 장치, 및 무바늘 제트 인젝터 건에서 사용될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 EP 제257,956호 참조).
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 액제 조성물의 등장성을 보장하기 위해 등장제가 제공될 수 있고, 이는 다가 당 알코올, 전형적으로는 3가 또는 더 고차의 당 알코올, 예컨대 글라이세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 솔비톨 및 만니톨을 포함한다. 이들 당 알코올은 단독으로 또는 병용하여 사용될 수 있다. 대안적으로, 용액 등장성을 제공하기 위해 염화나트륨 또는 적절한 무기 염이 사용될 수 있다.
완충제는, 예를 들어 원하는 pH에 따라서 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 포스페이트 완충제일 수 있다. 본 발명의 액체 제형 중 한 유형의 pH는 약 4 내지 8의 범위, 전형적으로는 거의 생리적 pH에서 완충된다.
보존제 페놀, 벤질 알코올 및 벤즈에토늄 할라이드, 예를 들어, 클로라이드는 사용될 수 있는 공지된 항미생물제이다.
본 명세서에 기재된 치료적 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥주사용 용액 백(bag) 또는 바이알에 위치된다. 제형은 전형적으로 반복된 정맥내(i.v.), 피하(s.c.) 또는 근육내(i.m.) 주사로서, 또는 비강내 또는 폐내 전달에 적합한 에어로졸 제형으로서 투여된다(폐내 전달을 위해, 예를 들어, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 EP 제257,956호 참조).
본 명세서에 기재된 장애의 진단 또는 치료에 유용한 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 함유하는 키트와 같은 제조물품은 적어도 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기는, 예를 들어 보틀, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 병태를 진단하거나 또는 시험하는데 효과적인 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥주사용 용액 백 또는 바이알 일 수 있다). 조성물 중의 활성제는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드이다. 용기 상의 또는 용기와 관련된 라벨은 조성물이 선택 병태를 진단하거나 또는 치료하기 위해 사용된다는 것을 나타낸다. 제조물품은 약제학적으로 허용가능한 완충제, 예컨대 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액, 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 충전재, 바늘, 주사기 및 사용을 위한 설명서를 구비한 포장 삽입물을 포함하는 상업적 및 사용자 견지에서 바람직한 다른 재료가 추가로 포함될 수 있다. 제조물품은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 다른 활성 약제학적 제제를 지니는 제2 또는 제3 용기를 포함할 수 있다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 또한 지속 방출된 제제 형태로 투여될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 폴리펩타이드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로겔(예를 들어, 문헌[Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)]에 기재된 바와 같은 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락타이드(미국 특허 제3,773,919호, EP 제58,481호), L-글루탐산 및 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), 비분해성 에틸렌-비닐아세테이트(Langer et al., 상기 참조), 분해성 락트산-글라이콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(Lupron Depot)(상표명)(락트산-글라이콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시뷰티르산(EP 제133,988호)을 포함한다. 이들 참고문헌 각각은 그의 전문이 본 명세서에 참조로서 포함된다.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글라이콜 산과 같은 중합체는 100일에 걸쳐 분자를 방출할 수 있지만, 특정 하이드로겔은 더 시간의 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 단백질이 장시간 동안 신체 내에 남아있을 때, 그들은 37℃에서 수분에 대한 노출의 결과로서 변성되거나 또는 응집될 수 있는데, 이는 생물학적 활성의 손실 및 면역원성에서의 가능한 변화를 초래한다. 수반된 메커니즘에 따라서 단백질 안정화를 위한 합리적 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메커니즘이 티오-다이설파이드 교환을 통해 분자간 이황화 결합을 형성하는 것으로 발견된다면, 설프하이드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키며, 수분 함량을 제어하고, 적절한 첨가제를 사용하며, 구체적 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화가 달성될 수 있다.
지속 방출 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 조성물은 또한 리포솜으로 포획된 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 포함한다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 함유하는 리포솜은 그 자체가 각각 본 명세서에 참조로서 포함되는 독일특허 제3,218,121호; 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980)]; 유럽특허 제52,322호; 유럽특허 제36,676호; 유럽특허 제88,046호; 유럽특허 제143,949호; 유럽특허 제142,641호; 일본국 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 유럽특허 제102,324호에서 공지된 방법에 의해 제조된다. 보통, 리포솜은 작은(약 200 내지 800 옹스트롬) 단층 유형을 가지며, 이때 지질 함량은 약 30㏖% 초과의 콜레스테롤이며, 선택된 비율은 최적의 요법을 위해 조절되었다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 치료적 유효량은, 물론, 치료되는(예방을 포함) 병리학적 병태, 투여방법, 어떤 관련된 공동요법, 대상체의 연령, 체중, 일반적 의학적 상태, 의학적 이력 등과 같은 이러한 인자에 따라서 다를 것이며, 그의 결정은 담당의사의 기량 내에 있다. 따라서, 최대 치료적 효과를 얻기 위해 의사는 필요한 투여 경로를 변형시키고, 투약량을 적정하는 것이 필요할 것이다. 임상의는 당해 병태의 원하는 치료 효과를 달성하는 투약량이 도달될 때까지 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 투여할 것이다. 예를 들어, 목적이 암 치료라면, 일 양상에 있어서, 양은 종양 성장을 저해하는 양이다.
상기 가이드라인에 의해, 유효량은 일반적으로 약 0.001 내지 약 1.0㎎/㎏, 더 전형적으로는 약 0.01 내지 1.0㎎/㎏, 및 가장 전형적으로는 약 0.01 내지 0.1㎎/㎏의 범위 내에 있다.
비경구적 사용을 위해, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 정맥내 주사에 의해 체중당 약 0.01 내지 50㎎, 전형적으로는 약 0.05 내지 약 20㎎, 가장 전형적으로는 약 1 내지 약 20㎎에서의 주사형태로 1회 내지 3회 투여될 수 있다. 경구 투여를 위해, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 전형적으로 체중당 약 5㎎ 내지 약 1g, 전형적으로는 약 10 내지 약 100㎎에서 1일 1 내지 3회 투여된다. 내독소 오염은 안전한 수준에서, 예를 들어 약 0.5ng/㎎ 미만의 단백질의 안전한 수준에서 최소로 유지되어야 하는 것으로 인식되어야 한다. 게다가, 인간 투여를 위해, 제형은 일반적으로 FDA 사무국 및 생물학적 표준에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열원성, 일반적 안전성 및 순도를 충족시킨다.
EGFL7 폴리펩타이드 또는 길항물질 또는 작용물질 투여의 경로는 공지된 방법에 따르며, 예를 들어 정맥내, 근육내, 대뇌내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 안내, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 주사 또는 주입에 의해, 또는 지속방출 시스템에 의한다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 또한 종양내, 종양주변, 장애내, 또는 주변부 경로에 의해 적절하게 투여되어 국소뿐만 아니라 전신 치료 효과를 발휘한다. 복강내 경로는, 예를 들어 난소 종양의 치료에서 특히 유용한 것으로 예상된다.
당해 장애를 예방하거나 또는 치료하는 것에서 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 유효성은 폴리펩타이드를 연속으로 투여함으로써 또는 동일한 동일한 조성물에서 또는 별개의 조성물에서 해당 목적에 효과적인 다른 약학적 제제와 병용하여 투여함으로써 개선될 수 있다.
예를 들어, 암 또는 안 질병과 같은 신생혈관생성-관련 질환을 치료하기 위해 사용한 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 상기 확인한 바와 같은 세포독성제, 화학치료제 또는 항신생혈관제와 병용될 수 있고, 이러한 다른 제제에 의해 상승적으로 또는 상가적으로 작용할 수 있다. 종양 모델에서, EGFL7은 종양이 항-VEGF 항체에 의해 치료된 후 억제된 종양 혈관의 트랙에 남아있는 것으로 발견되었다(본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 미국 특허 제2007/0031437호 참조). 특정 이론에 의해 구속되는 것을 바라지 않고, EGFL7는 기존의 ECM 트랙에 따른 EC 이동을 지지하도록 작용하며, 따라서 항-신생혈관생성 치료에 후속적인 종양 혈관 재성장을 보조할 수 있다. 따라서, 항신생혈관제의 활성을 향상시키거나 또는 민감화하기 위해 항신생혈관제와 병용하여 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 사용하는 것은 바람직하다. 일 양상에 있어서, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 그의 항-종양 효능을 향상시키기 위해 항-VEGF 항체 베바시주맙과 병용하여 사용된다.
루센티스(Lucentis)(상표명)는 "습식" 연령-관련 황반 변성의 치료를 위해 구체적으로 제시되고 승인된 아바스틴(Avastin)(상표명)(베바시주맙)의 Fab 단편이다. 따라서 또한 "습식" 연령-관련 황반 변성의 치료를 위해 루센티스(상표명), 또는 다른 항신생혈관제와 병용하여 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 사용하는 것은 바람직하다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드와 병용하여 투여된 치료적 제제의 유효량은 의사 또는 수의사의 재량에 의할 것이다. 투약량 투여 및 조절은 치료되는 병태의 최대 관리를 달성하도록 행해진다. 용량은 사용되는 치료적 제제의 유형 및 치료되는 구체적 환자와 같은 인자에 추가적으로 의존할 것이다. 전형적으로, 주어진 치료적 제제가 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 없이 투여된다면, 사용되는 양은 사용되는 것과 동일한 용량일 것이다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 동정 방법
본 발명은 또한 EGFL7와 상호작용하고, EGFL7 활성 및/또는 기능을 조절하는 것을 동정하기 위한 폴리펩타이드의 선별방법을 포함한다. 구체적 양상에서, 조합적 펩타이드 라이브러리는 도 1에 제시되고, 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 문헌 [Cho et al.]에서 기재되는 바와 같은 "비드 상의 비드" 접근을 사용하여 선별된다. 이 접근에서, 1 비드 1 화합물(one bead one compound: OBOC) 라이브러리는 90㎛ 텐타겔(Tentagel) 상에서 합성되고, 이에 의해 각각의 비드는 독특한 옥타펩타이드를 나타낸다. 그 다음에 자기 나노비드는 전장 재조합체 EGFL7로 코팅되며, 펩타이드 라이브러리와 혼합되고, 가장 크게 상호작용하는 라이브러리 비드 "히트"는 대형 포맷 유세포분석기를 사용하여 정렬된다. 그 다음에 인간 내피 세포를 사용하여 펩타이드 히트를 입증하기 위해 비드상 세포 결합 검정을 사용할 수 있다. 그 다음에 입증된 히트 펩타이드는 인-하우스 MALDI-TOF/MS 기법을 사용하여 서열분석되고, EGFL7에 대한 그의 결합 친화도는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR)을 사용하여 정량화된다(Amadei et al. 2009, J. Mass Spectrometry, 45:241-51; 미국 특허 제5,510,240호; 및 제7,262,269호, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함됨).
더 일반적으로, 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 전형적으로 EGFL7 활성의 잠재적 조절자를 빠르게 동정시키는 검정에서 우선 확인된다. 이러한 검정의 예는 단백질-단백질 결합 검정이되, EGFL7 수용체에 결합되는 후보 분자의 능력이 측정된다. 다른 예에서, EGFL7 수용체에 대한 EGFL7 결합을 방해하는 후보 분자의 능력이 측정된다. EGFL7에 결합하고/하거나 그와 상호작용하는 화합물의 동정 방법은 본 명세서에 전문이 참조로서 포함되는 미국 특허 제2007/0031437호에서 제시된다. 이러한 방법은 그들이 폴리펩타이드의 동정에 관련되기 때문에 이하에서 간략하게 제시된다.
일 양상에 있어서, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 EGFL7의 생물학적 활성 중 하나 이상을 조절하는(즉, 저해하거나 또는 향상시키는) 이들의 능력에 의해 동정된다. 따라서, 후보 폴리펩타이드는 EGFL7과 접촉된다. 그 다음에 EGFL7의 생물학적 활성이 평가된다. 일 양상에 있어서, 내피 세포 증식을 자극하기 위한 EGFL7의 능력이 결정된다. 또 다른 양상에 있어서, 내피 세포 생존을 촉진하는 EGFL7의 능력이 결정된다. 다른 양상에 있어서, 내피 세포 이동, 부착, 또는 관형성을 촉진하는 EGFL7의 능력이 결정된다. 폴리펩타이드는 EGFL7의 생물학적 활성이 폴리펩타이드의 존재에서 조절되는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드로서 동정된다.
또한, 단백질-단백질 상호작용에 적합한 어떤 방법이 EGFL7과 상호작용하는 폴리펩타이드를 동정하기 위해 사용될 수 있다. EGFL7과 상호작용하는 폴리펩타이드를 동정하기 위해 사용될 수 있는 전통적인 방법 중에 공면역침전법, 구배를 통한 가교 및 공정제 또는 크로마토그래피 칼럼이 있다. 이러한 검정에 대해, EGFL7 성분은 전장 단백질, 이의 가용성 유도체, 관심 대상 도메인에 대응하는 펩타이드 또는 EGFL7의 일부 영역을 함유하는 융합 단백질일 수 있다.
EGFL7과 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자의 동시적 동정을 초래하는 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 표지된 EGFL7 또는 이의 변종을 사용하여 λgt11 라이브러리의 항체 프로빙의 잘 공지된 기법과 유사한 방식에서 프로핑 발현 라이브러리를 포함한다.
생체내 단백질 상호작용을 검출하는 방법인 2-혼성 시스템은 단지 예시를 위해 제한하지 않고 상세하게 기재된다. 이 시스템의 일 형태는 기재되어 있고(본 명세서에 전문이 참조로서 포함된 문헌[Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9578-9582 (1991)]), 클론테크(Clontech)(캘리포니아주 팔로알토 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다.
