UA123392C2 - Пептид, здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (mhc) людини i класу, та його застосування для лікування раку - Google Patents

Abstract

Винахід стосується пептиду, який здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (MHC) людини I класу. Також винахід стосується нуклеїнової кислоти, рекомбінантної клітини-хазяїна, способу отримання пептиду, активованої Т-клітини, застосування пептиду у виробництві лікарського засобу для лікування раку, терапевтичного комплекту та фармацевтичної композиції.

Description

застосування пептиду у виробництві лікарського засобу для лікування раку, терапевтичного комплекту та фармацевтичної композиції.

Цей винахід стосується пептидів, білків, нуклеїнових кислот та клітин для їх застосування в імунотерапії. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Цей винахід також стосується епітопів пухлино-асоційованих пептидів Т-клітин, які самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованими пептидами можуть, наприклад, служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні відповіді, або стимулювати Т-клітини ех мімо і переносити їх в організм пацієнта. Пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС), або пептиди як такі можуть також бути мішенями для антитіл, розчинних Т-клітинних рецепторів та інших зв'язувальних молекул.

Цей винахід стосується декількох нових пептидних послідовностей та їх варіантів, отриманих із молекул НІГА | класу пухлинних клітин людини, які можуть застосовуватися у вакцинних композиціях з метою викликати протипухлинну імунну відповідь або являють собою мішені для розробки фармацевтично або імунологічно активних сполук і клітин.

Передумова створення винаходу

Рак підшлункової залози є одним із найбільш агресивних і летальних видів раку в усьому світі. У 2012 році він став дванадцятим за поширеністю видом раку у чоловіків із 178 000 випадками і одинадцятим за поширеністю видом раку у жінок із 160 000 випадками у масштабах всього світу. У тому ж році повідомлялося про 330 000 смертей, що вивело рак підшлункової залози на сьоме місце серед причин смерті від ракових захворювань (УУопа Сапсег Вероп, 2014).

Рак підшлункової залози не є одним видом ракового захворювання. Треба розрізнювати декілька чітко визначених підтипів. Ендокринні пухлини становлять приблизно 95 95 від усіх випадків раку підшлункової залози і включають протокові і ацинозні аденокарциноми, інтрадуктальні папілярно-муцинозні неоплазми, солідні псевдопапілярні пухлини, муцинозні кістозні аденоми і серозні цистаденоми. 5 95, що залишилися від усіх випадків раку підшлункової залози, належать до підгрупи нейроендокринних пухлин підшлункової залози (УУопа Сапсег

Вероні, 2014).

Інфільтруюча протокова аденокарцинома є найагресивнішою формою раку підшлункової залози, і завдяки її поширеності (9095 від усіх випадків раку підшлункової залози) епідеміологічні дані головним чином стосуються цього конкретного підтипу (У/опа Сапсег Вероті,

Коо) 2014).

У 2012 році 68 95 нових випадків було зареєстровано у розвинених країнах з найвищим показником захворюваності у центральній і Східній Європі, Північній Америці, Аргентині,

Уругваю і Австралії. Навпаки, у більшості країн Африки і Східної Азії спостерігаються низькі показники захворюваності. У масштабах всього світу показники захворюваності, зважаючи на все, є доволі стабільними у часі для обох статей (М/опа Сапсег Вероп, 2014).

За відсутності специфічних симптомів рак підшлункової залози звичайно діагностується на пізній стадії і часто вже на стадії метастазування. Прогноз на момент встановлення діагнозу вкрай несприятливий, з 5-річною виживаністю 55905 і співвідношенням смертності і захворюваності 0,98 (Ууопа Сапсег Неротї, 2014).

Як повідомлялося, ризик розвитку раку підшлункової залози підвищується під завдяки декільком факторам, включаючи літній вік, оскільки у більшості пацієнтів він перевищує 65 років в момент встановлення діагнозу, і расова приналежність, оскільки у США афроамериканці мають у 1,5 рази вищий ризик у порівнянні з європеоїдною популяцією. Додатковий ризик становлять паління сигарет, надмірна вага, цукровий діабет, група крові АВО, що не є І (0) групою, панкреатит і випадки раку підшлункової залози у сімейній історії (УУопа Сапсег Вероп, 2014).

До 10 95 випадків раку підшлункової залози вважаються такими, що пов'язані з сімейною історією цього захворювання. Гермінальні мутації у наступних генах асоціюються з підвищеним ризиком розвитку раку підшлункової залози: ріб/СсСОКкмМа2А, ВКСА2, РА! В2, РКБ551, ЗТК11, АТМ і генах системи корекції помилок спарювання основ у ДНК. Крім цього, спорадичні випадки раку підшлункової залози також характеризуються мутаціями у різних онкогенах і генах-супресорах пухлин. Найбільш поширені мутації у випадках протокової аденокарциноми відбуваються усередині онкогенів ККА5 (95 95) і АІВ1 (аж до 60 95) і генах-супресорах пухлин ТР5З (75 Об), ріб/СОКМагА (95 95) і ЗМАБА (55 95) (М'опа Сапсег Вероп, 2014).

Варіанти лікування пацієнтів з раком підшлункової залози дуже обмежені. Однією з головних проблем ефективності лікування є зазвичай пізня стадія розвитку пухлини під час встановлення діагнозу. Крім того, рак підшлункової залози є досить резистентним до хіміотерапевтичних препаратів, що може бути викликаним щільною і гіповаскулярною десмопластичною стромою пухлини.

Відповідно до рекомендацій, виданих Німецьким онкологічним товариством, Німецьким онкологічним фондом і Федеральною медичною асоціацією Німеччини, резекція пухлини є єдиним наявним варіантом радикального лікування. Резекція рекомендована у випадку, якщо пухлина обмежена підшлунковою залозою або якщо метастази обмежені прилеглими органами.

Резекція не рекомендована у випадку, якщо пухлина поширилася на віддалені органи. Резекція супроводжується ад'ювантною хіміотерапією гемцитабіном або 5-фторурацилом -/- лейковорин протягом шести місяців (53-І ейіпіє ЕхоКііпе5 РапКгеазКаггіпот, 2013).

Пацієнтів з неоперабельними пухлинами на пізніх стадіях можна лікувати комбінацією хіміотерапії з радіохіміотерапією (53-І ейіпіе ЕхоКгіпе5 РапКгєазКаг!гіпот, 2013).

Стандартним режимом паліативної хіміотерапії є прийом гемцитабіну, як монотерапії або в комбінації з інгібітором тирозинкіназних рецепторів епідермального фактору росту (ЕСЕ) ерлотинібом. Альтернативними варіантами є комбінація 5-фторурацилу, лейковорину, іринотекану і оксаліплатину, також відома під назвою протоколу БОЇ РІКІМОХ, або комбінація гемцитабіну з наб-паклітакселом, яка, як було показано у випробуванні МРАСТ, має кращий ефект у порівнянні з монотерапією гемцитабіном (Моп Ноїї єї аї!., 2013; 53-І ешіпіє ЕхоКгіпе5

РапКгєазКаг!гіпот, 2013).

Високе співвідношення смертності і захворюваності віддзеркалює нагальну потребу впровадження ефективніших терапевтичних стратегій в лікування раку підшлункової залози.

Засоби таргетної терапії, які виявилися ефективними у лікуванні ряду інших ракових захворювань, являють собою багатообіцяючий варіант. У зв'язку з цим було проведено декілька досліджень з метою оцінки користь від застосування засобів таргетної терапії для лікування поширеного раку підшлункової залози, на жаль, із дуже обмеженим успіхом (УМаїКег апа Ко, 2014). Тим не менш, генетична різноманітність захворювання на рак підшлункової залози може надати можливість застосування персоналізованої терапії: як було показано у випадку інвазивної протокової аденокарциноми з біалельною інактивацією ВКСА2 або РАЇ В2, вона більш чутлива до лікування інгібіторами полі(АДФ-рибозо)полімерази і мітоміцином Си (УУопа

Сапсег Нерон, 2014).

Націлювання на строму пухлини становить альтернативний підхід до розробки нових лікарських засобів для раку підшлункової залози. Зазвичай щільна і гіповаскулярна строма

Зо може відігравати роль бар'єра для хіміотерапевтичних засобів. Було показано, що вона доставляє сигнали, які сприяють проліферації і інвазії пухлини і підтримці ракових стовбурових клітин. Таким чином, різні доклінічні і клінічні випробування мали на меті проаналізувати ефект виснаження і інактивації функцій клітин строми (РискКі апа 2пепо, 2014).

Вакцинаційні стратегії досліджувалися як додаткова інноваційна і багатообіцяюча альтернатива при лікуванні раку підшлункової залози. Вакцини на основі пептидів, націлені на мутації гену ККА5, активна теломераза, гастрин, сурвівін, СЕА і МОС1, уже пройшли оцінку в клінічних випробуваннях, були отримані деякі багатообіцяючі результати. Більш того, клінічні випробування вакцин на основі дендритних клітин, алогенних вакцин на основі клітин, що секретують ГМ-КОСФ, і альгенпантуселю-їЇ, за участю пацієнтів із раком підшлункової залози, також виявили користь від імунотерапії У додаткових клінічних випробуваннях зараз проводиться подальше дослідження ефективності протоколів введення різних вакцин (ЗаІтап еїа!., 2013).

Зважаючи на важкі побічні ефекти і витрати, пов'язані з лікуванням раку, існує потреба ідентифікувати фактори, які можливо буде використовувати для лікування раку взагалі і раку підшлункової залози зокрема. Є також потреба в ідентифікації інших чинників, які виконують роль біомаркерів раку взагалі і раку підшлункової залози зокрема, які забезпечать кращу діагностику раку, оцінку прогнозу і передбачення успіху лікування.

Імунотерапія раку являє собою варіант специфічного націлювання на ракові клітини, у той же час зводячи до мінімуму побічні ефекти. У імунотерапії раку використовується існування пухлино-асоційованих антигенів.

Сучасна класифікація пухлино-асоційованих антигенів (ТАА) охоплює наступні головні групи: а) Раково-тестикулярні антигени: Перші будь-коли ідентифіковані ТАА, які можуть бути розпізнані Т-клітинами, належать до цього класу, які були спочатку названі раково- тестикулярними (СТ) антигенами завдяки експресії його представників у гістологічно різних пухлинах людини і, поряд із нормальними тканинами, тільки в сперматоцитах/сперматогоніальних клітинах яєчок і іноді в плаценті. Оскільки клітини яєчок не експресують молекули НГА І та ІЇ класу, ці антигени не можуть розпізнаватися Т-клітинами у нормальних тканинах і можуть, таким чином, вважатися пухлинно-специфічними, з точки зору імунології. Добре відомими прикладами СТ антигенів є члени сімейства МАСЕ і МУ-ЕБО-1.

б) Антигени диференціації: Ці ТАА розподілені між пухлинами та нормальними тканинами, з яких виникла пухлина. Більшість з відомих антигенів диференціації знайдена в меланомах і нормальних меланоцитах. Багато цих білків, пов'язаних із диференціацією у меланоцити, беруть участь у біосинтезі меланіну і тому не є пухлино-специфічними, але, тим не менше, широко застосовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, без обмеження, тирозиназу і Меіап-А/МАВТ-1 для меланоми або ПСА для раку передміхурової залози. в) Надмірно експресовані ТАА: Гени, що кодують ТАА, які широко експресуються, були виявлені в гістологічно різних типах пухлин, а також у багатьох нормальних тканинах, загалом з нижчими рівнями експресії. Можливо, що багато епітопів, що були процесовані і, можливо, презентовані нормальними тканинами, присутні у кількості, що нижча за пороговий рівень розпізнання Т-клітинами, в той час як їх надекспресія в пухлинних клітинах може запустити антиракову реакцію, порушивши раніш встановлену толерантність. Відомими прикладами для цього класу ТАА є Нег-2/пеи, сурвівін, теломераза або М/11. г) Пухлино-специфічні антигени: Ці унікальні ТАА утворюються в результаті мутацій нормальних генів (таких як бета-катенін, СОК4 тощо). Деякі з цих молекулярних змін зв'язані з неопластичною трансформацією і (або) прогресуванням пухлини. Пухлино-специфічні антигени загалом можуть викликати сильні імунні відповіді, не спричиняючи ризику аутоїмунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці ТАА у більшості випадків мають відношення тільки до певної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не є спільними для багатьох окремих пухлин. Специфічність пептиду до пухлини (або асоціація з пухлиною) може також виникати, якщо пептид походить із екзону пухлини (пухлино-асоційованого екзону) у випадку білків з пухлиноспецифічними (-асоційованими) ізоформами. д) ТАА, що виникають в результаті посттрансляційних модифікацій: Такі ТАА можуть виникати з білків, які не є ні специфічними, ні надмірно експресованими у пухлинах, але, незважаючи на це, стають асоційованими з пухлинами в результаті посттрансляційних процесів, первинно активних у пухлинах. Прикладами ТАА цього класу є антигени, що виникають в результаті змін характеру гликозилювання, що приводить до утворення у пухлинах нових епітопів, таких як МОСТІ, або таких подій як білковий сплайсинг під час деградації, які можуть бути пухлино-специфічними, а можуть і не бути.

Зо е) Онковірусні білки: Ці ТАА є вірусними білками, які можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі і, оскільки вони є чужорідними (не походять від людини), вони можуть викликати відповідь Т-клітин. Прикладами таких білків є білки вірусу папіломи людини типу 16,

Еб і Е7, які експресуються клітинами карциноми шийки матки.

Мішенями імунотерапії з використанням Т-клітин є пептидні епітопи, отримані з пухлино- асоційованих або пухлино-специфічних білків, які презентуються молекулами головного комплексу гістосумісності (МНС). Антигенами, які розпізнаються пухлино-специфічними Т- лімфоцитами, тобто їхніми епітопами, можуть бути молекули, що отримані з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, фактори транскрипції тощо, які експресуються і, у порівнянні з незміненими клітинами того ж походження, активність яких підвищена у клітинах відповідної пухлини.

Існує два класи молекул МНС, МНС | класу і МНС І класу. Молекули МНС І! класу складаються з альфа-важких ланцюгів і бета-2-мікроглобуліну, молекули МНС | класу складаються з альфа- і бета-ланцюгів. Їхня тримірна конформація приводить до утворення зв'язувальної щілини, що використовується для нековалентної взаємодії з пептидами.

Молекули МНС І класу можна виявити в більшості клітин, що мають ядро. Вони презентують пептиди, які утворюються в результаті розщеплення протеолітичними ферментами переважно ендогенних білків, дефектних рибосомальних продуктів (ОКІР) та більш великих пептидів.

Однак пептиди, одержані з ендосомальних компартментів чи екзогенних джерел, також часто зустрічаються на молекулах МНС | класу. Цей некласичний спосіб презентації | класом називається у науковій літературі крос-презентацієй (Вго5зап апа Вемап, 1997; ВоскК еї аї., 1990). Молекули МНС Ії класу містяться головним чином на професійних антигенпрезентуючих клітинах (АПК) і презентують головним чином пептиди екзогенних або трансмембранних білків, які поглинаються АПК в ході ендоцитозу і згодом процесуються.

Комплекси пептидів і молекул МНС І класу розпізнаються СО8-позитивними Т-клітинами, що несуть відповідний Т-клітинний рецептор (ТКР), в той час як комплекси пептиду і молекул МНС

МП класу розпізнаються СО4-позитивними Т-хелперами, що несуть відповідний ТКР.

Загальновідомо, що ТКР, пептид і МНС, таким чином, є присутніми у стехіометричних кількостях у співвідношенні 1:1:1.

Сора-позитивні Т-хелпери відіграють важливу роль, викликаючи та підтримуючи ефективну 60 відповідь СЮО8-позитивних цитотоксичних Т-клітин. Ідентифікація епітопів СО4-позитивних Т-

клітин, отриманих із пухлино-асоційованих антигенів (ТАА), може мати велике значення під час розробки фармацевтичних засобів для ініціювання протипухлинних імунних реакцій (Спіайіс еї а. 2003). У місці локалізації пухлини Т-хелперні клітини підтримують сприятливе для цитотоксичних Т-клітин (ЦТЛ) цитокінове середовище (Мопага єї аї., 2006) і притягують ефекторні клітини, такі як ЦТЛ, природні кілерні (МК) клітини, макрофаги і гранулоцити (Нжапд еїа!., 2007).

За відсутності запалення експресія молекул МНС Ії класу обмежується головним чином клітинами імунної системи, особливо професійними антиген-презентуючими клітинами (АПК), наприклад, моноцитами, клітинами, що походять з моноцитів, макрофагами, дендритними клітинами. Було виявлено, що клітини пухлин у хворих на рак пацієнтів експресують молекули

МНЄе Ії класу (Оеєпадіеї! єї а!., 2006).

Подовжені (довші) пептиди за винаходом можуть діяти як епітопи, активні по відношенню до молекул МНС ІІ класу.

Т-хелперні клітини, активовані зв'язаними з молекулами МНС ІІ класу епітопами, відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції ЦТЛ у протипухлинному імунітеті. Епітопи Т- хелперних клітин, які ініціюють реакцію Т-хелперів типу ТНІ, підтримують ефекторні функції

СОв-позитивних Т-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлини, що презентують комплекси пухлино-асоційованого пептиду/мНсС на поверхнях своїх клітин. У такий спосіб епітопи пухлино-асоційованих пептидів Т-хелперів самостійно або в комбінації з іншими пухлино-асоційованих пептидами можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції.

На моделях тварин-ссавців, наприклад, на мишах, було показано, що навіть за відсутності

СОрв8-позитивних Т-лімфоцитів, присутності СЮО4-позитивних Т-клітин виявляється достатньо для послаблення клінічних проявів пухлин шляхом інгібування ангіогенезу за рахунок секреції інтерферону-гамма (ІФН-у) (Вєайну апа Раїегзоп, 2001; Митрбега еї а!., 1999). Існують докази, що

Т-клітини є ефекторними клітинами прямої протипухлинної дії (ВгайтиїПег еї а!., 2013; Тгап еї аї., 2014).

Оскільки конститутивна експресія молекул НГА ІЇ класу зазвичай обмежується клітинами імунної системи, раніше вважалося неможливим виділити пептиди ІЇ класу безпосередньо з первинних пухлин. Однак ЮОепадіеІ і співавт. вдалося ідентифікувати декілька зв'язаних з молекулами МНС ІІ класу епітопів безпосередньо із пухлин (ММО 2007/028574, ЕР 1 760 088 В1).

Оскільки обидва типи відповіді, залежні від СО8 та СО4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та визначення характеристик пухлино-асоційованих антигенів, які розпізнаються або СОвТ- клітинами (ліганд: молекули МНС | класу ї- пептидний епітоп), або СО4- позитивними Т- хелперними клітинами (ліганд: молекули МН ІІ класу т пептидний епітоп).

Щоб пептид, зв'язаний з молекулою МНС Іі класу, ініціював (викликав) клітинну імунну відповідь, він також має зв'язатися з молекулою МНС. Цей процес залежить від алеля молекули

МНС її специфічних поліморфізмів амінокислотної послідовності пептиду. Пептиди, що зв'язуються з молекулами МНС | класу, зазвичай мають 8-12 амінокислотних залишків у довжину і зазвичай містять два консервативні залишки ("якорі") у своїй послідовності, які взаємодіють з відповідною зв'язувальною щілиною молекули МНС. У такий спосіб кожний алель

МНС має "зв'язувальний мотив", що визначає, які пептиди зможуть специфічно зв'язатися зі зв'язувальною щілиною.

В імунній реакції, залежній від молекул МНС І класу, пептиди не тільки мають бути здатними зв'язатися з певними молекулами МН І класу, що експресуються клітинами пухлини, але вони також мають розпізнаватися Т-клітинами, що несуть специфічний Т-клітинний рецептор (ТКР).

Для того, щоб білки розпізнавалися Т-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлино- асоційовані антигени, та щоб їх було можливо застосовувати в терапії, необхідно створити особливі передумови. Антиген має експресуватися, головним чином, пухлинними клітинами і не експресуватися або експресуватися у порівняно невеликих кількостях нормальними здоровими тканинами. В переважному втіленні вищезгаданий пептид має надмірно презентуватися пухлинними клітинами у порівнянні з нормальними здоровими тканинами. До того ж бажано, щоб відповідний антиген не тільки був присутнім у пухлині певного типу, але також був присутнім у високих концентраціях (тобто як декілька копій відповідного пептиду на клітину).

Пухлино-специфічні та пухлино-асоційовані антигени часто отримують із білків, які беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину, завдяки їх функції, наприклад, в контролі клітинного циклу або пригніченні апоптозу. Крім цього, низхідні бо мішені білків, що також є безпосередньою причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, таким чином, можуть бути опосередковано пухлино-асоційованими. Такі опосередковано пухлино-асоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (біпдп-Уазціа єї а!., 2004). Важливим є те, щоб в амінокислотній послідовності антигену були присутні епітопи, оскільки такий пептид ("їмуногенний пептид"), отриманий із пухлино- асоційованого антигену, має приводити до відповіді Т-клітин іп міїго або іп мімо.

По суті, будь-який пептид, що здатний зв'язуватися з молекулою МНС, може відігравати роль епітопу Т-клітини. Передумовою індукції відповіді Т-клітин іп міго або іп мімо є присутність

Т-клітин із відповідним ТКР ії відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу.

Таким чином, ТАА є стартовою точкою для розробки Т-клітинної терапії, включаючи, але не обмежуючись ними, протипухлинні вакцини. Методи ідентифікації та визначення характеристик

ТАА зазвичай базуються на використанні Т-клітин, які можна виділити з організму пацієнтів або здорових суб'єктів, або вони грунтуються на генерації різних профілів транскрипції або різному характері експресії пептидів тканинами пухлин і нормальними тканинами. Проте ідентифікація генів, які надмірно експресуються пухлинними тканинами або лініями пухлинних клітин людини, або селективно експресуються в таких тканинах або клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, що кодуються цими генами, в імунній терапії. Причиною цього є те, що тільки окрема субпопуляція епітопів цих антигенів придатна для такого застосування, оскільки має бути присутня Т-клітина з відповідним ТКР, і імунологічна толерантність по відношенню до цього епітопу повинна бути відсутньою або мінімальною. Отже, у більш переважному втіленні цього винаходу важливо вибрати тільки ті надмірно або селективно презентовані пептиди, проти яких можна знайти функціонуючу Т-клітину і (або) Т-клітину, здатну до проліферації. Така функціонуюча Т-клітина визначається як Т-клітина, яка за стимуляції специфічним антигеном може бути клонована і здатна виконувати функції ефектору (Сефекторна Т-клітина").

У випадку націлювання специфічних ТКР (наприклад, розчинних ТКР) і антитіл або інших зв'язувальних молекул (каркасів) за цим винаходом імуногенність базових пептидів є вторинною. У цих випадках визначальним фактором є презентація

Коротке формулювання суті винаходу

Зо Згідно з першим аспектом цього винаходу, пропонується пептид, що містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67 або варіант його послідовності, який принаймні на 7795, переважно принаймні на 8895 гомологічний (переважно принаймні на 77 95 або принаймні на 88 95 ідентичний) послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІО МО: 67, де згаданий варіант зв'язується з МНС і (або) викликає перехресну реакцію

Т-клітин із згаданим пептидом або його фармацевтично прийнятною сіллю, де згаданий пептид не є базовим повнорозмірним поліпептидом.

Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від БЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67 або його варіант, який принаймні на 77 Об, переважно принаймні на 88 95 гомологічний (переважно принаймні на 77 95 або принаймні на 88 95 ідентичний) послідовності від 56 ІЮО МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 67, де згаданий пептид або його варіант має загальну довжину між 8 і 100, переважно між 8 і 30 і найбільш переважно між 8 і 14 амінокислот.

У нижче наведеній таблиці описані пептиди за цим винаходом, їх відповідні зЗЕО ІЮ МО і очікувані вихідні (основні) гени для пептидів. Усі пептиди у Таблиці 1 і Таблиці 2 зв'язуються з

НІ А-А"02. Пептиди Таблиці 2 були розкриті раніше у великих списках як результати високопродуктивного скринінгу з великою частотою помилок або були розраховані з використанням алгоритмів, але їхній зв'язок з раковими захворюваннями взагалі не був встановлений. Пептиди Таблиці З є додатковими пептидами, які доцільно використовувати у комбінації з іншими пептидами за винаходом. Наведені у Таблицях 4 і 4-2 пептиди також можуть використовуватися в діагностиці і (або) лікуванні різних інших злоякісних пухлин, пов'язаних з надмірною експресією або надмірною презентацією відповідного базового поліпептиду.

Таблиця 1

Пептиди за цим винаходом

Мо. 6 |МИВІКОАРІМ | 77777712 17111171 СТАС 8 ПМорстІМі | 77777717171711130377777777777777711 17111111 СОМгАТСЖШЖ 9 |РІЕРОЗАМІМ | -:Х 12937777. | / сСОї6АЗССЩ ммозараумтнтм | 100996820, 344227, 345651, 440915, | АСТВІ2, РОТЕКР, РОТЕЕ,

Шшше 5 й 71, 728378 РОТЕУ, АСТОа1, РОТЕР 60, 641455, 653269, 653781, 71, 728378 РОТЕМ, РОТЕЇ, РОТЕ)У,

АСТа1, РОТЕР

Таблиця 2 (продовження)

Мо.

У

60 |МЕЕОУМОС | 777771717171123255.. | 5 ОбАгСсС

ТОВАТА

7846, 84790 ТОВА4А, ТОВАЗС, ТОВАТА,

ТОВАТС

653269, 653781, 70, 71, 72, 728378 АСТВ, РОТЕЇ, РОТЕУ,

АСТС1, АСТОИ1, АСТО,

РОТЕР

Таблиця З

Додаткові пептиди за цим винаходом, щодо яких зв'язок з раковими захворюваннями не був встановлений 66 | АШБЗОІНЕА 77293028. | - КОМА /Г/Г(

Таблиця 4

Пептиди, які доцільно використовувати, наприклад, для персоналізованої терапії раку 68 | КШТЕМНАА | -(К 101 | АсАМВ/////:ЗГ 69 | МУМАРЕТМТІ | -(х: 338.77 | 77 АРОВ7/7//:ЖГИС

Таблиця 5 (продовження) 80 | тУРНІВОМ | -( 1462 | ///// УсСАМ//Г//: 86 | 5ШАОМІБУЮ | -( 7070... | ..ЙюЙюЙР/ тм

Цей винахід також загалом стосується пептидів за цим винаходом для застосування для лікування проліферативних захворювань, таких як, наприклад, рак легенів, рак нирки, рак головного мозку, рак товстої або прямої кишки, рак стравоходу, рак молочної залози, рак яєчника, рак шлунка, рак печінки, рак передміхурової залози, меланома і лейкоз.

Особливо переважними є пептиди - для застосування самостійно або в комбінації - за цим винаходом, вибрані з групи послідовностей від 5ЕО І МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО: 67. Особливо переважними є пептиди - для застосування самостійно або в комбінації - за цим винаходом, вибрані з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 34 (див Таблиця 1), і їх застосовування в імунотерапії раку підшлункової залози, раку легенів, раку нирки, раку головного мозку, раку товстої або прямої кишки, раку стравоходу, раку молочної залози, раку яєчника, раку шлунка, раку печінки, раку передміхурової залози, меланоми і лейкозу, і переважно раку підшлункової залози. Як наведено далі у Таблицях 4 і 4-2, багато пептидів за цим винаходом також виявлені на пухлинах інших видів і можуть, таким чином, також застосовуватися в імунотерапії за іншими показаннями. Див. також Фігуру 1 і Приклад 1.

