KR102384795B1 - 전이성 암의 치료 및 예방을 위한 제약 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 전이의 예방 또는 치료에 유용한, 단리된 펩티드, 이의 단편 및 유도체, 및 이를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

Description

전이성 암의 치료 및 예방을 위한 제약 조성물 및 방법{PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF METASTATIC CANCER}

기술 분야

본 개시내용은 일반적으로 전이성 암 치료제에 관한 것이다.

종래 기술

본원에 개시된 주제에 대한 배경으로서 관련되는 것으로 간주되는 참고문헌이 하기에 열거된다:

[1] Fiorio Pla, A. and Gkika, D. 2013 Frontiers in Physiology 4 (Article 311): 1-12.

[2] Benoist, S. et al., 2006 J. Clinical Oncology 24(24): 3939-3945.

[3] WO 2006/046239.

[4] WO 2007/122622.

[5] WO 2007/091240.

[6] WO 2008/075349.

[7] Diaz, V. M. et al. 2004 GUT 53:993-1000.

[8] Kumar, S. et al., 2002 The Journal of Biological Chemistry Vol. 270 (46): 27905-27913

[9] Gillibert-Duplantier, J. et al. 2012 Oncogene 31:3516-3524.

본원에서의 상기 참고문헌의 인정은 이들이 어떠한 방식으로든 본원에 개시된 주제의 특허성에 관련된다는 것을 의미하는 것으로 추론되지 않아야 한다.

배경

세계 보건 기구(World Health Organization)에 따르면, 2008년에 전 세계적으로 760만명이 암으로 사망하였다. 암은 신체의 임의의 부분에 영향을 미칠 수 있는 대형 질환 군에 관련된 일반적인 용어라는 것이 널리 공지되어 있다. 암의 한가지 결정적인 특색은 자신의 일반적인 경계를 넘어서 성장하는 비정상적인 세포의 신속한 생성이고, 그 후 이는 전이로 지칭되는 프로세스에서 신체의 인접부를 침습할 수 있고 다른 기관으로 확산될 수 있다.

전이는 암 사망률의 주요 원인이고, 2가지 주요 프로세스에 의존적이다: 인접 조직 내로 침습하는 암 세포의 세포 이동에 이어지는 혈관/림프관 및 종양 맥관구조 내로의 혈관내 침입(intravasation) (이는 혈류에 대한 접근을 제공한다) (1). 암 전이는 신체 전체에 걸친 암 확산에 이르는 복합적인 다단계 프로세스로 공지되어 있고, 때때로 원발성 암을 치료하는데 선택된 접근법과는 상이한 치료적 접근법을 요구한다.

예를 들어, 가장 통상적인 암 중 하나인 결장직장 암종에서, 결장직장 암종 환자 중 약 50％에서 이들의 질환 과정 동안 일부 시점에 간 전이가 발생된다 (2). 간 전이의 수술 절제에 대한 후보인 환자는 장기 생존 또는 심지어 치유를 예상할 수 있다. 불행하게도, 환자 중 10％ 내지 25％만이 간 절제에 대한 후보이고, 절제가 불가능한 전이가 있는 환자에서는, 화학요법이 선택된 치료이다.

암 치료에 대한 완전한 반응은 영상화에서 표적 병변이 사라지는 것으로 일반적으로 정의된다. 그러나, 문헌 [Benoist, S. et al.] (2)에서 보고된 바와 같이, 25％를 초과하는 사례에서, 영상화를 기초로 사라진 것으로 간주된 간 전이 부위에서 수술에 의한 조사 동안 육안으로 보이는 잔류 질환이 발견되었다. 또한, 수술 시 명백한 질환이 없는 환자에서, 환자 중 80％에서 최초의 간 전이 부위로부터의 절제된 검체에서 미세암이 관찰되었다. 마지막으로, 더 이상의 종양이 관찰되지 않았고 완전한 반응 부위가 적소에 남은 환자에서, 1년 후 사례 중 74％에서 원위치 재발이 관찰되었다.

이러한 데이터는 영상화에서 나타난 완전한 반응이 화학요법의 효능을 평가하기 위한 유용한 기준일 수 있지만, 이는 대부분의 경우에 암의 치유를 의미하지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 특정 유형의 전이성 암은 만성 질환으로서 치료되고, 이에 의해 환자의 생명을 연장시키는 반면, 많은 유형의 전이성 암은 여전히 치유불능인 것으로 간주된다.

인간 흉선에 대해 독특한 cDNA에 의해 코딩되는 " T101 "로 명명된 펩티드가 확인되었다. 이러한 펩티드는, 특히, 면역계의 자극물로서의 이의 역할을 통해 암 치료에 연루되었다 (WO 2006/046239, 3). WO 2006/046239에서, T101이 면역계를 자극할 수 있고 종양 크기를 감소시킬 수 있다는 것이 실연되었고, 이는 이러한 펩티드가 암 세포의 증식에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 다양한 유형의 종양의 발생에 대한 T101의 효과가 특히 실연된 WO 2007/122622 (4)에서 T101을 사용하는 것에 의한 암 치료가 또한 제안되었다. 면역학적 질환의 치료와 관련하여 WO 2007/091240 (5)에서, 그리고 T1/ST2 수용체가 있는 세포를 수반하는 질환을 치료 또는 예방하는 것과 관련하여 WO 2008/075349 (6)에서 펩티드 T101이 또한 기술되었다.

일반적인 설명

한 측면에 의해, 본 발명은 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가적인 측면에 의해, 본 발명은 암 세포 운동성을 감소시키거나, 암 환자에서 혈관신생(angiogenesis)을 예방 또는 억제하거나, 또는 암 환자에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 수준을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에 의해, 본 발명은 암 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

추가적인 측면에서, 본 발명은 전이능이 있는 암으로 진단된 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 세포 운동성을 감소시키거나, 암 환자에서 혈관신생을 예방 또는 억제하거나, 또는 암 환자의 혈청 내의 VEGF의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드는 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진다.

추가적인 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드는 서열 3의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 변형된 아미노산 서열에서, 서열 3의 아미노산 서열이 있는 미변형 펩티드와 비교했을 때 변형된 펩티드의 생물학적 특징에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적 치환에 의해 교체된다.

구체적 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드는 서열 3의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 변형된 아미노산 서열에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 D-아미노산 잔기에 의해 교체된다.

추가적인 구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 서열 4의 아미노산 서열을 포함한다.

추가적인 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드는 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진다.

상기 및 기타 실시양태에서, 본 발명은 전이성 암인 암에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 전이성 암은 췌장암, 결장암, 결장직장암, 결장 선암종, 직장 선암종, 유방암, 피부암, 폐암, 비-소세포 폐 암종, 신장암, 다발성 골수종, 갑상선암, 전립선암, 선암종, 두경부암, 위장암, 위암, 소장암, 방추 세포 신생물, 간 암종, 간암 및 여성 생식관의 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 하나 이상의 추가적인 항암 요법과 함께 투여하기 위해 적합화된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 암 환자에게 하나 이상의 추가적인 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 암 요법은 항-혈관신생 작용제, 세포독성제, 화학요법제, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 면역요법으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물 및 본 발명에 따른 방법에서, 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 경피, 국소, 관절내, 결막하, 경구, 비강내 및 안내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 것이다.

도면의 간단한 설명
본원에 개시된 주제를 더욱 잘 이해하기 위해, 그리고 이러한 주제가 어떻게 실제로 수행될 수 있는지를 예시하기 위해, 하기와 같은 첨부된 도면을 참조로, 오직 비제한적인 예로써, 실시양태들이 기술될 것이다:
도 1: BrdU 혼입 검정법에서 검정된 인간 선암종 췌장암 세포 증식에 대한 네로페(Nerofe) 펩티드 (1-50 ㎍/ml)의 효과의 그래픽 표현 (상부의 선). 하부의 막대 그래프는 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA)를 세포 배지로 분비하는 인간 선암종 췌장암 세포의 능력에 대한 네로페 펩티드 (1-50 ㎍/ml)의 효과를 나타낸다. 약어: TPA, 조직 플라스미노겐 활성화제; BrdU, 브로모데옥시우리딘; 및 세포주 1, 세포주 2 및 세포주 3, 인간 선암종 췌장암 세포.
도 2는 BrdU 혼입 검정법에서 검정된 인간 선암종 췌장암 세포 증식에 대한 네로페 펩티드 (1-50 ㎍/ml)의 효과의 그래픽 표현이다 (상부의 선). 하부의 막대 그래프는 인간 선암종 췌장암 세포의 sST2 분비에 대한 네로페 펩티드 (1-50 ㎍/ml)의 효과를 나타낸다. 약어: sST2, 가용성 ST2; BrdU, 브로모데옥시우리딘; 및 세포주 1, 세포주 2 및 세포주 3, 인간 선암종 췌장암 세포.
도 3a - 도 3d는 세포 이동 검정법을 시작할 때 (도 3a 및 도 3b), 및 이동 검정법을 시작하고 나서 27시간 후 (도 3c 및 도 3d)에 찍은 인간 선암종 췌장암 세포의 현미경 사진이다. 세포는 검정법을 시작하기 전에 48시간 동안 25 ㎍/ml의 네로페 펩티드의 존재 (도 3b 및 도 3d) 또는 이러한 펩티드의 부재 (도 3a 및 도 3c) 하에 인큐베이션하였다.
도 4는 세포 이동 검정법을 시작하기 전에 48시간 동안 25 ㎍/ml의 네로페 펩티드의 존재 하에 인큐베이션된 인간 선암종 췌장암 세포를 사용하여 수행된 세포 이동 검정법에서 무세포 면적의 백분율을 나타내는 막대 그래프이다. 2회의 독립적인 검정법 (T1 및 T2)이 수행되었다. 4회의 독립적인 검정법에서 사용된 대조군 세포가 CON1, CON1, CON3 및 CON4로 표시된다. 실험을 시작하고 나서 27시간 후에 수득된 무세포 면적을 실험을 시작하고 나서 1시간 후에 수득된 무세포 면적으로 나눔으로써 무세포 면적의 백분율이 계산되었다.
도 5: 지시된 시점에 6 mg/㎡ (0.16 mg/체중 kg, 파선) 또는 12 mg/㎡ (0.32 mg/체중 kg, 실선)의 네로페 펩티드가 투여된 환자에서의 혈청 VEGF 수준의 그래픽 표현. 약어: pt002, pt004, pt007, pt011, 결장암에 걸린 환자; pt005, 결장직장암에 걸린 환자; 및 pt006, 방추 세포 신생물 암에 걸린 환자.
도 6: 지시된 시점에 24 mg/㎡ (0.64 mg/체중 kg, 파선) 또는 48 mg/㎡ (1.28 mg/체중 kg, 실선)의 네로페 펩티드가 투여된 환자에서의 혈청 VEGF 수준의 그래픽 표현. 약어: pt012, 췌장암에 걸린 환자; pt013, 소장암에 걸린 환자; pt015, 비-소세포 폐 암종에 걸린 환자; pt016, 간 암종에 걸린 환자; pt017, 결장 선암종 암에 걸린 환자; 및 pt019, 직장 선암종에 걸린 환자.