간략하게, 이러한 시스템을 이용하여, 2 혼성 단백질을 암호화하는 플라스미드가 구성되며: 하나의 플라스미드는 EGFL7을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 그것으로부터의 융합 단백질에 융합된 전사 활성자 단백질의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어지고, 다른 플라스미드는 cDNA 라이브러리의 부분으로서 이 플라스미드 내로 재조합된 알려지지 않은 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA에 융합된 전사 활성자 단백질의 활성화 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어진다. DNA-결합 도메인 융합 플라스미드 및 cDNA 라이브러리는 조절 영역이 전사 활성자의 결합 부위를 함유하는 리포터 유전자(예를 들어, HBS 또는 lacZ)를 함유하는 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 균주내로 형질전환된다. 혼성 단백질은 단독으로 리포터 유전자의 전사를 활성화할 수 없는데: DNA-결합 도메인 혼성체는 그것이 활성화 기능을 제공하지 않기 때문에 활성화할 수 없고, 활성화 도메인 혼성체는 그것이 활성체의 결합 부위에 대해 국소화할 수 없기 때문에 활성화할 수 없다. 2개의 혼성 단백질의 상호작용은 기능적 활성자 단백질을 재구성하고, 리포터 유전자의 발현을 초래하는데, 이는 리포터 유전자 산물에 대한 검정에 의해 검출된다.
2개 혼성체 시스템 또는 관련된 방법은 "미끼" 유전자 산물과 상호작용하는 단백질에 대한 활성화 도메인 라이브러리를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 예로서, 그리고 제한하지 않고, EGFL7는 미끼 유전자 산물로서 사용될 수 있다. 전체 게놈 또는 cDNA 서열은 활성화 도메인을 암호화하는 DNA에 융합된다. 이 라이브러리 및 DNA-결합 도메인에 융합된 미끼 EGFL7 유전자 산물의 혼성체를 암호화하는 플라스미드는 효모 리포터 균주내로 공동형질전환되고, 얻어진 형질전환체는 리포터 유전자를 발현시키는 것에 대해 선별된다. 예를 들어, 제한하지 않고, 미끼 EGFL7 유전자 서열, 예를 들어, 유전자의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 벡터 내로 클로닝되므로, GAL4 단백질의 DNA-결합 도메인을 암호화하는 DNA에 번역가능하게 융합될 수 있다. 이들 콜로니는 정제되고, 리포터 유전자 발현을 초래하는 라이브러리 플라스미드가 단리된다. 그 다음에 라이브러리 플라스미드에 의해 암호화된 단백질을 동정하기 위해 DNA 서열분석이 사용된다.
미끼 EGFL7 유전자 산물과 상호작용하는 폴리펩타이드가 검출되는 세포주의 cDNA 라이브러리는 당업계에서 일상적으로 실행되는 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 특정 시스템에 따라, 예를 들어, cDNA 단편은 그것이 GAL4의 전사 활성화 도메인에 번역에 의해 융합되도록 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이 라이브러리는 GALA 활성화 서열을 함유하는 프로모터에 의해 구동된 lacZ 유전자를 함유하는 효모 균주내로 미끼 EGFL7 유전자-GALA 융합 플라스미드와 함께 공동형질전환될 수 있다. 미끼 EGFL7 유전자 산물과 상호작용하는 GAL4 전사 활성화 도메인에 융합된 cDNA 암호화된 폴리펩타이드는 활성 GAL4 단백질을 재구성하고, 이에 의해 리포터 유전자의 발현을 구동시킬 수 있다. 리포터 유전자의 발현을 구동하는 콜로니는 당업계에서 일상적인 방법에 의해 검출될 수 있다. 그 다음에 cDNA는 이들 균주로부터 정제될 수 있고, 당업계에서 일상적으로 실행되는 기법을 사용하여 미끼 EGFL7 유전자-상호작용 폴리펩타이드를 생성하고 단리시키는데 사용될 수 있다.
컴퓨터 모델링 및 검색 기법은 EGFL7 기능 또는 활성을 조절할 수 있는 폴리펩타이드를 동정하게 하거나 또는 이미 동정된 폴리펩타이드를 개선시킨다. 이러한 폴리펩타이드를 동정하면, EGFL7과 상호작용하는 활성 부위 또는 영역이 동정된다. 이러한 활성 부위는 전형적으로 리간드 결합 부위일 수 있다. 활성 부위는, 예를 들어 펩타이드의 아미노산 서열로부터, 핵산의 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 적절한 폴리펩타이드와 EGFL7의 복합체 연구로부터를 포함하는, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 동정될 수 있다. 후자의 경우에, EGFL7 상에서 복합체화된 폴리펩타이드가 발견된 결과에 의해 활성 부위를 찾기 위해 화학적 또는 X-레이 결정학적 방법이 사용될 수 있다.
다음에, 활성 부위의 3차원 기하학적 구조가 결정된다. 이는 완전한 분자 구조를 결정할 수 있는, X-레이 결정학을 포함하는 공지된 방법에 의해 행해진다. 반면에, 고체 또는 액체상 NMR은 특정 분자내 거리를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 구조 결정의 어떤 다른 실험 방법은 부분적 또는 완전한 기하학적 구조를 얻기 위해 사용될 수 있다. 기하학적 구조는 천연 또는 인공의 복합체화된 폴리펩타이드에 의해 측정될 수 있는데, 이는 결정된 활성 부위 구조의 정확성을 증가시킬 수 있다.
불완전하거나 또는 불충분하게 정확한 구조가 결정된다면, 구조를 완전하게 하거나 또는 그의 정확성을 개선시키기 위해 컴퓨터 기반 수치적 모델링 방법이 사용될 수 있다. 폴리펩타이드와 같은 특정 생체중합체에 특이적인 파라미터화된 모델, 컴퓨터 분자 운동에 기반한 분자의 동적 모델, 열 앙상블에 기반한 통계적 역학 모델, 또는 조합된 모델을 포함하는, 어떤 인식된 모델링 방법이 사용될 수 있다. 대부분의 모델 유형에 대해, 구성성분 원소와 기 사이의 힘을 나타내는 표준 분자력장이 필요하며, 물리 화학에서 공지된 역장(force field)으로부터 선택될 수 있다. 불완전하거나 또는 덜 정확한 실험 구조는 이들 모델링 방법에 의해 계산된 완전하고 더 정확한 구조에 대한 제약으로서 작용할 수 있다.
최종적으로, 실험적으로, 모델링에 의해 또는 조합에 의해 활성 부위(또는 결합 부위) 구조를 결정하면, 후보 상호작용 폴리펩타이드는 그의 분자 구조에 대한 정보와 더불어서 화합물을 함유하는 데이터베이스를 검색함으로써 동정될 수 있다. 이러한 검색은 결정된 활성 부위 구조와 매칭되고, 활성 부위를 정하는 기와 상호작용하는 구조를 갖는 폴리펩타이드를 찾는다. 이러한 검색은 수동일 수 있지만, 전형적으로 컴퓨터로 보조된다. 이 검색으로부터 찾은 폴리펩타이드는 EGFL7 활성의 잠재적 조절자이다.
대안적으로, 이들 방법은 이미 공지된 상호작용 화합물 또는 리간드로부터 개선된 상호작용 폴리펩타이드를 동정하기 위해 사용될 수 있다. 공지된 폴리펩타이드의 조성물은 변형될 수 있고, 변형의 구조적 효과는 새로운 조성물에 적용되는 상기 기재한 실험적 및 컴퓨터 모델링 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 그 다음에 변경된 구조는 개선된 적합도 또는 상호작용 결과 여부를 결정하기 위해 복합체의 활성 부위 구조와 비교된다. 조성물에서의 이런 방식 체계적 변형에서, 예컨대 측기를 달리함으로써, 개선된 특이성 또는 활성의 변형된 상호작용 폴리펩타이드를 얻도록 빠르게 평가될 수 있다.
EGFL7의 활성 부위(또는 결합 부위)의 동정에 기반한 상호작용 폴리펩타이드를 동정하는데 유용한 추가적인 실험적 및 컴퓨터 모델링 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
분자 모델링 시스템의 예는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램(매사추세츠주 월섬에 소재한 폴리겐 코포레이션(Polygen Corporation))이다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 동역학 기능을 수행한다. QUANTA는 구성, 그래픽 모델링 및 분자 구조의 분석을 수행한다. QUANTA는 상호작용적 구성, 변형, 시각화 및 서로에 대한 분자 거동의 분석을 허용한다.
결합을 변경시킬 수 있는 폴리펩타이드의 설계 및 발생에 대해 상기 기재하였지만, 또한 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드에 대한 공지된 폴리펩타이드의 라이브러리 및/또는 신규한 폴리펩타이드의 라이브러리를 선별할 수 있었다.
시스템은 동족 수용체, 결합 상대 또는 기질와 상호작용할 수 있거나(예를 들어, 결합할 수 있거나) 또는 이들에 대한 EGFL7의 결합을 방해할 수 있는 폴리펩타이드를 동정하도록 설계될 수 있다. 동정되는 폴리펩타이드는, 예를 들어 야생형 및/또는 돌연변이체 EGFL7 유전자 산물의 활성을 조절하는데 유용할 수 있거나; EGFL7의 생물학적 기능을 상술하는데 유용할 수 있거나; 정상 EGFL7 상호작용을 파괴하는 화합물을 동정하기 위해 선별에서 이용될 수 있거나; 또는 이러한 상호작용을 그 자체가 파괴하거나 또는 활성화할 수 있다.
EGFL7 또는 EGFL7 동족 수용체 또는 기질에 결합되는 폴리펩타이드를 동정하기 위해 사용된 검정의 원칙은 2가지 성분이 상호작용하고 결합하는데 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 EGFL7의 반응 혼합물 및 시험 폴리펩타이드를 준비하는 단계, 및 이에 의해 반응 혼합물에서 제거되고/되거나 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 단계를 수반한다. 사용된 EGFL7 종은 선별 검정의 목표에 따라서 다를 수 있다. 예를 들어, 천연 수용체의 길항물질이 요망된다면, 전장 EGFL7, 또는 가용성 절단 EGFL7, 펩타이드, 또는 검정 시스템(예를 들어, 얻어진 복합체의 표지, 단리 등)에서 이점을 제공하는 단백질 또는 폴리펩타이드에 융합된 하나 이상의 EGFL7 도메인을 함유하는 융합 단백질이 이용될 수 있다. EGFL7과 직접적으로 상호작용하는 화합물이 추구되는 경우, 예를 들어, EGFL7에 대응하는 펩타이드 및 EGFL7을 함유하는 융합 단백질이 사용될 수 있다.
선별 검정은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 이러한 검정을 수행하는 한 방법은 EGFL7, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 그것으로부터의 융합 단백질, 또는 시험 폴리펩타이드를 고체상에 앵커링하는 단계 및 반응의 마지막에 고체상에 앵커링된 EGFL7/시험 폴리펩타이드 복합체를 검출하는 단계를 수반한다. 이러한 방법의 일 양상에서, EGFL7은 고체 표면 상에 앵커링될 수 있고, 앵커링되지 않은 시험 폴리펩타이드는 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다.
실행에서, 미세적정 플레이트는 고체상으로서 편리하게 이용될 수 있다. 앵커링된 성분은 비공유적 또는 공유적 부착에 의해 고정될 수 있다. 비공유적 부착은 단순히 고체 표면을 단백질 용액으로 코팅하는 단계 및 건조시키는 단계에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 고정된 항체, 전형적으로는 고정되는 단백질에 특이적인 단클론성 항체는 고체 표면에 단백질을 앵커링하기 위해 사용될 수 있다. 표면은 미리 제조되고 저장될 수 있다.
검정을 수행하기 위해, 비고정 성분이 앵커링된 성분을 함유하는 코팅된 표면에 첨가된다. 반응이 완료된 후, 미반응 성분은 형성된 어떤 복합체가 고체 표면 상에 고정된 채로 남는 조건 하에서 제거된다(예를 들어, 세척에 의해). 고체 표면 상에 앵커링된 복합체의 검출은 다수의 방법으로 수행될 수 있다. 이전에 고정되지 않은 성분이 미리 표지된 경우, 표면 상의 표지 고정된 성분의 검출은 복합체가 형성되었다는 것을 나타낸다. 이전에 고정되지 않은 성분이 미리 표지되지 않은 경우, 예를 들어, 이전에 고정되지 않은 성분에 특이적인 표지된 항체를 사용하여(결국 항체는 직접적으로 표지되거나 또는 표지된 항-Ig 항체를 이용하여 간접적으로 표지될 수 있음) 표면상에 앵커링된 복합체를 검출하기 위해 간접적 표지가 사용될 수 있다.
대안적으로, 반응은 액체상에서 수행될 수 있고, 예를 들어, EGFL7 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 융합 단백질에 특이적인 고정된 항체 또는 용액 중에 형성된 어떤 복합체를 앵커링하기 위한 시험 화합물, 및 앵커링된 복합체를 검출하기 위해 가능한 복합체의 다른 성분에 특이적인 표지된 항체를 사용하여, 반응 생성물은 미반응 성분 및 검출된 복합체로부터 분리된다.
EGFL7과 상호작용하는 거대분자는 본 논의의 목적을 위해 "결합 상대"로서 지칭된다. 이들 결합 상대는 EGFL7 매개 생물학적 경로에 연루될 가능성이 있다. 따라서, 신체 내 EGFL7 활성을 조절하거나 또는 증대시키는데 및/또는 이 활성(또는 이의 결함)과 관련된 장애를 조절하는데 유용할 수 있는 이러한 결합 상대의 상호작용을 방해하거나 또는 파괴하는 폴리펩타이드를 동정하는 것이 바람직하다.