Таблиця 6. Пептиди за цим винаходом та їх конкретне застосування при лікування інших проліферативних захворювань, особливо інших ракових захворювань. Із таблиці видно, на яких додаткових видах пухлин вони були виявлені і демонструють надмірну презентацію на більш ніж 5 95 досліджених зразків пухлин, або презентацію на більш ніж 5 95 досліджених зразків пухлин зі співвідношенням середніх геометричних показників для пухлин і для нормальних тканин більшим ніж 3. Надмірна презентація визначається як більш висока презентація на зразку пухлини у порівнянні із зразком нормальної тканини з найвищим рівнем презентації.

Таблиця 7 8 ПМООСТІМЕ о /Стравохід.7//////7777777777777711111111111111111сСсС 9 Ц|РІРООЗАМІМ |(Легеня, товстакишка,прямакишка, молочна залоза, стравохід.7 /-::- залоза, яєчник

Н

Таблиця 8 (продовження) меланома бо |МЕЕОМУСІ (Легеня, нирка, товстакишка, пряма кишка, молочна залозад-/-:/3/:/ 66 |АШБСІВЕА (Нирка лейкоцити меланома./://:///С/С/С:(«/Г|У3//С://Ж ой ні іній іній залоза, яєчник 69 |ММАРЕТМТІ (Легеня,печінка,передміхурова залоза, яєчник, стравохід.7//-/://:/ССУИ яєчник, стравохід меланома, яєчник, стравохід печінка, передміхурова залоза, молочна залоза, яєчник, стравохід печінка, лейкоцити, яєчник, стравохід залоза, молочна залоза, меланома передміхурова залоза, стравохід передміхурова залоза стравохід ванн Тор сне стен нених нет чин ння меланома

Таблиця 4-2. Пептиди за цим винаходом та їх конкретне застосування при лікування інших проліферативних захворювань, особливо інших ракових захворювань (поправка до Таблиці 4).

Із таблиці видно, як і з Таблиці 4, на яких додаткових видах пухлин були виявлені вибрані пептиди, що демонструють надмірну презентацію (включаючи специфічну презентацію) на більш ніж 5 95 досліджених зразків пухлин, або презентацію на більш ніж 5 95 досліджених зразків пухлин зі співвідношенням середніх геометричних показників для пухлин і для нормальних тканин більшим ніж 3. Надмірна презентація визначається як більш висока презентація на зразку пухлини у порівнянні із зразком нормальної тканини з найвищим рівнем презентації. Нормальними тканинами, у порівнянні з якими була досліджена надмірна презентація, були: жирова тканина, надниркова залоза, клітини крові, кровоносні судини, кістковий мозок, головний мозок, хрящ, стравохід, око, жовчний міхур, серце, нирки, товста кишка, печінка, легені, лімфатичний вузол, нервова тканина, підшлункова залоза, паращитоподібна залоза, очеревина, гіпофіз, плевра, слинна залоза, скелетні м'язи, тонка кишка, селезінка, шлунок, тимус, щитоподібна залоза, трахея, сечовід і сечовий міхур.

Таблиця 4-2

ЗЕО І . . .

З чАПТЕМЕОМ ДРЛ, РМ3З, меланома, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак

ОС дон и в миня мот ви 5 ІМОО5РІНТМ |ДРЛ, РМ3У, меланома, рак стравоходу, рак матки, рак жовчного міхура,

Об іди 76 МОВІХОАРІМ |РМУ, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак жовчних протоків

ІМООГ ТІМ. НДРЛ, РШ, меланома, рак матки, рак жовчного міхура, рак жовчних)

ОС он МИТ М ПИТ ТИ ТИ

ЕГгравзаАМІ М ДРЛ, меланома, рак яєчника, рак сечового міхура, рак жовчного

НИ й осів Ин 10 |РГМра5БАЇ. ДРЛ, КРК, меланома, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак

А й електр в с НИЙ 11. ТеЕСМКПОБЇ. ДРЛ, меланома, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак

ОПО доню т М Й МЕТ МИ РМ 12 | ЕМБЕІММОТУ ДРЛ, РШ, КРК, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак жовчних

ОПО рр МИ М ТИ ТИМИ 13 Пп ГАСОТУНУ НДРЛ, РМУ, РЯ, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак жовчного

ОР арени |5І АМММУТ5У Рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного міхура, рак жовчних)

ОП юю М МИ МИ 21 |НІМООРІ 5У РЯ, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного

МАЙ пі оте Мн 23 |5І5АЄЕТІ ДРЛ, РМ3У, меланома, РЯ, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак 7 нора вжив |ММОгОРТОМ ДРЛ, КРК, меланома, рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного

ОЛЯ раю 37 | ККІМ5М РМ3, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак

ОС ня

Таблиця 4-2 (продовження)

ЗЕО І й й . 41 РО равЕсУ ДРЛ, меланома, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак

ГТ в М 44 |М ОКІКМ ОМ |ДРЛ, РЯ, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак жовчного міхура,

ОД он 46 | ТЕАРМММТТЕМУК б рано ура ракових 55 |У ОАМММЕА РПІПМЗ3, меланома, рак сечового міхура, рак жовчного міхура, рак

ОС р 58 |СГААЕКАРІ. ДРЛ, РМ3У, меланома, рак стравоходу, рак матки, рак жовчного міхура,

ОС овнрнвя

МІ ЕЕОММОЇ. Меланома, рак стравоходу, рак сечового міхура, рак матки, рак

ОД оно юр акне 66 ІАПБСІВЕА (РШРМУ 00101011 67 |КМЕРЛОКМ РМЗ, меланома, РЯ, рак сечового міхура, рак матки, рак жовчного

ОЙ древо нхлья

НДРЛ - недрібноклітинний рак легенів, ДРЛ - дрібноклітинний рак легенів, РН - рак нирки,

РТПК - рак товстої і прямої кишки, РШ - рак шлунка, ГЦК - рак печінки, РПШЗ - рак підшлункової залози, РПМЗ - рак передміхурової залози, РМЗ - рак молочної залози, ККМ -- карцинома з клітин Меркеля, РЯ - рак яєчника, НХЛ - неходжкінська лімфома, ГМЛ - гострий мієлоїдний лейкоз, ХЛЛ - хронічний лімфоцитарний лейкоз.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом, вибраного з групи, що складається з 5ЕО ІО Мо. 3, 4, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 21, 23, 24, 30, 36, 40, АТ, 42, 43, 44, 50, 53, 58, 60, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84, 85 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого -- лікування раку легенів.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 3, 4, 5, 15, 30, 45, 50, 58, 60, 65, 66, 68, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку нирки.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮ Мо. 3, 5, 15, 30, 36, 39, 47, 55,67, 73, 74, 79, 81, 82, 86 і 87 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку головного мозку.

КУ дв. у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮ Мо. 3, 9, 11, 42, 43, 44, 50, 55, 60, 65, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку товстої кишки.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮ Мо. 3, 9, 11, 42, 43, 44, 50, 55, 60, 65, 68, 70,

71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку прямої кишки.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з 5ЕО ІЮ Мо. 3, 9, 11, 42, 43, 44, 50, 55, 60, 65, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 84 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку стравоходу.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮ Мо. 4, 5, 15, 44, 66, 72, 78 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування меланоми.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ХЕО ІЮО Мо. 5, 15, 24, 30, 41, 55, 65, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 83 і 84 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку яєчника.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІО Мо. 9, 10, 11, 12, 41, 43, 60, 71, 72, 73, 78, 83 і 84 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку молочної залози.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІО Мо. 5 30, 44, 55, 58, 65,67, 68, 69, 71, 72, 73, 74, 76, 79, 81, 82, 85 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку печінки.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з БЕО ІЮ Мо. 10, 15, 24, 30, 34, 44, 45, 50, 68, 70, 71, 72, 73, 74, 78, 81, 84 і 86 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку шлунка.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з «ЕО ІЮ Мо. 23, 39, 64, 69, 73, 78,81 їі 82 для - у одному переважному втіленні комбінованого - лікування раку передміхурової залози.

Отже, у ще одному аспекті цей винахід стосується застосування принаймні одного пептиду за цим винаходом відповідно до будь-якої з ЗЕО ІЮ Мо. 16, 30, 66 і 74 для - у одному

Зо переважному втіленні комбінованого - лікування раку лейкоцитів.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, які здатні зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І класу або - у подовженій формі, такій як відмінний за довжиною варіант - МН ІІ класу.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згадані пептиди (кожний із них) складаються або по суті складаються з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО

ІО МО: 67.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитого з М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії) або злитого з послідовністю (або вбудованого у послідовність) антитіла, наприклад, антитіла, що є специфічним до дендритних клітин.

Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептиди за цим винаходом.

Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК,

КДНК, ПНК, РНК чи їх комбінацію.

Цей винахід також стосується вектора експресії, що здатний експресувати і (або) експресує нуклеїнову кислоту за цим винаходом.

Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектора експресії за цим винаходом для застосування для лікування захворювань і в медицині, зокрема в лікуванні раку.

Цей винахід також стосується антитіл, які є специфічними по відношенню до пептидів за цим винаходом або комплексів згаданих пептидів за цим винаходом з МНС та способів їх отримання.

Цей винахід також стосується Т-клітинних рецепторів (ТКР), зокрема розчинних ТКР (ртКР), і клонованих ТКР, вбудованих у аутологічні або алогенні Т-клітини, та способів їх отримання, а також МК-клітин або інших клітин, що несуть згаданий ТКР або вступають у перехресну реакцію із згаданими ТКР.

Антитіла і (або) ТКР є додатковими втіленнями імунотерапевтичного застосування пептидів за винаходом що розглядається.

Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії, як зазначено вище. Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина є дендритною клітиною, і переважно дендритною клітиною.

Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду зі згаданого клітини-хазяїна або її культурального середовища.

Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген навантажують на молекули МНС І або ІЇ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини або штучної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.

Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, що здатний експресувати або експресує згаданий пептид, що містить послідовність від ЗЕО ІЮ Мо. 1 до ЗЕО ІО Мо.: 67, переважно, що містить послідовність від 5ХЕО

ІО Мо. 1 до 5ЕО ІЮ Мо.34 або варіант амінокислотної послідовності.

Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, де згадана Т-клітина селективно розпізнає клітину, яка експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.

Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.

Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектора експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом або активованого Т-лімфоцита, Т-клітинного рецептора або антитіла або інших молекул, що зв'язують пептид або комплекс пептид-МНОС, за цим винаходом як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу. Переважно, якщо згаданий лікарський засіб виявляє протиракову активність.

Переважно, якщо згаданий лікарський засіб призначений для клітинної терапії, є вакциною,

Ко) білком, виготовлений на основі розчинного ТКР або є антитілом.

Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами раку підшлункової залози, раку легенів, раку нирки, раку головного мозку, раку товстої або прямої кишки, раку стравоходу, раку молочної залози, раку яєчника, раку шлунка, раку печінки, раку передміхурової залози, меланоми і лейкозу, і переважно раку підшлункової залози.

Цей винахід також стосується біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які у цьому документі іменуватимуться як "мішені", які можуть використовуватися в діагностиці раку, переважно раку підшлункової залози. Маркером може бути надмірна презентація самого(-их) пептиду(-ів) або надмірна експресія відповідного(-их) гена(-ів). Маркери також можуть використовуватися для передбачення вірогідності успіху лікування, переважно імунотерапії, і найбільш переважно імунотерапії, націленої на ту ж мішень, що ідентифікується біомаркером.

Наприклад, антитіло або розчинний ТКР може використовуватися для барвлення зрізів пухлини для виявлення присутності досліджуваного пептиду у комплексі з МНС.

Необов'язково, антитіло містить додаткову функціональну ділянку, таку як імуностимулюючий домен або токсин.

Цей винахід також стосується цих нових мішеней у контексті лікування раку.

Як терапевтичне застосування проти інших типів раку, так і діагностичне застосування розкриті у наведеному нижче більш детальному описі продуктів експресії (поліпептидів), які є базовими для пептидів за цим винаходом.

Ген АСАТ2 кодує ацетил-СоА ацетилтрансферазу 2, тіолазу, яка бере участь у метаболізмі ліпідів. АСАТ2 експресується у високих кількостях у гепатоцелюлярній карциномі (50п9 еї аї., 2006). Експресія АСАТ2 зв'язана з резистентністю ліній клітин раку підшлункової залози до променевої терапії (Боиснек еї а!., 2014).

Ген АСТАЇТ кодує альфа-актин скелетних м'язів, члена сімейства білків актинів, які Є високо консервативними білками, що відіграють певну роль у рухомості, структурі і цілісності клітин.

Було показано, що АСТАТ, класичний міоепітеліальний маркер, експресується на високому рівні у раково-асоційованих фібробластах при раку сечового міхура, пласкоклітинній карциномі порожнини рота, інвазивному раку молочної залози, раку шлунка, холангіокарциномі і метастатичній карциномі печінки і робить свій внесок у епітеліально-мезенхімальний перехід,

формування пухлинної строми і фіброз (спипце єї аі!., 2012; ЕНгап: єї аі., 2010; Китода єї а!., 2005;

МаКауата в! аї., 2002; Тегада еї а!., 1996).

Ген АСТА2 кодує альфа-актин гладеньких м'язів, члена сімейства білків актинів, які є високо консервативними білками, що відіграють певну роль у рухомості, структурі і цілісності клітин (Веїбед, 2002). Однонуклеотидний поліморфізм або варіації кількості копій АСТА?2 були ідентифіковані при хронічному лімфоцитарному лейкозі, метастазах недрібноклітинного раку легені у головний мозок і в лініях клітин, отриманих із метастатичної меланоми (Вегтпоаї еї аї., 2013; І ее сеї аі., 2012; ОиШоп-Недезіег сеї аї., 2012). Очевидно, що функціонально високі рівні експресії АСТА2 пов'язані з підвищенням інвазивного потенціалу пухлинних клітин і утворенням метастазів (Кота єї аї!., 2014; І ее ві а!., 20136; Таїеппрогві еї а!., 2004).

Ген АСТВ кодує бета-актин, один з головних елементів скорочувального апарату і один із двох нем'язових цитоскелетних актинів (КНеїбед, 2002). Було показано, що регуляція експресії

АСТВ порушена при раку печінки, меланомі, раку нирки, колоректальному раку, раку шлунка, раку підшлункової залози, раку стравоходу, раку легенів, раку молочної залози, раку передміхурової залози, раку яєчника, лейкозі і лімфомі. Аномальна експресія і полімеризація

АСТВ ії утворені зміни у цитоскелеті, очевидно, пов'язані з інвазивністю і матастазуванням ракових пухлин (Со вї а!., 2013).

Ген АСТА2 кодує капа-актин, члена сімейства білків актинів, які Є високо консервативними білками, що відіграють певну роль у рухомості, структурі і цілісності клітин (Веїбєд, 2002).

Підвищена експресія АСТВІ2 спостерігалася у клітинах гепатоцелюлярної карциноми і гепатоми, у яких вона змінювала властивості щодо росту клітин і була причетною до невтішного післяопераційного прогнозу (СНапа еї а!., 2006; Снапо еї а!., 2011).

Ген АСТСІ кодує альфа-актин 1 серцевого м'яза, який є головним елементом скорочувального апарату у кардіоміоцитах (Негбед, 2002). Повідомлялося про змінену експресію АСТС1 у клітинах раку сечового міхура, недрібноклітинного раку легенів, лікованого паклітакселом, і хіміорезистентного раку яєчника (7агаміпоз єї аї., 2011; СнНе єї аї., 2013; Рап єї аІ!., 2009). Більш того, АСТС1 може виявитися прийнятним діагностичним маркером раку передміхурової залози і рабдоміосаркоми (Ниапа єї а!., 2010; Сіетепі еї а!., 2003).

Ген АСТОЇ1 кодує гамма-актин 1, виявлений у нем'язових клітинах цитоплазматичний актин,

Зо який становить основу клітинної рухливості (НеїзЗеад, 2002). Було показано, що АСТО1 надмірно експресується у тканинах дрібноклітинного раку легенів і остеосаркоми і його експресія знижена при епітеліальному раку яєчника (Іі еї аїЇ., 2010; деопа єї аї., 2011; Сном еї аї., 2010).

Повідомлялося, що зміни у рівні АСТО1 сприяють інвазії і утворенню метастазів для різних видів ракових клітин. У клітинах раку товстої кишки і гепатоцелюлярної карциноми надмірна експресія АСТО1 підвищує міграцію і інвазію, у той час як у клітинах меланоми і аденокарциноми слинної залози знижена експресія АСТО1 пов'язана з цим фенотипом (Бітісгу|ем еї аї., 2014; І цо еї аї., 2014; 7папо еї а!., 2006; сидетапп еї аї., 2001; Зигикі еї аї., 1998).

Ген АСТО2 кодує гамма-актин 2, актин гладеньких м'язів, який становить основу клітинної рухливості (Реїзбед, 2002). Обговорювалась можливість здійснення АСТО2 функцій біомаркеру при діагностиці раку передміхурової залози. Було показано, що рівень його експресії високий у трансдиференційованих клітинах строми передміхурової залози (БРійтоге єї аї., 2014;

Опівегдавзег еї аї., 2005). Стосовно хіміотерапії, рівень експресії АСТО2 підвищується після обробки паклітакселом клітин раку гортані, ймовірно, що він задіяний у резистентності клітин раку молочної залози до дії цисплатину, і було показано, що існує позитивна кореляція його рівню з чутливістю колоректального раку з метастазами у печінку до режиму лікування

ЕОГРОХА (Хи ві аї., 2013; МУ/аїзоп вї а!., 2007; и єї аї., 201365).

Ген АСАМ8 кодує АБАМ металопептидазний домен 8, члена сімейства АСАМ (домен дезінтегрину і металопротеїнази), який бере участь у міжклітинній взаємодії і взаємодії клітини з матриксом (Неїбед, 2002). Надмірна експресія АБАМ8 при раку підшлункової залози асоціюється з підвищеною міграцією і інвазивністю клітин аденокарциноми протоків підшлункової залози (5спіотапп єї аї., 2015). АБАМ8 бере участь у міграції і інвазії пухлинних клітин при раку легенів, нирковоклітинній карциномі і раку головного мозку (Моспіг2гикі апа

ОКада, 2007).

Ген АЕВРІ кодує білок 1, що зв'язує енхансер адіпоцитів -- карбоксипептидазу А, яка може відігравати роль корепресору транскрипції, який є важливим для адіпогенезу і диференціації клітин гладеньких м'язів (Веїбед, 2002). АЕВРІ1 експресується на високому рівні при меланомі і робить свій внесок до набутої резистентності до інгібування гомологу мутантного вірусного онкогену мишачої саркоми у-Каї ВІ (ВКАЕ) (Ни еї аї., 2013). Рівень АЕВРІ1 є підвищеним у 60 більшості первинних гліобластом (Недау єї аї!., 2008).

Ген АНМАКЗ2 кодує каркасний білок АНМАК, нуклеопротеїн 2 (Мага еї аї!., 2010). АНМАК2 є важливим елементом некласичного шляху секреції фактору росту фібробластів-1ї (РОТ), елементу, що бере участь у рості і інвазії пухлини (Кігом єї аї!., 2015).

Ген АМКН кодує гомолог білка прогресуючого анкілозу (мишачого) / регулятор транспорту неорганічного фосфату АМКН, політопний трансмембранний білок, який контролює рівні пірофосфату (НеїзЗеад, 2002).

Ген АМО1 кодує аноктамін 1, кальцій-активований хлоридний канал, асоційований із саркомою тонкої кишки і раком порожнини рота (Неїбед, 2002). АМО1 є ампліфікованим при пласкоклітинному раку стравоходу (ЕБСС), пухлинах строми шлунково-кишкового тракту (Б5І5Т), пласкоклітинній карциномі голови та шиї (НМЗСС), ракових пухлинах підшлункової та молочної залози (Ои еї а!., 2014).

Ген АРОВ кодує аполіпопротеїн В, головний аполіпопротеїн хіломікронів і ліпопротеїнів низької щільності (ЛЛНЩ) (НАНеїбЗед, 2002). У альфа-фетопротеїн-негативній ГЦК, пов'язаній з інфікуванням вірусом гепатиту В, було визначено, що АРОВ є одним із 14 диференційно експресованих білків, які можуть бути пов'язані з прогресуванням ГЦК (Не еї а!., 2014). Для раку молочної залози на пізніх стадіях було визначено, що АРОВ є одним із б диференційно експресованих білків, які сприяють передбаченню сприйнятливості до неоад'ювантної хіміотерапії і безрецидивної виживаності пацієнтів (Нушипа еї а!., 2011).

Ген АЗРНОЇ кодує білок 1, що містить домен аспартат-бета-гідроксилази. АБРНОЇ локалізуються на хромосомі 16р11.2 (Неїзед, 2002).

Ген АТМ кодує характерну для захворювання на атаксію- телеангіектазію мутантну форму члена сімейства РІЗ/РІ4-кіназ,, який є головним контролером сигнальних шляхів контрольних точок клітинного циклу, які необхідні для відповіді клітин на пошкодження ДНК і для стабільності геному (Неїбед, 2002). АТМ є супресором пухлин, який часто є мутованим у широкому діапазоні ракових пухлин людини, включаючи рак легенів, молочної залози і кровотворної системи (У/ерег апа Вуап, 2014).

Ген АТРБВ кодує мітохондріальний комплекс АТФ-синтази (комплекс Е1), що переносить Не, бета-поліпептид, бета-субодиницю каталітичного ядра мітохондріальної АТФ-синтази (Неїбед, 2002). Експресія гена АТР5ОВ була значно вищою у тканинах колоректального раку у порівнянні

Зо зі здоровими тканинами (СеуїкК єї аї.,2014). Низький рівень експресії АТР5В у тканинах пухлин має тісний зв'язок з метастазуванням, інвазивністю і несприятливим прогнозом при раку жовчного міхура (5ийп еї аї!., 20155).

Ген АТРОЇ. кодує мітохондріальний комплекс АТФ-синтази (комплекс Ео), що переносить Нею, субодиницю с компоненту мітохондріальної АТФ-синтази, що пронизує мембрану, який містить протоновий канал (Неїзед, 2002).

Ген АТР5БІ2 кодує мітохондріальний комплекс АТФ-синтази (комплекс Бо), що переносить

Ня, субодиницю 52 компоненту мітохондріальної АТФ-синтази, що пронизує мембрану, який містить протоновий канал (НеїзЗеад, 2002).

Ген ВАСЕ2 кодує фермент 2 розщеплення бета-АРР, інтегральний мембранний глікопротеїн і аспартатпротеазу. ВАСЕ2 розщеплює попередника амілоїдного білка до бета-амілоїдного пептиду (Веїбед, 2002). ВАСЕ2 бере участь у функціонуванні бета-клітин підшлункової залози (Маззаг еї а!., 2014).

Ген ССМВІ кодує циклін В1, регуляторний білок, що бере участь у мітозі (НеїзЗед, 2002).

ССМВІ1 є добре вивченим пухлинним антигеном, і його надекспресія була описана для раку молочної залози, голови та шиї, передміхурової залози, колоректального раку, раку легенів і печінки (Едіої єї а!., 2006).

Ген СЕАСАМ6 кодує пов'язану з раковоембріональним антигеном молекулу клітинної адгезії 6 (антиген, що неспецифічно перехресно реагує), члена сімейства СЕАСАМ пухлинних маркерів (Веїзед, 2002). Експресія СЕАСАМб підвищена у хворих на рак шлунка (Мавиї еї аї!., 2004).

СЕАСАМЄ є кандидатом у антигени пухлин молочної залози (5004, 2010).

Ген СІ ТА кодує клатрин, легкий ланцюг А, структурний компонент облямованих ямок, що здійснює регуляторні функції (ВНеїбЗед, 2002). Ген СІ ТА демонструє альтернативний варіант сплайсингу у гліомі (Спешпа еї а!., 2008).

Ген СТВ кодує клатрин, легкий ланцюг В, структурний компонент облямованих ямок, що здійснює регуляторні функції (Неїзеад, 2002).

Ген С.О кодує секретований шаперон, який, можливо, бере участь у декількох головних біологічних подіях, таких як клітинна смерть, прогресування пухлини і нейродегенеративні захворювання (Веїбед, 2002). Ймовірно, що його роль у пухлиногенезі подвійна, оскільки у нормальних клітинах і під час ранніх стадій канцерогенезу С.О може інгібувати прогресування бо пухлин, у той час як у пухлинах на пізніх стадіях він може забезпечити значну перевагу що стосується виживання, пригнічуючи численні терапевтичні стресори і прискорюючи розвиток метастазів. Було показано, що СІ І відіграє вирішальну роль у патогенезі раку передміхурової залози, регулює агресивну поведінку клітин світлоклітинної нирково-клітинної карциноми людини шляхом модуляції сигнального шляху ЕККТ1Т/2 і експресії ММР-9 і надає резистентність до лікарських засобів на пізніх стадіях раку легенів (Тоидако5, 2013; Рапісо еї аї., 2009;

ТаКеишснпі єї а!., 2014; Мапа еї а!., 20146).

Ген СОГ12А1 кодує альфа-ланцюг колагену типу ХІіЇ, члена сімейства колагенів ЕАСІТ (фібрил-асоційованих колагенів із розривами у потрійній спіралі), і таким чином є частиною позаклітинного матриксу (ЕСМ) (ВеїбЗед, 2002). СОІ12А1 надмірно експресується у резистентних до лікарських препаратів варіантів клітинних ліній раку яєчника (Чаписпому5кКі єї ам. 2014). При колоректальному раку СО 12А1 надмірно експресується у десмопластичній стромі у раково-асоційованих фібробластах і поблизу них, в також у ракових клітинах, що вистилають границі ділянки інвазії (Кагадіаппів еї а!., 2012).

Ген СО бАЗ кодує ланцюг альфа-3 колагену МІ типу, знайденого у більшості сполучних тканин колагену у вигляді філаментів-нсамистин, , що відіграє важливу роль в організації компонентів матриксу (Неїзед, 2002). Повідомлялося, що експресія СОЇ бАЗ є підвищеною при раку підшлункової залози, раку товстої кишки, раку шлунка, мукоепідермоїдних карциномах і раку яєчника. Раково-асоційовані варіанти транскрипту, включаючи екзони 3, 4 і 6, були виявлені при раку товстої кишки, сечового міхура, передміхурової залози і підшлункової залози (Агагаї єї аІ., 2011; Зтійй єї а!., 2009; Мапа евї аї., 2007; Хіє вї а!., 2014; І вїмо вії аі., 2005; Зпегтап-

Вашві еї а!., 2003; Сагаїпа єї аї., 2006; Тногзеп еї а!., 2008). При раку яєчника спостерігалася кореляція рівнів СОЇ бАЗ з високим ступенем злоякісності пухлини. Було показано, що при раку підшлункової залози СОЇ 6АЗ являє собою прийнятний діагностичний сироватковий біомаркер (ЗПпегтап-Вашсві евї а!., 2003; Капа єї а!., 2014).

Ген ОСВІ 02 кодує дискоїдин, білок 2, що містить домени СИВ і І СС, який також має назву нейропілін-подібний ендотеліальний та гладеньком'язовий трансмембранний корецепторний білок (ВеїбЗед, 2002). Експресія ОСВІ 02 є підвищеною у гліобластомах у ракових пухлинах голови та шиї (НМС), і він є необхідним для ЕСЕК-стимульованого пухлиногенезу (Репо 6вї аї., 2014). Крім того, експресія ОСВІ 02 є підвищеною у сублінях клітин і зразках тканин раку легенів із високим метастатичним потенціалом (Козпікаума еї а!., 2002). Навпаки, експресія ОСВІ 02 пригнічується шляхом гіперметилювання його промотору при раку шлунка (Кіт еї аї., 2008).