실시양태의 상세한 설명

본 발명은 본원에서 "네로페"로 명명된, 모든 아미노산 잔기가 이의 D 배위인 Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys의 아미노산 서열을 갖는 펩티드가 암 전이와 연관된 것으로 알려진 단백질 (즉, 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 및 가용성 ST2 (sST2))의 암 세포에 의한 분비를 감소시켰다는 발견을 기초로 한다. 이러한 펩티드는 시험관 내에서 암 세포의 이동을 직접적으로 억제하는 것으로 실연되었다. 또한, 이러한 펩티드는 암 환자에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 혈청 수준을 감소시키는 것으로 나타났다.

네로페 펩티드에 대한 노출 시의 암 세포에 의한 TPA 및 sST2의 분비 감소를 기초로, 시험관 내에서의 암 세포의 이동 능력에 대한 펩티드의 직접적인 효과를 기초로, 그리고 암 환자에서 관찰된 VEGF의 혈청 수준에 대한 네로페 펩티드의 효과를 기초로, 본 발명은 암 전이의 억제에서의 네로페 펩티드의 용도 및 방법을 제공한다.

따라서, 한 측면에서, 본 발명은 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본원에서 정의된 바와 같은 " 펩티드 "라는 용어는 아미노산 잔기의 분자 사슬을 지칭하고, 이는 필요하다면, 예를 들어, 만노실화, 글리코실화, 아미드화 (예를 들어 C-말단 아미드), 카르복실화 또는 인산화에 의해, 이의 아미노산 잔기 각각에서 변형될 수 있다. 합성에 의해, 유전자 조작 방법, 숙주 세포에서의 발현을 통해, 또는 임의의 기타 적절한 수단을 통해 펩티드가 수득될 수 있다. 펩티드 생산 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다.

"단리된"이라는 용어는 이의 천연 환경으로부터 제거되거나, 단리되거나 또는 분리된 분자, 예컨대 아미노산 서열 또는 펩티드를 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같은 " 아미노산 "이라는 용어는 천연 발생 및 합성 아미노산 잔기, 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 것, 뿐만 아니라 추후에 변형된 이러한 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린이다.

아미노산이라는 용어는 알파 탄소의 키랄성(chirality)이 역전된, L-아미노산의 거울상인 D-아미노산을 또한 포함한다. D-아미노산은 프로테아제-매개 분해에 대해 고도로 저항성이고, 면역원성 반응이 낮다.

" 아미노산 서열 " 또는 " 펩티드 서열 "이라는 용어는 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산 잔기들이 펩티드 및 단백질 내의 사슬에 놓인 순서에 또한 관련된다. 일반적으로 서열은 유리 아미노 기를 함유하는 N-말단부터 유리 카르복실 기를 함유하는 C-말단으로 보고된다.

하기 예시된 바와 같이, 모든 아미노산 잔기가 이의 D 배위인 Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys의 서열 (서열 4에 의해 표기됨)을 갖는, 본원에서 " 네로페 "로 명명된 펩티드는 암 세포에 의한 TPA 및 sST2의 분비를 감소시키는 것으로, 그리고 암 세포의 이동을 직접적으로 억제하는 것으로 나타났고, 이는 암 전이 억제에서의 이의 잠재력을 시사한다.

모든 아미노산 잔기가 L 아미노산 잔기인 Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys의 아미노산 서열 (본원에서 서열 3에 의해 표기됨)을 갖는 펩티드는 WO 2006/046239 (3)에 기술된 " 전장 T101 펩티드 "로 명명된 펩티드의 C-말단 단편이다.

전장 T101 펩티드는 본원에서 서열 1에 의해 표기된 아미노산 84개 길이의 서열이다. 이의 N-말단의 아미노산 33개의 신호 펩티드가 결실되어 본원에서 서열 2에 의해 표기되고 " T101 펩티드 "로 명명된 펩티드 단편이 산출된다. T101 펩티드는 아미노산 51개의 길이이다. 서열 1 및 서열 2, 뿐만 아니라 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열이 하기 표 1에서 상술된다.

<표 1>

본 발명에 따른 단리된 펩티드는 본원에서 "전장 T101 펩티드"로 명명된 펩티드의 연속적인 C-말단 단편, 예를 들어, 그러나 이에 한정되지는 않는, 전장 T101 펩티드의 C-말단의 아미노산 잔기 14개의 단편인 서열 3에 의해 표기되는 아미노산 서열을 적어도 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 전장 T101 펩티드 (서열 1에 의해 표기됨)의 C-말단으로부터의 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84개의 아미노산 잔기를 포함하는 전장 T101 펩티드의 연속적인 C-말단 단편을 포함한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 " 단리된 펩티드 "라는 용어는 서열 3에 의해 표기되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드, 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 및 유도체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 하기 정의된 바와 같은 전장 T101 펩티드 (서열 1) 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 및 유도체이다. 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 이의 N-말단의 아미노산 33개가 결여된 흉선 펩티드 T101 (서열 2) 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 및 유도체이다.

" 포함하는 "이라는 용어는 본 발명에 따른 단리된 펩티드가 서열 3 또는 서열 4에 의해 표기되는 펩티드를 포함하지만, 서열 3 또는 서열 4에 의해 표기되는 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 추가적인 아미노산 잔기를 또한 포함할 수 있다는 것을 의미하고, 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만, 본 발명에 따른 단리된 펩티드는 하기에 상술된 바와 같이 서열 1 및 서열 2에 의해 표기되는 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 서열 3에 의해 표기되는 바와 같은 아미노산 서열 Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys을 포함하는 단리된 펩티드, 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체에 관련된다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체로 이루어진 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이다.

본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드의 유도체 및 변형된 펩티드 또한 본 발명에 포함된다. " 변형된 ", " 유도체 " 또는 " 단리된 펩티드의 유도체 "라는 용어들은 전체 서열 내의 하나 이상의 아미노산이 상이한, 즉, 결실, 치환 (예를 들어, 보존적 치환에 의해 하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산에 의해 교체되는 것), 역전 또는 부가가 있는 펩티드를 포함하도록 의도된다. 이러한 용어는 전체 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기가 이의 각각의 D 아미노산 잔기에 의해 교체되는 것을 또한 포함한다.

예를 들어, 네로페 펩티드 (서열 4에 의해 표기됨)는 모든 아미노산 잔기가 이들의 상응하는 D 아미노산에 의해 교체된 서열 3의 아미노산 서열을 갖는다.

아미노산 " 치환 "은 한 아미노산을 구조 및/또는 화학적 성질이 유사한 또 다른 아미노산으로 교체하는 것, 즉, 보존적 아미노산 교체의 결과이다. 아미노산 치환은 수반되는 잔기들의 극성, 전하, 가용성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에서의 유사성을 기초로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 하기의 8개의 군 각각이 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산들을 함유한다:

1) 알라닌 (A), 글리신 (G);

2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);

3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);

4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);

5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);

6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W);

7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및

8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M).

본원에서 정의된 바와 같은 펩티드의 단편들 또한 본 발명에 포함된다. " 단 편 "이라는 용어는 본 발명에 따른 펩티드로부터의 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실에 의해 수득된, 본 발명에 따른 단리된 펩티드보다 아미노산 하나 이상이 더 짧은 임의의 펩티드를 지칭한다.

구체적으로, 전장 T101 펩티드 (서열 1에 의해 표기됨)를 포함하는 본 발명에 따른 단리된 펩티드의 단편은 전장 T101 펩티드의 C-말단으로부터의 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83 또는 84개 이상의 아미노산 잔기의 단편일 수 있다.

본 발명이 포함하는 단리된 펩티드의 특정한 변형된 펩티드는 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 변형된 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드이고, 이러한 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 미변형 펩티드와 비교하여 변형된 펩티드의 생물학적 특징에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 보존적 치환에 의해 교체된다.

일부 실시양태에서, 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 변형된 아미노산 서열은 각각 서열 1, 서열 2, 서열 3 및 서열 4의 상응하는 서열에 대한 동일성이 적어도 70％, 바람직하게는 80％, 더욱 바람직하게는 90％, 특히 100％이다.

본 발명에 따른 펩티드 유도체는 자신의 잔기 중 하나 이상을 통해 추가적인 작용제 (예를 들어, 안정화제, 항-혈관신생 작용제, 세포독성제 등)에 커플링된 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열, 뿐만 아니라 임의의 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드를 포함하는 임의의 융합 단백질 또는 접합체를 또한 포함한다.