EGFL7과 결합 상대 또는 상대들 간의 상호작용을 방해하는 폴리펩타이드를 동정하기 위해 사용되는 검정 시스템의 기본적 원칙은 EGFL7, 또는 이의 일부 변종, 및 결합 상대를 함유하는 반응 혼합물을 둘이 상호작용하는데 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 제조하는 단계, 이에 의해 복합체를 형성하는 단계를 수반한다. 저해제 활성에 대해 폴리펩타이드를 시험하기 위해, 반응 혼합물은 시험 폴리펩타이드의 존재 및 부재에서 제조된다. 시험 폴리펩타이드는 처음에 반응 혼합물 중에 포함될 수 있거나, 또는 EGFL7 및 이의 결합 상대의 첨가에 후속적인 시간에 첨가될 수 있다. 대조군 반응 혼합물은 시험 폴리펩타이드 없이 또는 대조군 폴리펩타이드와 함께 인큐베이션된다. 그 다음에 EGFL7과 결합 상대 간의 어떤 복합체의 형성이 검출된다. 시험 폴리펩타이드를 함유하는 반응 혼합물에서를 제외하고, 대조군 반응에서 복합체의 형성은 화합물이 EGFL7과 그의 결합 상대의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다. 또한, 시험 폴리펩타이드 및 정상 EGFL7 단백질을 함유하는 반응 혼합물 내에서 복합체 형성은 또한 시험 폴리펩타이드 및 돌연변이체 EGFL7을 함유하는 반응 혼합물 내에서의 복합체 형성과 비교될 수 있다. 이 비교는 해당 경우에 중요할 수 있되, 돌연변이체 또는 돌연변이된 EGFL7의 상호작용을 특이적으로 파괴하지만, 정상 단백질의 상호작용은 파괴하지 않는 폴리펩타이드를 동정하는 것이 바람직하다.
EGFL7과 결합 상대 간의 상호작용을 방해하는 폴리펩타이드에 대한 검정은 이종성 또는 상동성 방식으로 수행될 수 있다. 이종성 검정은 EGFL7, 또는 결합 상대를 고체상에 앵커링하는 단계 및 반응의 마지막에 고체상 상에 앵커링된 복합체를 검출하는 단계를 수반한다. 상동성 검정에서, 전체 반응은 액체상에서 수행된다. 접근에서, 반응물의 첨가 순서는 시험되는 폴리펩타이드에 관한 상이한 정보를 얻기 위해 변할 수 있다. 예를 들어, 경쟁에 의해 상호작용을 방해하는 시험 폴리펩타이드는 시험 폴리펩타이드의 존재에서 반응을 수행함으로써; 즉, EGFL7 및 상호작용의 결합 상대 전에 또는 동시에 반응 혼합물에 시험 폴리펩타이드를 첨가함으로써 동정될 수 있다. 대안적으로, 미리 형성된 복합체를 파괴하는 시험 폴리펩타이드, 예를 들어 복합체로부터의 성분 중 하나를 대신하는 더 높은 결합 상수를 지니는 폴리펩타이드는 복합체가 형성된 후 반응 혼합물에 시험 폴리펩타이드를 첨가함으로써 시험될 수 있다.
특정 실시형태에서, EGFL7 융합 단백질은 고정화를 위해 제조될 수 있다. 예를 들어, EGFL7, 또는 이의 펩타이드 단편은 얻어진 융합 단백질에서 그의 결합 활성이 유지되는 방식으로 pGEX-5X-1과 같은 융합 벡터를 사용하여 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)에 융합될 수 있다. 상호작용적 결합 상대는 정제될 수 있고, 당업계에서 일상적으로 실행되는 방법을 사용하여 단클론성 항체를 상승시키는데 사용될 수 있다. 이 항체는, 예를 들어 당업계에서 일상적으로 실행되는 방법에 의해 방사성 동위원소 125I로 표지될 수 있다. 이종성 검정에서, 융합 단백질은 글루타티온-아가로스 비드에 앵커링될 수 있다. 그 다음에 상호작용적 결합 상대는 상호작용 및 결합이 일어나는 방식에서 시험 폴리펩타이드의 존재 또는 부재에서 첨가될 수 있다. 반응 기간의 마지막에, 미결합 재료는 세척될 수 있고, 표지된 단클론성 항체는 시스템에 첨가되며, 복합체화된 성분에 결합되게 할 수 있다. EGFL7과 상호작용적 결합 상대 간의 상호작용은 글루타티온-아가로스 비드와 관련된 남아있는 방사능의 양을 측정함으로써 검출될 수 있다. 시험 폴리펩타이드에 의한 상호작용의 성공적인 저해는 측정된 방사성에서의 감소를 초래할 것이다.
대안적으로, GST 융합 단백질 및 상호작용적 결합 상대는 고체 글루타티온-아가로스 비드가 없을 때 액체 중에서 함께 혼합될 수 있다. 시험 폴리펩타이드는 종이 상호작용하게 하는 동안 또는 그 후에 첨가될 수 있다. 그 다음에 이 혼합물은 글루타티온-아가로스 비드에 첨가될 수 있고, 미결합 재료는 세척된다. 또한 EGFL7과 결합 상대 간의 상호작용의 저해 정도는 표지된 항체를 첨가하는 단계 및 비드와 관련된 방사성을 측정하는 단계에 의해 검출될 수 있다.
EGFL7의 그의 수용체에 대한 결합을 조절하는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 경쟁적 저해 검정을 위한 적절한 조건 하에서 EGFL7 및 후보 폴리펩타이드를 막-결합 EGFL7 수용체 또는 재조합체 수용체와 조합함으로써 검출될 수 있다. EGFL7은 예컨대 방사성에 의해 표지될 수 있으며, 수용체에 결합된 EGFL7 분자의 수는 후보 폴리펩타이드의 유효성을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상호작용 EGFL7 폴리펩타이드에 대한 다른 검정에서, EGFL7 수용체를 발현시키는 포유류 세포 또는 막 제조는 후보 폴리펩타이드의 존재에서 표지된 EGFL7과 함께 배양된다. 그 다음에 이 상호작용을 향상시키거나 또는 차단하는 폴리펩타이드의 능력이 측정될 수 있었다.
후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 시험하는 방법
EGFL7 상호작용 활성에 대해 EGFL7 폴리펩타이드를 시험하기 위해 다양한 검정을 이용할 수 있다. 이러한 검정은 하기 실시예에 제공된 것 및 미국 제2007/0031437호(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨)에 기재된 것을 포함한다.
암의 경우, 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드, 예컨대 소분자 길항제의 효율을 시험하기 위해 다양한 널리 공지된 동물 모델을 이용할 수 있디. 이러한 모델의 생체내 성질은 이것이 특히 인간 환자에서의 반응을 예측하게 만든다. 종양 및 암(예를 들어, 유방암, 대장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델은 비재조합체 및 재조합체(형질전환) 동물 둘 다를 포함한다. 비재조합체 동물 모델은 예를 들어 설치류, 예를 들어 쥣과 모델을 포함한다. 표준 기법, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐 하 이식 또는 오르토핀(orthopin) 이식을 이용하여 동질유전자 마우스로 종양 세포를 도입함으로써(예를 들어, 대장 조직에 이식된 대장암 세포) 이러한 모델을 생성할 수 있다. 예를 들어, 1997년 9월 18일자에 공개된 PCT 공보 제WO 97/33551호(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨)를 참조한다. 아마도, 종양학 연구에서 가장 자주 사용되는 동물 종은 면역결핍 마우스, 특히 누드 마우스이다. 흉선 형성부전/무형성증을 갖는 누드 마우스가 인간 종양 이종이식에 대한 숙주로서 성공적으로 작용한다는 관찰은 이 목적에 대한 이의 광범위한 사용을 발생시킨다. 예를 들어, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL를 포함하는 누드 마우스의 매우 많은 수의 명확한 유사유전자 균주에 상염색체 열성 nu 유전자를 도입하였다. 또한, 누드 마우스 이외의 유전성 면역학적 결함을 갖는 매우 다양한 다른 동물을 육종하고 종양 이종이식의 수혜자로서 사용하였다. 추가의 상세내용을 위해, 예를 들어 문헌[The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991)(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨)]을 참조하면 된다.
공지된 종양/암 세포주, 예를 들어 B 104-1-1 세포주(neu 원발암유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 등; ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 세포(ATCC HTB-37); 또는 적절히 잘 분화된 II 등급 인간 대장 선암 세포주, HT-29(ATCC HTB-38); 또는 원발성 종양 및 암으로부터 이러한 동물에 도입된 세포가 유래할 수 있다. 액체 질소 중에 냉동하고 저장하는 것을 수반하는 표준 조건을 이용하여 수술을 받은 환자로부터 종양 또는 암 세포의 샘플을 얻을 수 있다. Karmali et al., Br. J. Cancer 48:689-696 (1983)(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨).
다양한 절차에 의해 동물, 예컨대 누드 마우스 또는 EGFL7 넉아웃 마우스에 종양 세포를 도입할 수 있다. 마우스에서의 피하(s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고체 블록으로서, 투관침의 사용에 의한 침 생검으로서 또는 세포 현탁액으로서 s.c. 이식될 수 있다. 고체 블록 또는 투관침 이식의 경우, 적합한 크기의 종양 조직 단편이 s.c. 공간에 도입된다. 원발성 종양 또는 안정한 종양 세포주로부터 세포 현탁액을 새로 제조하고 피하로 주사한다. 종양 세포를 또한 피하 이식물로서 주사할 수 있다. 이 위치에서, 접종원이 s.c. 조직과 진피 연결 조직의 하부 부분 사이에 침착된다.
실질적으로 문헌[Drebin et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9129-9133 (1986)(참조문헌으로 본 명세서에 그 전문이 포함됨)]에 기재된 바와 같이 예를 들어 누드 마우스로 (neu 암유전자가 초기 단리된) 래트 신경모세포종 세포 또는 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 이식함으로써 유방암의 동물 모델을 생성할 수 있다.
유사하게, 동물, 예를 들어 누드 마우스에서 대장암 세포를 계대배양하여 이 동물에서 종양이 나타나게 하여 대장암의 동물 모델을 생성할 수 있다. 누드 마우스에서의 인간 대장암의 동소 이식 모델은 예를 들어 문헌[Wang et al., Cancer Research 54:4726-4728 (1994) 및 Too et al., Cancer Research 55:681-684 (1995)(각각 참조문헌으로 본 명세서에 그 전문이 포함됨)]에 기재되어 있다. 이 모델은 안티캔서, 인크.(AntiCancer, Inc.)(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재)가 판매하는 소위 "메타마우스(METAMOUSE)(상표명)"에 기초한다.
동물에서 생긴 종양을 제거하고 실험실내 배양할 수 있다. 이후, 시험관내 배양물로부터의 세포를 동물로 계대배양할 수 있다. 이러한 종양은 추가의 시험 또는 폴리펩타이드 스크리닝을 위한 표적으로서 기능할 수 있다. 예를 들어, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 BALB/c 암컷 마우스(DeLeo et al., J. Exp. Med. 146:720 (1977)(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨))의 화학 유도 섬유육종이고, 이는 다양한 물질의 항종양 활성을 연구하기 위한 고도로 제어 가능한 모델 시스템을 제공한다. Palladino et al., J. Immunol. 138:4023-4032 (1987)(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨). 간단히 말하면, 종양 세포를 세포 배양물 중에 시험관내 증식하였다. 동물에 주사하기 전에, 세포주를 세척하고 약 10x106 내지 10x107개 세포/㎖의 세포 밀도로 완충제 중에 현탁시킨다. 이후, 동물을 10 내지 100㎕의 세포 현탁액으로 피하로 감염시켜, 1주 내지 3주 종양이 나타나게 한다.
또한, 가장 완전하게 연구된 실험 종양 중 하나인 마우스의 루이스(Lewis) 폐 암종을 조사 종양 모델로서 사용할 수 있다. 이 종양 모델에서의 효율은 폐의 소세포 암종(SCCL)으로 진단된 인간 환자의 치료에서 유리한 효과와 상관된다. 이환 마우스로부터의 종양 단편 또는 배양물 중에 유지된 세포의 주사 시 정상 마우스에서 이 종양을 도입할 수 있다. Zupi et al., Br. J. Cancer 41: suppl. 4, 30 (1980)(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨). 증거는 종양이 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작할 수 있고, 매우 높은 비율의 감염된 종양 세포가 생존한다는 것을 나타낸다. 이 종양 모델에 대한 추가의 정보를 위해, 문헌[Zacharski, Haemostasis 16:300-320 (1986)(참조문헌으로 본 명세서에 그 전문이 포함됨)]을 참조한다.