Ген БИОБРІ4, фосфатази 14 з подвійною специфічністю, здатний дефосфорилювати тирозинові, а також серин-треонінові залишки і відіграє певну роль у інактивації МАР-кіназного сигнального шляху (ВНеїбзед, 2002). Однонуклеотидні поліморфізми у гені ФВОЗР14 мають зв'язок із зміною ризику розвитку меланоми (Мапа еї а!., 2014а; іш ега)!., 2013а).

Ген ЕЕРЕТАТ кодує ізоформу альфа-субодиниці комплексу фактора елонгації 1, який забезпечує ферментативну доставку аміноацил-т РНК до рибосоми (НеїбЗеєд, 2002). Було показано, що експресія ЕЕЕТАТ підвищена у багатьох видах ракових пухлин, включаючи колоректальний рак, рак яєчника, рак шлунка, рак передміхурової залози, гліобластому і пласкоклітинну карциному. Він був описаний як потенційний сироватковий біомаркер раку передміхурової залози (Маїазза єї а!., 2013; Миі-Кеє еї аІ., 2012; іт єї аІ., 2011; Кигатіїви єї аї., 2010; Кідо еї а!., 2010; Зспавеїї єї а!., 2008; ОЇ еї аї., 2005; Вентап еї аї., 2012). З точки зору механізмів, ЕЕЕТАТ інгібує апоптоз шляхом взаємодії з р53 апа р7З3, сприяє проліферації шляхом пригнічення транскрипції інгібітору клітинного циклу р21 і бере участь у регуляції епітеліально-мезенхімального переходу (Віапсі еї аї., 2013; Снпої еї аї., 2009; Низзеу 6ї аї., 2011).

Ген ЕЕЕТАТР»5 кодує псевдоген 5 еукаріотичного фактору 1 елонгації трансляції альфа 1 і локалізується на хромосомі 9434.13 (ВНеїзЗед, 2002).

Ген ЕАМСЗ є членом сімейства зі схожістю послідовностей З (ЕАМ3З) і кодує секретований білок із доменом 5. Зміна експресії цього білка спостерігалася у клітинах, отриманих з ракової пухлини підшлункової залози (Неїбед, 2002). У меланомі ЕАМСЗ ідентифікували як кандидата у біомаркери аутофагії, важливого механізму виживання пухлинних клітин (701 єї аї., 2002; Ктауа еї аі,, 2015). ЕАМСОЗ відіграє суттєву роль у епітеліально-мезенхімальному переході, який корелює з агресивністю, метастатичним прогресуванням пухлин і низькою виживаністю, особливо при гепатоцелюлярному раку, колоректальному раку, раку легенів і молочної залози (Свібвлаг єї а!., 2014; Сао єї аї., 2014с; опа єї аї., 2014; Спацапигу єї аї., 2010; І анзпід еї аї., 2009).

Ген ЕАР кодує трансмембранну серин-протеазу, яка селективно експресується у реактивних фібробластах строми пухлин епітеліального раку (раково-асоційованих фібробластах, або бо САР), у грануляційній тканині ран, що загоюються, і злоякісних клітинах сарком кісток і м'яких тканин (НРеїзЗед, 2002). ЕАР відіграє важливу роль у рості ракових пухлин і метастазуванні шляхом його участі у процесах клітинної адгезії і міграції і ремоделювання позаклітинного матриксу (ЕСМ) (дЧасор еї аї., 2012). Надмірна експресія БГАР корелює з несприятливим прогнозом, пізніми стадіями розвитку пухлини, метастатичному і інвазивному потенціалі різних видів раку відповідно до цього, раку товстої кишки, пласкоклітинної карциноми стравоходу, аденокарциноми підшлункової залози, гліобластоми, остеосаркоми, раку яєчника і раку молочної залози (М/іКрега сеї а!., 2013; КазНуар сеї аї., 2009; Сонеп еї аї!., 2008; Мепіеіп еї аї., 2011; Мцап еї а!., 2013; папа еїа!., 2011; Агіда єї а!., 2001).

Ген ЕКВР10О0 кодує ЕК5БОб-зв'язувальний білок 10, який належить до сімейства пептидил- проліл-цис/транс-ізомераз ЕКВвР-типу. Продукт гена ЕКВР1О локалізується в ендоплазматичному ретикулумі і діє як молекулярний шаперон (НеїбЗед, 2002). ЕКВР1О був ідентифікований як новий ген, який бере участь у набутті лейкозними клітинами адріаміцин- резистентного фенотипу і його підтримці (бБйп єї аїЇ., 2014). ЕКВРІ1ІО асоціювався з колоректальним раком через його підвищену експресію (ОіІебзеп єї аї., 2005). Навпаки, недостатня експресія ЕКВР10 була характерною для епітеліальних карцином яєчника (Опціпп єї а!., 2013).

Ген РСМА кодує філамін А, білок, що зв'язує актин, який зшиває волокна актину і зв'язує волокна актину з мембранними глікопротеїнами. Кодований білок бере участь у ремоделюванні цитоскелета, що призводить до змін у формі клітин і їх міграції, а також взаємодіє з інтегринами, комплексами трансмембранних рецепторів і вторинними переносниками інформації (Реїзеад, 2002). Залежно від субклітинної локалізації, філамін А відіграє подвійну роль у ракових пухлинах: у цитоплазмі філамін А діє у різних сигнальних шляхах факторів росту клітин, на додаток до участі у міграції клітин і каскадах адгезії. Таким чином, надмірна експресія сприяє пухлинному росту. На відміну від повнорозмірного філаміну А, С-кінцевий фрагмент, який вивільняється після протеолізу, локалізується у ядрі, де він взаємодіє з факторами транскрипції і таким чином пригнічує ріст і метастазування пухлини (Замоу апа Сови, 2013).

Ген СОБА1 кодує члена сімейства білків (ЗА), який локалізований в апараті Гольджі, містить домен "вуха" гамма-адаптинів і зв'язує АКЕ. Члени цього сімейства є повсюдними білками-коатомерами, які регулюють транспорт білків між трансо-Гольджі-мережею і ліпосомою (ВеїзЗеад, 2002).

Ген НВВ кодує бета-ланцюг гемоглобіну людини, металопротеїну еритроцитів, що містить залізо і транспортує кисень (Неїзед, 2002). Здатність раку молочної залози утворювати кісткові метастази і метастази у внутрішні органи являє собою чітке свідчення несприятливого клінічного прогнозу у порівнянні з випадками раку молочної залози з метастазами, обмеженими кістками. Підвищена експресія НВВ у кісткових метастазах корелювала з їх здатністю швидко розповсюджуватися на інші органи (Сариїйї єї аіІ., 2012). Було показано, що НВВ надмірно експресується у тканинах карциноми шийки матки. Ектопічна експресія НВВ у клітинах раку шийки матки пригнічувала окислювальний стрес і покращувала життєздатність клітин (Її еї аї., 2013).

Ген НВВ кодує дельта-ланцюг гемоглобіну людини, металопротеїну еритроцитів, що містить залізо і транспортує кисень. Два альфа-ланцюги разом із двома дельта-ланцюгами утворюють гемоглобін А2, який разом із гемоглобіном Е становить З 95 від усього зрілого гемоглобіну (Веїзеад, 2002).

Ген НКОСІ1 кодує білок 1, що містить гексокіназний домен і виявляє гексокіназну активність іп майго (Сшо еїа!., 2015). Використовуючи новий метод ідентифікації потенційних терапевтичних мішеней із неоднорідних даних, НКОСІ1, серед інших добре відомих терапевтичних мішеней, був виявлений як нова потенційна терапевтична мішень для лікування раку легенів (Іі апа

Ниапо, 2014).

Ген НЗРОЇ кодує мітохондріальний білок 1 теплового шоку 60 кДа, члена сімейства шаперонінів, який є суттєвим для фолдингу і збірки щойно імпортованих білків у мітохондріях і може виконувати функції сигнальної молекули в природній імунній системі (Веїбед, 2002). Хоча

Н5УРО1 вважається внутрішньомітохондріальним білком, його виявили у цитозолі, клітинній мембрані, везикулах, на клітинній поверхні, у позаклітинному просторі і у крові. Оскільки рівні

Н5УРО1 у цитозолі поступово підвищуються або знижуються під час канцерогенезу у різних органах, Н5РОЇ можливо використовувати як біомаркер для діагностики і прогнозу розвитку передпухлинних змін і пухлинних уражень. Більш того, деякі нещодавно ідентифіковані функції

Н5ЗРО1 асоціюються з канцерогенезом, конкретно з виживанням і проліферацією пухлинних клітин, і інтенсивно обговорювалась можливість його застосування як мішені протипухлинної терапії (Расе еї аіІ., 2013; МаКатига апа Міпедівні, 2013; Сарреїо єї аї!., 2013; Сарреїо еї аї., 60 02011; Сарреїо вії а!., 2008).

Ген НУОЦІ кодує білок 1, що надмірно експресується за умов гіпоксії, краще відомий під назвою регульованого глюкозою білка 170 кДа (СКРІ170), який належить до сімейства білків теплового шоку 70. Експресія НУФИТІ індукується за стрес-залежним механізмом за умов гіпоксії і приводить до накопичення білка в ендоплазматичному ретикулумі (ЕР). Вважають, що білок, який кодується НУФИШТІ, відіграє важливу роль у фолдингу і секреції білків у ЕР. (Неїбед, 2002).

Було показано, що активність внутрішньоклітинного білка НУОШІ надає користь для виживання ракових клітин під час прогресування пухлин або розвитку метастазів. Позаклітинний білок

НУОФИІ відіграє суттєву роль у розвитку протипухлинної імунної відповіді шляхом прискорення доставки пухлинних антигенів для їх крос-презентації (Ри апа І ее, 2006; М/апад еї аї., 2014а).

Білок НУОШІ був впроваджений у імунотерапію і показав позитивний імуномодулюючий ефект (Ум єї аї., 2013; Спеп еї аї., 201За; Уцап еї аї., 2012; Мапа апа 5и!ибіескК, 2013). У клітинах раку передміхурової залози пригнічення НУОШІ показало протипухлинний ефект (Міуаді еї аї., 2001).

Ген ІРТ88 кодує члена сімейства тетратрікопептидних повторів (ТРЕК) (Неїбед, 2002). У процесі мітозу ІЕТ88 є частиною динеїн-1-керованого комплексу, який транспортує кластери периферійних мікротрубочок до полюсів веретена для забезпечення належної орієнтації веретена. Виснаження ІРТ88 призводить до мітотичних дефектів у культурах клітин людини (Оєїамаї! єї а!., 2011). Втрата генної експресії ІРТ88 (також відомого під назвою Т49737) приводить до проліферації стовбурових клітин печінки (овальних клітин), і він є, таким чином, геном- супресором пухлин (неоплазій) печінки (Івтоп еї аЇ., 1997). У 2012 році було показано, що мутація є відповідальною за нову форму порушення функції війок і аносмії у людей, які вдалося вилікувати у мишей шляхом генної терапії із застосуванням аденовірусів (Мсіпіуге еї а!., 2012).

Ген ІСЕ2ВРЗ кодує зв'язувальний білок З ІРНК гена, що кодує інсуліноподібний фактор росту

ІЇ, онкофетальний білок, який пригнічує трансляцію інсуліноподібного фактора росту І! (БКеїзед, 2002). У декількох дослідженнях було показано, що ІСЕ2ВРЗ відіграє роль у різних важливих аспектах клітинних функцій, таких як поляризація, міграція, морфологія, метаболізм, проліферація і диференціація клітин. Дослідження іп міго показали, що ІСЕ2ВРЗ сприяє проліферації, адгезії і інвазії пухлинних клітин. Більш того, було показано, що ІСЕ2ВРЗ асоціюється з агресивними формами раку і з поширеною формою раку (Веї! єї а!., 2013; Сопа єї

Зо аі,, 2014). Надмірну експресію ІСЕ2ВРЗ було описано у багатьох видах раку. Вона корелює з несприятливим прогнозом, пізніми стадіями розвитку пухлини і наявністю метастазів, наприклад, при нейробластомі, колоректальній карциномі, внутрішньопечінковій холангіокарциномі, гепатоцелюлярній карциномі, раку передміхурової залози і нирково-клітинній карциномі (Веї! єї а!., 2013; Ріпаєїіз-Нозеу апа Хи, 2012; Ни єї аї., 2014; 57агуаз єї аї!., 2014; депд еї а!., 2009; Спеп еї аї., 2011; СНеп єї аї., 201365; Нойтапп еї а!., 2008; І іп еї аїІ., 2013р; Миап еї а!., 2009).

Ген ІТОВА кодує білок сімейства інтегринів. Інтегрини є гетеродимерами, які складаються з нековалентно зв'язаних альфа- і бета-субодиниць і є трансмембранними глікопротеїновими рецепторами. Вони опосередковують адгезію клітин до матриксу та міжклітинну адгезію і передають сигнали, які регулюють генну експресію і ріст клітин (Веїбед, 2002). ІТОВА (також відомий під назвою СО104) виявляє тенденцію до асоціації з субодиницею альфа-6 і, ймовірно, відіграє головну роль у біологічних властивостях декількох інвазивних карцином, таких як пласкоклітинна карцинома стравоходу, карциноми сечового міхура і яєчника (Куоп еїаї., 2013;

Регеїга єї аї., 2014; СНнеп еї аї!., 20145). Однонуклеотидний поліморфізм у гені ІТОВА4, очевидно, впливає на агресивність пухлин і виживаність і може мати прогностичне значення для пацієнтів із раком молочної залози (Вгепаїе еї аї., 2008).

Ген КСМКЄ кодує одного з членів надсімейства білків калієвих каналів, які містять Р-домени, що утворюють подвійні пори. Цей канальний білок, який вважається відкритим випрямлячем, широко експресується. Він стимулюється арахідоновою кислотою, а інгібується внутрішнім підкисленням і леткими анестетиками (Неїбед, 2002). КСМКб (який також має назву К2Рб.1) разом із К2РІ1.1, К2РЗ.1, К2РБ.1, К2Рб.1, К2Р7.1 ії К2РІ10.1, показав дуже низький рівень експресії у багатьох видах ракових пухлин, досліджених за допомогою онлайнової бази мікрочіпових онкологічних даних, Опсотіпе (ммлм.опсоптіпе.огу) (М/ПШіатз еї а!., 2013).

Цей ген КСММЗ належить до сімейства калієвих каналів КСММ. Він кодує інтегральний мембранний білок, який формує потенціал-незалежні канали, що активуються кальцієм, які вважають такими, що регулюють нейрональну збудливість, беручи участь у повільному компоненті синаптичної слідової гіперполяризації (Неїбед, 2002). Було показано, що експресія

КСММЗ (який також має назву ТАБК-1) знижується під впливом 17-бета-естрадіолу у клітинах мишачої нейробластоми М2А, і він сприяв проліферації клітин (Нао есї аї., 2014). Експресія бо КСММЗ підвищувалась під дією фізіологічних концентрацій 1,25-дигідрокси-вітаміну О (3) і його концентрацій, вищих за фізіологічні, на органотропну культуру клітин раку молочної залози (Мііапі еї аї., 2013). КСММЗ (який також має назву К2РЗ.1), разом із К2Р1.1 ії К2Р12.1, мав підвищені рівні експресії у ряді ракових пухлин, досліджених за допомогою онлайнової бази мікрочіпових онкологічних даних, Опсотіпе (ммлм.опсоптіпе.огу) (М/ПШіатз еї а!., 2013).

Ген КОМІА (який також має назву І 501) кодує ядерний білок, що містить домен 5УМЕМ,

ЕАО-зв'язувальний мотив і домен амінооксидази. Цей білок є компонентом декількох комплексів гістон-деацетилази, хоча він призводить до сайленсингу генів шляхом здійснення функції гістон- деметилази (ВНеїбед, 2002). Надмірна експресія КОМІТА сприяє проліферації, міграції і інвазії пухлинних клітин і асоціюється з несприятливим прогнозом у хворих на НДРЛ і ГЦК (Ім еї аї., 2012; йпао єї аїЇ,, 2013). Підвищена експресія КОМ'А корелює з рецидивами раку передміхурової залози і з підвищеною експресією МЕСЕ-А (КазнНуар еї аї., 2013). Інгібування

КОМА комбінацією трихостатину А (Т5А) їі 5-аза-2'-деоксицитидину (децитабіну) пригнічує онкогенність асцитних клітин раку яєчника лінії «КОМЗ (Мепа еї а!., 2013).

Ген КІР26В кодує члена надсімейства білків кінезинів (КІР), який є важливим для розвитку нирок. Експресія КІБ26В обмежена метанефричною мезенхімою, а його транскрипція регулюється транскрипційним регулятором зап, що містить домен "7іпс йпдег" (Тегарауабвнпі єї а. 2012). Високий рівень експресії КІБ26В при раку молочної залози асоціюється з несприятливим прогнозом (Мапа еї а!., 201305). Підвищена експресія КІЄ26В значуще корелює з розміром пухлини, судячи з даних аналізу тканин пухлин КРК і відповідної прилеглої нормальної слизової оболонки. КІЄ26В відіграє важливу роль у колоректальному канцерогенезі і виконує функції нового прогностичного індикатору і потенційної терапевтичної мішені для КРК (У/апад єї а!., 2015).

Ген ККТ19 кодує члена сімейства кератинів. Кератини є білками проміжних філаментів, відповідальними за структурну цілісність клітин епітелію. Їх поділяють на цитокератини і кератини волосся. ККТ19 специфічно експресується у перидермі, тимчасовому поверхневому шарі, який обгортає епідерміс, що розвивається (Неїбеєд, 2002). Експресія ККТ19 у пухлинних клітинах є прогностичним маркером для декількох видів пухлин, таких як ракові пухлини молочної залози, легенів, яєчника і гепатоцелюлярного раку (5Копага еї аї!., 2014; Сао еї аї., 2014р; Пи еї аї., 2013р; їЇее єї аї,, 201За). Було показано, що ККТ19 є незалежним

Зо прогностичним фактором розвитку нейроендокринних пухлин підшлункової залози, особливо інсулін-негативних пухлин. ККТ19-позитивні пухлини асоціюються з несприятливим прогнозом незалежно від встановлених показників патології, таких як розмір, мітоз, лімфоваскулярна інвазія і некроз (Чаїп еї а!., 2010).

Ген ККТ7 кодує члена сімейства кератинів. Цитокератини типу ІЇ складаються з основних або нейтральних білків, які організуються у пари гетеротипових кератинових ланцюгів, які сумісно експресуються під час диференціації простих і багатошарових епітеліальних тканин.

Цей цитокератин типу І специфічно експресується у простому епітелії, який вистилає порожнини внутрішніх органів, і у протоках залоз і кровоносних судинах (Неїбед, 2002). КАТ7 використовується у імуногістохімічних методах для розрізняння декількох фенотипів і як біомаркер для прогнозу перебігу певних ракових захворювань, таких як нирковоклітинна карцинома, карцинома яєчника, епітеліальні пухлини шкіри тощо (Кигода еї аї., 2013;

МесСіІнддаде апа Моипо, 2005; АІнитаїаі, 2012).

Ген ГАМС2 належить до сімейства ламінінів, сімейства глікопротеїнів позаклітинного матриксу. Ламініни є головними неколагенними компонентами базальних мембран. Вони причетні до широкого спектру біологічних процесів, включаючи адгезію клітин, їх диференціацію, міграцію, передачу сигналів, відростання нейритів і розвиток метастазів. | АМС2 кодує білок, який експресується у декількох тканинах плоду і специфічно локалізований у епітеліальних клітинах шкіри, легенів і нирок (Веїбед, 2002). І АМС2 експресується на високому рівні в анапластичній карциномі щитоподібної залози і асоціюється з прогресуванням, міграцією і інвазією пухлини шляхом модуляції сигнального шляху ЕСЕК (Сага єї аї!., 2014). Експресія

АМС2 служила передбаченням несприятливого прогнозу у пацієнтів з стадією ЇЇ колоректального раку (Кемапз еї а!., 2011). Було виявлено, що експресія ГАМС2 разом з трьома іншими біомаркерами значуще асоціюється з присутністю метастазів у лімфовузлах пацієнтів з пласкоклітинною карциномою порожнини рота (7апагидаїн еї аї!., 2013).

Ген ГОМ кодує члена сімейства малих протеогліканів, багатих лейцином (ЗІ КР), яке включає декорин, біглікан, фібромодулін, кератокан, епіфікан і остеогліцин. Люмікан є головним протеогліканом рогівки на основі кератан-сульфату, але також розподілений по всьому організму в колагеновому інтерстиціальному матриксі. Люмікан здатний регулювати організацію і периферійний ріст колагенових фібрил, прозорість рогівки, міграцію епітеліальних клітин і 60 відновлення тканин (Неїбед, 2002). Експресія більа ОМ підвищена у тканинах більшості пухлин, таких як рак молочної залози, колоректальний рак і рак підшлункової залози у порівнянні з нормальною тканиною і асоціюється з високим ступенем злоякісності і несприятливим прогнозом. Однак позаклітинний люмікан інгібує ріст клітин раку підшлункової залози і пов'язаний з довшою виживаністю після хірургічного лікування (Іеудиє еї аї., 1998; зЗеуа 6ї аї., 2006; Івпімата єї а!., 2007; 1 еї а. 2014). ГОМ та інші гени, пов'язані з цілісністю позаклітинного матриксу (ОСМ ії ОРТ), диференційно експресуються і можуть служити біомаркерами метастатичної і рецидивної пухлини гігантських клітин кісток (І іемеїйсй еї аї., 2014)

Експресія ГОМ знижена у варіантів ліній клітин раку яєчника А2780, резистентних до цисплатину, доксорубіцину, топотекану і паклітакселу (Чаписпомузкі еї а!., 2014).

Ген МАРА кодує головний білок, що є асоційованим з мікротрубочками ненейронального походження, який сприяє збірці мікротрубочок і протидіє їх дестабілізації проти катастрофічного руйнування в інтерфазі. Фосфорилювання цього білка впливає на властивості мікротрубочок і проходження клітин через клітинний цикл (Неїбед, 2002). Було показано, що існує позитивна кореляція між високими рівнями МАРА і ступенем злоякісності раку сечового міхура, у той час як фосфорилювання білка протеїнкіназою А знижує міграцію і інвазію клітин раку сечового міхура (Оч егаї.,, 2014) Результати дослідження на пацієнтах, хворих на недрібноклітинний рак легенів свідчать про високе співвідношення МАРА до іРНК статміну у зразках пухлин у порівнянні з нормальними зразками, що вказує на те, що це співвідношення може служити біомаркером недрібноклітинного раку легенів (Сисспіагеїії єї а!., 2008). Рівні МАР4, якому властива негативна регуляція з боку супресору пухлини ро53, впливають на ефективність дії речовин, мішенню яких є мікротрубочки. Високі рівні підвищують ефект лікарських препаратів, які стабілізують мікротрубочки (таксанів) і зменшують ефект препаратів, які дестабілізують мікротрубочки (алкалоїдів барвінка), у той час як низькі рівні МАРА4 справляють протилежну дію (Наїї апа Мапод, 2006; СаІтагіпі еї аї., 2003; 7Напо еї а!ї., 1999).

Ген ММР7 кодує фермент, який розкладає протеоглікани, фібронектин, еластин і казеїн і відрізняється від більшості членів сімейства ММР у тому, що у ньому відсутній консервативний

С-термінальний білковий фрагмент. Білки сімейства матричної металопротеїнази (ММР) беруть участь у руйнуванні позаклітинного матриксу в нормальних фізіологічних процесах, таких як розвиток ембріону, репродукція і ремоделювання тканин, а також у процесах, пов'язаних із

Зо захворюваннями, таких як артрит і метастазування (Неїбед, 2002). ММР7 часто надмірно експресується у тканинах раку людини, включаючи колоректальний рак, метастатичну карциному легенів і рак шлунка, і асоціюється з прогресуванням раку і метастазуванням (ії єї а!., 2006; Бип єї аї., 2015а; Нап еї а!., 2015; І опа єї аї., 2014). Було показано, що ММР?7 відіграє важливу роль у сприянні розвитку пухлин, таких процесах як деградація білків позаклітинного матриксу, активація проліферації пухлинних клітин шляхом підвищення біологічної доступності інсуліноподібного фактору росту і гепарин-зв'язувального епідермального фактора росту, і індукція апоптозу у клітинах, прилеглих до пухлини, шляхом відчеплення зв'язаного з мембраною ГРабз-ліганду (Ії еї а!., 2006).

Ген МКОНЄВ, також відомий під назвою Свогї73, локалізуються на хромосомі 8424.3 (ВНеїзед, 2002).

Ген МХ1 кодує білок, що метаболізує гуанозинтрифосфат (ГТФ). Цей білок індукується інтерферонами типу І і типу ІІ ї бере участь у відповіді клітин на дію вірусів (Веїбеад, 2002). Роль

МХІ1 в онкології поки що повністю не з'ясована. З одного боку, існує зворотна кореляція рівню експресії МХІ з раком передміхурової залози, спостерігається зниження метастазування і підвищення чутливості до доклетакселу. Більш того, був виявлений епігенетичний сайленсинг

МХ1 шляхом гіперметилювання у пласкоклітинній карциномі голови та шиї. Експресія МХ1 знижує рухливість клітин і інвазію ліній клітин раку передміхурової залози і меланоми, все це сприяє пригнічувальній дії МХ1 на пухлину (Вгомуп вї а!., 2015; СаІтоп єї аіІ., 2009; МизпіпекКі єї аім,, 2009). З іншого боку, однонуклеотидний поліморфізм у гені МХІ має зв'язок із раком передміхурової залози, а високий рівень експресії МХ1 пов'язаний з метастазами у лімфатичні вузли при колоректальному раку, що свідчить про онкогенні властивості МХІ (Стопег єї аї., 2014; Сіутри єї а!., 2013).

Ген МХКА5 кодує один із пов'язаних з ремоделюванням матриксу білків, який містить 7 лейцин-збагачених повторів і 12 імуноглобуліноподібних доменів С2-типу, споріднених із перлеканом (НеїзЗед, 2002). У проведеному в Китаї дослідженні МХКА5 виявився другим за частотою мутованим геном у недрібноклітинному раку легенів (Хіопу еї аЇ., 2012). Було показано, що МХКА5б5 є надмірно експресованим при раку товстої кишки і його можливо використовувати як біомаркер для ранньої діагностики і метастазів у сальник (70и еї аї.,2002;

Мапа еїга!., 2013а).

Ген МУНО кодує важкий ланцюг традиційного нем'язового міозину ІА, який містить 1(-домен і домен, подібний "голівці" міозину, що здійснює декілька важливих функцій, включаючи цитогенез, рухливість клітин і підтримку форми клітин (НеїбЗед, 2002). Було показано, що високий півень експресії МУНО асоціюється з несприятливим прогнозом пласкоклітинної карциноми стравоходу і, у комбінації з анексином ІІ і білком "Кіпаїїпд-2", може служити при цьому захворюванні прогностичним біомаркером загальної виживаності і виживаності без ознак захворювання (Хіа еї аї., 2012; Сао єї а!., 2014). Мутації у гені МУНО були виявлені у зразках раку молочної залози людини. Він диференційно експресується у карциномі товстої кишки (ЄПів5 еї а!., 2012; Ми еї а!., 2013). Дослідження іп міїго і дослідження ксенотрансплантатів вказують на те, що МУНО сприяє росту і інвазії пухлинних клітин різних ліній пухлинних клітин, включаючи клітини раку молочної залози і недрібноклітинного раку легенів (Вобіпзоп еї а!., 2013; І іп еї аї., 2013За; І ипа еї аї., 2012; ОєгусКе еї а!ї., 2011; Мед)Капе єї а!., 2009).