변형된 단편이 본 발명에 의해 또한 고려된다. 예를 들어, 변형된 단편은 전장 T101 펩티드 내에 포함된 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75개 또는 적어도 80개의 상응하는 서열에 대한 동일성 정도가 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 더욱 바람직하게는 적어도 90％, 특히 적어도 100％인 전장 T101 펩티드의 C-말단으로부터의 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75개 또는 적어도 80개의 아미노산 잔기의 연속적인 서열을 포함하는 펩티드일 수 있다.

이러한 펩티드 단편 또는 유도체가 원래의 펩티드의 생물학적 활성을 변경시키지 않아야 하는 것으로 이해된다. " 기능성 " 또는 " 미변형 펩티드와 비교했을 때 변형된 펩티드의 생물학적 특징에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 "라는 용어들은 변형된 펩티드가 미변형 펩티드의 것과 정성적으로 유사한 생물학적 활성을 유지한다는 것을 나타내도록 의도된다.

본 발명의 단리된 펩티드를 지칭할 때의 " 생물학적 특징 "이라는 용어는 암 세포 이동의 억제, 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 (TPA)의 분비 수준의 감소, 암 세포 내의 가용성 ST2의 분비 수준의 감소, 및 VEGF의 분비 수준의 감소를 포함한다.

펩티드가 미변형 펩티드의 것과 정성적으로 유사한 이의 생물학적 특징을 유지하는지 여부를 결정하기 위해, 하나 이상의 검정법, 예를 들어, 변형된 펩티드가 병행으로 검정되는 상응하는 미변형 펩티드에 비교되는 시험관내, 생체내 또는 임상 실험; 또는 변형된 펩티드가 별도로 수행된 시험으로부터 공지된 바와 같은 미변형 펩티드의 것과 유사한 생물학적 효과를 지니는지 여부를 검사하도록 변형된 펩티드가 검정되는 실험이 수행될 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예에 기술된 방식으로, 이같은 실험이 수행될 수 있다.

일부 구체적 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 변형되지 않은 단리된 펩티드, 즉 서열 1, 서열 2, 서열 3 또는 서열 4에 의해 표기되는 아미노산 서열의 것의 아미노산 서열에 대해 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 더욱 바람직하게는 적어도 90％, 특히 적어도 95％ 동일한 아미노산 서열을 갖는, 기능성 단편, 유도체 또는 변형된 펩티드에 관한 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 3 또는 서열 4의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 변형된 서열에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 미변형 펩티드와 비교했을 때 변형된 펩티드의 생물학적 특징에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 보존적 치환에 의해 교체된 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 3 또는 서열 4의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 변형된 서열에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 미변형 펩티드와 비교했을 때 변형된 펩티드의 생물학적 특징에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 보존적 치환에 의해 교체되고, 상기 변형된 아미노산 서열이 각각 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 미변형 펩티드의 아미노산 서열에 대해 적어도 70％, 바람직하게는 적어도 80％, 더욱 바람직하게는 적어도 90％, 특히 적어도 95％ 동일한 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 3의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 변형된 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 D-아미노산 잔기에 의해 교체된 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 단리된 펩티드가 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 것이다.

하기 예시된 바와 같이, 본원에서 " 네로페 "로 명명된 펩티드는 췌장암 세포 및 유방암 세포에서 세포 운동성 또는 이동을 직접적으로 억제하는 것으로 나타났다. 자신의 원래의 부위로부터 신체 내의 상이한 위치로 이동하는 암 세포의 능력은 암 전이에서의 기본적인 단계 중 하나이다.

본원에서 사용된 바와 같은 " 암 전이 "라는 용어는 암이 최초로 발생된 위치로부터 신체 내의 또다른 위치 또는 부위로의 암의 확산 또는 이동 프로세스를 지칭한다. 암 전이라는 용어는 전이성 암 세포의 원래의 부위와 상이한 위치에서 전이성 암 세포에 의해 형성된 종양에 또한 관련된다. 전이성 암 세포에 의해 형성된 종양은 전이성 종양으로도 칭해진다.

암세포 전이는 일반적으로 하기의 단계들을 수반한다: 인접한 정상 조직으로 암 세포가 국소적으로 침습함; 혈관내 침입에 의해 암 세포가 인접한 림프관 또는 혈관의 벽을 통해 침습 및 이동함; 암 세포가 림프계 또는 혈류를 통해 신체의 다른 부분으로 순환함; 정지 및 혈관외 유출(extravasation)에 의해, 암 세포가 원격 위치의 소형 혈관에서 정지한 후, 모세혈관의 벽을 침습하고, 주변 조직 내로 이동함 (혈관외 유출); 원격 위치에서 암 세포가 증식하여 미세전이로 공지된 소형 종양을 형성함; 및 혈관신생 (미세전이에 의한 새로운 혈관의 성장의 자극)으로 혈액 공급을 수득함. 가장 통상적인 암 전이 부위는 뼈, 간, 폐 및 뇌이다.

본 발명은 전이 또는 2차 성장을 형성할 수 있는 임의의 암 질환을 포함한다.

어떠한 유형의 암에서 궁극적으로 전이가 발달될지를 예측하는 것이 숙련된 의사 (예를 들어, 종양학 전공의 의사)에 의해 수행될 수 있다. 암의 전이능의 예측은, 특히, 크기, 심도 및 림프절이 수반되는지 또는 그렇지 않은지 여부를 포함하는 암의 전체적인 단계를 기초로 한다. 기타 지표는 종양 등급 및 유전학적 및 단백질 테스트일 수 있다.

예를 들어, 전이성 암의 징후일 수 있는 뼈 통증, 지속적인 기침 및 두통과 같은 증상이 나타나는 것을 추적함으로써, 암 전이를 확인 또는 진단하는 것이 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다. 또한, 일상적인 스캔, 예컨대 혈액 테스트, 영상화 (예를 들어, X-선, 양전자 방출 단층촬영 및 컴퓨터 단층 촬영 (PET/CT), 자기 공명 영상화 (MRI), 뼈 스캔, MRI 및 CT), 및 의심스러운 진단을 확인하기 위해 일반적으로 행해지는 생검에 의해 전이성 암이 검출될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 " 전이성 암 "으로 분류되는 암, 즉 관련 기술 분야에서 전이능이 있는 것으로 공지된 임의의 암 유형에 관한 것이다.

따라서, 상기 및 기타 실시양태에서, 본 발명에 포함되는 암은 전이성 암이다.

구체적 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 전이성 암은 췌장암, 결장암, 결장직장암, 결장 선암종, 직장 선암종, 유방암, 피부암, 폐암, 비-소세포 폐 암종, 신장암, 다발성 골수종, 갑상선암, 전립선암, 선암종, 두경부암, 위장암, 위암, 소장암, 방추 세포 신생물, 간 암종, 간암 및 여성 생식관의 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

첨부된 예에서 나타난 바와 같이, 암 환자에게 24 mg/㎡ 또는 48 mg/㎡ 용량 (신체 표면적 단위로 제공되고, 각각 약 0.64 또는 약 1.28 mg/체중 kg으로 전환됨)으로 네로페 펩티드를 투여했을 때 VEGF의 혈청 수준이 약 30-40％ 만큼 감소되었다. VEGF의 혈청 수준의 감소는 소장 및 직장 선암종 암에 걸린 암 환자의 경우에 특히 유의하였다.

관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관형성(vasculogenesis) 및 혈관신생을 자극하는 세포에 의해 생산되는 신호 단백질이다. VEGF의 정상적인 기능은 배아 발생 동안의 새로운 혈관, 손상 후 (운동 후의 근육)의 새로운 혈관, 및 차단된 혈관을 우회하는 새로운 혈관을 생성시키는 것이다. VEGF의 과발현이 질환의 원인이 될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 고형 암은 적합한 혈액 공급 없이는 제한된 크기 너머로 성장할 수 없기 때문에, VEGF를 발현할 수 있는 암은 성장 및 전이가 가능하다.

네로페 펩티드를 암 환자에게 투여한 결과로서 VEGF의 혈청 수준의 감소가 관찰된 것은 네로페 펩티드의 명백한 항-혈관신생 효과이다.

따라서, 또 다른 측면에 의해, 본 발명은 암 환자에서 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

한 구체적 실시양태에서, 혈관신생은 종양과 연관된 혈관신생이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, 혈관신생은 VEGF와 연관된다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가적인 구체적 실시양태에서, 본 발명은 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열로 이루어지는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, " 혈관신생 "이라는 용어는 이에 의해 새로운 혈관이 형성되고, 다양한 생리학적, 뿐만 아니라 병리학적 프로세스 (상처 회복, 재생, 허혈, 관절염, 건선, 망막병증, 고형 종양 성장 및 전이성 종양 확산에 대한 반응을 포함함)에서 수반되는 프로세스를 지칭한다. 혈관신생은 촉진 및 억제 인자 양쪽 모두의 복잡한 균형에 의존적인 고도로 제어되는 프로세스이다.

" 혈관신생을 예방 또는 억제함 "이라는 용어는 적어도 약 1％, 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 약 100％ 만큼의 혈관신생의 임의의 제한, 지연, 저하, 감소 또는 점감을 의미한다.

혈관신생을 예방 또는 억제함이라는 용어는 혈관형성 (중배엽 세포 전구체로부터의 내피 세포의 새로운(de novo) 형성)의 억제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 새로운 혈관 형성의 예방 또는 억제를 또한 의미한다.

관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 영상화에 의해 또는 혈관신생과 연관된 생리학적 마커 (예를 들어 혈관 내피 성장 인자)를 모니터링하는 것에 의해, 혈관신생에 대한 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드의 효과를 모니터링할 수 있다.