자발적 동물 종양의 치료에서 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 효율을 또한 시험할 수 있다. 이러한 연구에 대한 예시적인 적합한 표적은 고양이과 경구 편평 세포 암종(SCC)이다. 고양이과 경구 SCC는 이 종에 보고된 경구 종양 중 60%를 넘게 차지하는, 고양이의 가장 흔한 경구 악성종양인 가장 침윤성인, 악성 종양이다. 이는 먼 위치로 거의 전위하지 않지만, 이 낮은 전이 발생도는 단지 이 종양을 갖는 고양이에 대한 짧은 생존 시간의 반영일 수 있다. 이 종양은 주로 고양이과 구강의 해부학으로 인해 일반적으로 수술될 수 없다. 현재, 이 종양에 대한 효과적인 치료는 없다. 연구에 진입하기 전에, 각각의 고양이는 완전한 임상 실험 및 생검을 겪고, 컴퓨터 단층촬영(CT)으로 스캐닝된다. 설하 경구 편평 세포 종양이 진단된 고양이는 이러한 종양의 결과로서 혀가 마비될 수 있으므로 연구으로부터 배제될 수 있다. 따라서, 치료가 종양에 대해 효과적이더라도, 이환 동물은 스스로 섭식할 수 없을 수 있다. 각각의 고양이를 긴 기간 동안 반복하여 치료한다. 치료 기간 동안 매일 그리고 각각의 후속 재확인에 종양 사진을 찍는다. 치료 후, 각각의 고양이는 다른 CT 스캔을 받는다. 이후, 8주마다 CT 스캔 및 흉부 라디오그램(radiogram)을 평가한다. 대조군과 비교하여 생존, 반응 및 독성의 차이에 대해 데이터를 평가한다. 양성 반응은 통상적으로 삶의 질 개선 및/또는 수명 증가와 함께 종양 퇴행의 증거를 요할 수 있다.
또한, 개, 고양이 및 개코원숭이의 섬유육종, 선암, 림프종, 연골종 또는 평활근육종과 같은 다른 자발적 동물 종양을 또한 시험할 수 있다. 물론, 개 및 고양이에서의 유방 선암은 이의 외관 및 거동이 인간에서의 유방 선암과 매우 유사하므로 통상적인 모델이다. 그러나, 이 모델의 사용은 동물에서 이러한 유형의 종양의 드문 발생으로 인해 제한된다.
종양이 이식된 동물 모델에서의 시험 폴리펩타이드의 효율을 평가하는 일 방식은 치료 전에 및 후에 종양의 크기를 측정하는 것이다. 전통적으로, 이식된 종양의 크기를 2차원 또는 3차원으로 슬라이드 캘리퍼스로 측정한다. 2차원으로 제한된 측정은 종양의 크기를 항상 정확하게 반영하지 않고; 따라서, 이는 일반적으로 수학식을 이용하여 상응하는 용적으로 전환된다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확할 수 있다. 폴리펩타이드 후보의 치료학적 효과는 대개 치료 유발 성장 지연 및 특이적 성장 지연의 면으로 더 잘 기술될 수 있다. 종양 성장의 설명에서 또 다른 중요한 변수는 종양 용적 배가 시간이다. 문헌[Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p. 301(참조문헌으로 본 명세서에 그 전문이 포함됨)]에 보고된 프로그램과 같은 종양 성장의 계산 및 설명을 위한 컴퓨터 프로그램이 또한 이용 가능하다.
추가로, 형질전환 동물을 제조하는 표준 기법을 이용하여 관심 대상의 동물의 게놈으로 EGFL7 유전자의 암호화 부분을 도입함으로써 재조합체(형질전환) 동물 모델을 조작할 수 있다. 형질전환 조작을 위한 표적으로서 작용할 수 있는 동물은, 제한함이 없이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소 돼지 및 비인간 영장류, 예를 들어 개코원숭이, 침팬지 및 원숭이를 포함한다. 이러한 동물로 전이유전자를 도입하기 위해 당해 분야에 공지된 기법은 프로핵산 미량주사(미국 특허 제4,873,191호); 생식 계열로의 레트로바이러스 매개 유전자 전달(예를 들어, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6148-615 (1985)); 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화(Thompson et al., Cell 56:313-321 (1989)); 배아의 전기천공(Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803-1814 (1983)); 및 정자 매개 유전자 전달(Lavitrano et al., Cell 57:717-73 (1989))을 포함한다. 검토를 위해, 예를 들어 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다. 이 참조문헌 각각은 본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함된다.
형질전환 동물은 또한 이의 세포의 일부에서만 전이유전자를 운반하는 동물("모자이크 동물")을 포함한다. 전이유전자는 단일 전이유전자로서 또는 연쇄체, 예를 들어 머리 대 머리 또는 꼬리 대 꼬리 탠덤으로 편입될 수 있다. 특정한 세포형으로의 전이유전자의 선택적 도입은 또한 하기하는 예를 들어 문헌[Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-636 (1992)]의 기법에 의해 가능하다. 표준 기법에 의해 형질전환 동물에서의 전이유전자의 발현을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 전이유전자의 편입을 검증하기 위해 사우던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용할 수 있다. 이후, 인시츄 하이브리드화, 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기법을 이용하여 MRNA 발현 수준을 분석할 수 있다. 이후, 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 시험하기 위해 이러한 동물을 사용할 수 있다.
신생혈관생성을 측정하기 위한 당해 분야에 공지된 다른 시험관내 및 생체내 시험이 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 효율을 시험하기 위해 본 명세서에 또한 적합하다. 일 예에서, 내피 세포, 예를 들어, 화학적으로 얻거나 제조될 수 있는 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC) 또는 인간 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 1:1(v/v) 비로 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 피브리노겐(5㎎/㎖)으로 2x105개 세포/㎖의 농도로 혼합한다. 트롬빈(5단위/㎖(최종 농도))을 첨가하고, 혼합물을 24웰 플레이트(웰마다 0.5㎖)로 즉시 옮긴다. 피브린 겔이 형성되게 하고 이후 VEGF 및 bFGF를 후보 폴리펩타이드와 함께 (각각 5ng/㎖(최종 농도)로) 웰에 첨가한다. 세포를 4일 동안 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하고, 이때 각각의 웰에서의 세포를 계수하고, 둥글거나, 분지 없이 길거나, 하나의 분지를 가지면서 길거나, 2개 이상의 분지를 가지면서 긴 것으로 분류한다. 결과는 폴리펩타이드의 각각의 농도에 대해 5개의 상이한 웰의 평균으로 대개 표시된다. 통상적으로, 혈관신생 저해제, 예컨대 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 존재 하에, 세포는 둥글게 남아 있거나 비분화 관(예를 들어, 0개 또는 1개의 분지)을 형성한다.
이 검정은 생체내 항혈관신생 효율을 예측하는 것으로 당해 분야에서 인식된다(Min et al., 1996(참조문헌으로 본 명세서에 그 전문이 포함됨)).
교대 검정에서, 마트리겔(MATRIGEL)(상표명)에서 내피 세포를 배양할 때 내피 세포 관형성이 관찰되었다(Schnaper et al., 1995(본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨)). 내피 세포(1x104개 세포/웰)를 마트리겔(상표명)-코팅된 24웰 플레이트에 옮기고, 48시간 후 관형성을 정량한다. 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 내피 세포와 동시에 첨가하거나 이후 다양한 시점에 첨가하여 이를 시험한다.
특정한 유형의 기저막, 즉 이동하고 분화하는 내피 세포가 처음에 마주치는 것으로 예상되는 매트릭스의 층에 내피 세포를 제시함으로써 이 검정은 신생혈관생성을 모델링한다. 결합된 성장 인자 이외에, 마트리겔(상표명)(및 인시츄에서 기저막)에서 발견되는 매트릭스 성분 또는 이의 단백질분해 생성물은 또한 내피 세포 관형성에 대한 자극인자일 수 있고, 이 모델이 이전에 기재된 피브린 겔 신생혈관생성 모델(Blood and Zetter, 1990; Odedra and Weiss, 1991(각각 본 명세서에 참조문헌으로 그 전문이 포함됨))에 상호보완적이게 만든다. 검정 둘 다에서 내피 세포 관형성을 저해하는 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 이 폴리펩타이드가 또한 생체내 항혈관신생 활성을 갖는다는 것을 제시한다.
또한, 신생혈관생성의 널리 인정되는 기본 검정 및 이에 따른 항신생혈관제는 신생혈관의 각막 마이크로포켓 검정 및 병아리 장뇨막 검정(CAM) 검정이다. 미국 특허 제5,712,291호는 본 명세서에 참조문헌으로 구체적으로 포함되어 극도로 넓은 범위의 혈관신생 질환의 치료에서 사용하기 위한 물질을 동정하기 위해 각막 마이크로포켓 및 CAM 검정이 충분히 예측 가능하다는 것을 나타낸다.
미국 특허 제5,001,116호는 또한 CAM 검정을 기술할 목적으로 본 명세서에 참조문헌으로 구체적으로 포함된다. 요약하면, 병아리 수정 배아는 3일 또는 4일에 이의 껍질로부터 제거되고, 시험 화합물을 포함하는 메틸셀룰로스 디스크는 장뇨막에 이식된다. 배아를 대략 48시간 후 조사하고, 명확한 무혈관 구역이 메틸셀룰로스 디스크 주위에 나타나는 경우, 이 구역의 직경을 측정한다. 미국 특허 제5,712,291호(이 목적을 위해 본 명세서에 참조문헌으로 구체적으로 포함됨)에 개시된 바대로, 본 발명의 맥락에서, 임의의 무혈관 구역의 외관은 항혈관신생 폴리펩타이드를 입증하기에 충분하다. 구역이 더 클수록, 폴리펩타이드가 더 효과적이다.
래트 또는 래빗 각막을 사용하여 신생혈관의 각막 마이크로포켓 검정을 실행할 수 있다. 이 생체내 모델은, 미국 특허 제5,712,291호 및 제5,871,723호(각각 입증 목적을 위해 본 명세서에 참조문헌으로 구체적으로 포함됨)에 의해 입증되는 것처럼, 임상 유용성을 예측하는 것으로 널리 인정된다.
본 발명에서, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 동정하기 위해 각막 마이크로포켓 검정을 이용할 수 있다. 이는 각막 내의 일정하게 관찰되고, 통상적으로, 현저한 혈관 수 감소로 표시되는 것처럼, 유의적인 신생혈관생성 감소로 입증된다. 이러한 반응은, 후보 폴리펩타이드와 접촉될 때 성장 지속의 증거를 나타내지 않는, 이따금의 싹(sprout) 및/또는 헤어핀 루프만을 나타내는 각막으로서 통상적으로 정의된다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 사용한 치료 및 진단 방법
본 명세서에 기재된 생체내 및/또는 시험관내 검정에서 활성을 갖는 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 혈관에 영향을 미치는 전신 장애를 비롯한 병리학적 신생혈관생성과 관련된 다양한 장애에서 치료학적 용도를 가질 것이다. 이의 치료학적 유용성은 동맥, 모세혈관, 정맥 및/또는 림프관의 질환을 포함한다.
적혈구생성 또는 과립구형성을 저해하고, 상처 치유 또는 조직 재생 및 조직, 예컨대 연결 조직, 피부, 뼈, 연골, 근육, 폐 또는 신장의 과도한 재생에 관한 관련 치료를 저해하고, 신생혈관생성을 저해하고, 내피 세포의 이동을 저해하고, 혈관 평활근 성장 및 내피 세포 생성을 저해하기 위해 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 상처 치유 동안의 과도한 연결 조직 생성 또는 EGFL7이 이러한 생성을 촉진하는 경우 폐 섬유증을 제한하도록 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 사용할 수 있어서, 이러한 폴리펩타이드는 급성 심근 경색 및 심부전의 치료 시 용도가 발견된다.
특정한 유형의 질환이 하기 기재되어 있고, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 자리 특이적 약리학적 물질 전달 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 표적 모이어티로서의 용도가 발견될 수 있다. 죽상동맥경화증은 동맥 벽 내의 지질 축적, 평활근 세포 증식 및 섬유성 조직 형성으로 인해 동맥에서의 내막 비후화의 플라크의 축적을 특징으로 하는 질환이다. 이 질환은 임의의 장기에서 큰 동맥, 중간 동맥 및 작은 동맥에 영향을 미칠 수 있다. 내피 및 혈관 평활근 세포 기능의 변화가 이 플라크의 축적 및 퇴행을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.
고혈압은 전신 동맥, 폐 동맥 또는 문정맥계에서 혈압 상승을 특징으로 한다. 혈압 증가는 손상된 내피 기능 및/또는 혈관 질환으로부터 생기거나 이를 발생시킬 수 있다.
염증성 맥관염은 거대 세포 동맥염, 다카야스 동맥염(Takayasu's arteritis), 결절성 다발성 동맥염(미세혈관병성 형태를 포함), 가와사키병(Kawasaki's disease), 현미경 다발성 맥관염, 베게너 육아종증 및 다양한 감염성 관련 혈관 장애(헤노흐-쇤라인(Henoch-Schonlein) 자반병을 포함)를 포함한다. 변경된 내피 세포 기능은 이 질환에서 중요한 것으로 나타났다.
레이노병(Reynaud's disease) 및 레이노 현상은 추위 노출 시 사지를 통한 순환의 간헐적 이상 손상을 특징으로 한다. 변경된 내피 세포 기능은 이 질환에서 중요한 것으로 나타났다.
동맥류는 변경된 내피 세포 및/또는 혈관 평활근 세포와 관련된 동맥 또는 정맥 나무의 낭상 또는 방추 확장이다.
내피 및 혈관 평활근 세포의 기능 및 증식에서 변경의 결과로서 혈관성형술 이후 동맥 재협착(동맥 벽의 재협착)이 발생할 수 있다.
혈전정맥염 및 임파선염은 변경된 내피 세포 기능으로부터 생기고/생기거나 이를 발생시킬 수 있는 각각 정맥 및 림프관의 염증성 장애이다. 유사하게, 림프부종은 내피 세포 기능으로부터 생기는 손상된 림프관을 포함하는 병증이다.