Ген ММ 12А кодує регуляторний легкий ланцюг несаркомерного міозину, який регулює скорочення гладеньком'язових і нем'язових клітин (Атаївспек єї аї., 2004; Веїбєд, 2002).

Повідомлялося, що фосфорилювання МУ 12А сприяє рухливості пухлинних клітин і інвазії іп міїго і на моделі тварин (Маппіпо, «г. еї аї., 2000; Капеко еї аї., 2002; Кпиоп еї аї., 2010). Більш того, ймовірно, що МУГ12А регулює репарацію пошкоджень ДНК і р5З-залежний апоптоз шляхом секвестрування регулятора транскрипції, фактора транскрипції, що протидіє апоптозу (Норкег евї а!., 2012а; НоркКег єї а!., 20125).

Ген МУГ128ЩВ кодує регуляторний легкий ланцюг нем'язового міозину 1 (МУНО).

Фосфорилювання МУЇ128В приводить до вищої активності Мо-АТФази і збірці філаментів міозину Ії (НеїзЗед, 2002). Було показано, що експресія білка підвищена при раку яєчника З ступеню злоякісності і що фармакологічне блокування фосфорилювання або активації МУІ 128 зменшує міграцію пухлинних клітин і інвазію іп міїго і утворення метастазів раку молочної залози на моделі тварин. Ці дані свідчать про про-метастатичну роль МУЇ/1288 (іт еї аї., 2011;

Меппогїгег евї а!., 2014; /Напа єї аї., 2013; Раїе! єї аї., 2012).

Ген РАКОЗВ кодує білок, який локалізується у щільних контактах між клітинами епітелію і бере участь у встановленні полярності клітин (І2акі еї аї., 2005). Було показано, що однонуклеотидний поліморфізм у гені РАКОЗВ має значущий зв'язок із тяжкою

Зо гепатотоксичністю, пов'язаною з лікарськими препаратами, у дітей з гострим лімфобластним лейкозом або лімфобластною лімфомою (Ногіпоисні еї аї., 2010).

Ген РОЇІАбЄ (який також має назву ЕКр5) кодує білок дисульфідізомеразу, яка є резидентним білком ендоплазматичного ретикулуму (ЕР) і каталізує утворення, розпад і ізомеризацію дисульфідних зв'язків у білках. Вважають, що вона відіграє роль у фолдингу білків, з'єднаних дисульфідним зв'язком (ВеїбЗед, 2002). Імунне забарвлення мікрозразків тканини передміхурової залози для виявлення РОІАбЄ показало значуще вищу імунореактивність передракових уражень у порівнянні з незлоякісним епітелієм (Р « 0,0001, О-критерій Манна-

Уїтні) і у зразках раку з високим балом за шкалою Глісона (4-5) у порівнянні зі зразками з низьким показником злоякісності (2-3) (Р « 0,05) (Сіеп еї аї., 2010). Високий рівень експресії

ЕКр5/АБАМІ10 призводить до злущування МІСА і до порушення впізнавання МКО2О-лігандів у мікрооточенні лімфатичного вузла у ходжкінських лімфомах. Це веде до зниження рівня поверхневої експресії МКО2О на СО8 Т-клітинах і до неефективної протипухлинної відповіді (2осспі єї аї., 2012). Білки дисульфідізомерази РОЇІА4 ії РОІАЄ опосередковують резистентність до дії цисплатину, який викликає загибель клітин аденокарциноми легенів (Нотгібе еї аї., 2014).

Ген РІКЗІРІ кодує білок 1, який взаємодіє з фосфоінозитид-3-кіназою, інгібітором РІЗК (Веїзед, 2002). Низький рівень експресії РІКЗІР1 веде до підвищеного росту клітин у пухлинах

Т-клітинної лімфобластної лімфоми людини (У/опд еї аї., 2014). Рівень експресії РІКЗІРІ є зниженим у гепатоцелюлярній карциномі (ГЦК), ї РІКЗІР1 пригнічує розвиток ГЦК (Не еї аї., 2008).

Ген РГЕС кодує члена сімейства плакінів, плектин, білок, який бере участь у утворенні перехресних зв'язків і організації цитоскелета і комплексів адгезії (Восатеитг єї а!., 2014). Р ЕС надмірно експресується у колоректальній аденокарциномі, пласкоклітинній карциномі голови та шиї і пухлинах раку підшлункової залози (ее еї аї.,2004; Каїада еї аї., 2012; Вайзсп еї аї., 2011).

Ген РОТЕЕ кодує сімейство РОТЕ поліпептидів, що містять анкіриновий домен, члена Е, одного з 13 паралогів, що належать до сімейства генів РОТЕ. Вважається, що гени РОТЕ являють собою нове сімейство раково-тестикулярних антигенів. Біологічна функція сімейства генів РОТЕ поки що повністю не з'ясована, але деякі результати свідчать про їх проапоптотичну дію (ій єї аї., 2009; Вега єї аІ., 2006). РОТЕЕ переважно експресується у ракових пухлинах

Ге) передміхурової залози, молочної залози, товстої кишки, легенів і яєчника (Вега еї аї.,2006). В одному із досліджень було описано, що РОТЕЕ має тісний зв'язок з раком молочної залози. Ці результати були отримані з використанням комбінованого транскриптомного і протеомного аналізу (Сіпе еї а!., 2014).

Ген РОТЕБЕ кодує РОТЕ сімейство РОТЕ поліпептидів, що містять анкіриновий домен, члена

У, одного з 13 паралогів, що належать до сімейства генів РОТЕ. Вважається, що гени РОТЕ являють собою нове сімейство раково-тестикулярних антигенів. Біологічна функція сімейства генів РОТЕ поки що повністю не з'ясована, але деякі результати свідчать про їх проапоптотичну дію (ім еї а!., 2009; Вега еї а!., 2006). Було показано, що РОТЕБК викликає апоптоз клітин Неїа через мітохондріальний шлях (Гішй єї аі., 2009). РОТЕЕ переважно експресується у ракових пухлинах передміхурової залози, молочної залози, товстої кишки, легенів і яєчника (Вега вї аї., 2006).

Ген РОТЕЇ локалізується на хромосомі 2421.1 і кодує сімейство РОТЕ поліпептидів, що містять анкіриновий домен, члена І, одного з 13 паралогів, що належать до сімейства генів

РОТЕ. Вважається, що гени РОТЕ являють собою нове сімейство раково-тестикулярних антигенів. Біологічна функція сімейства генів РОТЕ поки що повністю не з'ясована, але деякі результати свідчать про їх проапоптотичну дію (Гіш єї аїЇ., 2009; Вега єї аЇ., 2006). РОТЕЇ переважно експресується у ракових пухлинах передміхурової залози, молочної залози, товстої кишки, легенів і яєчника (Вега єї а!., 2006).

Ген РОТЕУ кодує РОТЕ сімейство РОТЕ поліпептидів, що містять анкіриновий домен, члена

У, одного з 13 паралогів, що належать до сімейства генів РОТЕ. Вважається, що гени РОТЕ являють собою нове сімейство раково-тестикулярних антигенів. Біологічна функція сімейства генів РОТЕ поки що повністю не з'ясована, але деякі результати свідчать про їх проапоптотичну дію (ім еї аї., 2009; Вега єї аІ., 2006). РОТЕУ переважно експресується у ракових пухлинах передміхурової залози, молочної залози, товстої кишки, легенів і яєчника (Вега еї аї., 2006).

Ген РОТЕКР кодує РОТЕ сімейство РОТЕ поліпептидів, що містять анкіриновий домен, члена К, псевдогена, який локалізується на хромосомі 2421.1 (Веїбеад, 2002).

Ген РОТЕМ кодує РОТЕ сімейство РОТЕ поліпептидів, що містять анкіриновий домен, члена

М, одного з 13 паралогів, що належать до сімейства генів РОТЕ. Вважається, що гени РОТЕ являють собою нове сімейство раково-тестикулярних антигенів. Біологічна функція сімейства

Зо генів РОТЕ поки що повністю не з'ясована, але деякі результати свідчать про їх проапоптотичну дію (ім єї аї!., 2009; Вега евї а!., 2006). РОТЕМ був ідентифікований як специфічний транскрипт для нормальних і злоякісних тканин передміхурової залози (001ІК евїаї!., 2004).

Ген РТЕКЕ кодує полімеразу І і рілізинг-фактор транскрипції, регулятор транскрипції РРНК, який сприяє дисоціації комплексів транскрипції і повторно ініціює полімеразу І на вивільнення рРНК-транскриптів, що ростуть (ВНеїбед, 2002). Експресія РТЕЕ знижена у лініях клітин раку молочної залози і тканинах пухлин молочної залози (Ваї єї аЇ., 2012). РТКЕ є маркером недрібноклітинного раку легенів (Сатез-Роо вї а!., 2012). Експресія РТЕЕ знижена у пухлинах раку передміхурової залози, і відсутність РТКЕ у клітинах раку передміхурової залози відіграє значну роль у прогресуванні пухлин і розвитку метастазів шляхом підвищення ангіогенного потенціалу ракових клітин (Мавззаг єї а!., 2013).

Ген РОЗ7ІЇ. кодує білок, подібний до гомологу псевдоуриділат-синтази 7 (дріжджі), білок з можливою псевдоуридин-синтазною активністю. Ген РОЗ7Ї. локалізується на хромосомі 12412 (Веїзеад, 2002).

Ген КАМ кодує КАМ, члена сімейства КА5-онкогенів, невеликий ГТФ-зв'язувальний білок, що бере участь у транслокації РНК і білків через комплекс ядерних пор, у контролі синтезу ДНК і проходженні клітин через клітинний цикл, у формуванні і організації мережі мікротрубочок і у активації андрогенного рецептора (Неїбед, 2002). КАМ є ключовим білком у метастатичному прогресуванні раку. КАМ надмірно експресується у цілому ряді пухлин, таких як молочної залози та нирки (Маїснеї! єї аі., 2014).

Ген КАМРІ кодує КАМ, псевдоген 1, члена сімейства КАБ-онкогенів, псевдоген, який локалізується на хромосомі бр21.33 (ВНеїзЗед, 2002).

Ген КАЗА4 кодує активатор 4 КА5-білка (рг21), Са (2)-залежний ГТФазу-активуючий білок, який деактивує Каз-МАРК-шлях у відповідь на дію Са (2-4) (ВНеїбЗеад, 2002). КАБА4 є значуще ампліфікованим у первинній ефузійній лімфомі (Ноу еї аїЇ., 2011). КАБА4 диференційно експресується у аденокарциномі ендометрію у порівнянні з нормальним ендометрієм (Уеєда єї а!., 2014).

Ген КАБА4В кодує активатор 48 КАЗ-білка (р21), Са (25)-залежний ГПФазу-активуючий білок, який, можливо, бере участь у регуляції Каз-МАРК-шляху (Веїбеад, 2002)

Ген КСМІ кодує ретикулокальбін 1, білок із кальцій-зв'язувальним доменом "ЕР-Напа", бо кальцій-зв'язувальний білок, локалізований у порожнині ендоплазматичного ретикулуму. КСМІ1 локалізується у плазматичній мембрані клітин ліній раку ендотелію і передміхурової залози людини (Неїбед, 2002). Експресія КСМІ підвищена у хворих на рак молочної залози (Атаїзснек еї а!., 2004).

Ген КО54 кодує регулятор 4 сигнального шляху с-білка, ГП Фазу-активуючий білок (САР) для субодиниць б-альфа гетеродимерних О-білків (Неїзед, 2002). Був виявлений статистично значущий низький рівень експресії КО54 у метастазах в печінку і на фронті інвазії пухлини у порівнянні з первинною пухлиною підшлункової залози (Міедегдейтапп есеї аї., 2007). На54 дуже часто є надмірно експресованим у карциномах щитоподібної залози, хоча він не експресується у нормальних тканинах людини (Мікоїома єї а!., 2008). Транскрипт КО54 був виявлений у неракових іморталізованих клітинах епітелію поверхні яєчника у рівнях, у декілька тисяч разів вищих за рівень його експресії у клітинних лініях раку яєчника (Нитгві єї а!., 2009).

Ген КРОб кодує рибосомний білок 56, білок цитоплазматичних рибосом, компонент субодиниці 405 рибосом. КРБОб може робити свій внесок у контроль росту і проліферації клітин шляхом селективної трансляції конкретних класів ІРНК (НеїбЗед, 2002). КРБЗб є низхідною мішенню ттТоК і, як було виявлено, асоціюється з багатьма фізіологічними і патофізіологічними функціями (Спеп єї аЇ., 2014а) Фосфорилювання КРОб ослаблює пошкодження ДНК і пригнічення розвитку пухлин раку підшлункової залози (КпНаїаїей еїаї., 2013).

Ген КРБЗ8 кодує рибосомний білок 58, білок рибосом цитоплазми, який є компонентом субодиниці 405 рибосом. Експресія КРЗ8 підвищена у колоректальних пухлинах і поліпах товстої кишки у порівнянні з відповідною нормальною слизовою оболонкою товстої кишки (Веїбед, 2002). Підвищена експресія КРБЗВ8 у пацієнтів з аденокарциномою протоків підшлункової залози корелює з короткою тривалістю життя (Спеп еїаї., 2015).

Ген КРБЗ8РІ10 кодує псевдоген 10 рибосомного білка 58, псевдоген, який локалізується на хромосомі 15411.2 (НеїзЗеад, 2002).

Ген 5005 кодує секретогранін М (782-білок), нейроендокринний секреторний білок (Ропе!їа-

Сютез єї аі!., 2008). Подвоєння, що охоплює 3'"-кінець гена 5СО5 і ділянку до локусу СКЕМ'І, може підвищити ризик розвитку колоректального раку (даеєдег єї аї., 2012; Мапа еї аї., 201460).

Ген ЗЕБЕРІМВАІ2 кодує інгібітор серпінпептидази, клада В (овальбумін), члена 2, який інгібує дію активатору плазміногену - позаклітинної протеази урокіназного типу, і тканинного

Зо активатору плазміногену (Зспгодег єї аї., 2014). БЕКРІМВ2 експресується у декількох різних видах пухлин. Експресія ЗЕКРІМВ2 асоціюється зі сприятливим прогнозом при раку молочної залози і підшлункової залози, але з несприятливим прогнозом при раку ендометрію і яєчника і при колоректальному раку (5спгодег" єї а!., 2014).

Ген БЕКРІМВЗ кодує протеазний інгібітор, інгібітор серпінпептидази, клада В (овальбумін), члена З (НеїзЗед, 2002). ЗЕКРІМВЗ є Каз-чутливий фактор, який відіграє важливу роль у Каз5- асоційованій продукції цитокінів і пухлиногенезі (Саїаплато єї аїЇ., 2014). 5ЕВРІМВЗ експресується у високих кількостях у гепатоцелюлярній карциномі (Ропіївзо, 2014). ФЕВРІМВЗ асоціюється з розвитком раку яєчника (ІГіт апа опо, 2013).

Ген ЗБЕКРІМВА кодує протеазний інгібітор, інгібітор серпінпептидази, клада В (овальбумін), члена 4 (НеїбЗед, 2002). ЗЕКРІМВ4 є Каз-чутливий фактор, який відіграє важливу роль у пов'язаній з Каб продукції цитокінів і пухлиногенезі (Саїаплаго єї аї., 2014). 5БЕВРІМВ4А експресується у високих кількостях у гепатоцелюлярній карциномі (Ропіївзо, 2014).

Ген ЗЕКРІМНІ кодує інгібітор серпінпептидази, клада Н (білок 47 теплового шоку), члена 1 (колаген-зв'язувального білка 1), інгібітор серинпротеази. БЕЕРІМНІ діє як колаген-специфічний молекулярний шаперон у ендоплазматичному ретикулумі (ВНеїбЗед, 2002). ФЕВРІМНІ надмірно експресується при багатьох видах раку людини, включаючи рак шлунка, аденокарциному протоків підшлункової залози, гліому, і карциномах, асоційованих з виразковим колітом (7пао сеї а!., 2014).

Ген ЗЕ26Ї. кодує гомолог білка 6, подібного до мишачого, що має зв'язок з епілептичними нападами, трансмембранного білка з багатьма доменами, які беруть участь у міжбілковій взаємодії і передачі сигналів (Мівєпіока єї аї., 2000). 5Е26І є гіперметильованим при раку шлунка (Капоа еї аї!., 2008) 5Е26Ї надмірно експресується у високих кількостях у лініях клітин недрібноклітинного раку легенів і дрібноклітинного раку легенів, а також у зразках первинних пухлин у порівнянні з нормальними тканинами легенів (Согіом єї аї., 2007).

Ген 5ІСІбАЗ кодує члена 3 сімейства переносників розчинених речовин 16, монокарбоксилатний переносник у симпорті з протоном (Неїбед, 2002). У більшості солідних пухлин, як відомо, вироблення енергії базується на гліколізі. Високі швидкості гліколізу призводять до підвищеної продукції лактату, який асоціювався з несприятливим клінічним результатом і прямим внеском у ріст і прогресію пухлин. 5ЇС16А є одним з небагатьох бо монокарбоксилатних переносників, які прискорюють експорт лактату з ракових клітин (Опир еї а!., 2012; Огаоці апа Регоп, 2011). Експресія 5І С16АЗ асоціювалася з несприятливим прогнозом у пацієнтів з гепатоцелюлярним раком і підвищеною проліферацією, міграцією і інвазією клітин у експериментах на клітинних лініях (Сіао єї аї!., 2014а). Функціональна причетність ЗІ С16АЗ до пухлиногенезу була продемонстрована для підгрупи ракових захворювань підшлункової залози (ВаєкК єї аї., 2014)

Ген МТС! кодує фактор 1 утворення поперечних зв'язків між мікротрубочками. Було показано, що МТСІ1 бере участь у ремоделюванні мікротрубочок, яке залежить від полярності, і опосередковує реорганізацію нецентросомальних мікротрубочок, специфічну для епітеліальних клітин, шляхом утворення поперечних зв'язків між мікротрубочками (зай бї аї., 102013).

Ген 55тТ кодує препробілок гормону соматостатину. Соматостатин експресується по усьому організму і інгібує вивільнення численних вторинних гормонів. Цей гормон є важливим регулятором ендокринної системи шляхом його взаємодії з гіпофізарним гормоном росту, тиреотропним гормоном і більшістю гормонів шлунково-кишкового тракту. Соматостатин впливає також на швидкість нервової передачі у центральній нервовій системі ї на проліферацію як нормальних, так і онкогенних клітин (ВНеїбед, 2002). Аналоги гена 551 успішно використовуються і проходять подальші дослідження як терапевтичний підхід до лікування нейроендокринних (карциноїдних) пухлин шлунково-кишкового тракту і підшлункової залози, гепатоцелюлярного раку і раку молочної залози (Рімопеїо еї а!., 2014; СиПег, 2011; Арреїесспіа апа Ваїйдеїйї, 2010; Моадіїп еїаї., 2010; Май еї а!., 2008).

Ген ТНУ1 є кандидатом у гени-супресори пухлин у назофарингеальній карциномі, як носій антиінвазивної активності (І ипо еї а!., 2010).

Ген 15022204 кодує білок, який є членом сімейства білків із доменом Т5С022, регуляторів траскрипції, що містять структурний мотив "лейцинова застібка-блискавка" (Неїзед, 2002). Рівні т5022054 у печінці були підвищені при раковій кахексії (Чопез еї а!., 2013).

Ген ТОВАТА кодує альфа-тубулін а. Експресія ТИОВАТА переважно виявлена у морфологічно диференційованих нервових клітинах. Мутації у цьому гені є причиною лісенцефалії 3-го типу (1153) - вади нервової системи, яка характеризується мікроцефалією, розумовою відсталістю, виникненням епілепсії у ранньому віці. У основі лісенцефалії лежать

Зо дефекти нейрональної міграції (ВНеїЗед, 2002). Порушення регуляції експресії ТОВАТА та деяких інших генів, викликані хромосомними перебудовами у трансформованих під дією випромінювання і онкогенних ліній клітин молочної залози, можуть бути віддзеркаленням ранніх молекулярних подій у канцерогенезі молочної залози (пдег еї аї., 2010). За допомогою порівняльного протеомного аналізу поширеної карциноми серозного епітелію яєчника ТОВАТА був ідентифікований як один із потенційних факторів передбачення хіміорезистентності (Кіт єї а!., 2011).

Ген ТОВАТВ кодує альфа-тубулін 15 (Неїбед, 2002). Різна експресія ТОВАТ1В у комбінації з експресією деяких інших генів асоціювалася з прогнозом при лімфомі з клітин мантійної зони, передбаченням рецидиву у пацієнтів зі стадією | колоректального раку і розрізнянням увеальної меланоми з метастазами та без (ВіепкК еї аї., 2008; Адезеп евї аї., 2012; І іпде еї аї., 2012). Експресія ТОВА1ТВ підвищувалась у тканинах гепатоцелюлярного раку і проліферуючих клітинах гепатоцелюлярного раку. Підвищена експресія ТОВАТВ була пов'язана з низької загальною виживаністю і резистентністю до паклітакселу у пацієнтів з гепатоцелюлярним раком (би єї аїЇ.,, 201За). У клітинах раку яєчника знижена експресія ТОВАТВ асоціювалася з резистентністю до оксаліплатину (Титтагїйа еї а!., 2009).

Ген ТОВАТ1С кодує альфа-тубулін 1с (НеїзЗед, 2002). Було показано, що експресія ТОВАТС підвищена при остеосаркомі і гепатоцелюлярному раку, пов'язаному з інфікуванням вірусом гепатиту С, ії що вона може бути потенційним біомаркером пухлиногенезу при остеосаркомі або високодиференційованому гепатоцелюлярному раку, пов'язаному з інфікуванням вірусом гепатиту С (Кигатіїзи єї а!., 2011; її еї аї., 2010).

Ген ТОВАЗС кодує альфа-тубулін Зс (НеїзЗеад, 2002). Ген ТОВАЗО кодує альфа-тубулін За (НеїбЗед, 2002). Ген ТИОВАЯ4А кодує альфа-тубулін 4а (Неїбед, 2002). За допомогою порівняльного протеомного аналізу пласкоклітинної карциноми стравоходу (ПККС) була показана підвищена експресія ТОВА4ДА (О) єї аї., 2005).

Ген ТОВАВ8 кодує альфа-тубулін 8. Мутації у ТОВА8 асоціюються з полімікрогірією і з гіпоплазією зорового нерва (Неїбед, 2002). Після лікування фенобарбіталом, негенотоксичним канцерогеном, у печінці мишей індукувалася експресія ТОВАВ8. Було показано, що у клітинних лініях гепатоцелюлярної карциноми надмірна експресія ТОВА8 впливає на ріст, проліферацію і міграцію клітин (Катіпо єї а!., 2011).

Ген ОСМ3З є членом сімейства соувагіну/кортикотропін-вивільнюючого фактору/уротензину І.

Він структурно подібний до гена, що кодує кортикотропін-вивільнюючий фактор (КВФ), і продукт, що кодується, є ендогенним лігандом для рецепторів КВФ типу 2. Можливо, що у головному мозку він є відповідальним за дію стресу на апетит (Неїбед, 2002). Осп3 виробляється у нормальних надниркових залозах і їх пухлинах (як у адренокортикальних пухлинах, так і у феохромоцитомах) і діє як аутокринний і паракринний регулятор у нормальних надниркових залозах і їх пухлинах (ТакКанНабвні єї а!І., 2006). Урокортин З активує метаболічні шляхи АМРК і

АК і підвищує засвоєння глюкози скелетними м'язами щурів (Ноивіїй еї аї!., 2014).

Ген МСАМ є членом сімейства протеогліканів, що складається з агрекану і версикану. Білок, що кодується ним, є великим хондроїтинсульфат протеогліканом і являє собою головний компонент позаклітинного матриксу. Цей білок бере участь у клітинній адгезії, проліферації, міграції і ангіогенезі і відіграє головну роль у морфогенезі і підтримці життєдіяльності тканин (Веїзед, 2002). Експресія МСАМ регулюється у раково-асоційованих фібробластах рецептором

Таг-бета типу ІІ і ЗМАЮ-сигнальним каскадом. Підвищена експресія МСАМ сприяє рухливості і інвазії клітин раку яєчника за рахунок активації сигнального шляху МЕ-каппавВ і підвищення рівня експресії СО44, матричної металопротеїнази-9у і рецептора гіалуронан-опосередкованої рухливості (УМецпд еї аї., 2013). Генетичний підпис ремоделювання колагену, включаючи сигнальний шлях ТОЕ-бета, регульований МСАМ, асоціювався з метастазами і низькою виживаністю при серозному раку яєчника (Спеоп еї аЇ,, 2014). МСАМ виявляє значуще підвищену експресію у КРК у порівнянні з відповідними зразками здорової слизової оболонки товстої кишки і пухлинними тканинами 53 пацієнтів (Рішіє еїаї!., 2013).

Ген 16 безкрилого типу сімейства інтеграції ММТУ, член 16, кодує секретований сигнальний білок, який бере участь у онкогенезі і у декількох процесах розвитку, включаючи регуляцію спеціалізацію клітин і формування біологічного патерну під час ембріогенезу (Неїбеад, 2002).

Було показано, що експресія М/МТ16 є підвищеною при гострому лімфобластному лейкозі (ГЛЛ) з хромосомною транслокацією ї (1;19) і відіграє важливу роль у лейкозогенезі (Сазадгапає єї а!., 2006; Ма?лієгез єї а!., 2005). Дослідження клітинних ліній ГЛЛ і зразків, отриманих у пацієнтів з ГЛЛ, показали, що підвищена експресія М/МТ16 і декількох інших генів-мішеней у сигнальному шляху М/МТ, викликана метилюванням інгібіторів МУпі, вона також асоціюється зі значуще

Зо зниженими 10-річними виживаністю без ознак захворювання і загальною виживаністю (Нотап-

Соте? еї аї., 2007).

Ген МУ/УМТ5А належить до сімейства генів М/МТ, яке складається з структурно споріднених генів, які кодують сигнальні білки, що секретуються. Ці білки задіяні у онкогенезі і у декількох процесах розвитку, включаючи регуляцію спеціалізацію клітин і формування біологічного патерну під час ембріогенезу. Ген М/МТ5А кодує члена сімейства генів УУМТ, який є елементом сигнальних шляхів МУМТ, як канонічного, так і неканонічного. Цей білок є лігандом для семипрохідного трансмембранного рецептора 5, що завивається, і орфанного тирозинкіназного рецептора 2. Цей білок відіграє суттєву роль у регуляції процесів розвитку зародку під час ембріогенезу. Цей білок може також відігравати певну роль у онкогенезі (Веїбед, 2002). ММТ5А надмірно експресується у КРК їі має показник зіставності 76 96 між первинною пухлинною і метастазами (ее еї аї., 2014). Експресія М/МТ5А підвищена і він є ключовим регулятором епітеліально-мезенхімального переходу і метастазування у клітинах карциноми шлунка людини, назофарингеальної карциноми і раку підшлункової залози (Капгама евї а!., 2013; 7пи еї аї., 2014;

Во еї аї., 2013).