관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 그리고 상기에서 지시된 바와 같이, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 내피 세포 이동, 튜브 형성 및 증식을 포함하는 혈관신생-유발(pro-angiogenic) 성질을 자극하는 유사분열촉진 인자이다. 병리학적 병태에서 혈관신생의 1차 자극으로서 VEGF를 인식하는 것은 VEGF 활성을 차단하는 다양한 시도에 이르렀다.

이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 도 6에 제시된 바와 같이, 네로페 펩티드를 암 환자에게 투여한 결과로서 VEGF의 혈청 수준의 감소가 관찰된 것은 네로페 펩티드의 항-혈관신생 효과를 표시한다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에서 VEGF 수준을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드로의 치료를 시작하기 전 및 치료 동안 및 치료 후의 다양한 시점에 환자로부터 수득된 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액)을 수득함으로써, 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드가 투여된 암 환자에서 VEGF 수준을 측정하는 것이 수행될 수 있다. 이러한 생물학적 샘플 내의 VEGF의 수준을 관련 기술 분야에 널리 공지된 절차를 따라 결정할 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드로의 치료를 시작한 후에 암 환자로부터 수득된 생물학적 샘플(들) 내의 VEGF의 혈청 수준이 치료를 시작하기 전에 암 환자로부터 수득된 생물학적 샘플(들) 내의 VEGF의 혈청 수준보다 낮은 경우에 VEGF 수준의 감소가 관찰된다.

본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드가 투여된 암 환자의 혈액 내의 VEGF의 혈청 수준의 임의의 감소가 본 발명에 포함된다. 구체적 실시양태에서, VEGF의 혈청 수준의 감소는 적어도 약 1％, 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 약 100％일 수 있다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 VEGF 수준을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 VEGF 수준을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열로 이루어지는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명은 VEGF의 과발현과 연관된 전이성 암에 관련된다. 예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같은 전이성 암은 췌장암, 소장암, 직장 선암종, 결장암, 결장직장암, 방추 세포 신생물, 비-소세포 폐 암종, 간 암종 및 직장 선암종일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.

추가적인 구체적 실시양태에서, 본 발명은 췌장암, 유방암, 소장암 또는 직장 선암종인 전이성 암에 관련된다.

관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본원에서 정의된 바와 같은 " 췌장암 "이라는 용어는 췌장 (위 너머에 위치하는 샘 기관)을 구성하는 세포의 제어되지 않은 성장을 지칭한다. 이러한 암 세포는 신체의 다른 부분으로 침습 또는 확산하는 능력이 있다. 다수의 상이한 유형의 췌장암이 있지만, 췌장 선암종이 사례의 약 85％를 차지한다.

본원에서 정의된 바와 같은, 그리고 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 " 유방암 "이라는 용어는 유방 조직에서 형성되는 암을 지칭한다. 가장 통상적인 유형의 유방암은 관 암종이고, 이는 유관의 내층(lining)에서 시작된다. 또 다른 유형의 유방암은 소엽 암종이고, 이는 유방의 소엽 (유선)에서 시작된다. 침습성 유방암은 유방의 관 또는 소엽 내의 시작된 곳에서 주변의 정상 조직으로 확산된 유방암이다.

관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, " 소장암 "이라는 용어는 악성 암 세포가 소장 조직에서 형성되는 희귀 질환이다.

" 직장 선암종 "이라는 용어는 암 세포가 직장 조직에서 형성되는 질환에 관한 것이다. 선암종이 결장 및 직장 암의 대부분 (98％)을 이루고, 더 희귀한 직장 암은 림프종 (1.3％), 카르시노이드 (0.4％), 및 육종 (0.3％)을 포함한다.

추가적인 구체적 실시양태에서, 본 발명은 췌장암 또는 유방암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드, 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

추가적인 구체적 실시양태에서, 본 발명은 췌장암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 펩티드, 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 용도의 방법 및 제약 조성물의 의도된 용도는 암 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 암 전이를 예방 또는 치료하는 것이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 방법 및 제약 조성물은 암에 걸린 것으로 진단된 환자에서 암 전이의 형성을 예방하도록 의도된다. 이같은 경우에, 본 발명의 제약 조성물은 그 자체로 또는 다른 항암제와 조합되어 암으로 진단된 개체에 투여되는 주 요법에 추가적으로 투여되는 "예방" 또는 아주반트 계획으로서 투여될 수 있다. 주 요법은 예를 들어 수술 및/또는 화학요법일 수 있다.

" 아주반트 요법 "이라는 용어는 1차 치료, 주 치료 또는 초기 치료에 추가적으로 제공되는 치료를 지칭한다. 현재 공지된 암 환자에게 투여되는 아주반트 요법의 일부 비제한적인 예는 암 유형에 따른 화학요법, 호르몬 요법, 생물학적 요법, 방사선 요법, 또는 이들의 조합이다. 아주반트 요법은 추후 전이의 위험을 낮추도록 디자인되지만, 재발하지 않도록 보장하지는 않는다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 상기 제약 조성물이 하나 이상의 추가적인 항암 요법과 함께 투여하기 위해 적합화된 것이다.

즉, 한 측면에서, 본 발명은 암 전이의 발생을 예방하기 위해, 임의적으로는 1차 치료, 주 치료 또는 초기 치료와 조합하여, 암으로 진단된 대상체 (암 환자)의 치료에서 사용하기 위한 방법 및 제약 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 제약 조성물의 투여는 하나 이상의 추가적인 항암 요법의 투여 전에, 이의 투여와 동시에, 또는 이의 투여 후에 수행될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 " 하나 이상의 추가적인 항암 요법 "이라는 용어는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 항암 요법, 예를 들어, 항-혈관신생 작용제, 세포독성제, 화학요법제 (예를 들어 알킬화제, 항-대사물, 토포이소머라제 억제제 및 세포독성 항생제), 호르몬 요법 (예를 들어 유방암 치료용 타목시펜(Tamoxifen)), 방사선 요법 및 면역요법 (예를 들어 세포-기반 요법, 항체 요법 또는 사이토카인 요법)을 지칭하지만, 이에 한정되지 않는다

본원에서 사용된 바와 같은 "항-혈관신생 작용제"라는 용어는 새로운 혈관의 성장 (혈관신생)을 억제하는 물질을 지칭한다. 혈관신생을 억제하는 작용제의 일부 비제한적인 예는, 몇몇 예를 들자면, 혈관신생-유발 인자의 생산을 감소시키는 작용제 및 VEGF 경로의 억제제이다. VEGF 경로의 억제제는, 예를 들어, 타이로신 키나제 억제제 및 VEGF 또는 VEGFR에 대해 지시된 항체, 예컨대 VEGF에 결합하고 VEGF가 VEGF 수용체에 결합하는 것을 억제하는 베바시주맙(Bevacizumab) (아바스틴(Avastin))일 수 있다.

따라서, 상기 및 기타 실시양태에서, 상기 하나 이상의 추가적인 암 요법은 항-혈관신생 작용제, 세포독성제, 화학요법제, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 면역요법으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본원에서 정의된 바와 같은 " 예방함 "이라는 용어는 암으로 진단된 개체 (암 환자)에서의 암 전이의 형성의 임의의 제한, 지연, 저하, 감소, 저해, 억제, 지체 또는 저지를 의미하고, 여기서 암은 임의적으로 전이성 암으로 진단될 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같은 예방함이라는 용어는 암으로 진단된 개체에서의 암 전이의 형성의 적어도 약 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 또는 약 100％만큼의 임의의 제한, 지연, 저하, 감소, 저해, 억제, 지체 또는 저지를 의미한다.

본 발명은 암 전이를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본원에서 정의된 바와 같은 제약 조성물을 또한 제공한다. 달리 말하면, 암 환자에서 암 전이가 진단된 후의 전이성 암 세포의 지속적인 또는 추가적인 확산의 예방으로서 본원에서 정의되는 " 암 전이의 치료 "에 본 발명에 따른 방법이 또한 유용할 수 있다.

따라서 본원에서 정의된 바와 같은 " 암 환자 " 또는 " ~를 필요로 하는 암 환자 "라는 용어는 암, 특히 전이성 암에 걸린 것으로 진단된 온혈 동물, 특히 인간을 지칭한다. " 치료하다 ", " 치료 "라는 용어 또는 이의 변화형은 환자의 질환 또는 병태를 예방하거나, 억제하거나, 정지시키거나 또는 경감시키는 것을 의미한다.

관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 단리된 펩티드의 존재 하에 적절한 검정법을 수행함으로써 암 전이의 형성을 저해하거나, 억제하거나, 지체시키거나 또는 저지하는 수준을 실험적으로 평가할 수 있다. 예를 들어 상기 기술된 바와 같이, 숙련된 의사에 의해 암 전이의 형성을 저해하거나, 억제하거나, 지체시키거나 또는 억제하는 수준의 임상 평가가 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 제약 조성물 또는 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 모범 의료 지침(good medical practice)에 따라, 예를 들어, 전신적으로, 비경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 주사에 의해 투여 및 투약될 수 있다. 또 다른 예에서, 정맥내, 피하, 경피, 국소, 근육내, 관절내, 결막하, 또는 점막, 예를 들어, 경구, 비강 또는 안내 투여를 포함하는 임의의 적절한 경로에 의해 제약 조성물이 부위에 도입될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 경피, 국소, 관절내, 결막하, 경구, 비강내 및 안내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의한 것이다.

하기 예시된 바와 같이, " 네로페 " 펩티드는 췌장암 세포에서 세포 운동성을 직접적으로 억제한 것으로 나타났다.

따라서, 또 다른 한 측면에서, 본 발명은 암 세포 운동성을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 제약 조성물은 전이능이 있는 암으로 진단된 암 환자에서 암 세포 운동성을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다.