양성 및 악성 혈관 종양의 패밀리는 혈관계의 세포 성분의 비정상 증식 및 성장을 특징으로 한다. 예를 들어, 임파관종은 신생아에서 일반적으로 발생하는 림프관의 선천적, 대개 낭성, 기형인 림프계의 양성 종양이다. 낭성 종양은 인접한 조직으로 성장하는 경향이 있고, 일반적으로 경관 및 겨드랑이 구역에서 발생한다. 이는 또한 사지의 연조직에서 발생할 수 있다. 주증상은 연결 조직에 의해 둘러싸인 확장된, 때때로 망상, 구조화 림프관 및 림프구이다. 임파관종은 손상된 국소적 림프 배액을 발생시키는 부적절하게 연결된 배아 림프관 또는 이의 결핍증에 의해 야기되는 것으로 추정된다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드에 대한 또 다른 용도는 종양이 성장하고/하거나 전이하게 하는 종양의 혈관신생을 수반하는, 종양 신생혈관생성의 예방 또는 저해에 있다. 따라서, 더 광범위하게, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 암의 치료 및/또는 예방에서 용도가 발견될 수 있다.
EGFL7 상호작용 폴리펩타이드는 또한 안내 신생혈관 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.
류마티스성 관절염은 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드에 대한 추가의 적응증이다. 혈관 성장 및 맥관구조를 통한 염증성 세포의 표적화가 관절염의 류마티스성 및 음성 혈청 형태의 발병학에서 중요한 성분이다.
다른 치료학적 섭생은 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드가 암을 치료하는 경우, 이러한 폴리펩타이드로 치료하고자 하는 환자는 또한 방사선 치료를 받을 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 화학치료제를 환자에게 투여할 수 있다. 제조업자의 지시에 따라 또는 숙련의가 경험적으로 결정하는 바대로 이러한 화학치료제의 제조 및 투약 스케줄을 사용할 수 있다. 이러한 화학치료제의 제조 및 투약 스케줄은 또한 문헌[Chemotherapy Service, Ed., M. C. Perry (Williams & Wilkins: Baltimore, Md., 1992)(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨)]에 기재되어 있다. 화학치료제는 폴리펩타이드의 투여에 선행하거나 후행할 수 있거나, 이와 동시에 제공될 수 있다.
암을 치료하기 위해 폴리펩타이드를 사용하는 경우, EGFL7에 대한 항체, 예컨대 미국 제2007/0031437호(참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 것 또는 다른 종양-관련 항원에 대한 다른 항체, 예컨대 ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체(들) 중 하나 이상에 결합하는 항체를 또한 투여하는 것이 바람직할 수 있다 또한, 조사를 수반하든 방사능 물질의 투여를 수반하든 간에, 방사선학 치료와 조합되어 또는 순차적으로 적절하게 항체를 투여한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 명세서에 개시된 동일한 또는 2개 이상의 상이한 항원에 결합하는 2개 이상의 항체를 환자에게 동시 투여할 수 있다. 때때로, 하나 이상의 사이토카인을 환자에게 투여하는 것이 또한 유리할 수 있다. 일 양상에 있어서, 본 명세서의 폴리펩타이드를 성장-저해제와 동시 투여한다. 예를 들어, 성장-저해제를 처음에 투여한 후 본 발명의 상호작용 폴리펩타이드를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 폴리펩타이드의 투여가 처음에 또한 고려된다. 성장-저해제에 적합한 용량은 현재 사용되는 것이고 성장-저해제 및 본 명세서의 폴리펩타이드의 조합 작용(상승효과)으로 인해 낮아질 수 있다.
일 양상에 있어서, 종양의 혈관신생은 병용 치료에서 공격받는다. 예를 들어 종양 괴사 또는 이의 전이 병소(있다면)를 관찰함으로써 결정되는 치료학적 유효 용량으로 종양 보유 환자에게 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드 및 항체(예를 들어, 항-VEGF)를 투여한다. 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린, 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony stimulating factor: GM-CSF) 또는 종양에서 미세혈관 응고를 촉진하는 물질, 예컨대 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체 또는 C4b 결합 단백질(제WO 91/01753호(본 명세서에 참조문헌으로 포함됨) 참조) 또는 열 또는 방사선과 같은 추가의 항종양 물질을 추가로 투여할 수 있다.
다른 양상에 있어서, FGF 또는 PDGF 길항제, 예컨대 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체를 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드와 함께 환자에게 투여한다. 폴리펩타이드에 의한 치료를 상처 치유 또는 원하는 신생혈관의 기간 동안 중단할 수 있다.
또 다른 양상에 있어서, 스크리닝, 진단 및/또는 질환의 예후의 예측을 위한 표적으로서 EGFL7을 사용할 수 있다. 예를 들어, EGFL7은 종양의 내피 및 활성 신생혈관생성을 겪는 다른 조직에서 상향 조절되는 단백질이다. EGFL7 발현은 예를 들어 악성 신경교종, 간세포 암종 및 비소세포 폐암을 포함하는 몇몇 암 유형에서 빈약한 예후와 상관되고, 임상적으로 관련된 신생물 및 전이에 대한 바이오마커이다. 구체적으로, EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 상기 기재된 대상체에 투여하거나, 진단학적 또는 예후적 유효량으로 생체외 종양 샘플, 예컨대 생검 샘플에 적용한다. 이 양은 암을 치료하기에 충분할 수 있거나, EGFL7에 대한 결합 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 단순히 충분할 수 있다. EGFL7 상호작용 폴리펩타이드를 일반적으로 위에서 기재된 바와 같이 표지화하여 이를 영상화할 수 있고 신체 또는 샘플 내의 이의 분포를 결정할 수 있다. 결합 EGFL7 폴리펩타이드의 존재는 대상체가 진단을 얻기 위해 추가의 시험을 거쳐야 한다는 스크리닝 표지자일 수 있거나, 결합 EGFL7의 존재는 그 자체가 진단적이고 그 자체의 진단일 수 있다. 또한, 환자가 이미 암이 진단된 경우, 결합 EGFL7 폴리펩타이드의 존재는 결합 EGFL7 폴리펩타이드가 부재하는 경우와 비교하여 빈약한 예후 표지자로서 작용할 수 있다. EGFL7 폴리펩타이드의 결합은 정성적 또는 정량적일 수 있고, 따라서, 양상에서, 각각의 대상체의 질환 상태, 등급 및 예후에 대한 더 구체적인 정보를 제공하기 위해 사용될 수 있다. EGFL7 폴리펩타이드는 또한 다른 진단학적 또는 예후적 분자, 예컨대 특정한 종양에서 과발현된 성장 수용체와 조합되어 사용되어, 당해 종양에 대한 더 구체적인 정보를 제공할 수 있다.
상기 개시내용은 본 발명을 일반적으로 기술한다. 하기 구체적인 실시예를 참조하여 더 완전한 이해를 얻을 수 있다. 이 실시예는 단지 예시 목적으로 기재되어 있고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 상황이 방책을 제시하거나 만들 수 있으므로, 형태 변화 및 등가물 대체가 고려된다. 구체적인 조건이 본 명세서에서 사용되지만, 이러한 조건은 설명 의미로 의도되고 제한 목적으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1 - 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 동정
방법:
재조합체 EGFL7의 클로닝 및 발현
EGFL7 cDNA를 PCR(센스 프라이머: 5'-CACCATGAGGGGCTCTCAGGAGGTG-3' 및 안티-센스 프라이머: 5'-CTACGAGTCTTTCTTGCAGGAGCAG-3')에 의해 증폭하고 매뉴얼의 지시에 따라 pENTR/TEV/D-TOPO 벡터(인비트로젠(Invitrogen))로 클로닝하였다. TEV-EGFL7 구역을 재조합에 의해 pDEST20 플라스미드(인비트로젠)로 클로닝하고, 재조합체 바크미드 DNA를 인비트로젠 매뉴얼의 지시에 따라 단리하였다.
재조합체 GST-EGFL7의 정제
셀펙틴(CellFECTIN) 형질감염 시약(인비트로젠)을 사용하여 1㎎의 바크미드 DNA로 형질감염된 Sf21 세포인 스포돕테라 프루지페르다로부터 재조합체 바큘로바이러스를 생성하였다. 인비트로젠 매뉴얼에 기재된 표준 프로토콜에 따라 바이러스의 플라크 적정을 수행하였다. Sf21 세포를 대략 80% 포화도로 T175 세포 배양 플라스크에 파종하였다(seeded). 세포 유착 시, 배지를 제거하고 세포를 27℃에서 72시간 동안 20의 다중감염도(multiplicity of infection: MOI)로 재조합체 바큘로바이러스로 감염시켰다. 세포 용해물을 0.1% NP40 중에 수확하고 1㎖의 글루타티온-아가로스 수지를 통과시켰다. 이후, 칼럼을 25㎖의 완충제(150mM NaCl, 20mM 트리스-HCl, pH 7-9)로 세척하고 20mM 환원 글루타티온이 보충된 완충제로 용리시켰다. 용리물을 1㎖ 분획에서 수집하고 4℃에서 저장하였다. SDS-PAGE를 이용하여 모든 용리된 분획을 분석하고 은 염색으로 가시화하였다.
EGFL7-자기 비드의 생성
EGFL7 재조합체 단백질을 포함하는 모든 분획을 함께 풀링하였다. 30㎍의 항-GST 항체를 단백질 용액으로 혼합하고 4℃에서 15분 동안 370㎎의 매그나바인드(MagnaBind) 단백질 A/G 자기 비드(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))와 항온처리하였다. 세척 완충제에 의한 여러 번 세척 후, 단백질을 SDS 로딩 완충제 중에 비등시킴으로써 자기 비드로부터 방출시키고, 항-EGFL7 다중클론 항체(알앤디 시스템즈(R&D Systems))를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
OBOC 라이브러리의 스크리닝
OBOC 펩타이드 라이브러리 비드를 스크리닝 전에 70% 에탄올, 증류수 및 결합 완충제(50mM Na2HPO4, 150mM NaCl, 2mM CaCl2, 0.5M L-아르기닌, pH 7.4)를 사용하여 광범위하게 세척하였다. 자기 비드를 유리 바이알 내에서 라이브러리 비드와 혼합하고 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 강력 자석을 바이알의 측에 위치시키고, 라이브러리를 조(Cho) 등의 문헌에 기재된 바대로 스크리닝하였다. 양성 히트(hit)를 풀링하고 에탄올 및 물로 광범위하게 세척하였다. 조(Cho) 등의 문헌에 기재된 바대로 tdTomato를 발현하는 EGFL7-양성 HT1080 섬유육종 세포 및 GFP를 발현하는 EGFL7-음성 MDA435 유방암 세포를 사용하여 2차 세포-기반 스크린을 수행하였다. 히트 비드를 수집하고 펩타이드를 조(Cho) 등에 기재된 바와 같이 MALDI TOF MS/MS를 이용하여 온-비드(on-bead)로 서열분석하였다.
결과:
재조합체 EGFL7 단백질을 정제하고(도 2a 및 도 2b), 자기 비드에 접합하였다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 다중클론 항-EGFL7 항체를 사용하여 자기 비드에 대한 정제된 EGFL7의 성공적인 접합을 나타냈다(도 2c). 이후, EGFL7-접합 자기 비드를 OBOC 조합 펩타이드 라이브러리와 혼합하고, 강력 네오디늄 자석을 사용하여 양성 히트를 단리하였다. EGFL7-양성 적혈구(TH1080-tdT-EGFL7v5) 및 EGFL7-음성 그린 세포(MDA435-GFP)를 사용한 2차 세포-결합 검정을 이용하여 세포 표면에 디스플레이된 EGFL7에 대한 고친화도를 갖는 펩타이드를 동정하였다(도 2d). 비드를 도립 형광 현미경 하에 조사하고, 적혈구와 매우 관련되지만 그린 세포와 상호작용을 갖지 않거나 거의 갖지 않는 히트 비드를 수동으로 단리하였다.
HMYFLLGH, DPYDHEFR, AYYEEAYE, RYVDHEDW, EWELHAEE, SQSSMYPS, RYQLHHPR 및 WYKLHPTM의 서열은 OBOC 펩타이드 라이브러리 스크리닝 방법을 이용하여 EGFL7에 대한 고친화도를 갖는 것으로 동정되었다.
다른 예시적인 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드가 표 1에 기재되어 있다. "LCE#"로 표시된 표 1의 1열은 화합물 참조 번호를 나타낸다. "서열"로 표기된 표 1의 2열은 펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸다. "순도"로 표기된 표 1의 3열은 역상 HPLC 분석으로부터 220nm에서 UV 흡광도를 이용하여 실험적으로 결정된 화학 순도를 나타낸다. "MS(계산)"로 표기된 표 1의 4열은 전자분무(양성 이온 모드) 질량 분광법을 이용할 때 펩타이드에 예측된 전하 비율에 대한 이론적 질량을 나타낸다. "MS(실험)"로 표기된 표 1의 5열은 전자분무(양성 이온 모드) 질량 분광법을 이용할 때 펩타이드에 발견된 전하 비율에 대한 실험으로 결정된 질량을 나타낸다.
Figure pct00001
실시예 2 - EGFL7로부터 유래한 후보 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 동정
EGFL8에 존재하지 않는 EGFL7로부터의 3개의 고도로 보존된 서열을 선택하였다. 동정된 서열은 GSLLVHSFQQLG, KLQLVLAPLHSLAS 및 RSPGLAPARPRYA이다.
실시예 3 - 동정된 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 검증
방법:
결합 연구
펩타이드를 GWC 매뉴얼로부터의 표준 프로토콜을 이용하여 금 스팟에 부동화하였다. 이후, 펩타이드를 500㎕의 정제된 EGFL7 단백질에 노출시켰다. 펩타이드를 포함하는 각각의 스팟에 대한 반사율 변화(%)(%R)를 V++ 프리시즌 디지털 이미징 시스템즈(Precision Digital Imaging Systems), 버전 5.0 소프트웨어를 사용하여 수집하고, 해리 상수(KD)를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism), 버전 5.0에서 '회합 이후 해리' 식을 이용하여 계산하였다.