Стимуляція імунної відповіді залежить від присутності антигенів, що сприймаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Відкриття пухлино-асоційованих антигенів зробило можливим використання імунної системи хазяїна для втручання в ріст пухлини. Зараз вивчається можливість використання для імунотерапії раку різних механізмів задіяння як гуморальної, так і клітинної ланки імунної системи.

Специфічні елементи клітинної імунної відповіді здатні специфічно розпізнавати та знищувати пухлинні клітини. Виділення Т-клітин із популяції пухлино-інфільтруючих клітин або з периферичної крові говорить про те, що такі клітини відіграють важливу роль у природному імунному захисті проти раку. Важливу роль у цій відповіді відіграють, зокрема, СО8-позитивні Т- клітини, які розпізнають пептиди, зв'язані з молекулами головного комплексу гістосумісності І класу (МНС). Ці пептиди зазвичай складаються з 8-10 амінокислотних залишків, що отримані з білків або дефектних рибосомальних продуктів (ОРІР), які містяться у цитозолі. Молекули МНС людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НІ А).

Якщо не зазначено інше, під нижче наведеними термінами, що використовуються у цьому описі, розуміються наступні поняття.

Термін "Т-клітинна відповідь" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом іп міїго чи іп мімо. Для цитотоксичних Т-клітин, обмежених МНЕ |І класу, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней, оброблених пептидом чи пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, ТМЕ-альфа або ІЛ-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно гранзимів чи перфоринів, індукована пептидом, або дегрануляція.

Термін "пептид" використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один 3 одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Бажано, щоб пептиди були довжиною у 9 амінокислот, але можуть бути такими короткими, як довжиною у 8 амінокислот, і такими довгими, як довжиною у 10, 11, 12 13 або 14 амінокислот або більшими по довжині, а у випадку пептидів, що зв'язані з молекулами МНС І класу (подовжені варіанти пептидів за цим винаходом), вони можуть досягати такої довжини, як 15, 16, 17, 18, 19 або 20 амінокислот.

Термін "пептид" використовується також для позначення солей серії амінокислотних залишків, що з'єднані один 3 одним зазвичай пептидним зв'язком між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Переважно, щоб ці солі були фармацевтично прийнятними солями пептидів, наприклад, такими як хлорид або ацетат (трифторацетат). Треба зазначити, що солі пептидів за цим винаходом суттєво відрізняються від пептидів у їхньому стані іп мімо, оскільки пептиди не є солями іп мімо.

Термін "пептид" повинен також включати "олігопептид". Термін "олігопептид" використовується в цьому описі для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для цього винаходу за умови, що він містить правильний епітоп чи епітопи. Олігопептиди зазвичай коротші, ніж довжиною близько амінокислотних залишків, і довші, ніж довжиною близько 15 амінокислотних залишків.

Термін "поліпептид" використовується для позначення серії амінокислотних залишків, що з'єднані один з одним зазвичай пептидними зв'язками між альфа-аміно та карбонільними групами сусідніх амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для цього винаходу за умови, що він містить правильні епітопи. На відміну до термінів "пептид" і "олігопептид", під

Зо терміном "поліпептид" маються на увазі молекули, що містять більш ніж 30 амінокислотних залишків.

Пептид, олігопептид, білок або полінуклеотид, що кодує таку молекулу, має назву "Імуногенного" (і, отже, є ""імуногеном" в межах цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну відповідь. У межах цього винаходу імуногенність точніше визначається як здатність викликати відповідь Т-клітин. Отже, "іімуногеном" може бути молекула, яка здатна індукувати імунну відповідь, і що стосується цього винаходу, молекула, що здатна індукувати відповідь Т- клітин. В іншому аспекті імуноген може бути пептидом, комплексом пептиду з МНС, олігопептидом і/або білком, який використовується для продукції специфічних антитіл або ТКР проти нього. "Епітоп" | класу Т-клітини потребує короткого пептиду, який зв'язаний із рецептором молекули МНС І класу, утворюючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг молекули МНС І класу, бета-2-мікроглобулін і пептид), який може розпізнаватися Т-клітиною, що несе відповідний Т- клітинний рецептор, який зв'язується із комплексом МНС/пептид із належної афінністю.

Пептиди, які зв'язані з молекулами МНС І класу, зазвичай мають довжину в 8-14 амінокислот, і, найбільш типово, довжину в 9 амінокислот.

У людини є три різні генетичні локуси, які кодують молекули МНС І класу (молекули МНС людини мають також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НГА)): НГА-А, НІ А-В і

НІГА-С. НІ А-А"О1, НІ А-А"О02 і НГ А-В"07 є прикладами різних алелів МНС І класу, які можуть експресуватися з цих локусів.

Таблиця 9. Частоти експресії Е для НІ А"А02 і НІ А-А"24 і найбільш поширених серотипів

НГА-ОК. Частоти, отримані з частот виявлення гаплотипів Її серед населення США, адаптовано з публікації Могі і співавт. (Могі еї аЇ., 1997), з використанням формули Харді-

Вайнберга: Е-1- (1-597. Комбінація А"02 або А"24 з певними алелями НІГ А-ОК внаслідок неврівноваженого зчеплення може бути збагаченою або збідненою у порівнянні з передбачуваною на основі індивідуальних частот виявлення. Докладну інформацію див. у

Спапоск і співавт. (Спапоск еї аї., 2004).

Таблиця 10 частоти алелів

АБ | Європеоїднараса(Півнінадмерив) 333330317711111026735 ве | Європесїднараса(Півнчнадмерияу 33333331... 235

ОА | Афроамериканці(Півнчнаймерив) 3331... 33036 ве |Афроамериканці(Півнінадмерик) 33333331. 58035 ов | Американці монголоїдної раси Північна Америка) | 3 2БИ0

Ве | Американцімонголоїдної раси Північна Америка) | 186035

ОВ | Латиноамериканці (Північна Америка) 33333311 31035

Ве | Латиноамериканці (Північна дмерив) 33331... 21055

Сдбаю? Яюія 32303071 585

А фядяї 323237--- 1-33, и5 /П

Таблиця 11 (продовження) частоти алелів оАТЯАЮ? індя ////777771111111111111111111111111111111111112961

Пептиди за винаходом, переважно якщо введені до складу вакцини за винаходом, як описано в цьому документі, зв'язуються з А"02. Вакцина може також містити пептиди, що універсально зв'язуються з молекулами МНС ІІ класу. Таким чином, вакцина за винаходом може застосовуватися для лікування раку у пацієнтів, що є А"02-позитивними, у той час як немає необхідності вибору алотипів МНС ІІ класу завдяки здатності цих пептидів до універсальності зв'язування.

Якщо пептиди, що зв'язуються з НІ А-А"02, поєднати з пептидами, які зв'язуються з іншим алелем, наприклад, А"24, лікуванню можна піддати більший відсоток будь-якої популяції пацієнтів, у порівнянні з охопленням пацієнтів, у яких кожний алель МНО І класу наявний окремо. У той час як у більшості популяцій менше ніж 50 956 пацієнтів може бути охоплено кожним алелем окремо, вакцина, що містить пептиди, які є епітопами НІ А-А"24 ії НІГ А-А"О02, дозволяє вакцинувати принаймні 60 95 пацієнтів у кожній відповідній популяції. Конкретно, наступні відсоткові долі пацієнтів будуть позитивними принаймні до одного з цих алелів у різних регіонах: США - 61 95, Західна Європа - 62 95, Китай - 75 95, Південна Корея - 77 95, Японія - 86 95 (розраховано з даних улмум.аеїІетеднепсіез.пед.

У переважному втіленні термін "нуклеотидна послідовність" стосується гетерополімеру дезоксирибонуклеотида.

Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид або поліпептид, може зустрічатися в природі або може бути сконструйована синтетично. Загалом, сегменти ДНК, які кодують пептиди, поліпептиди та білки за цим винаходом, зібрані з фрагментів кКДНК і коротких олігонуклеотидних лінкерів або з серії олігонулеотидів з утворенням синтетичного гена, що здатний експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, що містить регуляторні елементи, які отримані з оперона мікроорганізму або вірусу.

Термін "нуклеотидне кодування пептиду" в контексті цього винаходу означає нуклеотидну послідовність, що кодує пептид, включаючи штучні (створені руками людини) старт- і стоп- кодони, сумісні з біологічною системою, якою ця послідовність буде експресуватися, наприклад, з дендритними клітинами або іншою системою клітин, застосовних для отримання ТКР.

Зо Для цілей цього винаходу посилання на послідовність нуклеїнової кислоти означає як одноланцюгову, так і дволанцюгову нуклеїнову кислоту. Отже, наприклад, для ДНК, конкретна послідовність, якщо контекст на вказує на інше, відноситься до одноланцюгової ДНК такої послідовності, дуплекса такої послідовності з її комплементом (дволанцюгова ДНК), і комплементу такої послідовності.

Термін "кодуюча ділянка" відноситься до тієї частини гена, яка або природно, або нормально кодує продукт експресії цього гена в його природному геномному оточенні, тобто до ділянки, що кодує іп мімо природний продукт експресії гена.

Кодуюча ділянка може бути ділянкою немутованого ("нормального"), мутованого або зміненого гена, або навіть ділянкою послідовності ДНК або гена, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих фахівцям у галузі синтезу ДНК.

Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гена та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом виродження генетичного коду, і, таким чином, кодує ту ж амінокислоту (ті ж амінокислоти).

Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка містить менш ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи активність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки.

Термін "сегмент ДНК" відноситься до полімеру ДНК у формі окремого фрагмента чи як компонент більшої конструкції ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектора клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронів, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні за відкритою рамкою зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок.

Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з одним ланцюгом ДНК та надає вільний З'ОН-кінець, на якому ДНК-полімераза починає синтез дезоксирибонуклеотидного ланцюга.

Термін "промотор" означає ділянку ДНК, яка бере участь у зв'язуванні РНК-полімерази для ініціації транскрипції.

Термін "виділений" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, існуючий у природі полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тваринах, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектора, і (або) такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і все ж таки бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища.

Ці полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; скоріше він має відносне значення та може включати препарати високого ступеню очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі

Зо розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки КДНК, були стандартним чином очищені до електрофоретичної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири-п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99,999, або принаймні в 99,99 95 чи 99,9 9б; і навіть бажано 99 95 за масою чи більше, також чітко пропонується у винаході.

Нуклеїнові кислоти та поліпептиди як продукти експресі, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які містять такі нуклеїнові кислоти і (або) такі поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні приблизно в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), бажано 0,01 95, за масою, принаймні краще приблизно 0,195 за масою. Також маються на увазі збагачені препарати приблизно в 0,5 9, 1 У, 5 Уо, 10 95 та 20 95 за масою. Послідовності, конструкції, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть, що більш сприятливо, бути у збагаченій чи виділений формі. Термін "активний фрагмент" означає фрагмент, зазвичай пептиду, поліпептиду або нуклеїново-кислотної послідовності, що генерує імунну реакцію (тобто має імуногенну активність) при введенні індивідуально чи, необов'язково, з прийнятним ад'ювантом або у векторі, тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину, до того ж така імунна реакція має вид стимуляції Т-клітинної відповіді у тварини- реципієнта, такої як людина. Альтернативно, "активний фрагмент" також може використовуватись для індукції Т-клітинної відповіді іп міго.

В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються по відношенню до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності.

Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептидаз, таких як трипсин або хімотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки згаданих полінуклеотидів будь-якою з типових ендонуклеаз.

Відповідно до цього винаходу, термін "відсоткова ідентичність" або "відсоток ідентичності" 60 відносно послідовності означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вирівнювання послідовності, яка порівнюється ("Послідовність, що порівнюється"), з описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна послідовність").

Відсоткова ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули:

Відсоткова ідентичність - 100 (1 -(С/А)) де С - кількість відмінностей між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, на довжині вирівнювання між Контрольною послідовністю та Послідовністю, що порівнюється, де () кожна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, і (ії) кожний розрив у Контрольній послідовності та () кожна вирівняна основа чи амінокислота в Контрольній послідовності, котра не має відповідної вирівняної основи чи амінокислоти у Послідовності, що порівнюється, становить відмінність, і (ійї) вирівнювання повинне починатися з позиції 1 вирівняних послідовностей; і К є числом основ або амінокислот у Контрольній послідовності по довжині вирівнювання з

Послідовністю, що порівнюється, причому будь-який розрив, створений у Контрольній послідовності, також вважається основою або амінокислотою.

Якщо існує вирівнювання між Послідовністю, що порівнюється, та Контрольною послідовністю, для якої відсоткова ідентичність, що розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Відсоткова ідентичність, то Послідовність, що порівнюється, має зазначену мінімальну відсоткову ідентичність до Контрольної послідовності, хоча можуть існувати вирівнювання, в яких розрахована, як описано вище, Відсоткова ідентичність є меншою, ніж зазначена Відсоткова ідентичність.

Як згадано вище, цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від 5ЕО ІЮО МО: 1 до 5ЗЕО ІЮО МО: 67 або їхній варіант, який на 88 95 є гомологічним послідовностям від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО: 67 або їхнього варіанту, який викликає перехресну реакцію Т-клітин із зазначеним пептидом. Пептиди за винаходом здатні зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини | класу, або подовжені версії згаданих пептидів - з молекулою ЇЇ класу.

Зо У цьому винаході термін "гомологічний" означає ступінь ідентичності (див. "Відсоткова ідентичність" вище) послідовностей двох амінокислотних послідовностей, тобто пептидних або поліпептидних послідовностей. Згадана вище "гомологія" визначається порівнянням двох послідовностей, що були вирівняні в оптимальних умовах щодо послідовностей, які порівнюються. Таку гомологічність послідовностей можна розрахувати, створивши вирівнювання за допомогою, наприклад, алгоритму СіивіаіМуУ. Загальнодоступне програмне забезпечення для аналізу послідовностей, більш конкретно, Месіог МТІ, СЕМЕТУХ або інші інструменти можна знайти у базах даних у вільному доступі.

Фахівець у цій галузі в змозі оцінити, чи будуть Т-клітини, індуковані варіантом конкретного пептиду, вступати в перехресну реакцію із самим пептидом (Аррау вї а!., 2006; Соіотрені еї аї., 2006; Бопа еї а!., 2001; 7агетрбва еї а!., 1997).

Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюги, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (зокрема, шляхом заміни їх боковим ланцюгом залишку іншої природно існуючої амінокислоти чи якимось іншим боковим ланцюгом) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою

НГА, по суті, у такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 67. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде принаймні зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися зі зв'язувальною щілиною прийнятної молекули МНС, такої як НІ А-А"02 або -ОК, і у такий спосіб принаймні зберігати чи навіть поліпшувати здатність зв'язуватися з ТКР активованих Т-клітин.

Ці Т-клітини можуть згодом вступати в перехресну реакцію із клітинами і знищувати клітини, які експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду як визначено в аспектах цього винаходу. Як можна дізнатися з наукових публікацій і баз даних (ВНаттепзвевє вї аї!., 1999; СзоакКіп еї аї., 1997), окремі позиції пептидів, що зв'язують НІ А, є типово якірними залишками, які формують ключову послідовність, що відповідає зв'язувальному мотиву рецептора НІГА, який визначається полярністю, електрофізичними, гідрофобними властивостями і просторовою структурою поліпептидних ланцюгів, що утворюють зв'язувальну щілину. Отже, фахівець у цій галузі зможе модифікувати амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО 67, зберігаючи відомі якірні залишки, і буде здатний визначити, чи зберігають такі варіанти здатність зв'язувати молекули МНС |І або І бо класу. Варіанти за цим винаходом зберігають здатність зв'язуватися з ТКР активованої Т-

Зо клітини, який потім може вступати в перехресну реакцію з- і знищувати клітини, які експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду як визначено в аспектах винаходу.

Первісні (немодифіковані) пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюга, якщо не зазначено інакше. Переважно, щоб ці заміщення знаходилися на кінці амінокислотного ланцюга. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, наприклад, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, наприклад, коли лейцин замінюється на ізолейцин. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків певні амінокислотні заміщення допускаються частіше, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю за розміром, зарядом, полярністю та гідрофобністю між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень".

Консервативні заміщення визначаються в цьому документі як обмін в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: група 1 - малі аліфатичні, неполярні чи слабо полярні залишки (Аа, зег, Тпг, Рго, Су); група 2 - полярні, негативно заряджені залишки та їх аміди (А5р, Авп,

Сім, СІп); група З - полярні, позитивно заряджені залишки (Ні, Аго, І уз); група 4 - великі аліфатичні неполярні залишки (Меї, І ем, Пе, Маї, Сув); та група 5 - великі ароматичні залишки (Ре, Тут, Пр).

Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але дещо відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну залишком ізолейцину. Високо-неконсервативні заміни можуть включати заміщення кислої амінокислоти полярною, або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їх хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами.

Зо Звичайно, такі заміщення можуть включати структури, що відрізняються від звичайних І - амінокислот. Отже, Ю-амінокислоти можуть заміщуватися І-амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах цього винаходу та все ж охоплюються розкриттям в ньому.

Крім того, нестандартні амінокислоти (тобто інші, ніж стандартні амінокислоти природних білків), також можуть використовуватись для заміщення з метою отримання імуногенів та імуногенних поліпептидів відповідно до цього винаходу.

Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції приводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Як правило, в пептиді замінюються одночасно не більш ніж 4 позиції.

Пептид, що по суті складається з амінокислотної послідовності як зазначено у цьому документі, може мати одну або дві неякірні амінокислоти (див. нижче пояснення щодо якірного мотиву), що були замінені без того, щоб здатність пептиду зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу суттєво змінилася або піддалася негативному впливу у порівнянні з немодифікованим пептидом. У іншому пептиді, що складається або по суті складається з цієї амінокислотної послідовності як зазначено у цьому документі, одна або дві амінокислоти можуть бути замінені партнерами по консервативній заміні (також див. нижче у цьому документі) без того, щоб здатність пептиду зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини | або ІІ класу суттєво змінилася або піддалася негативному впливу у порівнянні з немодифікованим пептидом.

Ті амінокислотні залишки, що не є суттєвими для взаємодії з Т-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має суттєвого впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНО. Отже, за винятком зазначеної умови, пептид за винаходом може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи її варіант, як він є.

Таблиця 12

Варіанти і мотив пептидів відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 4, 29 і 30 111111. Позиця | 11213456 785 //// / 85Б0ю0М4 |5|0|У 54РР|Р|ЇКкХ

Варіанти ни М ПО ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ НОТ пи М ПО ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ КООСА гг ня ПИ ПИ ПОЛЯ ПНЯ ПОН ПОН КАН КАС

НИ МГ ПО ПНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НАННЯ КОСУ

НИ МГ ПИ ПНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НАННЯ НА

МИ МГ ПО ПНЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НАННЯ УЧ

ГАЇ Її 7177171 117

ГАЇ Її 71 7171 1 171

ГАЇ Г1 71711

ГАЇ Її 17 1 1 1 А мі її 717 1771711 мі її 717 171 1 1 (мі її 71 1 1 1 11 1міІ 1 11111 1

МИ ПИ ПИ ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ НОТ г

МИ М ПИ ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ НА

771

Го 17717711 11 191 1 17171171 1 91 17717711 1 1 91 171 11111 71111111 Позиця ...// | 1121314 5167/8185. /// 85Б00Ммог3 7 || 1ф|0|Е ХХ |о9оГА/

Варіанти ния М Я ПО ПНЯ ПОН НОЯ НАННЯ КОСА п МЛ ПО ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ ПОАКТ п М ПО ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ АН

ПА мі її 717 171 1 1 мі 17177171 (мі її 71 1 1 1 11 (мі її 71 1 111

ГАЇ Її 7177171 1 1

ГАЇ Її 17 171 1717

ГАЇ Її 17 171 1 1

ГАЇ ЇЇ 1 1 1771 1 ни ПИТИ М ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ КОСА ни ПИТИ М ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ ПОАКТ ни ПИТИ М ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ НА гг гг ними пк ПИ ПНЯ ПНЯ ПОН НОЯ НАННЯ КОСА

МИ ПИ ПИ ПНЯ ПОН КОНЯ КОНЯ НАННЯ НОАКТ

МИ п ПО ПО ПОН ПНЯ КОНЯ НАННЯ НАННЯ

Таблиця 13 (продовження) 11111111 Позлця 7 | 1 | 2 3| 4516 7 |8|5 пи ли Я ПНЯ ПО НОЯ КОНЯ КОНЯ КО У пи ие Я ПНЯ ПО ПО ПО КОНЯ НОЯ пи ие Я ПНЯ ПО ПО ПОН НАННЯ НАУ пи ие Я ПНЯ ПО ПО ПО КОНЯ КАК 911 1 її А 11111111 Позиця 7 | 112131 4|516|7 85 80 0Мо3зо |У | Е|Сс|РІ|Т І

Варіанти пи п ПИ ПНЯ ПО ПО ПОН КОНЯ КОСА ни п Я ПНЯ ПО ПО ПО КОНЯ КАС ни п Я ПНЯ ПО ПО ПОН КОНЯ КО ЧН гм 1 717 71 1 1 11

Гм 11717171

Гм 17171171 гм 1 1 1 1 їх ни г Я ПНЯ ПО НОЯ КОНЯ КОНЯ КОСА ня п ПО НОЯ НО ПОН КОНЯ АНЯ АТ ни и Я ПНЯ ПО ПОН КОНЯ КОНЯ КАК

ГА 7171711 11

ГАЇ Її 1 1 її 17

ГАЇ 1 1 1 1117

ГАЇ ГГ її її 11

ГАЇ 1 1 1 її А гг пи ли Я ПНЯ ПО ПО ПОН КОНЯ КА гг

Г1т7770171717177 11 я пе п ОО ПО НОЯ КОНЯ НОЯ КО пи ие Я ПО ПО ПО ПО ННЯ НАС пи ие Я ПНЯ ПО ПО ПО КОНЯ КАК

Геї 1 11 11 111

Більш довгі (подовжені) пептиди також можуть бути придатними. Можливо, щоб епітопи комплексу МН І класу, хоча вони мають зазвичай довжину 8-11 амінокислот, утворювались шляхом процесингу з більш довгих пептидів чи білків, які включають фактичний епітоп. Бажано, щоби бокові залишки фактичного епітопу не завдавали значного впливу на протеолітичне розщеплення, необхідне для презентації фактичного епітопу під час процесингу.

Пептиди за цим винаходом можуть бути подовжені аж до чотирьох амінокислот, тобто 1, 2, З або 4 амінокислоти можуть біти додані до будь-якого кінця у будь-якій комбінації між 4:0 і 04.

Комбінації подовжень за цим винаходом можуть бути проілюстровані у Таблиці 7.

Таблиця 14

Комбінації подовжень у пептидах за цим винаходом 41

Таблиця 15 (продовження) 77770 буабої, або, абоз,абої 410 0 | б.абої,абог,абоЗ,або4

Амінокислотами для подовжень/елонгацій можуть бути пептиди вихідної послідовності білка або будь-яка інша амінокислота (будь-які інші амінокислоти). Подовження може використовуватися для підвищення стабільності або розчинності пептидів.

Отже, епітопи відповідно цього винаходу можуть бути ідентичними природним пухлино- асоційованим та пухлино-специфічним епітопам або можуть включати епітопи, які відрізняються не більше ніж на чотири залишки від контрольного пептиду, за умови, що вони мають по суті ідентичну антигенну активність.

У альтернативному втіленні пептид є подовженим з будь-якого або з обох боків на більш ніж 4 амінокислоти, переважно до загальної довжини аж до 30 амінокислот. Це може привести до утворення пептидів, що зв'язуються з молекулами МНС ІІ класу. Зв'язування з молекулами МНС

ЇЇ класу може бути перевірено методами, відомими в цій галузі.

Відповідно, за цим винаходом також пропонуються пептидні епітопи і епітопи пептидних варіантів, що зв'язуються з молекулами МНС І класу, де згаданий пептид або його варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30, та найбільш переважно від 8 до 14, а саме 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 амінокислот, а у випадку подовжених пептидів, що зв'язуються з молекулами НГА ЇЇ класу, вони можуть також досягати довжини 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 або 22 амінокислоти.

Зрозуміло, що пептид або його варіант за цим винаходом здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або ІІ класу. Зв'язування пептиду або його варіанту з комплексом МНС може бути досліджено методами, відомими в цій галузі.

Переважно, коли Т-клітини, специфічні по відношенню до пептиду за цим винаходом, досліджують у порівнянні із заміщеними пептидами, причому концентрація пептиду, за якої заміщені пептиди досягають половини максимального росту лізису відносно фонових значень, є не більше ніж 1 мМ, переважно не більше ніж 1 мкМ, ще більш переважно не більше ніж приблизно 1 нМ, і ще більш переважно не більше ніж приблизно 100 пМ, і найбільш переважно не більше ніж приблизно 10 пМ. Переважно також, щоб заміщений пептид розпізнавався Т- клітинами, отриманими від більш ніж однієї особи, принаймні двох, і більш переважно трьох

Зо осіб.

У особливо переважному втіленні цього винаходу пептид складається або по суті складається з амінокислотної послідовності від зхЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО І МО: 67. "По суті складається 3" означає, що пептид за винаходом, на додаток до послідовності відповідно до будь якої послідовності від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮО МО 67, чи його варіант, містить додаткові М- і (або) С-термінальні фрагменти послідовності амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як епітоп для молекул МНС.

Проте ці фрагменти можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду відповідно до цього винаходу в клітини. В одному з втілень цього винаходу пептид є частиною гібридного білка, який містить, наприклад, 80 М-термінальних амінокислот НІ А-ОВ- антиген-асоційованого інваріантного ланцюга (р33, надалі "Ії", одержаного з МСВІ, інвентарний номер в генному банку (СепВапкК) Х00497. У інших злиттях пептиди за цим винаходом можуть бути злиті з антитілом, як описано в цьому документі, або з його функціональною частиною, зокрема з послідовністю антитіла, щоби бути специфічно націленими згаданими антитілами, або, наприклад, злиті з антитілом або з послідовністю антитіла, що є специфічним до дендритних клітин, як описано в цьому документі.

Крім того, пептид чи його варіант може бути додатково модифікований для поліпшення його стабільності і (або) зв'язку з молекулами МНС, щоб викликати сильнішу імунну відповідь.

Методи такої оптимізації пептидної послідовності добре відомі в цій галузі та включають, наприклад, введення реверсованих пептидних зв'язків чи непептидних зв'язків.

В реверсованому пептидному зв'язку амінокислотні залишки не з'єднуються пептидними зв'язками (-СО-МН-), а пептидний зв'язок реверсується. Такі ретро-інверсивні пептидні міметики можуть бути отримані методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі

Мелієге і співавт. (1997) (Ме?лієге сеї а!ї., 1997), яка включена в цей документ шляхом посилання.

Такий підхід включає формування псевдо-пептидів, які містять зміни із залученням остова, а не орієнтації бокових ланцюгів. Мелієге і співавт. (Ме?ієге еї аї!., 1997) показують, що для відповіді

МН і Т-клітин-хелперів зазначені псевдо-пептиди є прийнятними. Ретро-інверсивні пептиди, які містять зв'язки МН-СО замість пептидних зв'язків СО-МН, набагато більш стійкі до протеолізу.

Непептидний зв'язок - це, наприклад, -СН2-МН, -СНе5-, -СНаСНе-, -«СН-СН-, -СОСН»-, -

СнН(ОН)СН»- та -СНг5О-. У патенті США 4 897 445 пропонується метод твердофазного синтезу непептидних зв'язків (-СН2-МН) в поліпептидних ланцюгах, що включає поліпептиди, синтезовані за допомогою стандартних методик, та непептидний зв'язок, синтезований шляхом реакції аміноальдегіду та амінокислоти в присутності МасСМВН»з.