" 암 세포 운동성을 감소시킴 "이라는 용어는 자신의 위치로부터 이동하는 암 세포의 능력의 임의의 부분적인 또는 완전한 억제, 약화 또는 감소를 의미한다. 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 하기에 예시된 세포 이동 검정법에 의해 암 세포 이동을 모니터링할 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같은 " 조성물 " 또는 " 제약 조성물 "이라는 용어는 본 발명에 따른 단리된 펩티드인 활성 작용제, 및 완충제, 조성물의 삼투성을 조정하는 작용제, 및 임의적인, 하나 이상의 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 첨가제 중 하나 이상을 일반적으로 포함한다.

제약 산업에 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 본 발명에 따른 제약 조성물이 제조될 수 있다. 이같은 기술은 활성 성분을 제약상 허용되는 담체(들), 부형제(들) 또는 첨가제(들)와 회합시키는 단계를 포함한다.

예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같은 " 제약상 허용되는 담체 "라는 용어는 관련 기술 분야에 널리 공지된 바와 같은 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항박테리아 및 항진균 작용제를 포함한다. 각각의 담체는 다른 성분들과 혼화성이고 환자에 해롭지 않다는 점에서 제약상 및 생리학상 양쪽 모두로 허용가능하여야 한다.

제약상 허용되는 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적절한 혼합물, 및 식물성 오일을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.

보조적 또는 부가적 활성 성분, 예를 들어 추가적인 항암제 또한 본 발명의 제약 조성물 내로 혼입될 수 있다.

상기에서 특히 언급된 성분에 추가적으로, 제형이 당해 제형의 유형에 관련된 기술 분야에서 통상적인 다른 작용제를 또한 포함할 수 있다는 것을 이해하여야 하고, 예를 들어, 경구 투여에 적절한 것은 풍미제를 포함할 수 있다.

따라서, 상기 및 기타 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물 및 본 발명에 따른 용도의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 첨가제를 추가로 포함한다.

또 다른 측면에 의해, 본 발명은 암 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 본원에서 정의된 바와 같은 상기 단리된 펩티드가 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 단리된 펩티드가 서열 1 또는 서열 2의 아미노산 서열 또는 이러한 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체로 이루어진 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 단리된 펩티드가 서열 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 단리된 펩티드가 서열 3 또는 서열 4의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 변형된 서열에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 각각 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 미변형 펩티드와 비교했을 때 변형된 펩티드의 생물학적 특징에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 보존적 치환에 의해 교체된 것이다.

추가적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 단리된 펩티드가 서열 3의 변형된 아미노산 서열을 포함하고, 이러한 변형된 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 D-아미노산 잔기에 의해 교체된 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 단리된 펩티드가 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 암 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법은 상기 방법이 상기 암 환자에게 하나 이상의 추가적인 본원에서 정의된 바와 같은 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것이다.

본 발명은 전이능이 있는 암으로 진단된 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 세포 운동성을 감소시키는 방법을 추가로 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 혈관신생의 예방 또는 억제를 필요로 하는 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에 의해, 본 발명은 혈청 내의 VEGF의 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 암 환자에게 치료적 유효량의 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 혈청 내의 VEGF의 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 암 환자의 혈청에서 VEGF 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 세포 운동성을 감소시키는 방법, 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법 또는 혈청 내의 VEGF의 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 암 환자의 혈청에서 VEGF 수준을 감소시키는 방법은 상기 제약 조성물이 치료적 유효량의 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드를 포함하는 것이다.

다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 암 세포 운동성을 감소시키는 방법, 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법 또는 혈청 내의 VEGF의 수준을 감소시키는 것을 필요로 하는 암 환자의 혈청에서 VEGF 수준을 감소시키는 방법은 상기 제약 조성물이 치료적 유효량의 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 펩티드를 포함하는 것이다.

본원에서 정의된 목적을 위한 본 발명에 따른 단리된 펩티드의 " 치료적 유효량 " (또는 치료적 유효량들)은 암 전이를 치료하거나, 예방하거나, 억제하거나, 정지시키거나 또는 경감시키기 위해 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 고려사항에 의해 결정된다.

본 발명에 따른 단리된 펩티드 또는 이를 포함하는 제약 조성물은 치료적 유효량의 단일 또는 다중 용량으로 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드 또는 이를 포함하는 제약 조성물의 투여의 투약 체계 및 투약 일정은 관련 기술 분야에 공지된 고려 사항을 기초로, 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만, 하기 표 3에 요약된 임상 검정법을 따라, 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 정의된 바와 같은 용도의 치료 방법 및 제약 조성물은 암 전이의 진행을 억제하거나, 저해하거나 또는 느리게 하도록 의도된다. 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드의 치료 효과 (또는 본원에서 정의된 바와 같은 치료에 대한 암 환자의 반응성)을 모니터링하는 것이 숙련된 의사에 의해, 예를 들어, 모든 종양을 평가하고 이의 크기 및 전이를 추적함으로써, 또는, 예를 들어 상기 기술된 바와 같이, 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 암 환자에서의 암 전이의 증상을 추적함으로써 정기적으로 수행될 수 있다.

예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같은 용도의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료에 대한 암 환자의 반응성을 결정하는 것이 암 전이의 특이적 마커, 예를 들어, 이에 한정되지는 않지만, 분비된 가용성 ST2, TPA 또는 VEGF의 수준 중 하나 이상을 본원에서 정의된 바와 같은 용도의 방법 및 제약 조성물로 치료되기 전에, 그리고 치료 후의 규칙적인 방식 (예를 들어, 1주일에 1회, 2주일에 1회, 1개월에 1회)으로 암 환자로부터 수득된 세포를 함유하는 생물학적 샘플로부터 추적함으로써 수행될 수 있다.

" 생물학적 샘플 "이라는 용어는 이의 가장 넓은 의미로 사용된다. 동물 (인간 포함)로부터 생물학적 샘플을 수득할 수 있고, 이는 유체 (예를 들어 혈액), 고체 및 조직을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암 전이를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물의 제조에서의 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체의 용도를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 암 전이의 예방 또는 치료를 필요로 하는 암 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암 전이를 예방 또는 치료하기 위한 제약 조성물의 제조에서의 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체의 용도를 제공한다.

본 발명은 암 세포 운동성을 감소시키기 위한 제약 조성물의 제조에서의 본원에서 정의된 바와 같은 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체의 용도를 추가로 제공한다.

구체적 실시양태에서, 본 발명은 암 세포 운동성을 감소시키기 위한 제약 조성물의 제조에서의 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 단리된 펩티드 또는 상기 단리된 펩티드의 임의의 기능성 단편 또는 유도체의 용도를 제공한다.

본원에서 정의된 바와 같은 " 약 "이라는 용어는 언급된 값보다 1％, 더욱 구체적으로는 5％, 더욱 구체적으로는 10％, 더욱 구체적으로는 15％, 일부 경우에는 20％까지 더 높거나 또는 더 낮게 편차가 있을 수 있는 값을 지시하고, 편차 범위는 연속적인 범위를 구성하는 정수 값을 포함하고, 적용가능한 경우, 연속적인 범위를 구성하는 비-정수 값을 또한 포함한다.

개시 및 기술되었지만, 본 발명이 본원에 개시된 특정 예, 방법 단계 및 조성물에 한정되지 않는다는 것을 이해하여야 하는데, 이같은 방법 단계 및 조성물이 다소 변할 수 있기 때문이다. 본 발명의 범주는 첨부된 청구항 및 이의 등가물에 의해서만 한정될 것이기 때문에 본원에서 사용된 용어법은 특정 실시양태를 기술하는 목적으로만 사용되고 한정적인 것으로 의도되지 않는다는 것을 또한 이해하여야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형의 "a", "an" 및 "the"는 문맥적으로 명백하게 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시물을 포함한다.

본 명세서 및 하기의 실시예 및 청구항 전반에 걸쳐, 문맥적으로 달리 요구되지 않는 한, "포함하다(comprise)"라는 단어 및 이의 변형, 예컨대 "포함하다(comprises)" 및 "포함함"은 언급된 정수 또는 단계 또는 일군의 정수 또는 단계를 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 일군의 정수 또는 단계를 배제하지 않는 것을 암시하는 것으로 이해될 것이다.

하기의 예는 본 발명의 측면들을 수행하는 것에서 발명가들이 사용한 기술을 나타낸다. 이러한 기술들이 본 발명의 실행을 위한 바람직한 실시양태의 예시인 한편, 관련 기술 분야의 기술자는, 본 개시내용의 견지에서, 수많은 변형이 본 발명의 취지 및 의도된 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 인지할 것임을 이해하여야 한다.

실시예

추가적인 상술 없이, 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 앞서 기술된 것을 사용하여 본 발명을 이의 최대 한도로 활용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기의 바람직한 구체적 실시양태들은 단지 설명적인 것이고, 청구된 발명을 어떠한 방식으로도 한정하지 않는 것으로 해석되어야 한다.

관련 기술 분야에 공지되어 있고 본원에서 구체적으로 기술되지 않은 표준 분자 생물학 프로토콜은 일반적으로 문헌 [Sambrook & Russell, 2001]에서와 같은 프로토콜을 따른다.

실험 절차

세포 배양 (세포 계대 )

세포 (인간 선암종 췌장암 세포 및 인간 유방암 세포)를 37℃, 5％ CO₂의 인큐베이터에서 70-80％ 밀도에 도달할 때까지 플라스크에서 성장시켰다. 70-80％ 밀도에 도달했을 때, 세포를 하기와 같이 처리하였다: 배양 배지를 폐기하고, 플라스크를 트립신 EDTA (5 ml, 바이올로지컬 인더스트리즈(Biological industries) 카탈로그 번호 03-052-1B)로 세정하였다. 그 후, 추가적인 5 ml 부피의 트립신 EDTA를 세포에 첨가하고, 대부분의 세포가 플라스크로부터 탈착될 때까지 세포를 수 분 (5-10분) 동안 37℃, 5％ CO₂의 인큐베이터 내에 놓았다. 세포 탈착을 증가시키기 위해 플라스크를 두드리는 것을 자제하도록 권장된다. 플라스크는 눈크(Nunc) (카탈로그 번호 178905)로부터 구입하였다.