시험관내 신생혈관생성
96웰 플레이트를 마트리겔의 웰당 50㎖로 코팅하였다. 마트리겔을 고화시킨 후, 대략 2000개의 HUVEC를 중합된 매트릭스에 파종하였다. VEGF(10ng/㎖) 및 bFGF(10ng/㎖)를 혈관신생 자극으로서 각각의 웰에 첨가하였다. HMYFLLGH 또는 FLAG 펩타이드(대조군) 중 어느 하나를 적절한 웰에 200mM의 농도로 도입한 후 5% CO2에서 37℃에서 항온처리하였다. 4-6시간 후, 세포를 도립 현미경 하에 영상화하고, 각각의 웰로부터 시야마다 분지점의 수를 계수하여 관형성의 정도를 정량화하였다.
생체내 조류 장뇨막(CAM) 신생혈관생성 검정
조류 배아 장뇨막(CAM) 온플랜트(onplant) 검정을 이용하여 신생(de novo) 신생혈관생성을 측정하였다. 콜라겐 얽힌 그리드(<1㎜)를 HMYFLLGH(200μM 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에 HT1080 섬유육종 세포로 접종하였다. HT1080 세포를 섬유-메쉬에서 배양하여 CAM으로부터 메쉬로의 혈관의 동원을 자극하였다. 콜라겐 메쉬 온플랜트를 3일 동안 9일 무각(shell-less) 배아의 CAM에 위치시킨 후 자이스 루마(Zeiss Lumar) 형광 입체현미경을 사용하여 영상화하였다. 가시적인 혈관을 포함하는 각각의 메쉬에서 그리드의 백분율을 계수하여 신생혈관생성의 수준을 정량화하였다.
결과:
상기 기재된 결합 연구를 이용하여, 각각 GSLLVHSFQQLG 및 HMYFLLGH에 대해 14.7nM 및 13.2nM의 결합 친화도를 계산하였다(도 3).
시험관내 신생혈관생성 검정은 HMYFLLGH가 대조군(FLAG 펩타이드 및 물)과 비교하여 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC) 스프라우팅(sprouting) 및 VEGF 및 FGF의 존재 하의 마트리겔 상의 관형성을 저해한다는 것을 나타낸다(도 4). HUVEC 세포에 의해 형성된 분지점의 수를 계수함으로써 스프라우팅 수준을 정량화하였다(도 4).
생체내 신생혈관생성 검정은 닭 장뇨막(CAM) 모델을 이용하여 HMYFLLGH가 신생혈관생성을 유의적으로 저해한다는 것을 나타낸다. HT1080 세포를 섬유-메쉬에서 배양하여 CAM으로부터 메쉬로의 혈관의 동원을 자극하였다(도 4). 가시적인 혈관(적색 화살표로 표시됨)을 포함하는 메쉬 내에 그리드의 백분율을 계수하여 신생혈관생성의 수준을 정량화하였다(도 5).
시험관내 신생혈관생성 검정을 또한 이용하여 노치(Notch) 결합 도메인이 GSLLVHSFQQLG 또는 HMYFLLGH의 효과에 필요하지 않다는 것을 결정하였다(도 6).
실시예 4 - 영상화를 위한 EGFL7 상호작용 폴리펩타이드의 용도
방법:
FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH) 및 FITC-E7-p72(dAA)(FITC-HMYFLLGH(dAA))의 세포 흡수 연구
INTERFERin 형질감염 시약(HUVEC-si) 및 단백질의 엑손 5를 표적화하는 siRNA를 사용하여 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)에서의 EGFL7 넉다운을 성취하였다. 야생형 HUVEC 및 HUVEC-si 세포를 6웰 조직 배양 플레이트에서 별개의 웰에 파종하여 대략 80% 포화상태가 되게 하였다. 세포를 10% 소 태아 혈청 및 Pen/Strep를 포함하는 DMEM 중에 37℃에서 5% CO2로 밤새 항온처리하였다. 각각의 웰에서의 배지를 제거하고 예비 냉각된 PBS로 대체하였다. FITC-E7-p72(FITC-HMYFLLGH)를 세포에 첨가하여 최종 농도가 1mM이 되게 하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 EDTA를 갖는 웰로부터 탈착시키고, PBS로 3회 세척하고 나서, 4% 폼알데하이드로 고정하였다. 유세포분석기에 의해 FITC 표지 펩타이드의 흡수를 분석하였다.
결과:
유세포분석기에 의해 HUVEC에 의한 플루오레세인 표지 HMYFLLGH 펩타이드 흡수를 평가하였다. 엑손 5를 표적화하는 siRNA를 사용한 EGFL7의 넉다운을 보여주는 웨스턴 블롯 분석이 도 7a에 도시되어 있다. 음성 siRNA(대조군) 또는 EGFL7 siRNA 중 어느 하나로 처리된 HUVEC 세포에 의한 FITC 표지 HMYFLLGH 흡수의 유세포분석기 분석이 도 7b에 도시되어 있다. 도 7c는 그래프패드 프리즘, 버전 5.0을 이용하여 작도된 평균 세포 형광의 그래프를 나타낸다.
실시예 5 - 지향된 생체내 신생혈관생성 검정(DIVAA)
방법:
DIVAA 키트를 사용하여 제조업자의 추천 프로토콜(Trevigen, 메릴랜드주 게터스버그)에 따라 7주령 암컷 누드 마우스(Crl:NU-Foxn1nu; 챨스 리버(Charles River))에서 신생혈관생성을 평가하였다. 혈관반응기(angioreactor) 관을 기저막 추출물(BME), BME + 50,000개 HT1080 세포 또는 BME + 50,000개 HT1080 + GSLLVHSFQQLG(LCE71) 또는 HMYFLLGH(LCE72/E7-p72)로 충전하고, 마우스에 피하로 삽입하였다. 10일 후, 마우스를 희생시키고 나서, 혈관반응기를 제거하고, 혈관반응기 내용물을 원심분리 관에 옮겼다. 내피 세포를 FITC-렉틴 용액 중에 밤새 표지하고, 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 정량화하였다. 동물을 포함하는 모든 실험은 웨스턴 온타리오 대학교의 동물 사용 소위원회(프로토콜 2008-101호)에 의해 승인받았다.
결과:
도 9a는 200μM GSLLVHSFOOLG가 기저막 추출물(BME)로 충전된 혈관반응기에서 HT1080 세포 매개 신생혈관생성을 저해할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 9b는 200μM HMYFLLGH가 기저막 추출물(BME)로 충전된 혈관반응기에서 HT1080 세포 매개 신생혈관생성을 저해할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 6 - EA.hy926 내피 세포에서 빈쿨린의 세포 유착 검정 및 면역세포화학 국소화
방법:
유착 검정을 위해, EGFL7 siRNA(시그마(Sigma), 캐나다) 또는 스크램블링된 siRNA(음성 대조군)(시그마, 캐나다)를 사용하여 EA.hy926 내피 유래 세포를 형질감염시켰다. EA.hy926 세포를 6웰 플레이트에 파종하고, INTEFERin 형질감염 시약(폴리플러스(Polyplus) 형질감염)을 사용하여 40nM의 최종 농도로 EGFL7 또는 스크램블링된 siRNA로 형질감염시켰다. EGFL7 siRNA 또는 스크램블링된 siRNA(음성 대조군)로 처리된 EA.hy926 내피 유래 세포를 트립신/EDTA에 의한 처리에 의해 탈착시키고 1% 혈청을 포함하는 DMEM 중애 재현탁시켰다. 세포를 96웰 플레이트에 평판 배양하고, 37℃에서 4시간 동안 200μM의 플래그(대조군), 스크램블링된 GSLLVHSFQQLG 펩타이드로 처리하였다. 이후, 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 폼알데하이드로 고정하였다. 세포 핵을 훽스트(Hoechst)(피어스(Pierce))로 염색하고 EVOS f1 도립 형광 현미경(AMG) 하에 영상화하였다. 볼로시티, 버전 4.0을 사용하여 플레이트에 유착된 채 있는 세포의 수를 결정하였다. 1방향 ANOVA 및 터키 사후 시험(Tukey post hoc test)을 이용하여 모든 통계학을 수행하였다.
빈쿨린 염색을 위해, EA.hy926 세포를 커버슬립에 평판 배양하고 1% 혈청을 포함하는 DMEM 중에 37℃에서 4시간 동안 200μM의 스크램블링된 (대조군) 또는 GSLLVHSFQQLG 펩타이드로 처리하였다. 이후, 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 폼알데하이드로 고정하였다. 세포를 0.2% 트리톤(Triton)-X를 포함하는 PBS로 5분 동안 투과성이 되게 한 후, 25℃에서 1시간 동안 5% 염소 혈청 및 1% BSA로 차단하였다. 항-빈쿨린 1차 항체를 1:500 희석으로 첨가하고 25℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 25℃에서 1시간 동안 1:1000 희석으로 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 594 2차 항체(인비트로젠, 캐나다)와 항온처리하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이후, 세포를 실온에서 10분 동안 1:1000 희석으로 맥아 응집소(WGA)로 처리하였다. 세포를 2회 세척하고, DAPI를 포함하는 프로롱 골드(ProLong Gold) 시약에 탑재하고 자이스 스피닝 디스크 공초점 현미경 하에 영상화하였다. 각각의 세포를 통해 Z 적층 영상을 캡처하였다.
결과:
도 10은 GSLLVHSFQQLG(LCE71)가 인간 내피 세포의 유착 특성을 변경하지 않는다는 것을 나타낸다. 도 10a는 세포 유착 검정의 결과를 나타내고, 여기서 스크램블링된 siRNA가 세포에서 사용될 때 또는 200μM의 GSLLVHSFQQLG(LCE71)가 대조군 세포와 비교하여 세포에 적용될 때 EA.hy926 내피 세포의 유착은 다르지 않은 것으로 보였다. 반면, EGFL7을 특이적으로 넉다운시키는 siRNA를 사용할 때, 세포 유착이 유의적으로 감소하여, EGFL7이 세포 유착에 관여하는 중요한 매개자라는 것을 나타낸다. 도 10b는 빈쿨린(오렌지색), DAPI(청색) 및 WGA 원형질막 염색(녹색)으로 염색된 GSLLVHSFQQLG(LCE71)에 의한 처리 전과 후의 EA.hy926 내피 세포를 나타낸다. 두 경우에, 유리 커버슬립에서 병소 유착 형성이 관찰되었다.
실시예 7 - 포스포-RTK 프로필러 어레이
방법:
HUVEC를 트립신/EDTA에 의한 처리에 의해 탈착시키고 EGM 중에 재현탁시켰다. 세포를 T-75 플라스크로 평판 배양하고 EGM 중에 37℃에서 4시간 동안 200μM의 플래그 또는 E7C13 펩타이드로 처리하였다. 세포를 수확하고 인간 포스포-수용체 티로신 키나제(RTK) 어레이 키트(알앤디 시스템즈) 제조업자의 가이드라인에 따라 어레이 완충제(Array Buffer) 1 중에 용해시켰다. 차단 후, 각각의 포스포-RTK 어레이 막을 제조업자의 가이드라인에 따라 100㎍의 용리물과 항온처리하였다. 막을 세척하고 항-포스포-HRP와 항온처리하였다. 제조업자의 가이드라인에 따라 증강 화학발광(enhanced chemiluminescence: ECL)에 의해 활성화 티로신 키나제를 검출하였다.
결과:
도 11은 GSLLVHSFQQLG(LCE71)에 의한 처리 시 HUVEC에서의 RTK 활성화를 프로필로 나타낸 것이다. 도 11a는 대조군 FLAG 펩타이드 또는 200μM의 GSLLVHSFQQLG(LCE71) 펩타이드 중 어느 하나로 처리된 HUVEC로부터의 용해물과 항온처리된 49개의 다른 항-인간 RTK 항체를 디스플레이하는 어레이 막을 나타낸다. 도 11b는 어레이 좌표(왼쪽) 및 이의 각각의 RTK(오른쪽 표)를 나타낸다. 도 11c는 GSLLVHSFQQLG 펩타이드에 의한 처리 후 HUVEC에서의 RTK의 활성화 프로필을 나타내는 폭포 도면이다. Tie-2, Mer 및 섬유아세포 성장 인자 수용체 3(FGFR3)와 같은 몇몇 RTK의 인산화가 증가되고 역형성 림프종 키나제(ALK), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGF R) 및 Axl과 같은 몇몇 다른 RTK의 인산화가 감소한다는 것을 볼 수 있다.
실시예 8 - 포스포티로신의 면역침전
방법:
HUVEC를 T-75 플라스크에서 성장시키고 EGM 중에 37℃에서 4시간 동안 200μM의 플래그 또는 E7C13 펩타이드로 처리하였다. 세포를 PBS로 세척하고 RIPA 완충제(50mM 트리스-HCl, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM NaF, 1mM PMSF, 1% NP40, 0.1% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS) 중에 용해시켰다. 세포 용해물을 수집하고 BCA 단백질 검정을 이용하여 단백질 농도를 결정하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 각각의 샘플로부터의 용해물의 분취량을 따로 두었다. 용해물을 회전기에서 4℃에서 1시간 동안 30㎕의 세척된 단백질 A/G 비드와 배양함으로써 각각의 용해물을 예비 청소하였다. 예비 청소된 용해물을 원심분리(5초 동안 12,000 xg)에 의해 수집하고 4℃에서 2시간 동안 3㎕의 4G10 항-포스포 항체(Millipore)와 항온처리하였다. 세척된 단백질 A/G 비드(30㎕)를 각각의 샘플에 첨가하고 회전기에서 4℃에서 2시간 동안 항온처리하였다. 용해물을 원심분리(5초 동안 12,000 xg)에 의해 수집하고 웨스턴 블롯 분석을 위해 따로 두었다. 면역복합체를 세척 완충제(50mM 트리스-HCl, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1mM NaF, 1% NP40)를 사용하여 5회 세척하고 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. 단백질 샘플을 8% 겔에서 실행하고 PVDF 막(Bio-Rad)으로 옮겼다. 항-Axl 항체(알앤디 시스템즈) 및 항-VEGFR-1 항체(시그마, 캐나다)로 면역침전된 단백질의 검출을 수행하였다.