Пептиди, що включають послідовності, описані вище, можуть бути синтезовані з додатковими хімічними групами, присутніми на їхніх аміно- і (або) карбоксильних кінцях, для посилення стабільності, біологічної доступності і (або) афінності пептидів. Наприклад, гідрофобні групи, такі як карбобензоксильні, данзильні чи трет-бутилоксикарбонільні, можуть додаватися до аміно-кінців пептидів. Подібним чином, на аміно-кінцях пептидів може розміщуватись ацетильна група чи 9-флуоренілметоксикарбонільна група. До карбоксильних кінців пептидів може бути додана також гідрофобна група, трет-бутилоксикарбонільна чи амідо- група.

Крім того, пептиди за винаходом можуть бути синтезовані для зміни їхньої просторової конфігурації. Наприклад, може використовуватися ЮО-ізомер одного чи кількох амінокислотних залишків пептиду, а не звичайний І-ізомер. До того ж, принаймні один з амінокислотних залишків пептидів за винаходом може замінюватись одним з добре відомих амінокислотних залишків неприродного походження. Такі заміни можуть служити для підвищення стабільності, біологічної доступності і (або) здатності до зв'язування пептидів за винаходом.

Подібним чином, пептид чи його варіант за винаходом може модифікуватися хімічно, шляхом реакції окремих амінокислот до чи після синтезу пептиду. Приклади таких модифікацій добре відомі в цій галузі та узагальнені, зокрема, в роботі К. І ипабіад, Спетіса! Кеадепів ог

Ргоївіп Моаіїісайтоп, За еа. СВС Ргев5, 2004 (І ипаріад, 2004), яка включена в цей документ шляхом посилання. Хімічна модифікація амінокислот включає, але не обмежується ними, модифікацію шляхом ацилювання, амідинування, піридоксилювання лізину, відновлювального алкілування, тринітробензилювання аміногруп 2,4,6-тринітробензолсульфоновою кислотою (ТМВ5), амідну модифікацію карбоксильних груп та сульфгідрильну модифікацію шляхом окиснення пермурашиною кислотою цистеїну в цистеїнову кислоту, формування похідних ртуті, утворення змішаних дисульфідів з іншими тіольними сполуками, реакцію з імідом малеїнової кислоти, карбоксиметилювання йодоцтовою кислотою чи йодацетамідом та карбамоїлування ціанатом при лужному рнН, хоча способи модифікації не обмежуються наведеними тут. В цьому відношенні досвідчений фахівець може звернутися до Глави 15 публікації Сигтепі Ргоїосої5 Іп

Ргоївіп бсіепсе, Ед5. Соїїдап еї аї. (ойп Уміеу апа 5оп5 МУ 1995-2000) (Соїїдап еї а!., 1995), де докладно описано методику відносно хімічної модифікації білків.

Стисло, модифікація, наприклад, аргінільних залишків часто базується на реакції віцинальних дикарбонільних сполук, таких як фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон і 1,2- циклогександіон, з утворенням адукту. Іншим прикладом є реакція метилгліоксалю з аргініновими залишками. Цистеїн може бути модифікований без супутньої модифікації інших нуклеофільних сайтів, таких як лізин та гістидин. В результаті велика кількість реагентів є доступною для модифікації цистеїну. Веб-сайти таких компаній, як Зідта-Аїагісн (перулумли.відта-аїІагісп.сот), надають інформацію щодо конкретних реагентів.

Селективне відновлення дисульфідних зв'язків також є поширеним. Дисульфідні зв'язки можуть утворюватися і окислюватися під час теплової обробки біофармацевтичних препаратів.

К-реагент Вудворда може використовуватися для модифікації деяких залишків глутамінової кислоти. М-(З-диметиламінопропіл)-М'-етилкарбодіїмід може використовуватися для утворення внутрішньомолекулярних зшивок між залишками лізину і глутамінової кислоти. Наприклад, діетилпірокарбонат є реагентом для модифікації гістидильних залишків у білках. Для модифікації гістидину може також використовуватися 4-гідрокси-2ноненаль. Реакція залишків лізину та інших альфа-аміногруп є, наприклад, прийнятною для зв'язування пептидів до бо поверхонь або поперечного зшивання білків/пептидів. Лізин є сайтом для прикріплення поліетиленглікюолю і головним сайтом модифікації при глікозилюванні білків. Метіонінові залишки у білках можна модифікувати, наприклад, йодацетамідом, брометиламіном і хлораміном Т.

Тетранітрометан і М-ацетилімідазол можуть використовуватися для модифікації тирозильних залишків. Поперечне зшивання шляхом утворення дитирозину може здійснюватися пероксидом водню/іонами міді.

У недавніх дослідженнях модифікації триптофану використовувалися М-бромсукцинімід, 2- гідрокси-о-нітробензилбромід або 3-бром-3-метил-2-(2-нітрофенілмеркапто)-ЗН-індол.: (ВМРЗ- скатол).

Успішна модифікація ПЕГ (поліетиленгліколем) терапевтичних білків та пептидів, що часто асоціюється з подовженням напівперіоду циркуляції при перехресному зшиванні білків із глутаральдегідом, поліетиленглікольдіакрилатом та формальдегідом, використовується для приготування гідрогелів. Хімічна модифікація алергенів для використання в імунотерапії часто досягається шляхом карбамоїлування ціанатом калію.

Пептид чи його варіант, де пептид є модифікованим або включає непептидні зв'язки, є переважним втіленням цього винаходу. Загалом, пептиди і їх варіанти (принаймні такі, що містять пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані Етос- поліамідним методом твердофазного синтезу пептидів, як це розкрито у роботі І иКазх і співавт. (І иКаз еї аї., 1981) і в посиланнях, що є в ній. Тимчасовий захист М-аміногрупи забезпечується 9-флуоренілметилоксикарбонільною (Етос) групою. Повторювальне розщеплення цієї дуже нестійкої до дії луг захисної групи виконується за допомогою 2095 піперидину у М, М- диметилформаміді. Можна захистити функціональні групи бокових ланцюгів, такі як бутилові етери (у випадку серину, треоніну та тирозину), бутилові естери (у випадку глутамінової кислоти і аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільне похідне (у випадку лізину і гістидину), тритильне похідне (у випадку цистеїну) і 4-метокси-2,3,6-триметилбензосульфонільне похідне (у випадку аргініну). У сполуках, в яких С-термінальними залишками є глутамін або аспарагін, для захисту амідогруп бокових ланцюгів використовують 4,4"-диметоксибензгідрильну групу. Основою твердофазного носія є полідиметилакриламідний полімер, що складається з трьох мономерів: диметилакриламіду (каркасний мономер), біс-акрилоїлетилендіаміну (компонент для

Зо перехресного зшивання) і акрилоїлсаркозинметилового естеру (функціоналізуючий агент). Як агент, що утворює зв'язок пептиду і смоли, який піддається розщепленню, використовується нестійке до дії кислот похідне 4-гідроксиметилфеноксиоцтової кислоти. Всі амінокислотні похідні додають у вигляді заздалегідь синтезованих симетричних ангідридних похідних за винятком аспарагіну і глутаміну, які додають з використанням зворотної М, М-дициклогексилкарбодіїмід/1- гідроксибезотриазол-опосередкованої реакції сполучення. Усі реакції сполучення і зняття захисту відслідковували за допомогою методів контролю з використанням нінгідрину, тринітробензолсульфонової кислоти і ізотину. Після завершення синтезу пептиди віддеплюють від смоли-носія з супутнім видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 95 трифтороцтовою кислотою, що містить 5095 суміші поглиначів. Зазвичай використовувані поглиначі включають етандитіол, фенол, анізол і воду, конкретний вибір залежить від амінокислотних складових пептиду, що синтезується. Для синтезу пептидів можливе також використання комбінації твердофазних і рідкофазних методик (див., наприклад, (ВгисКаопег єї а!., 2004) і посилання, наведені в цій роботі).

Трифтороцтову кислоту видаляють випаровуванням у вакуумі з подальшим подрібнюванням із діетиловим етером, що забезпечує отримання сирого пептиду. Будь-які поглиначі, які присутні в матеріалі, видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дозволяє отримати сирий пептид, вільний від поглиначів. Реагенти для синтезу пептидів, як правило, можна придбати, наприклад, у компанії СаІріоспет-Момабріоспет (Нотінггем, Велика

Британія).

Очищення може виконуватися за допомогою одного будь-якого методу або їх комбінації, таких як перекристалізація, ексклюзійна хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад, з використанням системи ацетонітрил/вода.

Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, електрофорезу, зокрема, капілярного електрофорезу, твердофазної екстракції (ТФЕ), зворотно- фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після кислотного гідролізу та мас-спектрометрії із бомбардуванням прискореними атомами (ЕАВ), а також мас- спектрометричного аналізу МАО та Е5БІ-О-ТОБЕ.

Щоб вибрати надмірно презентовані пептиди, розраховується профіль презентації, який дозволяє оцінити медіану презентації у зразку, а також варіацію повторних вимірювань.

Профіль зіставляє зразки пухлини, що вивчається, з фоновим рівнем зразків нормальних тканин. Кожний із цих профілів можна потім консолідувати у показник надмірної презентації, підрахувавши р-значення за допомогою лінійної моделі змішаних ефектів (Ріпнеїго еїаї.,2015), з поправкою на багаторазове тестування за методом оцінки долі хибних відхилень (Вепіатіпі апа Носпрего, 1995).

З метою ідентифікації і відносного кількісного визначення Ні А-лігандів методом мас- спектрометрії молекули НІГ А зразків тканин після шокової заморозки були очищені, і були виділені пептиди, що зв'язуються з молекулами НІ А. Виділені пептиди були розділені, а їх послідовності були ідентифіковані методом рідинної хроматографії і мас-спектрометрії (РХ-МС) у режимі реального часу з іонізацією у наноелектроспреї. Отримані пептидні послідовності були перевірені порівнянням шаблону фрагментації природних ТОМАР, записаного для зразків раку підшлункової залози (М-18 А"02-позитивних зразків), із шаблонами фрагментації відповідних синтетичних контрольних пептидів із ідентичними послідовностями. Оскільки було безпосередньо виявлено, що пептиди є лігандами молекул НГА на клітинах первинних пухлин, ці результати надали прямі докази природного процесингу і презентації ідентифікованих пептидів на тканинах первинних ракових пухлин, отриманих від 18 пацієнтів, хворих на рак підшлункової залози.

Патентовані інформаційні канали з наукової розробки ХРЕЕБІСЕМТФ м2.1 (див., наприклад, заявку США 2013-0096016, яка таким чином включена в цей документ шляхом посилання в усій повноті) дозволяють ідентифікувати і виділяти відповідні кандидати у вакцини на базі надмірно презентованих пептидів, застосовуючи метод прямого відносного кількісного визначення рівнів

НІГ А-рестриктованих пептидів на ракових тканинах у порівнянні з декількома різними нераковими тканинами і органами. Цього вдалося досягти за рахунок розробки методу диференційного кількісного визначення на основі даних РХ-МС без використання ізотопної мітки, що були оброблені патентованими інформаційними каналами аналізу даних, в яких об'єднані алгоритми для ідентифікації послідовностей, спектральної кластеризації, підрахунку іонів, вирівнювання часу утримання, деконволюції за зарядовими станами і нормалізації.

Зо Були встановлені рівні презентації, включаючи оцінку похибок для кожного пептиду і зразка.

Були ідентифіковані пептиди, що презентуються виключно на пухлинних тканинах, і пептиди, надмірно презентовані на пухлинних тканинах у порівнянні з нераковими тканинами і органами.

Комплекси НІ А-пептид, отримані із зразків тканин раку підшлункової залози, були очищені, і пептиди, зв'язані з молекулами НІА, були виділені і проаналізовані методом РХ-МС (див. приклади). Усі досліджувані ТОМАР були за допомогою цього підходу ідентифіковані на зразках пухлин первинного раку підшлункової залози, що підтвердило факт їх презентації на клітинах первинного раку підшлункової залози.

Ідентифіковані на тканинах багатьох пухлин раку підшлункової залози і на нормальних тканинах ТОМАР були кількісно визначені методом РХ-МС без застосування ізотопних міток з реєстрацією спектрів у режимі підрахунку іонів. Цей метод базується на припущенні, що площі піків РХ-МС пептиду корелюють з його кількістю у зразку. Усі сигнали, які залежать від кількості пептиду, у різних експериментах за методом РХ-МС, були нормалізовані на основі середніх значень, усереднені по зразках і злиті у гістограму, що має назву профілю презентації. Профіль презентації об'єднує дані різних методів аналізу, таких як пошук по базах даних для білків, спектральної кластеризації, деконволюції за зарядовими станами (розрядження) і вирівнювання часу утримання і нормалізації.

Предметом цього винаходу є пептиди для лікування раку та інших пухлин, переважно раку підшлункової залози, які надмірно чи виключно презентують пептиди за цим винаходом. Ці пептиди, за даними мас-спектрометрії, презентуються природно молекулами НІ А на зразках тканин первинного раку підшлункової залози людини.

Вихідний ген/білок (який також визначається як "повнорозмірний білок" або "базовий білок"), із якого отримані пептиди, як було показано, відзначається високою надекспресією у клітинах раку у порівнянні з нормальними тканинами - "нормальні тканини" у контексті даного винаходу означає або клітини здорової підшлункової залози, або клітини інших здорових тканин, що свідчить про високий ступінь зв'язку пухлин із вихідними генами (див. Приклад 2). Більш того, самі пепгиди дуже надмірно презентуються на тканинах пухлини - "пухлинні тканини" у контексті даного винаходу означає зразок від пацієнта, що страждає на рак підшлункової залози, але не на нормальних тканинах (див. Приклад 1).

Зв'язані з НГА пептиди можуть розпізнаватися імунною системою, а саме Т-лімфоцитами. Т- клітини можуть руйнувати клітини, що презентують розпізнаний комплекс Ні А/пептид, наприклад, клітини раку підшлункової залози, що презентують отримані пептиди.

Було показано, що пептиди за цим винаходом здатні стимулювати відповідь Т-клітин і (або) надмірно презентуються, і, таким чином, можуть використовуватися для отримання антитіл і (або) ТКР, таких як розчинні ТКР, за цим винаходом (див. Приклад 3, Приклад 4). Більш того, пептиди, якщо вони утворюють комплекси з відповідними молекулами МНС, також можуть використовуватися для продукції антитіл і (або) ТКР, особливо рТКР за цим винаходом.

Відповідні способи добре відомі фахівцю у цій галузі, і їх описи можна знайти також у відповідній літературі. Отже, пептиди за цим винаходом можуть використовуватись для генерації імунної відповіді організму пацієнта, завдяки чому клітини пухлини можуть бути зруйновані. Імунна відповідь організму пацієнта може індукуватися прямим введенням пацієнту описаних пептидів або відповідних прекурсорних речовин (наприклад, подовжених пептидів, білків або нуклеїнових кислот, які кодують ці пептиди), ідеально в комбінації з агентом, що підвищує імунну реакцію (тобто ад'ювантом). Можна очікувати, що імунна відповідь, що виникає в результаті такої терапевтичної вакцинації, є високо специфічною по відношенню до клітин пухлини, оскільки цільові пептиди за цим винаходом не є присутніми на нормальних тканинах у достатній кількості копій, що попереджає ризик небажаних аутоїмунних реакцій проти нормальних клітин в організмі пацієнта. "Фармацевтична композиція" є переважно композицією, прийнятною для введення людині у медичній установі. Переважно, фармацевтична композиція є стерильною і виробляється відповідно до вимог належної виробничої практики (ЗМР).

Фармацевтичні композиції включають пептиди або у вільній формі, або у формі фармацевтично прийнятної солі (див. також вище). Термін "фармацевтично прийнятна сіль" в контексті цього винаходу означає похідну сполуку розкритих пептидів, в якій пептид модифікується шляхом створення кислої чи основної солі речовини. Наприклад, кислі солі готуються з вільної основи (як правило, де нейтральна форма лікарського засобу має нейтральну -МН2-групу), за участю реакції з прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти для приготування кислих солей включають органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота,

Зо пропіонова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфокислота, етансульфокислота, п-толуолсульфокислота, саліцилова кислота і т. ін., а також неорганічні кислоти, наприклад, соляна кислота, бромистоводнева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота і т. ін. | навпаки, приготування основних солей кислотних компонентів, які можуть бути присутніми на пептиді, здійснюється з використанням фармацевтично прийнятної основи, такої як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, гідроксид кальцію, триметиламін і тому подібні.

В особливо переважному втіленні фармацевтичні композиції містять пептиди у вигляді солей оцтової кислоти (ацетати), трифторацетатів або солей соляної кислоти (хлориди).

Переважно, лікарський засіб за цим винаходом є імунотерапевтичним засобом, таким як вакцина. Вона може вводитися безпосередньо пацієнту, в уражений орган або системно в/ш, в/м, п/ш, в/ч і в/в, або вноситися ех мімо у клітини, отримані від пацієнта, чи у клітинну лінію людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись іп мйго для селекції субпопуляції з імунних клітин, які отримані від пацієнта і які потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини іп міго, тоді може бути корисним, щоби клітини були трансфекованими, щоби спільно експресувати імуностимулюючі цитокіни, наприклад, інтерлейкін-2. Пептид може бути, по суті, чистим, або поєднаним з імуностимулюючим ад'ювантом (див. нижче), чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, або вводитися з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептиди також можуть бути кон'юговані з належним носієм, таким як гемоціанін фісурели (КІН) або маннан (див. патентну заявку УМО 95/18145 та роботу (І опаєпескКег евї аї., 1993)). Пептид також може бути міченим або бути злитим білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовності яких наведені у цьому винаході, стимулюють СО4 або СО8 Т-клітини. Проте стимуляція СО8Т-клітин є більш ефективною за умови сприяння з боку СО4 Т-хелперних клітин.

Таким чином, для епітопів МНС І класу, які ссимулюють СО8 Т-клітини, партнер по злиттю або сегменти гібридної молекули принагідно постачають епітопи, які ссимулюють СО4-позитивні Т- клітини. СО4- ії СО8-стимулюючі епітопи добре відомі фахівцям в цій галузі і включають епітопи, ідентифіковані в цьому винаході.

Згідно з одним аспектом винаходу, вакцина містить принаймні один пептид, який має амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ Мо. 1 до ЗЕО ІЮ Мо. 67, і принаймні один додатковий пептид, переважно, від двох до 50, більш переважно, від двох до 25, ще більш переважно, від двох до 20, і найбільш переважно, два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять або вісімнадцять пептидів. Пептид(и) може (можуть) бути виділений (виділені) з одного або більшої кількості специфічних ТАА ії може (можуть) зв'язатися з молекулами МНС І класу.

Згідно з ще одним аспектом винаходу пропонується нуклеїнова кислота (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид чи його варіант за винаходом. Полінуклеотид може бути, наприклад, ДНК, кКДНК, ПНК, СНК, РНК чи їх комбінацією, як одноланцюговою, так і (або) дволанцюговою, або природними чи стабілізованими формами полінуклеотидів, такими як, наприклад, полінуклеотиди з фосфоротіоатним скелетом; він може містити або не містити інтрони, за умови, що він кодує пептид. Звичайно, що тільки пептиди, що містять природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природно існуючими пептидними зв'язками, можуть бути кодовані полінуклеотидом. Згідно з ще одним аспектом цього винаходу, пропонується вектор експресії, здатний експресувати поліпептид відповідно до винаходу.

Було розроблено багато способів зв'язування полінуклеотидів, особливо ДНК, з векторами, наприклад, за допомогою комплементарних липких кінців. Наприклад, можуть бути додані комплементарні гомополімерні хвости до сегменту ДНК, щоб бути вставленими у вектор ДНК.

Цей вектор і сегмент ДНК потім з'єднують водневим зв'язком між комплементарними гомополімерними хвостами з утворенням молекул рекомбінантної ДНК.

Синтетичні лінкери, що містять один або більше сайтів рестрикції, забезпечують альтернативний спосіб об'єднання фрагментів ДНК у вектори. Синтетичні лінкери, що містять різноманітні сайти впізнавання рестрикційних ендонуклеаз, комерційно доступні у декількох джерелах, включаючи компанію Іпіегпайопаї! Віотесппоіодіез Іпс., Нью Хейвен, Конектикут, США.

У бажаному методі модифікації ДНК, що кодує поліпептид за винаходом, використовується полімеразна ланцюгова реакція, як це розкрито у роботі ЗаїКі КК і співавт. (ЗаїКі єї аї!., 1988).

Цей метод може використовуватися для введення цієї ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення відповідних сайтів рестрикції, або його можна застосовувати для модифікації

Зо ДНК у інший прийнятний спосіб, відомий фахівцеві у цій галузі. Якщо використовуються вірусні вектори, переважними є вектори на основі поксвірусу або аденовірусу.

Ця ДНК (або, у випадку ретровірусного вектора, РНК) може потім експресуватися у відповідному організмі-хазяїні, утворюючи поліпептид, що містить пептид або чи його варіант за винаходом. Таким чином, ДНК, яка кодує пептид чи його варіант за винаходом, може використовуватися відповідно до відомих методик, належним чином модифікованих виходячи з ідей, розкритих у цьому описі, для конструювання вектора експресії, який після цього використовується для трансформації відповідних клітин-хазяїв таким чином, щоб вони набули здатність експресувати і виробляти пептиди за винаходом. Ці методики включають такі, що розкриті, наприклад, у патентах США 4 440 859, 4 530 901, 4 582 800,4 677 063, 4 678 751, 4 704 362, 4 710 463, 4 757 006, 4 76607514 810 648.

Ця ДНК (або, у випадку ретровірусного вектора, РНК), яка кодує поліпептид, що є предметом цього винаходу, може бути з'єднана з широким спектром інших послідовностей ДНК для введення у відповідну клітину-хазяїна. Ця супутня ДНК буде залежати від природи хазяїна, способу представлення ДНК хазяїну, і від того, необхідне утримання в епісомальній чи інтегрованій формі.

Зазвичай ДНК вставляється у вектор експресії, такий як плазміда, у належній орієнтації і коректній рамці зчитування для експресії. Якщо необхідно, ДНК може бути зв'язаною з відповідними нуклеотидними послідовностями, що забезпечують координацію транскрипції і трансляції, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи зазвичай містяться у векторі експресії. Вектор згодом вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. Загалом, не всі хазяї трансформуються вектором. Отже, необхідно виділити трансформовані клітини-хазяї. Одна з методик виділення включає введення до складу вектора експресії такої послідовності ДНК із будь-якими необхідними контрольними елементами, яка кодує вибрану ознаку у трансформованій клітині, таку як резистентність до антибіотиків.

Як альтернатива, ген для такої вибраної ознаки може бути вбудованим в інший вектор, який використовується для спільної трансформації бажаної клітини-хазяїна.

Клітини-хазяї, які були трансформовані рекомбінантною РНК за винаходом, потім культивують протягом достатнього періоду часу у відповідних умовах, які відомі фахівцеві в цій галузі з точки зору ідей, розкритих тут, з метою дати можливість експресувати поліпептид, який 60 потім може бути виділений.

Фахівцям відомі багато експресійних систем, включаючи бактерії (наприклад, Е. сої ії Васійи5 5,иБій5), дріжджі (наприклад, Засспаготусеб5 сегемізіае), міцеліальні гриби (наприклад,

АзрегодіНи5 5рес.), клітини рослин, тварин і комах. Переважно, система може бути клітинами ссавців, таких як клітини СНО, які комерційно доступні від Американської колекції типових культур АТСОС.

Типова векторна плазміда клітин ссавців для конститутивної експресії включає вірус СММУ або опромотор 5М40 з відповідним поліаденільним хвостом роїу(А)-їай і маркером резистентності, таким є неоміцин. Одним із прикладів є рем, доступний від компанії Ріагтасіа,

Піскатеуей, Нью-Джерсі, США. Прикладом вектора індуцибельної експресії у ссавців є рРМ5О, також доступний від компанії Рпагтасіа. Корисними є плазмідні вектори дріжджів рК5403-406 і рАб413-416, які доступні від компанії Зігаїадепе Сіопіпд Зузіет5, Ла Джола, Каліфорнія 92037,

США. Плазміди рКк5403, рК5404, рїК5405 і рК5406 є дріжджовими інтегруючими плазмідами (МІр) і включають дріжджові селективні маркери НІ5ЗЗ, ТКРІ, ГЕЦ2 ї ОКАЗ. Плазміди рК5413- 416 є дріжджовими плазмідами з центромерами (Уср). Вектори на базі промотору СММ (наприклад, від компанії бідта-Аїдгіспй) забезпечують тимчасову або стабільну експресію, цитоплазматичну експресію або секрецію і М-термінальне або С-термінальне мічення для різних комбінацій ЕРГАС, ЗхХРГАС, с-тус або МАТ. Ці злиті білюи можна використовувати для виявлення, очищення і аналізу рекомбінантного білка. Злиття з використанням двох міток забезпечує гнучкість під час виявлення.

Сильна регуляторна область промотора цитомегаловірусу (СММ) людини підвищує рівні конститутивної експресії білка у клітинах лінії СО5 до таких високих значень, як 1 мг/л. У разі не таких активних ліній клітин рівні білка зазвичай становлять «0,1 мл/л. Присутність ділянки початку реплікації у фрагменті 5440 приводить до високих рівнів реплікації ДНК у пермісивних клітинах СО5. Вектори СМУ, наприклад, можуть містити РМВ1 (похідне рВК322) ділянку початку реплікації у клітинах бактерій, ген бета-лактамази для вибору резистентності бактерій до ампіциліну, роїу(А) гормону росту людини і ділянку початку реплікації 7. Вектори, що містять лідерну послідовність препротрипсину (РРТ), можуть направляти секрецію злитих білків БІ АС в культуральному середовищі на очищення антитіл проти ЕГАсС, смол і планшетів. Інші вектори і експресійні системи також добре відомі у цій галузі для використанні у багатьох клітинах- 0) хазяїнах.

В іншому втіленні два або більше пептидів або варіантів пептидів за винаходом кодуються і, отже, експресуються послідовно (подібно до конструкцій "вузли на мотузці"). При цьому пептиди або варіанти пептидів можуть бути зв'язані або злиті одне з одним фрагментами лінкерних амінокислотних послідовностей, такими, наприклад, які ГГ, або можуть зв'язатися без будь- яких додаткових пептидів між ними. Ці конструкції можуть також застосовуватися для терапії раку і можуть індукувати імунну відповідь за участі як молекул МНС І класу, так ії МНС ІІ класу.

Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, трансформованої полінуклеотидною векторною конструкцією за винаходом. Клітина-хазяїн може бути або прокаріотичною, або еукаріотичною. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами- хазяїнами у деяких обставинах, а зазвичай це штам Е. соїї, такий як, наприклад, штам ОН5 Е. соїї, доступний від компанії Ве(пезаа Кезеагсй І абогацогіез Іпс., Бетесда, Меріленд, США, і КК, доступний від Американської колекції типових культур АТСС, Роквіл, Меріленд, США (Номер

АТСС 31343). Переважні еукаріотичні клітини-хазяї включають клітини дріжджів, комах і ссавців, переважно клітини хребетних, такі як лінії фібробластних клітин і клітин товстої кишки від мишей, пацюків, мавп або людини. Дріжджові клітини-хазяї включають УРІН499, УРН5БОО і

УРН5БОЇ, які зазвичай доступні від компанії Зігаїадепе Сіопіпд Зузіет5, Ла Джола, 92037,

Каліфорнія, США. Переважні клітини-хазяї ссавців включають клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), доступні як штам АТСС ССІ161, клітини ембріонів швейцарської миші штаму

МІН/ЗТЗ, доступні з колекції АТСС СК. 1658, клітини СО5-1 з нирок мавп, доступні з колекції

АТСС СНІ 1650 і клітини 293 нирок ембріонів людини. Переважними клітинами комах є клітини 519, що можуть бути трансфековані векторами експресії бациловірусу. Огляд публікацій щодо вибору відповідних клітин-хазяїв для експресії можна знайти, наприклад, у підручнику: Рацшіїпа

Ва!ба:х апа Агодеїїа Гогепсе "Меїйпоаз іп МоїІесшіаг Віоюду Несотбріпапі Сепе Ехргезвіоп, Вемівм/в апа РгоїосоЇ5, " Рай Опе, Зесопа Еайайоп, ІЗ5ВМ 978-1-58829-262-9, і інших літературних джерелах, відомих фахівцю у цій галузі.

Трансформація відповідних клітин-хазяїв за допомогою ДНК-конструкції за цим винаходом здійснюється добре відомими методами, вибір яких, як правило, залежить від типу вектора, що використовується. Щодо трансформації прокаріотичних клітин-хазяїв див., наприклад, Сопеп і співавт. (СоНеп еї аї., 1972) і (Стеєп апа ЗатргоокК, 2012). Трансформація дріжджових клітин 60 описана в роботі ЗПептап і співавт. (Зпептап еї а!., 1986). Метод Ведо5 (Ведов, 1978) також є корисним. Щодо клітин хребетних, реагенти, придатні для трансфекції таких клітин, наприклад, фосфат кальцію і ДЕАЕ-декстран або ліпосомні препарати, доступні від компанії бігаїадепе

СіІопіпд Зузіетв, або І Те Тесппоїодієз Іпс., Гейтерсберг, Меріленд 20877, США. Електропорація також придатна для трансформації і (або) трансфекції клітин і відома в цій галузі як метод трансформації клітин дріжджів, клітин бактерій, клітин комах і клітин хребетних.

Успішно трансформовані клітини, наприклад, клітини, що містять ДНК-конструкцію за цим винаходом, можуть бути ідентифіковані добре відомими методами, такими як ПлР.

Альтернативно, присутність білка у супернатанті можна виявити за допомогою антитіл.

Зрозуміло, що певні клітини-хазяї за винаходом здатні синтезувати пептиди за винаходом, наприклад, клітини бактерій, дріжджів і комах. Проте в певних терапевтичних методах можуть використовуватися інші клітини-хазяї. Наприклад, антиген-презентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть принагідно використовуватися, щоби експресувати пептиди за винаходом, які можуть бути навантажені на відповідні молекули МНС. Отже, цей винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту або вектор експресії за цим винаходом.

У переважному втіленні клітина-хазяїн є антиген-презентуючою клітиною, зокрема дендритною клітиною або антиген-презентуючою клітиною. Управління з контролю за харчовими продуктами та лікарськими засобами (ЕСА) США 29 квітня 2010 року схвалило застосування АПК, навантажених рекомбінантним злитим білком, що містить простатичну кислу фосфатазу (РАР), для лікування метастатичного НКРС (гормон-рефрактерного раку передміхурової залози), що протікає безсимптомно або з мінімально вираженими симптомами (сіпулейцел-Т) (Віпі єї а!., 2006; Зтаї! єї а!., 2006).

Згідно з ще одним аспектом винаходу пропонується спосіб отримання пептиду або його варіанту, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна і виділення пептиду з клітини- хазяїна або її культурального середовища.

В іншому втіленні пептид, нуклеїнова кислота або вектор експресії за винаходом застосовуються у медицині. Наприклад, пептид або його варіант може бути приготований для внутрішньовенного (в/в) введення, підшкірного (п/ш) введення, внутрішньошкірного (в/ш) введення, внутрішньочеревного (в/ч) введення, внутрішньом'язового (в/м) введення. Переважні способи введення пептиду - це п/ш, в/ш, в/ч, в/м і в/в. Переважними способами введення ДНК є в/ш, в/м, п/ш, в /ч і в/в. Можуть вводитись дози від 50 мкг до 1,5 мг, переважно від 125 мкг до 500 мкг пептиду або ДНК залежно від відповідного пептиду чи ДНК. Дози в цьому діапазоні успішно використовувались в попередніх дослідженнях (УМаїег еї аї., 2012).

Полінуклеотид, що застосовується для активної вакцинації, може бути по суті чистим або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Нуклеїнова кислота може бути, наприклад, ДНК, кКДНК, ПНК, РНК чи їхньою комбінацією. Методи конструювання і введення такої нуклеїнової кислоти добре відомі фахівцям в цій галузі. Їх огляд наведений, наприклад, у роботі Тешеї! і співавт. (Тешєї єї а), 2005). Полінуклеотидні вакцини легко приготувати, але механізм дії цих векторів у виникненні імунної відповіді повністю не з'ясований. Прийнятні векторні системи і системи доставки включають вірусну ДНК і (або) РНК, такі як системи на базі аденовірусу, вірусу коров'ячої віспи, ретровірусу, вірусу герпесу, аденоасоційованого вірусу або гібридів, що містять елементи більш ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі в галузі засобів доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою "генної гармати". Пептид або пептиди, що кодуються нуклеїновою кислотою, може (можуть) бути злитим білком, наприклад, з епітопом, що стимулює Т-клітини щодо відповідних протилежних СОК, як відзначається вище.

Лікарський засіб за винаходом може також включати один або більше ад'ювантів. Ад'юванти є речовинами, які у неспецифічний спосіб підвищують або підсилюють імунну відповідь (наприклад, імунну відповідь на антиген, яку опосередкують СОв-позитивні Т-клітини і Т- хелпери (ТН), і, отже, можуть вважатися корисними для використання у лікарському засобі за винаходом. Відповідні адюванти включають, але не обмежуються ними, 1018 І55, солі алюмінію, АМРІ ІМАХФ, А5ЗІ15, ВСО, СР-870,893, СроО7909, СуаА, азі ІМ, флагелін чи ліганди

ТІК5, які походять з флагеліну, ліганд ЕІТ3, ГМ-КСФ, ІСЗО, ІСЗ31, іміквімод (АГОАКАФ), резиквімод, ІтигРасі ІМР321, інтерлейкіни, такі як ІЛ-2, ІЛ-13, ІЛ-21, інтерферон-альфа чи -бета, або їхні пегільовані похідні, І5 Раїсі, ІЗ5, ІЗСОМАТЕЇХ, імуностимулюючі комплекси ІЗСОМ,

Уиміттипеф, ГіромМас, МАГР2, МЕ59, монофосфориловий ліпід А, монтанід ІМ5 1312, монтанід

ІЗА 206, монтанід ІЗА 50У, монтанід ІЗА-51, емульсії "вода у маслі" та "масло у воді", ОК-432,

ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОМТАК, О5рА, векторну систему Рертеїб, мікрочастинки на основі полілактиду когліколіду ІРІС| та декстрану, талактоферин, КІ 172, віросоми та інші вірусоподібні частинки, УЕ-17О0, МЕСЕ ігар, К848, бета-глюкан, Ратз3Сув, стимулон 0521 Адпиіїа, бо який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, наприклад, Кіріє Юеїох, ОЦ чи зЗирего5. Переважними є такі ад'юванти, як ад'ювант Фрейнда або ГМ-КОФ. Декілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, МЕ59), специфічних до дендритних клітин, та способи їх приготування були описані раніше (АїЇЇїзоп апа Киттвеї!, 1995). Також можуть застосовуватися цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені з впливом на міграцію дендритних клітин до лімфоїдних тканин (наприклад, ТМЕ-), прискорюючи дозрівання дендритних клітин до ефективних антиген-презентуючих клітин для Т-лімфоцитів (наприклад, ГМ-КСФ, ІЛ-1 та ІЛ-4) (Патент США 5 849 589, конкретно включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті) та діючі як імуноад'юванти (наприклад, ІЛ-12, ІЛ-15, ІЛ-23, ІЛ-7, ІФН-альфа, ІФН-бета) (Сабрилйомісй єї а!., 1996).

Також доповідалося про те, що імуностимулюючі Сро-олігонуклеотиди посилюють ефект ад'ювантів у складі вакцин. Якщо не вдаватися у подробиці теорії, Сро-олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою ТоїІ-подібних рецепторів (ТІК), переважно ТІКУ. Активація ТІКУ, ініційована Сро, посилює антиген- специфічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, включаючи пептидні чи білкові антигени, живі або знищені віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні клітинні вакцини та полісахаридні кон'юЮгати як в профілактичних, так і в терапевтичних вакцинах. Важливішим є те, що посилюється визрівання та диференціація дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію ТНІ-клітин та інтенсивну генерацію цитотоксичних Т- лімфоцитів (ЦТЛ) навіть за відсутності підтримки з боку СОВА Т-клітин. Активація ТНІ, індукована стимуляцією ТІ КО, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як галун чи неповний ад'ювант Фрейнда (ІРА), котрі зазвичай сприяють активації ТН2. Сро-олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли переводяться в лікарську форму або вводяться разом з іншими ад'ювантами чи в таких формах, як мікрочастинки, наночастинки, ліпідні емульсії або подібні композиції, особливо необхідні для індукування сильної відповіді, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну відповідь та дозволяють зменшити дози антигену приблизно на два порядки в порівнянні з відповідями антитіл на вакцину в повній дозі без Сро, як спостерігалося в деяких експериментах (Кгієд, 2006). У патенті США б 406 705 ВІ описується комбіноване застосування Сро-олігонуклеотидів,

Зо ад'ювантів, що не містять нуклеїнові кислоти, та антигену для індукування антиген-специфічної імунної відповіді Сро ТІ КО-антагоністом є абзІІМ (імуномодулятор із структурою типу дволанцюжкове стебло-петля) компанії Моіодеп (Берлін, Німеччина), котрий є переважним компонентом фармацевтичної композиції за цим винаходом. Також можуть використовуватись інші ТІ К-зв'язувальні молекули, наприклад, ТІ Р. 7, ТІ К 8 і (або) ТІ К 9, що зв'язуються з РНК.

Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані Сро (наприклад, Срк, Ідега), аналоги а5-РНК, такі як полі(І:С) та їхні похідні (наприклад, АтріїсепФф),

НійопоїФ, полі-(ІСІ С), полі(ІС-К), полі(:С12)), бактеріальні ДНК або РНК, відмінні від Сро, а також невеликі імунологічно активні молекули та антитіла, такі як циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, целебрекс, МСХ-4016, сілденафіл, тадалафіл, варденафіл, сорафеніб, темозоломід, темзиролімус, ХІ -999, СР-547632, пазопаніб, МЕСЕ Тгар, 202171, А2О2171, анти-

СТІ А4, інші антитіла, націлені на ключові структури імунної системи (наприклад, анти-С040-, анти-ТоЕбета-, анти-ТМЕальфа-рецептори) та 5058175, які можуть діяти терапевтично і (або) як ад'юванти. Кількості та концентрації ад'ювантів та добавок, прийнятних в контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим фахівцем без зайвого експериментування.

Переважними ад'ювантами є анти-СО40-антитіла, іміквімод, резиквімод, ГМ-КСОФ, циклофосфамід, сунітиніб, бевацизумаб, інтерферон-альфа, Сро олігонуклеотиди та їх похідні, полі-(І:С) та її похідні, РНК, сілденафіл і композиції з твердих мікрочастинок з РІ С або віросоми.

В переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювант вибирається з групи, що складається з колонієстимулюючих факторів, таких як Фактор стимулювання утворення колоній гранулоцитів-макрофагів (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамід, іміквімод, резиквімод та інтерферон-альфа.

В переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювант вибирається з групи, що складається з колонієстимулюючих факторів, таких як Фактор стимулювання утворення колоній гранулоцитів-макрофагів (ГМ-КСФ, сарграмостим), циклофосфамід, іміквімод і резиквімод. У переважному втіленні фармацевтичної композиції за винаходом ад'ювантом є циклофосфамід, іміквімод чи резиквімод. Навіть більш переважними ад'ювантами є монтанід

ІМ5 1312, монтанід ІЗА 206, монтанід ІЗА 50М, монтанід ІЗА-51, полі-ІСЇ С (НійопоїФ) і моноклональні анти-СО040-антитіла або їх комбінація.

Ця композиція може застосовуватися для парентерального введення, наприклад, бо підшкірного, внутрішньошкірного, внутрішньом'язового або для перорального застосування Для цього пептиди і необов'язково інші молекули розчиняють або суспендують у фармацевтично прийнятному, переважно водному носієві. Крім того, композиція може містити допоміжні речовини, такі як буфери, зв'язувальні речовини, баластні речовини, розріджувачі, ароматизатори, антифрикційні речовини тощо. Пептиди можна також ввести разом із імуностимуляторами, такими як цитокіни. Великий перелік допоміжних речовин, які можна використовувати у такій композиції, можна знайти, наприклад, у посібнику А. Кірбе, Напароок ої

Рпаптасешіса! Ехсіріепі5 (Кіррбе, 2000). Ця композиція може застосовуватися для попередження, профілактики і (або) лікування аденоматозних або ракових захворювань.

Приклади фармацевтичних композицій наведені, наприклад, у ЕР2113253.

Важливо розуміти, що імунна відповідь, ініційована вакциною за винаходом, спрямована проти ракових клітин на різних стадіях клітинного циклу і на різних стадіях розвитку пухлини.

Більш того, атака здійснюється на різні асоційовані з раковими пухлинами сигнальні шляхи. Це є перевагою над вакцинами, які направлені тільки на одну чи малу кількість мішеней, що може привести до легкої адаптації пухлини до атаки (уникання пухлиною). Більш того, не усі індивідуальні пухлини експресують одну й ту саму картину антигенів. Таким чином, комбінація декількох пухлино-асоційованих пептидів гарантує, що кожна окрема пухлина несе принаймні деякі з мішеней. Композиція була створена виходячи з того, що, як очікується, кожна пухлина експресує декілька антигенів і охоплює декілька незалежних сигнальних шляхів, необхідних для росту і розвитку пухлини. Таки чином, вакцину може легко використовувати у "готовому для застосування" вигляді для більшої популяції пацієнтів. Це означає, що попередній відбір пацієнтів, що потребують лікування цією вакциною, можна обмежити типуванням за НІ А, не потребує будь-якого додаткового дослідження біомаркерів експресії антигенів, але все ж забезпечується одночасна атака декількох мішеней у вигляді індукованої імунної відповіді, що є важливим для ефективності (Вапспегеаи еї аї., 2001; УУанег еї а!ї., 2012).

Термін "каркас" в контексті цього винаходу означає молекулу, яка специфічно зв'язується з (наприклад, антигенною) детермінантою. В одному з втілень каркас здатний направляти об'єкт, до якого він приєднаний (наприклад, (другий) антиген-зв'язувальний елемент) до сайта-мішені, наприклад, до клітини конкретного виду пухлини або до строми пухлини, що несе антигенну детермінанту (наприклад, комплекс пептид-МНе відповідно до цього підходу). В іншому втіленні каркас здатний активувати сигнальний шлях через його антиген-мішень, наприклад, антиген комплексу Т-клітинного рецептора. Каркаси включають, але не обмежуються ними, антитіла і їх фрагменти, антиген-зв'язувальні домени антитіл, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга антитіла, зв'язувальні білки, що містять принаймні один модуль анкіринового повтору і однодоменні антиген-зв'язувальні (З5ОАВ) молекули, аптамери, (розчинні) ТКР ії (модифіковані) клітини, такі як алогенні або аутологічні Т- клітини. Щоб оцінити, чи буде молекула каркасом, що зв'язується з мішенню, можна провести аналіз зв'язування. "Специфічне" зв'язування означає, що каркас зв'язує досліджуваний комплекс пептид-МНО краще ніж інші природно існуючі комплекси пептид-МНС до такої міри, що каркас, споряджений активною молекулою, яка здатна знищувати клітину, що несе конкретну мішень, не здатний знищувати іншу клітину без конкретної мішені, але таку, що презентує інший(-ї) комплекс(-и) пептид-МНеО. Зв'язування з іншими комплексами пептид-МНС не має значення, якщо пептид, що бере участь у перехресній реакції, не зустрічається в природі, тобто не отриманий із пептидому НІ А. Тести для оцінки знищення клітин-мішеней добре відомі фахівцям в цій галузі.

Їх потрібно виконувати з використанням клітин-мішеней (первинних клітинних культур або клітинних ліній) із незміненою презентацією пептидів молекулами МНС, або клітин, навантажених пептидами, у такий спосіб, щоб були досягнуті природні рівні комплексів пептид-

МН.

Кожний каркас містить мітку, яка забезпечує можливість виявлення зв'язаного каркаса шляхом визначення присутності або відсутності сигналу, який генерує мітка. Наприклад, каркас може бути міченим флуоресцентним барвником або іншою застосовною маркерною молекулою клітини. Такі маркерні молекули добре відомі в цій галузі. Наприклад, флуоресцентне мічення, наприклад, флуоресцентним барвником, може забезпечити візуалізацію зв'язаного аптамеру за допомогою флуоресценції або лазерної сканувальної мікроскопії або проточної цитометрії.

Кожний каркас може бути кон'югованим із другою активною молекулою, такою як, наприклад, ІЛ-21, антитіло проти СОЗ і антитіло проти СО28.

Додаткову інформацію про поліпептидні каркаси див., наприклад, у розділі "Передумова створення винаходу" у заявці УМО 2014/0719784А1 і у посиланнях, наведених в ній.

Цей винахід також стосується аптамерів. Аптамери (див., наприклад, УМО 2014/191359 і бо посилання, наведені в цій роботі) є молекулами коротких одноланцюгових нуклеїнових кислот,

які можуть складатися у певні тримірні структури і розпізнавати специфічні структури-мішені.

Вони, очевидно, є прийнятними альтернативами для розробки таргетної терапії. Було показано, що аптамери селективно зв'язуються з багатьма складними мішенями з високою афінністю і специфічністю.

Аптамери, що розпізнають розташовані на поверхні молекули, були ідентифіковані у минулому десятиріччі і забезпечують засоби для розробки діагностичних і терапевтичних підходів. Оскільки було показано, що аптамери майже не проявляють жодної токсичності і імуногенності, вони є перспективними кандидатами у речовини для біомедичних застосувань.

Справді, аптамери, наприклад, такі, що розпізнають простат-специфічні мембранні антигени, були успішно застосовані для таргетної терапії, і було показано, що вони виявляють ці функції в трансплантатних моделях іп мімо. Більш того, були ідентифіковані аптамери, які розпізнають конкретні лінії пухлинних клітин.

Можуть бути вибрані аптамери ДНК, що проявляють розпізнавальні властивості широкого спектру по відношенню до різних ракових клітин, особливо до таких, що отримані з солідних пухлин, у той час як непухлиногенні і первинні здорові клітини ними не розпізнаються. Якщо ідентифіковані аптамери розпізнають не тільки підтип конкретної пухлини, але скоріше взаємодіють з рядом пухлин, це надає аптамерам властивість бути застосовними в якості так званих діагностичних і терапевтичних засобів широкого спектру.

Далі, дослідження зв'язувальних властивостей по відношенню до клітин методом проточної цитометрії показало, що аптамери виявляють дуже добру позірну афінність, яка знаходиться у наномолярному діапазоні.

Аптамери можуть використовуватися для діагностичних і терапевтичних цілей. Далі, можна показати, що деякі аптамери поглинаються пухлинними клітинами і таким чином можуть використовуватися як молекулярні носії для цілеспрямованої доставки протиракових препаратів, таких як міРНК, у пухлинні клітини.

Аптамери можуть бути вибрані проти складних мішеней, таких як клітини і тканини і комплекси пептидів, що включають, переважно що складаються з послідовності відповідно до будь якої послідовності від ЗЕО ІЮ МО 1 до 5ЕО ІЮ МО 67 за цим винаходом із молекулою МНС з використанням методики ЗЕГЕХ (Систематична еволюція лігандів шляхом експоненційного

Зо збагачення).

Пептиди за цим винаходом можуть використовуватися для продукції і розробки антитіл, специфічних до комплексів МНС/пептид. Вони можуть застосовуватися для лікування, націлюючи токсини або радіоактивні речовини на хворі тканини. Іншим використанням цих антитіл може бути націлювання радіонуклідів на хворі тканини з метою формування зображень, таких як позитронна емісійна томографія (ПЕТ). Таке використання може виявляти невеликі метастази або визначати розмір і точну локалізацію хворих тканин.

Таким чином, в ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання рекомбінантного антитіла, яке специфічно зв'язується з головним комплексом гістосумісності (МНС) людини | або ІІ класу, який входить до складу комплексу з антигенами, обмеженими за

НІА, причому спосіб включає: імунізацію клітинами ссавців нелюдського походження, отриманих методами генної інженерії що експресують згаданий головний комплекс гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу із розчинною формою молекули МН І або ІІ класу, яка входить до складу комплексу зі згаданими антигенами, обмеженими за НІГА; виділення молекул ІРНК із клітин згаданих ссавців нелюдського походження, що продукують антитіла; отримання бібліотеки фагового дисплея, що містить фаги, які експонують молекули білка, який кодується згаданими молекулами іРНК; і виділення принаймні одного фага із згаданої бібліотеки фагового дисплея, причому згаданий принаймні один фаг експонує згадане антитіло, що специфічно зв'язується із згаданим головним комплексом гістосумісності (МНС) людини І або ЇЇ класу, який входить до складу комплексу із згаданим антигеном, обмеженим за НІ А.

У ще одному аспекті цей винахід стосується антитіла, яке специфічно зв'язується з головним комплексом гістосумісності (МНС) людини І або ІЇ класу, який входить до складу комплексу з антигенами, рестриктованими за НіА, в якому антитіло переважно є поліклональним антитілом, моноклональним антитілом, біспецифічним антитілом і (або) хімерним антитілом.

Відповідні способи отримання таких антитіл і одноланцюгових головних комплексів гістосумісності (МНС) І класу, а також інших інструментів отримання цих антитіл розкриті в заявках УМО 03/068201, УМО 2004/084798, УМО 01/72768, ММО 03/070752 і статтях (Сопнеп еї аї., 200За; Сопеп еї а!., 20036; ЮРепкбего еї аї., 2003), які для цілей цього винаходу всі у прямій формі включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.

Переважно, антитіло зв'язується з спорідненістю на рівні нижче 20 наномолів, переважно нижче 10 наномолів, у комплекс, який також вважається "специфічним" у контексті цього винаходу.

Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮО МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67 або їхній варіант, який принаймні на 88 95 є гомологічним (переважно ідентичним) послідовностям від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 67 або їхнього варіанту, що викликає перехресну реакцію Т-клітин із зазначеним пептидом, де зазначений пептид не є базовим повнорозмірним поліпептидом.

Цей винахід також стосується пептиду, що містить послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮО МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67 або їхній варіант, який принаймні на 88 95 є гомологічним (переважно ідентичним) послідовностям від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮО МО: 67, де зазначений пептид або його варіант має загальну довжину між 8 і 100, переважно між 8 і 30 і найбільш переважно між 8 і 14 амінокислот.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, які здатні зв'язуватись з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І або Ії класу.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згадані пептиди складаються або по суті складаються з амінокислотної послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є (хімічно) модифікованим і (або) включає непептидні зв'язки.

Цей винахід також стосується пептидів за цим винаходом, де згаданий пептид є частиною злитого білка, зокрема злитим із М-термінальними амінокислотами НІГА-ОК антиген- асоційованого інваріантного ланцюга (Ії), або де пептид є злитим із антитілом (або вбудованим в антитіло), наприклад, із антитілом, що є специфічним до дендритних клітин.

Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти, що кодує пептиди за цим винаходом за умови, що пептид не є повністю (цілковито) людським білком.

Цей винахід також стосується нуклеїнової кислоти за цим винаходом, яка являє собою ДНК,

КДНК, ПНК, РНК чи їх комбінацію.

Цей винахід також стосується вектора експресії що здатний експресувати нуклеїнову кислоту за цим винаходом.

Зо Цей винахід також стосується пептиду за цим винаходом, нуклеїнової кислоти за цим винаходом або вектора експресії за цим винаходом для застосування в медицині, зокрема в лікуванні раку підшлункової залози.

Цей винахід також стосується клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту за цим винаходом або вектор експресії за цим винаходом.

Цей винахід також стосується клітини-хазяїна за цим винаходом, яка є антиген- презентуючою клітиною, і переважно дендритною клітиною.

Цей винахід також стосується способу отримання пептиду за цим винаходом, причому спосіб включає культивування клітини-хазяїна за цим винаходом і виділення пептиду зі згаданого клітини-хазяїна або її культурального середовища.

Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген навантажують на молекули МНС І або ІЇ класу, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини шляхом контакту достатньої кількості антигену з антиген-презентуючою клітиною.

Цей винахід також стосується способу за цим винаходом, де антиген-презентуюча клітина містить вектор експресії, здатний експресувати згаданий пептид, що містить послідовність від

ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67 або згаданий варіант амінокислотної послідовності.

Цей винахід також стосується активованих Т-клітин, отриманих згідно способу за цим винаходом, де згадані Т-клітини селективно розпізнають клітину, яка експресує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за цим винаходом.

Цей винахід також стосується способу знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить будь-яку амінокислотну послідовність за цим винаходом, причому спосіб включає введення в організм пацієнта ефективної кількості Т-клітин за цим винаходом.

Цей винахід також стосується застосування будь-якого пептиду, що описаний тут, нуклеїнової кислоти за цим винаходом, вектора експресії за цим винаходом, клітини за цим винаходом, або активованого цитотоксичного Т-лімфоцита за цим винаходом, як лікарського засобу або в процесі виробництва лікарського засобу. Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб виявляє протиракову активність.

Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський засіб являє собою вакцину. Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де лікарський бо засіб виявляє протиракову активність.

Цей винахід також стосується застосування за цим винаходом, де згадані ракові клітини є клітинами раку підшлункової залози або клітинами інших солідних або гематологічних пухлин, таких як рак підшлункової залози, рак головного мозку, рак нирки, рак товстої або прямої кишки, лейкоз.

Цей винахід також стосується конкретних маркерних білків і біомаркерів на основі пептидів за цим винаходом, які у цьому документі іменуватимуться як "мішені", які можуть використовуватися в діагностиці і (або) визначенні прогнозу перебігу раку підшлункової залози.

Цей винахід також стосується застосування цих нових мішеней для лікування раку.

Термін "антитіло" або "антитіла" використовується в тут у широкому сенсі і включає як поліклональні, так і моноклональні антитіла. На додаток до інтактних або "повнорозмірних" молекул імуноглобуліну, до терміну "антитіла" також входять фрагменти (наприклад, фрагменти

СОН, Ем, Раб ї Ес) або полімери цих молекул імуноглобуліну і гуманізовані версії молекул імуноглобуліну, за умови, що вони виявляють будь-які з бажаних властивостей (наприклад, специфічне зв'язування (полі)упептидного маркера раку підшлункової залози, доставка токсину до клітини раку підшлункової залози, що експресує ген-маркер раку легенів на підвищеному рівні, і (або) інгібування активності поліпептидного маркера раку підшлункової залози) відповідно до цього винаходу.