그 후, RPMI 배지 (10 ml)를 트립신-처리 세포에 첨가하였다. 이러한 배지는 RPMI 1640 (L-글루타민 및 25 mM HEPES 함유, 레늄(Renium) 카탈로그 번호 52400)에 50 ml FBS (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 04-121-1A), 5 ml 피루브산나트륨 (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 03-042-1B), 5 ml 펜-스트렙(Pen-Strep) (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 03-031-1B) 및 5 ml 비필수 아미노산 (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 03-340-1B)을 보충함으로써 제조되었다. 그 후 배지 및 트립신-처리 세포를 2개의 플라스크 내로 분할하고, 각각의 플라스크에 추가적인 15 ml의 신선한 배지를 보충하였다. 70-80％ 세포 밀도에 도달할 때까지 세포를 2-3일 성장시켰다. 그 후, 상기 절차를 반복하였다.

펩티드 제조

Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys (또는 단문자 코드의 WWTFFLPSTLWERK이고, 서열 4에 의해 표기된 바와 같음)의 아미노산 서열을 갖는, 모든 아미노산 잔기가 이의 D 배위인 아미노산 잔기 14개 길이의 펩티드로서, 본원에서 "네로페"로 또한 명명된 펩티드가 하기와 같이 제조되어 사용되었다: 노베티드(Novetide)에 의해 우수 의약품 제조 기준(Good Manufacturing Practice, GMP) 하에 펩티드가 합성되었고, 분말로 동결건조되었다. 네로페 분말을 10 mg/ml 또는 20 mg/ml 네로페 용액이 수득되도록 디메틸 술폭시드 (DMSO)에 용해시킨 후, 최종 세포 현탁액 내의 총 2％ DMSO의 농도를 초과하지 않으면서, 원하는 검정법 농도의 2배가 수득되도록 배지로 추가로 희석하였다. 실험에서 사용된 최종 네로페 농도는 1, 10, 25 및 50 ㎍/ml였다. 유사한 양의 DMSO를 네로페의 존재 하에 인큐베이션되지 않은 대조군 세포에 첨가하였다.

브로모데옥시우리딘 ( BrdU ) 혼입 검정법

상기 기술된 바와 같이 인간 선암종 췌장암 세포 및 인간 유방암 세포를 플라스크에서 70-80％ 밀도에 도달할 때까지 성장시키고 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크로부터 탈착시켰다 (세포 배양을 위한 상기 프로토콜을 10 ml 배지를 트립신-처리 세포에 첨가하는 단계까지 사용하였다). 그 후, 배지 및 트립신에 현탁된 세포를 50 ml 코니칼 튜브로 옮기고, 300g에서 원심분리하였다 (10분, 4℃). 그 후, 상청액을 폐기하고, 세포 펠릿을 신선한 배지 (상기 기술된 바와 같이 제조된 2 ml 배지)에 재현탁시켰다.

그 후, 세포를 유체화하고, 세포가 총 부피 5 ml의 배지에 재현탁되도록 추가적인 3 ml 배지를 세포 현탁액에 첨가하였다. 그 후, 세포를 계수하고, 20,000개의 세포/배지 ml의 농도로 희석하였다. 다음으로, 각각의 웰이 2000개의 세포를 함유하도록 웰 당 100 ㎕ 세포 현탁액을 배치함으로써, 세포를 96웰 플레이트 (눈크 카탈로그 번호 167008) 내에 배치하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 철야로 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

농축된 네로페 펩티드를 총 부피 100 ㎕의 배지에 현탁시키고, 96웰 플레이트 내의 검정된 세포에 1, 10, 25 및 50 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 대조군 (배경) 검정법은 펩티드의 부재 하에 수행하였고, 즉 100 ㎕ 배지를 대조군 세포에 첨가하였다.

24 또는 48시간 동안 37℃에서 네로페 펩티드의 존재 하에 세포를 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 수확하기 24시간 전에, 웰 당 20 ㎕의 브로모데옥시우리딘 (BrdU) 시약 (밀리포어(Millipore) 카탈로그 번호 2752, 배지에 1:500 희석됨)을 웰에 첨가하였다. 즉, 펩티드와의 인큐베이션 시 즉각적으로, 또는 세포가 48시간 동안 인큐베이션된 실험에서는 최초의 24시간의 인큐베이션 후에, BrdU를 첨가하였다. BrdU 키트 (셀 시그널링 엘티디(Cell Signaling Ltd))를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였다.

조직 유형 플라스미노겐 활성화제 (TPA) 인간 ELISA 검정법

상기 기술된 바와 같이 인간 선암종 췌장암 세포를 플라스크에서 70-80％ 밀도에 도달할 때까지 성장시키고 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크로부터 탈착시켰다. 그 후, 배지 및 트립신에 현탁된 세포를 원심분리하고, 2 ml의 신선한 배지에 재현탁시켰다 (상기 BrdU 혼입 검정법에 대해 기술된 바와 같음).

그 후, 세포를 유체화하고, 세포가 총 부피 5 ml의 배지에 재현탁되도록 3 ml 배지를 세포 현탁액에 첨가하였다. 세포를 계수하고, 50,000개의 세포/배지 ml의 농도로 희석하였다. 다음으로, 각각의 웰이 100,000개의 세포를 함유하도록 웰 당 2 ml 세포 배양물을 배치함으로서, 세포를 6웰 플레이트 (눈크 카탈로그 번호 140675)의 각각의 웰 내에 배치하였다. 다음으로, 세포를 37℃에서 철야로 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

상청액을 폐기하고, 2.5％ FBS를 함유하는 1 ml RPMI 배지로 교체하였다. 그 후, 세포를 1, 10, 25 및 50 ㎍/ml의 최종 농도의 네로페 펩티드의 존재 하에 37℃에서 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포의 원심분리 (300g에서 5분, 4℃)에 의해 상청액을 수집하고, -20℃에서 보관하였다.

다음으로, TPA ELISA 검정법을 하기와 같이 수행하였다: 상청액을 해동시키고, 얼음 상에서 유지시킨 후, 키트와 함께 제공된 TPA 희석제 (x1N, 애비캠(Abcam) 카탈로그 번호 ab108914)로 1:15 희석하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 절차를 계속하였고, 450/590의 광학 밀도 (O.D.)에서 ELISA 플레이트를 판독하였다.

가용성 ST2 ( sST2 ) ELISA 검정법

상기 기술된 바와 같이 인간 선암종 췌장암 세포 및 인간 유방암 세포 (MDA-MB-231)를 플라스크에서 70-80％ 밀도에 도달할 때까지 성장시키고 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크로부터 탈착시켰다. 그 후, 배지 및 트립신에 현탁된 세포를 원심분리하고, 2 ml의 신선한 배지에 재현탁시켰다 (상기 BrdU 혼입 검정법에 대해 기술된 바와 같음).

그 후, 세포를 유체화하고, 세포가 총 부피 5 ml의 배지에 재현탁되도록 3 ml 배지를 세포 현탁액에 첨가하였다. 그 후, 세포를 계수하고, 50,000개의 세포/배지 ml의 농도로 희석하였다. 각각의 웰이 100,000개의 세포를 함유하도록 플레이트 당 2 ml의 세포를 6웰 플레이트의 각각의 웰 내에 배치하였다. 세포를 37℃에서 철야로 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

상청액을 폐기하고, 2.5％ FBS를 함유하는 1 ml RPMI 배지로 교체하였다. 그 후, 세포를 1, 10, 25 및 50 ㎍/ml의 최종 농도의 네로페 펩티드의 존재 하에 37℃에서 24 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 세포의 원심분리 (5분, 300g, 4℃)에 의해 상청액을 수집하고, -20℃에서 보관하였다.

다음으로, sST2 ELISA 검정법을 하기와 같이 수행하였다: 먼저, 10,000 pg/ml에서 156 pg/ml까지의 PBS (바이올로지컬 인더스트리즈, 02-023-5A) 내의 sST2 펩티드 (젠메드(Genmed), 프로젝트 ID 35622 B-형태, 서열: HTVRLSRKNPSKECF)의 단계 희석물에 의해 sST2 펩티드에 대해 검정 곡선을 제조하였다. 그 후, 상청액 샘플을 해동시키고, 얼음 상에서 유지시켰다 (농축된 샘플을 PBS에서 희석하였다). 각각의 샘플 및 표준물의 100 ㎕ 사본들을 맥시소프(Maxisorp) 96웰 플레이트 (눈크, F96 맥시소프, 442404)에 로딩함으로써 샘플을 로딩하였다. 로딩된 플레이트를 부드럽게 궤도형으로 진탕시키면서 4℃에서 철야로 인큐베이션하였다.

그 후, 액체를 제거하고 멀티-피펫 또는 자동 세정기를 사용하여 PBS 내의 0.05％ TW-20 (암레스코(Amresco), 0777-1L) 300 ㎕로 플레이트를 3회 세정함으로써, 샘플을 세정하였다. 5％ BSA (MP 바이오메디컬스(MP biomedicals, 160069))를 PBS에 희석하고 각각의 웰에 300 ㎕의 차단 완충제를 로딩함으로써, 샘플을 차단하였다. 차단 단계는 실온 (RT)에서 진탕 (350 RPM)하면서 1시간 동안 인큐베이션하는 기간을 포함하였다. 다음으로, 샘플을 상기 기술된 바와 같이 세정하였다.