결과:
도 12는 프로파일러 어레이의 결과를 확인시켜 주고, HUVEC에서의 Axl 및 VEGFR1 RTK의 인산화가 GSLLVHSFQQLG(LCE71)에 의한 처리 시 감소한다는 것을 나타낸다. 도 12a는 4시간 동안 대조군 플래그 펩타이드 또는 200μM의 LCE71(GSLLVHSFQQLG) 펩타이드 중 어느 하나로 처리된 HUVEC의 웨스턴 블롯을 보여준다. 단백질 A/G 아가로스에 커플링된 4G10 항-포스포 항체를 사용하여 면역침전을 수행하였다. 항-Axl, 항-VEGFR1 및 항-GAPDH 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 12b는 도 12a에 도시된 웨스턴 블롯으로부터 얻은 각각의 밴드의 평균 신호 강도를 나타내는 막대 그래프이다.
실시예 9 - DOTA-EGFL7 펩타이드의 합성
1. DOTA-LCE71(DOTA-GSLLVHSFQQLG)/DOTA-LCE72(DOTA-HMYFLLGH)의 합성
펩타이드를 수지(링크-아마이드-MBHA)(반응식 1)에 의해 고상 합성을 위한 전통적인 절차에 의해 합성하였다:
Figure pct00002
반응식 1. [ Ga ] DOTA - LCE71 및 [ Ga ] DOTA - LCE72 의 합성
a) Fmoc-탈보호: 2회 피페리딘/DMF(40%, 1.2㎖)에 의해 펩타이드의 N-말단 또는 수지로부터 Fmoc 보호기의 제거. 6회 DMF를 사용하여 수지를 세척하였다.
b) 펩타이드 커플링 조건: 커플링 반응을 75℃에서 5분 동안 DMF 중에 DMF(4당량) 및 DIPEA(8당량) 중의 Fmoc-아미노산 및 HCTU에 의해 수행하고 DMF로 세척하였다. DOTA(t-Bu)3 및 Fmoc-히스티딘을 실온에서 1시간 동안 커플링시켰다.
c) 수지로부터 펩타이드의 개열: 펩타이드를 6시간 동안 TFA/H2O/TIS 95%/2.5%/2.5%의 개열 칵테일로 마지막으로 처리하였다.
d) 수지에서 Fmoc-보호 N-말단을 갖는 펩타이드로부터 mtt 보호기의 개열. 혼합물(TFA/TIS/DCM: 2%/5%/93%)을 사용하여 2㎖×6에 대해 mtt 기를 개열하였다.
e) 펩타이드 정제: 수지로부터 펩타이드의 개열 후, 원료 펩타이드를 차가운 tert-뷰틸메틸 에터로 희석하고 원심분리에 의해 침전시켰다. 원료 펩타이드를 HPLC에서 정제하고 동결건조시켜 백색의 고체(DOTA-LCE71의 경우 35㎎, 9.7%; DOTA-LCE72의 경우 32㎎, 9.8%)를 얻었다.
Figure pct00003
2. [69/71Ga]DOTA-LCE71/LCE72(-GSLLVHSFQQLG/HMYFLLGH)의 합성
DOTA-LCE71/DOTA-LCE72(10㎎)를 NaOAc/HOAc(pH=5, 0.1M) 중에 용해시키고, GaCl3(5㎎)를 첨가하고 70℃에서 30분 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 HPLC에서 정제하고 동결건조시켜 백색의 고체([69/71Ga]DOTA-LCE71의 경우 3㎎; [69/71Ga]DOTA- LCE72의 경우 2㎎)를 얻었다.
3. [68Ga]DOTA-LCE71/LCE72(-GSLLVHSFQQLG/HMYFLLGH)의 방사합성
[68Ga]DOTA-LCE71/LCE72를 반응식 2에 기재된 바와 같이 에커트 앤드 지글러(Eckert&Ziegler) 모듈에 의해 자동으로 합성하였다:
Figure pct00004
반응식 2. [ 68 Ga ] DOTA - LCE71 /72의 방사합성
100㎕의 HEPES 완충제(1M, pH = 3.5) 중의 10㎍의 전구체(DOTA-LCE71/LCE72)를 N2 용액(300㎕) 중에 68Ga3+와 혼합하였다. 반응 바이알을 90℃에서 10분 동안 가열하였다. 반응 바이알을 실온으로 냉각시키고 Sep-Pak C-18 카트리지에 포획하였다. 에탄올을 사용하여 Sep-Pak C-18 카트리지로부터 생성물을 세척하였다. 방사화학 수율은 [68Ga]DOTA-LCE71의 경우 81%이고, [68Ga]DOTA-LCE72의 경우 53%이었다. 비활성은 [68Ga]DOTA-LCE71의 경우 3.3GBq/μ㏖이고, [68Ga]DOTA-LCE72의 경우 9.4GBq/μ㏖이었다. 분석용 HPLC에서 방사화학 순도를 측정하였다(도 13).
실시예 10 - 종양 감소 연구
본 발명자들은 다른 섬유육종, 인간 전립선암 및 유방암 세포주로 확립된 누드 마우스에서 고형 종양을 치료하기 위한 EGFL7 상호작용 펩타이드의 잠재성을 평가하였다. 본 발명자들은 이 펩타이드의 효율을 대조군 또는 스크램블 펩타이드의 효율과 비교하였다. 이후, 본 발명자들은 환자에서 암을 치료하기 위해 클리닉에 대한 이 유망한 항-혈관신생 펩타이드 후보의 적용을 지정하였다.
프로토콜:
도 14의 흐름도에 프로토콜이 일반적으로 도시되어 있다. 누드 마우스를 마취시키고 원발성 질환을 유도하기 위해 마우스의 한 측의 등 아래 부분에 전립선암(PC3), 유방암(MDA231) 또는 섬유육종(HT1080) 세포의 피하 주사를 하였다.
동물에 의해 관용될 수 있는 EGFL7 상호작용 펩타이드의 양을 결정하기 위해 처음에 용량 곡선을 생성한다.
종양을 대략 15㎣로 성장시켰다.
용량 곡선에 기초하여, 동물은 EGFL7 상호작용 펩타이드(E7-p72/HMYFLLGH 또는 LCE71/GSLLVHSFQQLG) 또는 대조군 펩타이드의 꼬리 정맥 주사를 받았다. 또한, 본 발명자들은 펩타이드에 의한 치료가 아바스틴(Avastin) 단독에 의한 치료와 비교하여 상승적 치료학적 이익을 제공할 수 있는지를 평가하기 위해 아바스틴과 조합하여 EGFL7 상호작용 펩타이드를 또한 투여하였다.
동물을 안락사시켜 종양을 절제하여 고정시키고 냉동시켜 조직학 분석을 위해 절개하였다.
생물분포 연구를 위해 장기를 또한 수집하였다.
예측 결과:
본 발명자들은 E7-p72(HMYFLLGH) 또는 LCE71(GSLLVHSFQQLG)로 치료된 마우스가 대조군 펩타이드로 치료된 마우스와 비교하여 감소된 종양 크기 및 연장된 수명을 갖는다고 예측하였다. 본 발명자들은 또한 이 펩타이드를 사용한 항-EGFL7 치료가 아바스틴 단독에 의한 치료와 비교하여 상가적 치료학적 이점을 제공한다고 예측하였다. 본 발명자들의 조직학 분석에서, 본 발명자들은 상기 기재된 실시예에 기초하여 신생혈관생성의 예측 가능한 감소로 인해 EGFL7 상호작용 펩타이드로 치료된 마우스에서 종양과 관련된 혈관이 더 적게 보인다고 예측하였다.
상기 개시내용은 일반적으로 본 발명을 기술한다. 구체적인 용어가 본 명세서에 사용되지만, 이러한 용어는 설명 의미로 의도되고 제한 목적이 아니다.
모든 공보, 특허 및 특허 출원은, 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조문헌으로 그 전문이 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로, 참조문헌으로 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 예시적인 실시형태가 자세히 본 명세서에 기재되어 있지만, 본 발명의 사상 또는 특허청구범위로루터 벗어남이 없이 이에 변형이 이루어질 수 있다는 것을 당해 분야의 당업자는 이해할 것이다.
<110> LONDON HEALTH SCIENCES CENTRE RESEARCH INC. <120> EGFL7 TARGETING AND/OR BINDING POLYPEPTIDES AND METHODS FOR INHIBITING ANGIOGENESIS <130> WO2013/142961 <140> PCT/CA2013/000251 <141> 2013-03-15 <150> US 61/616,131 <151> 2012-03-27 <160> 32 <170> PatentIn version 2.0 <210> 1 <211> 273 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Gly Ser Gln Glu Val Leu Leu Met Trp Leu Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Val Gly Gly Thr Glu His Ala Tyr Arg Pro Gly Arg Arg Val Cys Ala 20 25 30 Val Arg Ala His Gly Asp Pro Val Ser Glu Ser Phe Val Gln Arg Val 35 40 45 Tyr Gln Pro Phe Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg Ala Cys Ser Thr 50 55 60 Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser Pro Gly Leu Ala 65 70 75 80 Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Ala Cys Cys Pro Gly Trp Lys Arg Thr Ser 85 90 95 Gly Leu Pro Gly Ala Cys Gly Ala Ala Ile Cys Gln Pro Pro Cys Arg 100 105 110 Asn Gly Gly Ser Cys Val Gln Pro Gly Arg Cys Arg Cys Pro Ala Gly 115 120 125 Trp Arg Gly Asp Thr Cys Gln Ser Asp Val Asp Glu Cys Ser Ala Arg 130 135 140 Arg Gly Gly Cys Pro Gln Arg Cys Ile Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Trp 145 150 155 160 Cys Gln Cys Trp Glu Gly His Ser Leu Ser Ala Asp Gly Thr Leu Cys 165 170 175 Val Pro Lys Gly Gly Pro Pro Arg Val Ala Pro Asn Pro Thr Gly Val 180 185 190 Asp Ser Ala Met Lys Glu Glu Val Gln Arg Leu Gln Ser Arg Val Asp 195 200 205 Leu Leu Glu Glu Lys Leu Gln Leu Val Leu Ala Pro Leu His Ser Leu 210 215 220 Ala Ser Gln Ala Leu Glu His Gly Leu Pro Asp Pro Gly Ser Leu Leu 225 230 235 240 Val His Ser Phe Gln Gln Leu Gly Arg Ile Asp Ser Leu Ser Glu Gln 245 250 255 Ile Ser Phe Leu Glu Glu Gln Leu Gly Ser Cys Ser Cys Lys Lys Asp 260 265 270 Ser <210> 2 <211> 278 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Gln Thr Met Trp Gly Ser Gly Glu Leu Leu Val Ala Trp Phe Leu 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Asp Gly Thr Thr Glu His Val Tyr Arg Pro Ser Arg 20 25 30 Arg Val Cys Thr Val Gly Ile Ser Gly Gly Ser Ile Leu Glu Thr Phe 35 40 45 Val Gln Arg Val Tyr Gln Pro Tyr Leu Thr Thr Cys Asp Gly His Arg 50 55 60 Ala Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Ile Tyr Arg Thr Ala Tyr Arg Arg Ser 65 70 75 80 Pro Gly Val Thr Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Ala Cys Cys Pro Gly Trp 85 90 95 Lys Arg Thr Ser Gly Leu Pro Gly Ala Cys Gly Ala Ala Ile Cys Gln 100 105 110 Pro Pro Cys Gly Asn Gly Gly Ser Cys Ile Arg Pro Gly His Cys Arg 115 120 125 Cys Pro Val Gly Trp Gln Gly Asp Thr Cys Gln Thr Asp Val Asp Glu 130 135 140 Cys Ser Thr Gly Glu Ala Ser Cys Pro Gln Arg Cys Val Asn Thr Val 145 150 155 160 Gly Ser Tyr Trp Cys Gln Gly Trp Glu Gly Gln Ser Pro Ser Ala Asp 165 170 175 Gly Thr Arg Cys Leu Ser Lys Glu Gly Pro Ser Pro Val Ala Pro Asn 180 185 190 Pro Thr Ala Gly Val Asp Ser Met Ala Arg Glu Glu Val Tyr Arg Leu 195 200 205 Gln Ala Arg Val Asp Val Leu Glu Gln Lys Leu Gln Leu Val Leu Ala 210 215 220 Pro Leu His Ser Leu Ala Ser Arg Ser Thr Glu His Gly Leu Gln Asp 225 230 235 240 Pro Gly Ser Leu Leu Ala His Ser Phe Gln Gln Leu Asp Arg Ile Asp 245 250 255 Ser Leu Ser Glu Gln Val Ser Phe Leu Glu Glu His Leu Gly Ser Cys 260 265 270 Ser Cys Lys Lys Asp Leu 275 <210> 3 <211> 280 <212> PRT <213> Xenopus <400> 3 Met Trp Lys Val Ser Cys Leu Val Thr Gly Tyr Leu Leu Ile Leu Ala 1 5 10 15 Val Thr Ser Ala Ala Ala Asp His Leu Tyr Arg Thr Gly Arg Arg Ile 20 25 30 Cys Ser Ala Asp Gly His Pro Gly Thr Val Ser Val Thr Gln Ser Phe 35 40 45 Val Gln Pro Val His Ser Pro Ile Met Thr Leu Cys Glu Gly His Arg 50 55 60 Ile Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Thr Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Gln Val 65 70 75 80 Ser Arg Lys Thr Ser Phe Pro Leu Tyr Ser Cys Cys Pro Gly Trp Arg 85 90 95 Arg Ile Gly Ala Gln Thr His Ser Cys Gly Gln Ala Leu Cys Arg Leu 100 105 110 Gln Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Ser Asn Lys Cys Glu Cys 115 120 125 Pro Ala Gly Trp Arg Gly Ile His Cys Gln Met Asp Val Asp Glu Cys 130 135 140 Ser Asp Gly Thr His Gln Cys Ser Gln Ala Cys Ile Asn Ser Ala Gly 145 150 155 160 Ser Phe Ser Cys Glu Cys Leu Glu Gly Tyr Arg Leu Met Ala Asp Gly 165 170 175 Lys Thr Cys Arg Lys Val Pro Ala Pro Thr Val Pro Pro Ala Ser Pro 180 185 190 Thr Ser Val Gln Glu Ser Gly Ile Pro His Ser Val Lys Glu Glu Met 195 200 205 Ala Glu Leu Arg Ser Lys Ile Asp Val Leu Glu Gln Lys Leu His Leu 210 215 220 Leu Leu Thr Pro Phe Gln Gly Leu Thr Thr Phe Ser Pro Asp Asp Ala 225 230 235 240 Ala Asp Pro Ile Ala Leu Leu Thr Arg Ser Leu Gln Gln Leu Asp Arg 245 250 255 Ile Asp Ser Leu Ser Glu Gln Ile Ser Phe Leu Glu Glu Arg Leu Glu 260 265 270 Thr Cys Ser Cys Lys Thr Glu Leu 275 280 <210> 4 <211> 277 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 4 Met Tyr Thr Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ser Leu Phe Leu Leu His Val 1 5 10 15 Thr Cys Thr Pro Gln Thr His Ser His His Gly Arg Arg Val Cys Val 20 25 30 Gly Asp Val Trp Ser Arg Arg Val Ser Tyr Ser Thr Glu Ser Phe Leu 35 40 45 Gln Pro Val His Lys Pro Tyr Ile Thr Met Cys Gln Asn His Arg Met 50 55 60 Cys Ser Thr Tyr Lys Thr Ile Tyr Lys Val Ser Tyr Arg Gln Val Thr 65 70 75 80 Arg Ala Ala Pro Asn Leu Gln Ile Tyr Pro Glu Cys Cys Pro Gly Trp 85 90 95 Arg Arg Met His Ser His Asn Cys Asn Gln Ala Val Cys Glu Gln Ser 100 105 110 Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Val Arg Pro Asn His Cys Ala Cys Leu 115 120 125 Arg Gly Trp Thr Gly Arg Phe Cys Gln Ile Asp Val Asp Glu Cys Lys 130 135 140 Glu Ala Gln His Cys Ser Gln Lys Cys Val Asn Thr Leu Gly Ser Phe 145 150 155 160 Gln Cys Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu Asp Glu Asp Lys Val Thr 165 170 175 Cys Ser Lys Asn Pro Ala Ser Ser Arg Asn Thr Gly Gly Gly Leu Gly 180 185 190 Leu Val Glu Asn Val Thr Glu Glu Val Gln Ile Leu Lys Asn Arg Val 195 200 205 Glu Leu Leu Glu Gln Lys Leu Glu Met Val Leu Ala Pro Phe Thr Thr 210 215 220 Leu Leu Pro Leu Asp Gly Ala Gly Asp Thr Asn Ser Phe Leu Ser Glu 225 230 235 240 Arg Thr Asn Phe Leu Ser His Ser Leu Gln Gln Leu Asp Arg Ile Glu 245 250 255 Ser Leu Ser Glu Gln Val Gly Phe Leu Glu Glu Arg Ile Gly Ala Cys 260 265 270 Gly Cys Gln Glu Asn 275 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <400> 5 His Met Tyr Phe Leu Leu Gly His 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <400> 6 Gly Ser Leu Leu Val His Ser Phe Gln 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Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <400> 14 Lys Leu Gln Leu Val Leu Ala Pro Leu His Ser Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <400> 15 Arg Ser Pro Gly Leu Ala Pro Ala Arg Pro Arg Tyr Ala 1 5 10 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATION <400> 16 Lys Leu Gln Leu Val Leu Ala Pro Leu His Ser Leu Ala Ser 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <400> 17 Cys Lys Leu Gln Leu Val Leu Ala Pro Leu His Ser Leu Ala Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <220> <221> SITE <222> (10) <223> DOTA-modified residue <400> 18 His Met Tyr Phe Leu Leu Gly His Acp Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL7 interacting peptide <220> <221> SITE <222> (1) <223> 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Claims (105)