희석제 (PBS 내의 0.05％ TW-20, 0.1％ BSA) 내의 1:100 희석된 항-sST2 친화력 정제 항체 (젠메드, 프로젝트 ID 35622 B-형태)에 의해 sST2의 검출을 수행하였고, 이때 100 ㎕의 검출 항체를 각각의 웰에 로딩하였다. 그 후, 샘플을 1.5 시간 동안 R.T.에서 진탕 (350 RPM)하면서 인큐베이션하고, 상기 기술된 바와 같이 세정하였다. 그 후, 희석 (희석제 내의 1:500)된 염소 항-토끼 HRP 컨쥬게이트 항체 (셀 시그널링, 7074)를 각각의 웰에 로딩하고 (100 ㎕), 샘플을 30분 동안 R.T.에서 진탕하면서 추가로 인큐베이션하였다. 그 후, 샘플을 상기 기술된 바와 같이 세정하고, 100 ㎕ 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB, 밀리포어(Milipore), ES001-500ML)을 각각의 웰에 첨가하고, 청색이 발색되기를 기다리고, 최종적으로 100 ㎕ 2N H₂SO₄ (프루타롬(Frutarom), 5552540)를 첨가함으로써 발색시켰다. 450/590 nm의 0.D.에서 마이크로플레이트 판독기에서 플레이트 흡광도를 판독하였다.

인간 암 세포의 세포 이동 검정법

상기 기술된 바와 같이 인간 선암종 췌장암 세포를 플라스크에서 70-80％ 밀도에 도달할 때까지 성장시키고 트립신 EDTA를 사용하여 플라스크로부터 탈착시켰다. 그 후, 배지 및 트립신에 현탁된 세포를 10분 동안 300g에서 원심분리하고 (4℃), 2 ml의 신선한 배지에 재현탁시켰다 (상기 BrdU 혼입 검정법에 대해 기술된 바와 같음).

그 후, 세포를 유체화하고, 세포가 5 ml 부피의 배지에 재현탁되도록 3 ml 배지를 세포 현탁액에 첨가하고, 이어서 계수하고, 150,000개 또는 300,000개의 세포/배지 ml의 농도로 희석하였다.

별법적으로, 50 ml FBS (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 04-121-1A), 5 ml 헤페스(Hepes) 1 M (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 03-025-1C), 0.5 ml 암포테리신(Amphotericin) B 2500 ㎍/ml (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 03-029-1) 및 5 ml 젠타마이신 술페이트 50 mg/ml (바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 03-035-1)가 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, 바이올로지컬 인더스트리즈 카탈로그 번호 01-055-1A)를 세포 배양 및 재현탁에 사용하였고, 세포를 100,000개의 세포/배지 ml의 최종 농도로 재현탁시켰다.

래디어스(Radius) 96-웰 세포 이동 검정법 플레이트 (셀 바이오랩스 인크(Cell Biolabs Inc.) 카탈로그 번호 CBA-126)를 제조사의 프로토콜에 따라 제조하고, 각각의 웰이 10,000, 15,000 또는 30,000개의 세포를 함유하도록 각각의 웰에 100 ㎕ 세포를 로딩하였다. 세포를 인큐베이터에서 철야로 인큐베이션하였다 (37℃). 다음으로, 상청액을 폐기하고, 2.5％ FBS를 함유하는 RPMI 100 ㎕로 교체하였다. 그 후, 각각의 웰이 200 ㎕의 총 부피를 함유하도록, 세포를 총 부피 100 ㎕의 배지에 (1 및 10 ㎍/ml의 최종 농도로) 현탁된 네로페 펩티드로 처리하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

별법적으로, 상청액을 폐기하고, 2.5％ FBS를 함유하는 DMEM 200 ㎕로 교체하고, 필요한 처리, 즉 대조군 (네로페 없음), 10, 25 또는 50 ㎍/ml 네로페를 수행하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 48시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션하였다.

세포가 70-80％ 밀도에 도달했을 때, 제조사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 세포의 부착에 영향을 미치지 않으면서, 상청액을 폐기하고 웰의 중심부로부터 겔을 제거하였다. 그 후, 0 시점 (즉, 겔이 제거된 직후)에, 그리고 그 후 2시간 마다 도립 공초점 현미경 (×40 배율)을 사용하여 세포가 없는 면적의 사진을 찍었다. 제조사의 프로토콜에 따라 세포를 염색함으로써 검정법을 종결하였다.

포토샵 소프트웨어를 사용하여, 세포가 없는 면적을, 해당 빈 영역 내로 세포가 전진하는 속도를 결정하기 위하여 매 시점에 계산하였다. 모든 실험을 이중으로 수행하였다.

실시예 1 인간 췌장암 세포 내의 조직 유형 플라스미노겐 활성화제 (TPA)의 수준에 대한 네로페 펩티드의 효과

췌장암 세포에서의 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA)의 과발현이 시험관 내에서의 침습 및 증식 및 생체 내에서의 종양 성장 및 혈관신생을 촉진한다는 것이 보고되었다 (7).

시험관 내에서의 췌장암 세포에 의한 TPA 분비에 대한 Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys (서열 4에 의해 표기된 바와 같음)의 모두 D형인 아미노산 서열을 갖는 네로페 펩티드의 효과를 시험하였다. 도 1 (하부의 막대 그래프)는 상기 기술된 바와 같이 24시간 동안 1-50 ㎍/ml의 네로페 펩티드의 존재 하에 인큐베이션된 후 ELISA 검정법에 의해 TPA 수준에 대해 평가된 인간 선암종 췌장암 세포를 나타낸다.

도 1 (하부의 막대 그래프)에서 실연된 바와 같이, 네로페 펩티드의 존재 하에, 이러한 펩티드와 함께 인큐베이션되지 않은 대조군 세포와 비교하여 테스트된 세포 (본원에서 "세포주 1", "세포주 2" 및 "세포주 3"로 또한 명명됨)에서 더 낮은 수준의 TPA 분비가 검출되었다.

상기 지시된 바와 같이, 췌장암 세포에서의 TPA의 과발현은 세포 침습을 촉진한다. 결과적으로, TPA 수준의 감소는 암 세포의 침습 또는 전이능에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 이러한 펩티드의 존재 하에 TPA 수준의 감소가 실연된 것은 이러한 펩티드가 세포 운동성을 감소시키는데 효과적일 수 있다는 것을 가리킨다.

실시예 2 인간 췌장암 세포 내의 가용성 ST2의 수준에 대한 네로페 펩티드의 효과

T1/ST2 수용체 (인터루킨 1 수용체-유사 1로 또한 지칭됨)는 Toll-유사 수용체 수퍼패밀리의 구성원이다. 가용성 및 막-결합형 T1/ST2 수용체 양쪽 모두가 생체 내에서 조혈 조직에서 우세하게 발현된다 (8). 가용성 형태의 ST2 (sST2)의 녹다운(knockdown)이 다양한 세포주에서 ErbB2-유도 세포 운동성을 감소시켰다는 것이 최근에 보고되었다 (9).

도 2 (하부의 막대 그래프)에서 실연된 바와 같이, 1-50 ㎍/ml의 네로페 펩티드의 존재 하에, 펩티드와 함께 인큐베이션되지 않은 세포에서의 sST2의 수준과 비교하여 모든 테스트된 세포 (인간 선암종 췌장암 세포)에서 더 낮은 수준의 sST2가 검출되었다. 네로페 펩티드의 관찰된 효과는 용량-의존적이었다. sST2는 세포 운동성과 연관되기 때문에, 이러한 펩티드의 존재 하에 sST2 수준의 감소가 실연된 것은 이러한 펩티드가 세포 운동성 또는 침습을 감소시키는데 효과적일 수 있다는 것을 가리킨다.

유사한 검정법 조건 하에서 네로페 펩티드의 존재 하에 sST2 수준에서의 약 80％의 감소가 인간 유방암 세포 (MDA-MB-231)에서 또한 실연되었다 (데이터는 제시되지 않음).

실시예 3 인간 선암종 췌장암 세포 증식에 대한 네로페 펩티드의 효과

서열 2에 의해 표기되는 아미노산 서열을 갖는, 흉선 펩티드의 C-말단의 아미노산 잔기 51개로 이루어진 펩티드 (상기 표 1에서 지시된 바와 같이 "T101 펩티드"로 명명됨)는 기존에 본 발명가들에 의해 성체 Balb/C 마우스 모델에서 종양 크기를 유의하게 감소시키는 것으로 실연되었다 (3).

또한, 모두 D형인 아미노산 잔기로서의 T101 펩티드의 C-말단의 아미노산 잔기 14개 (서열 4에 의해 표기됨)로 이루어진, T101 펩티드의 변형된 펩티드 단편인 네로페 펩티드가 조혈 기원의 다양한 암 세포에서 세포 증식을 억제하는 것으로 기존에 나타났다. " 세포 증식에 대한 억제 효과 "는 펩티드의 부재 하에 수행된 대조군 검정법과 비교하여 펩티드의 존재 하에서의 세포 증식의 적어도 40％의 억제로서 본원에서 정의된다.

놀랍게도, 이제 본 발명가들은, 도 1 및 도 2의 상부 패널에서 나타난 바와 같이, 네로페 펩티드가 인간 선암종 췌장암 세포 증식에 대해 미미할 뿐인 효과가 있는 것으로 발견되었다는 것을 나타낸다.