  1. EGFL7의 도메인과 상호작용하는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7의 C-말단 도메인과 상호작용하거나, 또는 상기 폴리펩타이드는 EGFL7의 노치 결합 도메인(Notch binding domain)의 외부에서 EGFL7와 상호작용하는 것인 폴리펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 50% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 75% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 85% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 90% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 95% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 약 99% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 보존성 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14) 또는 RSPGLAPARPRYA(서열번호 15)를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 약 8 내지 약 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 약 8 내지 약 250개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 200개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 20개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 16개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기 또는 약 12 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH(서열번호 5), GSLLVHSFQQLG(서열번호 6), DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14) 또는 RSPGLAPARPRYA(서열번호 15)로 이루어진 것인 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는HMYFLLGH(서열번호 5) 또는 GSLLVHSFQQLG(서열번호 6)인 것인 폴리펩타이드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 나노몰 친화도로 EGFL7에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 EGFL7의 이합체화 도메인에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7 수용체 결합을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7 활성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 관형성(tubulogenesis)을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 이동을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 유착을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 신생혈관생성(angiogenesis)을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  26. 제25항에 있어서, 상기 표지는 핵 의학 기술을 이용해서 검출 가능한 것인 폴리펩타이드.
  27. 제26항에 있어서, 상기 표지는 가돌리늄인 것인 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 대상체 내의 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위하여 상기 약제학적 제제에 커플링되는 것인 폴리펩타이드.
  29. 제28항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 항-VEGF 항체인 것인 폴리펩타이드.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 나노입자를 통해서 상기 폴리펩타이드에 커플링되는 폴리펩타이드.
  31. 서열 HMYFLLGH, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 90% 동일성을 포함하는 폴리펩타이드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 95% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  33. 제32항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 99% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 보존성 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  35. 제31항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 약 8 내지 약 300개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  37. 제34항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 약 8 내지 약 200개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 약 8 내지 약 20개의 아미노산 잔기 및 약 8 내지 약 12개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  38. 제31항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 HMYFLLGH로 이루어진 것인 폴리펩타이드.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  40. 제39항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 나노몰 친화도로 EGFL7에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 EGFL7의 이합체화 도메인에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7 수용체 결합을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7 활성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 관형성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 이동을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  47. 제31항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 유착을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  48. 제31항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 신생혈관생성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  49. 제31항 내지 제4548항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 표지는 핵 의학 기술을 이용해서 검출 가능한 것인 폴리펩타이드.
  51. 제50항에 있어서, 상기 표지는 가돌리늄인 것인 폴리펩타이드.
  52. 제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 대상체 내에 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위하여 상기 약제학적 제제에 커플링되는 것인 폴리펩타이드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 항-VEGF 항체인 것인 폴리펩타이드.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 나노입자를 통해서 상기 폴리펩타이드에 커플링되는 것인 폴리펩타이드.
  55. 서열 GSLLVHSFQQLG, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 90% 동일성을 포함하는 폴리펩타이드로서, 상기 폴리펩타이드는 약 12 내지 약 250개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  56. 제55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 GSLLVHSFQQLG, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 95% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  57. 제56항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 서열 GSLLVHSFQQLG, 또는 그의 생물학적으로 활성적인 변종에 대해서 적어도 99% 동일성을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  58. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 보존성 아미노산 치환을 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  59. 제55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 GSLLVHSFQQLG를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 약 12 내지 약 200개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 100개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 50개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 30개의 아미노산 잔기, 약 12 내지 약 20개의 아미노산 잔기 또는 약 12 내지 약 16개의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  61. 제55항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열 GSLLVHSFQQLG로 이루어진 것인 폴리펩타이드.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 EGFL7의 이합체화 도메인에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  64. 제62항 또는 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 나노몰 친화도로 EGFL7에 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩타이드.
  66. 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7 수용체 결합을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  67. 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 EGFL7 활성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 관형성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  69. 제55항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 이동을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  70. 제55항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 유착을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  71. 제55항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 신생혈관생성을 조절하는 것인 폴리펩타이드.
  72. 제55항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 검출 가능한 표지를 포함하는 것인 폴리펩타이드.
  73. 제72항에 있어서, 상기 표지는 핵 의학 기술을 이용해서 검출 가능한 것인 폴리펩타이드.
  74. 제73항에 있어서, 상기 표지는 가돌리늄인 것인 폴리펩타이드.
  75. 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 대상체 내의 발현된 EGFL7을 함유하는 부위에 약제학적 제제의 표적화된 전달을 위하여 상기 약제학적 제제에 커플링되는 것인 폴리펩타이드.
  76. 제75항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 항-VEGF 항체인 것인 폴리펩타이드.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 상기 약제학적 제제는 나노입자를 통해서 상기 폴리펩타이드에 커플링되는 것인 폴리펩타이드.
  78. DPYDHEFR(서열번호 7), AYYEEAYE(서열번호 8), RYVDHEDW(서열번호 9), EWELHAEE(서열번호 10), SQSSMYPS(서열번호 11), RYQLHHPR(서열번호 12), WYKLHPTM(서열번호 13), KLQLVLAPLHSLAS(서열번호 14), RSPGLAPARPRYA(서열번호 15) 및 그의 생물학적으로 활성적인 변종으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  80. 제79항의 핵산을 포함하는 벡터.
  81. 제80항의 벡터를 포함하는 세포.
  82. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제79항의 핵산 또는 제81항의 세포를, 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항-VEGF 항체와 같은 항신생혈관제(anti-angiogenic agent)와 함께 포함하는 조성물.
  83. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드, 제79항의 핵산 또는 제81항의 세포를, 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 항-VEGF 항체와 같은 항신생혈관제와 함께 포함하는 약제.
  84. 병리학적 신생혈관생성을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 병리학적 신생혈관생성의 치료 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태인 것인, 병리학적 신생혈관생성의 치료 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암인 것인, 병리학적 신생혈관생성의 치료 방법.
  87. 병리학적 신생혈관생성을 치료하기 위한 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 용도.
  88. 제87항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  89. 제88항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  90. 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 제25항 내지 제27항, 제49항 내지 제51항 및 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항의 검출 가능한 표지를 포함하는 폴리펩타이드를 투여하는 단계 및 상기 대상체를 영상화(imaging)하여 상기 표지를 검출하는 단계를 포함하되, 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 암시하는 것인, 병리학적 신생혈관생성의 스크리닝 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서의 병리학적 신생혈관생성의 진단인 것인, 병리학적 신생혈관생성의 스크리닝 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태인 것인, 병리학적 신생혈관생성의 스크리닝 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암인 것인, 병리학적 신생혈관생성의 스크리닝 방법.
  94. 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 스크리닝하기 위한 제25항 내지 제27항, 제49항 내지 제51항 및 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항의 검출 가능한 표지를 포함하는 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서 병리학적 신생혈관생성을 암시하는 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  95. 제94항에 있어서, 상기 표지의 검출은 상기 대상체에서의 병리학적 신생혈관생성의 진단인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  96. 제95항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  97. 제96항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  98. 암 예후를 예측하는 방법으로서, 상기 방법은 암을 지닌 대상체에게 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드를 투여하는 단계 및 상기 대상체에서의 상기 폴리펩타이드의 존재를 결정하는 단계를 포함하되, 상기 대상체에서의 상기 폴리펩타이드의 존재는 상기 대상체에서의 상기 폴리펩타이드의 부재에 비해서 나쁜 예후를 예고하는 것인, 암 예후의 예측 방법.
  99. 대상체에서 암 예후를 예측하기 위한 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항의 폴리펩타이드의 용도로서, 상기 대상체에서의 상기 폴리펩타이드의 존재는 상기 대상체에서의 상기 폴리펩타이드의 부재에 비해서 나쁜 예후를 예고하는 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  100. 병리학적 신생혈관생성으로 고통받는 환자에서의 표적화된 약물 전달 방법으로서, 상기 방법은 대상체에게 제28항 내지 제30항, 제52항 내지 제54항 및 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항의 약제학적 제제와 연관된 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 표적화된 약물 전달 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태인 것인 표적화된 약물 전달 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암인 것인 표적화된 약물 전달 방법.
  103. 병리학적 신생혈관생성으로 고통받는 환자에서 표적화된 약물 전달을 위한, 제28항 내지 제30항, 제52항 내지 제54항 및 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항의 약제학적 제제와 연관된 폴리펩타이드의 용도.
  104. 제103항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암, 관절염, 심혈관 질환, 연령-관련 황반 변성 및 당뇨망막병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 병태인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
  105. 제104항에 있어서, 상기 병리학적 신생혈관생성은 암인 것인, 폴리펩타이드의 용도.
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