상기 기술된 바와 같이, DNA를 합성하는 세포의 양을 평가하기 위하여, 브로모데옥시우리딘 (BrdU) 혼입 검정법을 사용하여 인간 선암종 췌장암 세포의 증식을 평가하였다. 도 1 및 도 2 (상부의 선)에서 나타난 바와 같이, 펩티드의 부재 하에 수행된 대조군 검정법과 비교했을 때, 1, 10, 25 및 50 ㎍/ml의 네로페 펩티드의 존재 하에 인큐베이션된 인간 췌장암 세포에서 이의 BrdU 혼입 능력에서의 중간 정도인 감소 (26％ 이하의 억제)가 실연되었다. 또한, 네로페 펩티드의 농도와 억제 정도 사이에 상관 관계가 발견되지 않았다.

실시예 4 인간 선암종 췌장암 세포에서의 세포 이동에 대한 네로페 펩티드의 효과

래디어스 세포 이동 검정법을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 세포 이동에 대한 네로페 펩티드의 효과를 직접적으로 검정하였다. 간략하게, 세포를 래디어스 96-웰 플레이트 (셀 바이오랩스 인크, 카탈로그 번호 CBA-126)의 웰에 시딩(seeding)하였고, 세포가 생체적합성 히드로겔 스팟이 놓인 웰의 중심부를 제외한 모든 곳에 부착되었다. 세포가 단층을 형성하였으면, 제거가능한 용액으로 겔을 부드럽게 용해시킴으로서 검정법을 시작하였고, 이때 갭이 남고, 이를 가로질러 세포 이동이 발생할 수 있다.

하기 표 2에서 실연된 바와 같이, 세포를 8시간 동안 (10 ㎍/ml의 최종 농도로) 네로페 펩티드의 존재 하에 인큐베이션하였을 때, 웰의 중심부로의 세포의 이동이 대조군 세포 (펩티드와 함께 인큐베이션되지 않음)와 비교하여 세포주 1의 경우는 30％만큼, 세포주 2의 경우는 82％만큼 감소되었다. 세포주 "1" 및 세포주 "2"는 양쪽 모두 선암종 췌장암 세포이다.

이러한 결과들은 암 세포의 이동 잠재력에 대한 네로페 펩티드의 효과에 대한 직접적인 증거이다.

<표 2>

상이한 검정법 조건 하에, 즉 0, 10, 25 및 50 ㎍/ml 네로페 펩티드의 존재 하에 검정법을 시작하기 전의 48시간의 인큐베이션 기간을 세포에 적용함으로써, 인간 선암종 췌장암 세포의 이동 능력에 대한 네로페 펩티드의 효과를 추가로 검정하였다.

인간 선암종 췌장암 세포를 25 ㎍/ml 네로페 펩티드의 존재 하에 인큐베이션함으로써 수행된 검정법의 결과가 도 3에서 제시된다. 이동 검정법을 시작하고 나서 27시간 후에 수득된 도 3c를 이동 검정법을 시작하고 나서 1시간 후에 수득된 도 3a에 비교하는 것으로부터 명백한 바와 같이, 네로페 펩티드로 처리되지 않은 대조군 암 세포는 플레이트의 중심부로 이동하였다.

대조적으로, 도 3d를 도 3b에 비교하는 것으로부터 실연된 바와 같이, 네로페 펩티드의 존재 하에 인큐베이션된 세포의 이동이 실질적으로 억제되었다.

이러한 억제 효과가 도 4에서 그래프에 의해 또한 제시되고, 이는 이동 검정법을 시작하기 전에 48시간 동안 25 ㎍/ml 네로페 펩티드 (T1 및 T2)의 존재 하에 인큐베이션된 인간 선암종 췌장암 세포로 수행된 2회의 독립적인 이동 검정법에서 수득된 결과, 및 대조군 세포 (CON1, CON2, CON3 및 CON4)로 수행된 4회의 독립적인 검정법에서 수득된 결과를 나타낸다.

도 4에서 그래프로 나타난 바와 같이, 이전에 네로페 펩티드에 노출된 세포로 수행된 세포 이동 검정법에서의 무세포 면적이 이동 검정법 동안 실질적으로 유지되고, 이는 이러한 세포의 이동이 크게 억제된다는 것을 시사한다.

네로페 펩티드의 존재 하에 TPA 및 sST2의 분비 수준에서의 감소가 관찰된 것은, 암 세포 이동에 대한 네로페의 직접적인 억제 효과와 함께, 암 전이의 억제에서의 이러한 펩티드에 대한 특정한 치료적 잠재력을 시사한다.

이론에 의해 한정되기를 원치 않으면서, 네로페 펩티드의 이러한 관찰된 효과들은 세포 증식 기구와 필수적으로 연관되지는 않는데, 도 1 및 도 2에서 예시된 바와 같이 네로페가 세포 증식에 대한 미미할 뿐인 억제 효과가 있는 것으로 나타났기 때문이다.

실시예 5 암 환자에서의 혈관 내피 성장 인자의 혈청 수준에 대한 네로페 펩티드의 효과

혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 혈관형성 및 혈관신생을 자극하는 세포에 의해 생산되는 신호 단백질이다. 상기 지시된 바와 같이, VEGF를 발현할 수 있는 암은 성장 및 전이가 가능하다.

따라서, VEGF의 혈청 수준을 추적하는 임상 연구를 네로페 펩티드가 투여된 암 환자에서 수행하였다. 표 3에서 요약된 바와 같이, 연구에 참여하는 환자는 다양한 암 유형, 즉 결장, 결장직장, 방추 세포 신생물, 췌장, 소장, 비-소세포 폐 암종, 간 암종, 결장 선암종 및 직장 선암종으로 진단되었다.

환자는 코호트 1, 코호트 2, 코호트 3 및 코호트 4 중 하나 이상에 포함되었고, 지시된 시점에 각각 6, 12, 24 또는 24 mg/㎡ (약 0.16, 0.32, 0.64 또는 1.28 mg/체중 kg)의 네로페 펩티드가 환자에게 제공되었다.

인간 VEFG에 대한 ELISA 키트 (R&D 시스템즈(R&D systems))를 사용하여 이러한 환자로부터 수득된 혈액 샘플에서 VEGF의 혈청 수준을 측정하였고, 결과가 도 5 (코호트 1 및 코호트 2의 환자) 및 도 6 (코호트 3 및 코호트 4의 환자)에서 제시된다.

도 5에서 실연된 바와 같이, 코호트 1 및 코호트 2에서, 참여한 암 환자에 대해 VEGF의 혈청 수준이 증가하였다. 그러나, 도 6에서 실연된 바와 같이, VEGF의 혈청 수준이 코호트 3 및 코호트 4의 환자의 혈청에서 30-40％만큼 감소하였고, 이는 암 환자에서의 네로페의 명백한 항-혈관신생 효과를 실연한다.

이러한 관찰된 효과는 소장 및 직장 선암종 암에 걸린 암 환자, 즉 각각 환자 13 및 19에 대해 특히 유의하였다.

<표 3>

전이 및 종양 세포 이동이 혈관을 통해 발생하기 때문에, VEGF 수준의 감소 시, 혈관이 덜 투과성이고, 전이가 억제될 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Immune System Key Ltd. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF METASTATIC CANCER <130> 2318215 <150> US 61/912,156 <151> 2013-12-05 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 84 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Ala Leu Arg Ser Gln Gly Leu Met Leu Pro Gln Ser Cys Pro 1 5 10 15 Gln Leu Ala Phe Leu Thr Leu Ser Ala Leu Ala Ala Val Ser Phe Ser 20 25 30 Ala Leu His Leu Trp Leu Ser Gly Glu Pro Val Gln Ser Ser Gly Thr 35 40 45 Lys Asp Met Arg Ser Lys Ser Asp Ser Lys Arg Val Ser Asp Lys Gln 50 55 60 Leu Ile Ser Lys Ala Val Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu 65 70 75 80 Trp Glu Arg Lys <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> isolated synthetic peptide (fragment of T 101 peptide) <400> 2 Leu His Leu Trp Leu Ser Gly Glu Pro Val Gln Ser Ser Gly Thr Lys 1 5 10 15 Asp Met Arg Ser Lys Ser Asp Ser Lys Arg Val Ser Asp Lys Gln Leu 20 25 30 Ile Ser Lys Ala Val Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp 35 40 45 Glu Arg Lys 50 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> isolated artificial peptide (C-terminal fragment of T101 peptide) <400> 3 Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide "Nerofe" <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is equal to D-Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is equal to D-Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa is equal to D-Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa is equal to D-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa is equal to D-Phe <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa is equal to D-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is equal to D-Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa is equal to D-Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa is equal to D-Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Xaa is equal to D-Leu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa is equal to D-Trp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa is equal to D-Glu <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa is equal to D-Arg <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Xaa is equal to D-Lys <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10

Claims (34)

1. 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 펩티드를 포함하는 제약 조성물로서, 상기 암이 전이성 암인, 제약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 전이성 암이 췌장암, 결장암, 결장직장암, 결장 선암종, 직장 선암종, 유방암, 피부암, 폐암, 비-소세포 폐 암종, 신장암, 다발성 골수종, 갑상선암, 전립선암, 선암종, 두경부암, 위장암, 위암, 소장암, 방추 세포 신생물, 간 암종, 간암 및 여성 생식관의 악성 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법이 하나 이상의 추가적인 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가적인 항암 요법이 항-혈관신생 작용제, 세포독성제, 화학요법제, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 면역요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제약 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 경피, 국소, 관절내, 결막하, 경구, 비강내 및 안내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 제약 조성물.
6. 암 환자에서 암 세포 운동성을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 펩티드를 포함하는 제약 조성물.
7. 암 환자에서 혈관신생을 예방 또는 억제하는 방법에서 사용하기 위한, 서열 4의 아미노산 서열로 이루어진 단리된 펩티드를 포함하는 제약 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 경피, 국소, 관절내, 결막하, 경구, 비강내 및 안내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서, 상기 방법이 하나 이상의 추가적인 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 제약 조성물.
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