За найменшої можливості антитіла за винаходом слід закуповувати у комерційних підприємств. Антитіла за винаходом можуть бути отримані з використанням добре відомих методів. Кваліфікований фахівець зрозуміє, що для отримання антитіл за винаходом можуть бути використані як повнорозмірні поліпептидні маркери раку підшлункової залози, так і їх фрагменти. Поліпептид, який буде використовуватися для отримання антитіл за винаходом, може бути повністю чи частково очищеним компонентом природного джерела або може бути отриманий за допомогою технології рекомбінантних ДНК.

Наприклад, кКДНК, що кодує пептид за цим винаходом, такий як пептид з послідовністю від

ЗБО ІО МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 67 або його варіант чи фрагмент, може експресуватися в прокаріотичних клітинах (наприклад, бактерій) або еукаріотичних клітинах (наприклад, клітинах дріжджів, комах або ссавців), після чого рекомбінантний білок можна очистити і використати для отримання препарату моноклональних або поліклональних антитіл, які специфічно зв'язують

Зо поліпептидний маркер раку підшлункової залози, що був використаний для отримання антитіл за цим винаходом.

Фахівцю ов цій галузі відомо, що отримання двох або більше різних комплектів моноклональних або поліклональних антитіл максимально збільшує ймовірність отримання антитіла, що буде мати специфічність та афінність, необхідні для використання за призначенням (наприклад, для ЕГІ5А, імуногістохімічних методів, візуалізації іп мімо, лікування імунотоксинами). Антитіла досліджують на бажану активність добре відомими методами, відповідно до цілей, у яких мають використовуватися антитіла (наприклад, ЕГІ5А, імуногістохімічні методи, імунотерапія тощо; додаткові відомості щодо отримання і перевірки антитіл див., наприклад, Сгеепієїа, 2014 (Стеепіїєїд, 2014)). Наприклад, антитіла можуть бути досліджені методами ЕГІЗА, Вестерн-блотингу, імуногістохімічним забарвлюванням фіксованих формаліном зрізів ракової тканини або заморожених зрізів тканини. Після попередніх досліджень іп міго антитіла, які мають використовуватися для терапевтичних цілей або для діагностики іп мімо, досліджують з використанням відомих методів клінічного дослідження.

Термін "моноклональне антитіло" в тому виді, в якому він використовується тут, означає антитіло, отримане із по суті гомогенної популяції антитіл, тобто індивідуальні антитіла, що складають популяцію, є ідентичними, за винятком мутантних форм, що спостерігаються в природі, які можуть бути присутніми в незначній кількості. Моноклональні антитіла за цим патентом конкретно включають "химерні" антитіла, у яких частина важкого і (або) легкого ланцюга ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих із окремого виду, або які належать до окремого класу чи підкласу антитіл, в той час як решта ланцюга (ланцюгів) ідентична або гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, отриманих із іншого виду або які належать до іншого класу чи підкласу антитіл, а також фрагментів таких антитіл, за умови, що вони виявляють бажану антагоністичну активність (Пат.

США 4 816 567, включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті).

Моноклональні антитіла за винаходом можуть бути отримані гібридомними технологіями. У гібридомних технологіях мишу або іншу прийнятну тварину-хазяїна, як правило, імунізують імунізуючим агентом для створення лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які специфічно зв'язуються з імунізуючим агентом. Альтернативно, лімфоцити можуть бути імунізовані іп міїго.

Моноклональні антитіла можуть також бути створені технологіями рекомбінантних ДНК, такими як описані в патенті США 4 816 567. ДНК, що кодує моноклональні антитіла за винаходом, можна легко виділити і секвенувати з використанням традиційних методик (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні зонди, здатні специфічно зв'язуватися з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги антитіл миші).

Методи Іп міго також придатні для створення одновалентних антитіл. Розщеплення антитіл з метою отримання їх фрагментів, зокрема, Рар-фрагментів, можна провести з використанням стандартних методик, відомих у галузі. Наприклад, розщеплення можна виконати за допомогою папаїну. Приклади розщеплення за допомогою папаїну описані у заявці УМО 94/29348 і в патенті

США 4 342 566. При розщепленні антитіл за допомогою папаїну, як правило, утворюються два ідентичних антиген-зв'язувальних фрагменти, які звуться Еаб-фрагментами, кожний з одним антиген-зв'язувальним сайтом, і залишковим Бе фрагментом. Обробка пепсином дає фрагмент

К(абв)2 і фрагмент рЕс'.

Фрагменти антитіл, чи то з'єднані з іншими послідовностями, чи ні, можуть також включати вставки, делеції, заміни або інші вибрані модифікації окремих частин або амінокислотних залишків за умови, що активність фрагмента не є значно зміненою або пошкодженою у порівнянні з немодифікованим антитілом або фрагментом антитіла. Ці модифікації можуть надати деякі додаткові властивості, такі як видалити/додати амінокислоти, що здатні до дисульфідного зв'язування, підвищити біологічну довговічність, змінити секреторні властивості тощо. У будь-якому випадку, фрагмент антитіла має виявляти біологічну активність, таку як зв'язувальна активність, регулювання зв'язування у зв'язувальному домені тощо. Функціональні або активні центри антитіла можуть бути ідентифіковані шляхом мутагенезу конкретної ділянки білка, який супроводжується експресією і перевіркою експресованого поліпептиду. Такі методи є цілююм очевидними для фахівця у цій галузі і можуть включати сайт-специфічний мутагенез нуклеїнової кислоти, що кодує фрагмент антитіла.

Антитіла за винаходом можуть додатково включати гуманізовані антитіла або людські антитіла. Гуманізованими формами антитіл нелюдського походження (наприклад, мишачі) є химерні імуноглобуліни, ланцюги імуноглобулінів або їх фрагменти (такі як Ем, Рабр, Раб" та інші антиген-зв'язувальні послідовності антитіл), які містять мінімальну послідовність, отриману з

Зо імуноглобуліну нелюдського походження. Гуманізовані антитіла включають імуноглобуліни людини (антитіло-реципієнт), в яких залишки від комплементарної детермінантної групи (СОК) реципієнта заміщені залишками від СОК нелюдського походження (антитіло-донор), такого як від миші, пацюка або кроля, що має бажану специфічність, афінність і зв'язувальну здатність. У деяких випадках Ем каркасні (ЕК) залишки імуноглобуліну людини є заміщеними відповідними залишками нелюдського походження. Гуманізовані антитіла можуть включати залишки, які не були виявлені ні в антитілі-реципієнті, ні в імпортованих СОМ або послідовностях каркаса. Як правило, гуманізоване антитіло буде містити по суті всі з принаймні одного, а зазвичай двох варіабельних доменів, в яких всі або по суті всі із діллнок СОК відповідають ділянкам імуноглобуліну нелюдського походження і всі або по суті всі із ділянок ЕК є ділянками консенсусної послідовності імуноглобуліну людини. Оптимально, якщо гуманізоване антитіло містить також принаймні частину константної ділянки імуноглобуліну (Ес), зазвичай ділянку імуноглобуліну людини.

Методи гуманізації нелюдських антитіл добре відомі фахівцю у цій галузі. Загалом, гуманізоване антитіло має один або більше амінокислотних залишків, введених в нього з джерела, яке є нелюдського походження. Ці амінокислотні залишки нелюдського походження часто називають "імпортними" залишками, які зазвичай беруть із "імпортного" варіабельного домену. Гуманізацію можна по суті провести шляхом заміщення СОК або послідовностей СОМ гризунів відповідними послідовностями людського антитіла. Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США 4 816 567), в яких суттєво менша частина ніж інтактний варіабельний домен людини була заміщена відповідною послідовністю біологічних видів, відмінних від людини. На практиці гуманізовані антитіла є зазвичай людськими антитілами, в яких деякі залишки СОК і, можливо, залишки ЕК є заміщеними залишками з аналогічних сайтів антитіл гризунів.

Можуть використовуватися трансгенні тварини (наприклад, миші), які після імунізації набувають здатність продукувати повний спектр людських антитіл в умовах відсутності виробки ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гена, що кодує ділянку з'єднання важких ланцюгів антитіла, у химерних клітин і лінії клітин зародків мутантних мишей приводить до повного інгібування виробки ендогенних антитіл. Перенесення генної матриці імуноглобуліну клітин зародків людини у лінію клітин зародків мутантних мишей приводить до виробки людських антитіл після антигенної стимуляції. Людські антитіла можуть також бути виділені методом фагового дисплея з комбінаторної бібліотеки.

Антитіла за винаходом переважно вводять суб'єкту у фармацевтично прийнятному носієві.

Як правило, для надання фармацевтичній композиції ізотонічності використовують відповідну кількість фармацевтично прийнятної солі. Приклади фармацевтично прийнятного носія включають фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин глюкози. рН розчину переважно має становити приблизно від 5 до 8, і більш переважно приблизно від 7 до 7,5. Додатково пропонуються носії, що включають препарати з тривалим вивільненням, такі як напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, які містять антитіла, причому ці матриці мають вигляд сформованих предметів, наприклад, плівок, ліпосом або мікрочастинок. Фахівцю в цій галузі зрозуміло, що певні носії можуть бути більш переважними, залежно від, наприклад, способу введення і концентрації антитіла, що вводиться.

Антитіла можна вводити суб'єкту, пацієнту або в клітину шляхом ін'єкції (наприклад, внутрішньовенної, внутрішньочеревної, підшкірної, внутрішньом'язової) або іншими методами, такими як інфузія, яка гарантує їх доставку у кровотік у ефективній формі. Антитіла можуть також бути введені внутрішньопухлинним або перитуморальним шляхом з метою отримати місцевий, а також системний терапевтичний ефект. Кращими є місцеве або внутрішньовенне введення.

Ефективні дози і режими дозування для введення антитіл можна визначити емпіричним шляхом, такі визначення знайомі фахівцю в цій галузі. Фахівцю в цій галузі зрозуміло, що дози антитіл, які необхідно вводити, залежать, наприклад, від суб'єкта, який отримує антитіла, шляху введення, конкретного типу використовуваних антитіл та інших лікарських препаратів, які вводяться. Типова щоденна доза при застосуванні антитіл як монотерапії може становити від приблизної мкг/кг до 100 мг/кг маси тіла або більше на добу, залежно від вищезгаданих факторів. Після введення антитіл, переважно з метою лікування раку підшлункової залози, ефективність терапевтичної дії антитіл можна оцінити різними способами, відомими фахівцю в цій галузі. Наприклад, розмір, кількість і (або) розповсюдження раку в організмі суб'єкта, що отримує лікування, можна контролювати за допомогою стандартних методик візуалізації пухлин.

Введене з терапевтичними цілями антитіло, яке затримує ріст пухлини, приводить до

Зо скорочення пухлини і (або) запобігає розвитку нових пухлин у порівнянні з перебігом захворювання, який би спостерігався за відсутності введення антитіла, є ефективним антитілом для лікування гліобластоми.

У ще одному аспекті цей винахід стосується способу отримання розчинного Т-клітинного рецептора (рТКР), що розпізнає конкретний комплекс пептиду і МНС. Такі розчинні Т-клітинні рецептори можуть бути отримані зі специфічних клонів Т-клітин, і їх спорідненість можна підвищити мутагенезом, націленим на комплементарні детермінантні групи. З метою вибору Т- клітинних рецепторів може використовуватися метод фагового дисплея (Заявка США 20100113300, (ГПідау еї аї.,, 2012)». З метою стабілізації Т-клітинних рецепторів у процесі фагового дисплея і у разі застосування як лікарського препарату альфа- і бета-ланцюги можуть буди зв'язані, наприклад ненативними дисульфідними зв'язками або іншими ковалентними зв'язками (одноланцюговий Т-клітинний рецептор) або доменами димеризації (ВошНег єї аї., 2003; Сага єї аї., 2004; М/йсох єї аїЇ., 1999). Т-клітинний рецептор може бути зв'язаний з токсинами, лікарськими препаратами, цитокінами (див., наприклад, заявку США 2013/0115191), доменами, що залучають ефекторні клітини, такі як домени антитіл проти СОЗ тощо, щоб виконувати конкретні функції на клітинах-мішенях. Більш того, він може експресуватися у Т- клітинах, що використовуються для адоптивного переносу. Додаткову інформацію можна знайти у заявках УМО 2004/033685А1 і УМО 2004/074322А1. Комбінація рРТКР описана у заявці УМО 2012/056407А1. Інші способи отримання розкриті у заявці УМО 2013/057586А1.

Крім того, пептиди і (або) ТКР, або антитіла, або інші зв'язувальні молекули за цим винаходом можуть використовуватися для підтвердження діагнозу "рак", поставленому патоморфологом на основі дослідження біоптату.

Ці антитіла або ТКР можуть використовуватися також для діагностики іп мімо. Зазвичай антитіла мітять радіонуклідами (такими як "п, 99Тс, 140, 11І, ЗН, 32 Р або 355), щоб пухлину можна було локалізувати, використовуючи імуносцинтіграфію. В одному з втілень антитіла або їх фрагменти зв'язуються з зовнішньоклітинними доменами двох або більше таких мішеней білка, вибраного з групи, що складається з вищезгаданих білків., із константою зв'язування (Ка) меншою ніж 1 х 10 мкМ.

Антитіла для діагностичного застосування можна мітити зондами, що підходять для виявлення різними методами візуалізації Методи виявлення зондів включають, але не бо обмежуються ними, флуоресценцію, світлову, конфокальну і електронну мікроскопію, магнітно-

резонансну візуалізацію і спектроскопію, флуороскопію, комп'ютерну томографію та позитронну емісійну томографію. Відповідні зонди включають, але не обмежуються ними, флуоресцеїн, родамін, еозин та інші флуорофори, радіоіїзотопи, золото, гадоліній та інші лантаноїди, парамагнітне залізо, фтор-18 та інші радіонукліди, що випромінюють позитрони. Крім цього, зонди можуть бути бі- або багатофункціональними і виявлятися більш ніж одним із зазначених методів. Ці антитіла можуть бути безпосередньо або опосередковано мічені вищезгаданими зондами. Прикріплення зондів до антитіл включає ковалентне зв'язування зонда, включення зонда в антитіло і ковалентне прикріплення хелатуючої сполуки для зв'язування зонда, серед інших методів, добре відомих фахівцю у цій галузі. У разі імуногістохімічних методів зразок хворої тканини може бути свіжим чи замороженим або може бути залитим у парафін і фіксованим за допомогою консерванту, такого як формалін. Фіксовані або залиті зразки зрізів тканин приводять у контакт із міченим первинним антитілом і вторинним антитілом, де антитіло використовується для виявлення експресії цих білків іп іш.

Згідно з іншим аспектом цього винаходу пропонується спосіб отримання активованих Т- клітин іп мійго, причому спосіб включає контактування іп мійго Т-клітин із навантаженими антигеном молекулами МНС, що експресуються на поверхні відповідної антиген-презентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації Т-клітини шляхом набуття нею специфічності до антигену, де згаданий антиген є пептидом за винаходом. Переважно з антиген-презентуючою клітиною використовують достатню кількість антигену.

Переважно клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР чи має його знижений рівень або знижену функціональну активність. Відповідні клітини з дефіцитом пептидного транспортера ТАР включають клітини Т2, КМА-5 і клітини дрозофіли. ТАР є транспортером, асоційованим із процесингом антигену.

Лінія людських клітин з недостатністю Т2, на які завантажуються пептиди, доступна для придбання у Американській колекції типових культур АТСС за адресою 12301 РагКІамп Огіме,

КоскКміїе, Магуїапа 20852, США, номер за каталогом СК. 1992; лінія клітин дрозофіли Зсппеїдег 2 доступна для придбання в АТСС, номер за каталогом СК. 19863; клітинна лінія миші КМА-5 описана у Ципдаогеп і співавт. (І їипддгеп апа Каїте, 1985).

Переважно, клітина-хазяїн до трансфекції не експресує суттєвої кількості молекул МН І

Зо класу. Також переважно клітина-стимулятор експресує молекулу, яка є важливою для забезпечення додаткового стимулюючого сигналу для Т-клітин, таку як будь-яка з молекул В7.1,

В7.2, ІСАМ-1 ії БА 3. Послідовності нуклеїнових кислот багатьох молекул МНС І класу і костимуляторних молекул є у вільному доступі в базах даних сСепВапк і ЕМВІ..

У випадку, коли роль антигенів відіграють епітопи комплексу МНС І класу, Т-клітини є СО8- позитивними Т-клітинами.

Якщо антиген-презентуючи клітину трансфекують для експресії такого епітопу, клітина переважно містить вектор експресії, здатний експресувати пептид, що містить послідовності від

ЗЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 67, або варіант його амінокислотної послідовності.

Ряд інших способів може використовуватися для отримання Т-клітин іп міго. Наприклад, для отримання ЦТЛ можуть використовуватися аутологічні лімфоцити, які інфільтрують пухлину.

Ріебапзкі і співавт. (Ріерап:хкі еї а!., 1995) використовували аутологічні лімфоцити периферійної крові (РІВ) для отримання Т-клітин. Більш того, можливе створення аутологічних Т-клітин шляхом обробки дендритних клітин пептидом або поліпептидом або інфікуванням рекомбінантним вірусом. Для отримання аутологічних Т-клітин можуть також використовуватися

В-клітини. Крім того, для отримання аутологічних Т-клітин можуть використовуватися макрофаги, оброблені пептидом або поліпептидом або інфіковані рекомбінантним вірусом. 5.

Умацег і співавт. (У/аег еї а!., 2003) описують примування Т-клітин іп міго за допомогою штучних антиген-презентуючих клітин (штучні АПК), що також є прийнятним способом отримання Т- клітин проти вибраного пептиду. В цьому винаході штучні АПК отримували шляхом прикріплення заздалегідь сформованих комплексів МНОС-пептид до поверхні полістирольних частинок (мікрогранул)у за допомогою системи біотин-стрептавідин. Ця система забезпечує точний контроль щільності МНС на штучних АПК, що дозволяє селективно викликати високо- або низькоавідні специфічні до антигену відповіді Т-клітин з високою ефективністю для зразків крові. Окрім комплексів МНО-пептид, штучні АПК мають нести інші білки з костимулювальною активністю, такі як антитіла проти СО28, прикріплені до їхньої поверхні. До того ж такі системи на базі штучних АПК часто вимагають додавання відповідних розчинних елементів, наприклад, цитокінів, таких як інтерлейкін-12.

Алогенні клітини також можуть використовуватися для отримання Т-клітин, і відповідний спосіб докладно описаний у заявці М/О 97/26328, яка включена в цей документ шляхом бо посилання. Наприклад, окрім клітин ЮОгозорпйа і клітин Т2, інші клітини можуть використовуватися для презентації антигенів, такі як клітини СНО, інфіковані бациловірусом клітин комах, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою.

Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу Рога і співавт. (Ропа єї аї., 1994), в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентації чужорідних пептидів.

Активовані Т-лімфоцити, які спрямовані проти пептидів за винаходом, є корисними в терапії.

Отже, згідно з ще одним аспектом винаходу пропонуються активовані Т-клітини, які можна отримати за допомогою вищезгаданих способів за винаходом.

Активовані Т-клітини, які отримані вищезгаданим способом, селективно розпізнають клітину, яка аберантно експресує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 569 ІЮ МО 67.

Переважно, Т-клітина розпізнає цю клітину шляхом взаємодії свого Т-клітинного рецептора з комплексом НІ А/пептид (наприклад, зв'язуванням). Т-клітини є корисними у способі знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за винаходом, за яким пацієнту вводиться ефективна кількість активованих Т-клітин. Ці Т-клітини, що вводяться пацієнту, можуть бути виділені з організму пацієнта і активовані як описано вище (тобто вони є аутологічними Т-клітинами). Як альтернатива, ці Т-клітини одержуються не з організму пацієнта, а від іншої людини. Зрозуміло, що переважно ця людина є здоровою людиною. Під терміном "здорова людина" автори винаходу мають на увазі, що людина має хороший загальний стан здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, на яке її можна легко перевірити і виявити.

Іп мімо, клітини-мішені для СО8-позитивних Т клітин за цим винаходом можуть бути клітинами пухлини (які іноді експресують МНС ІІ класу) і (або) клітинами строми, що оточують пухлину (пухлинні клітини) (які іноді також експресують МН ІІ класу; (Оєпа/є! еї а!., 2006)).

Т-клітини за цим винаходом можуть використовуватися як активні інгредієнти терапевтичної композиції. Отже, предметом цього винаходу також є спосіб знищення клітин-мішеней в організмі пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що містить амінокислотну послідовність за винаходом, причому спосіб включає введення пацієнту

Зо ефективної кількості Т-клітин згідно визначеному вище.

Під терміном "аберантно експресовані" автори винаходу мають на увазі, що поліпептид є надмірно експресованим у порівнянні з нормальними рівнями експресії або що ген є "мовчазним" у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Під терміном "надмірно експресований" автори винаходу мають на увазі, що поліпептид присутній на рівні, що принаймні у 1,2 рази вищий за рівень у нормальній тканині, переважно принаймні у 2 рази, та більш переважно принаймні у 5 або 10 разів вищий за рівень у нормальній тканині.

Т-клітини можуть бути отримані способами, що відомі в галузі, наприклад, тими, що описані вище.

Протоколи для цього так званого адоптивного перенесення Т-клітин добре відомі в цій галузі Огляди можна знайти, наприклад, у роботах Сайціопі і співавт. і Могдап і співавт. (Саціпопі еї а!., 2006; Могдап еї а)ї., 2006).

У ще одному аспекті цей винахід стосується застосування пептидів, які входить до складу комплексу з МНС, для отримання Т-клітинного рецептора, нуклеїнова кислота якого клонована і введена у клітину-хазяїн, переважно Т-клітину. Ця отримана методами генної інженерії Т- клітина може потім бути перенесена в організм пацієнта для лікування раку.

Будь-яка молекула за винаходом, тобто пептид, нуклеїнова кислота, антитіло, вектор експресії, клітина, активована Т-клітина, Т-клітинний рецептор або нуклеїнова кислота, яка її кодує, є прийнятною для лікування захворювань, для яких є характерним те, що клітини уникають імунної відповіді. Таким чином, будь-яка молекула за цим винаходом може застосовуватися як лікарський засіб або в процесі виробництва лікарського засобу. Згадана молекула може використовуватися сама по собі або у комбінації з іншою молекулою (іншими молекулами) за винаходом або відомою молекулою (відомими молекулами).

Предметом цього винаходу є лікарський засіб, який може застосовуватися при лікуванні раку, зокрема, раку підшлункової залози та інших злоякісних захворювань.

За цим винаходом також пропонується комплект, що включає: (а) контейнер, який містить фармацевтичну композицію як зазначено вище, у розчині або у ліофілізованій формі; (б) необов'язково, другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення ліофілізованої композиції, і 5О0

(в) необов'язково, інструкції із (ї) застосування розчину або (ії) відновлення і (або) застосування ліофілізованої композиції.

Комплект може додатково включати один або більше (ії) буферів, (ім) розріджувачів, (м) фільтрів, (мі) голок або (мії) шприців. Контейнер є переважно пляшкою, флаконом, шприцом або пробіркою; і він може бути контейнером багаторазового застосування. Фармацевтична композиція є переважно ліофілізованою.

Комплекти за винаходом, переважно, включають ліофілізовану композицію за цим винаходом в належному контейнері та інструкції з її відновлення і (або) застосування. Належні контейнери включають, наприклад, пляшки, флакони (наприклад, двокамерні флакони), шприци (такі як двокамерні шприци) і пробірки. Контейнер може бути виготовленим із багатьох видів матеріалів, таких як скло або пластмаса. Переважно, комплект і (або) контейнер містить(ять) інструкції із застосування контейнера або пов'язані з контейнером, які містять вказівки щодо відновлення і (або) застосування. Наприклад, на етикетці може вказуватися, що ліофілізована лікарська форма має бути відновлена до таких концентрацій пептидів як зазначено вище. На етикетці, крім того, може бути зазначено, що лікарська форма є прийнятною для або призначена для підшкірного введення.

Контейнер із лікарською формою може бути флаконом багаторазового застосування, котрий дозволяє робити повторні введення (наприклад, від 2 до б введень) відновленої лікарської форми. Комплект додатково може включати другий контейнер, що містить прийнятний розріджувач (наприклад, розчин бікарбонату натрію).

Після змішування розріджувача та ліофілізованої форми остаточна концентрація пептиду у відновленій формі переважно становить принаймні 0,15 мг/мл/пептиду (-75 мкг) та переважно не більше З мг/мл/пептиду (51500 мкг). Комплект додатково може включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та з точки зору користувача, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци та вкладиші в упаковку з інструкціями із застосування.

Комплекти за цим винаходом можуть включати один контейнер, який містить лікарську форму фармацевтичних композицій відповідно до цього винаходу з іншими компонентами чи без них (наприклад, інші сполуки або фармацевтичні композиції цих інших сполук) чи включати окремі контейнери для кожного компоненту.

Зо Переважно, комплекти за винаходом включають композицію за винаходом, упаковану для використання, в комбінації з одночасним введенням другої сполуки, такої, як ад'юванти (наприклад, ГМ-КСФ), хіміотерапевтичний агент, природний продукт, гормон чи антагоніст, анти- ангіогенезний агент чи інгібітор, апоптоз-індукуючий агент або хелатор) чи їхню фармацевтичну композицію Компоненти комплекту до введення пацієнту можуть бути завчасно змішані, чи кожний компонент може бути в окремому контейнері. Компоненти комплекту можуть бути надані в одному чи кількох рідких розчинах, переважно, водному розчині, більш переважно, стерильному водному розчині Компоненти комплекту також можуть надаватись як речовини у твердому стані, які можуть бути переведені на рідини шляхом додання прийнятних розчинників, котрі переважно містяться в іншому окремому контейнері.

Контейнер терапевтичного комплекту може являти собою флакон, пробірку, колбу, пляшку, шприц або будь-який інший засіб для вміщення твердої речовини чи рідини. Зазвичай, коли є більш ніж один компонент, комплект включає другий флакон чи другий контейнер, який дозволяє окреме дозування. Комплект може також включати інший контейнер для фармацевтично прийнятної рідини. Переважно, терапевтичний комплект буде включати апарат (наприклад, одну чи кілька голок, шприци, очні піпетки, піпетку та ін), який робить можливим введення речовин відповідно винаходу, що є компонентами цього комплекту.

Ця лікарська форма є формою, прийнятною для введення пептидів будь-яким зручним способом, наприклад, пероральним (ентеральним), назальним, очним, підшкірним, внутрішньошкірним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним або трансдермальним. Переважно, введення може здійснюватися підшкірно, та найбільш переважно, внутрішньошкірно інфузійним насосом.

Оскільки пептиди за винаходом були виділені з тканин раку підшлункової залози, лікарський засіб за винаходом переважно застосовується для лікування раку підшлункової залози.

Цей винахід також стосується способу отримання персоналізованого фармацевтичного засобу для застосування для конкретного пацієнта, який включає виготовлення фармацевтичної композиції, яка містить принаймні один пептид, вибраний із "сховища" заздалегідь "просіяних" ТОМАР, в якому щонайменше один пептид, використаний у фармацевтичній композиції, вибраний таким чином, щоб підходити конкретному пацієнту. В одному з втілень фармацевтична композиція є вакциною. Спосіб може також бути пристосованим для отримання клонів Т-клітин для подальшого використання, такого як виділення ТКР, або розчинних антитіл та інших варіантів лікування. "Персоналізований фармацевтичний засіб" означає засоби лікування, спеціально адаптовані для конкретного пацієнта, які будуть застосовані для лікування лише цього конкретного пацієнта, включаючи активно персоналізовані протиракові вакцини і засоби адоптивної клітинної терапії з використанням аутологічних тканин, отриманих від пацієнта.

Термін "сховище" в контексті цього винаходу означає групу пептидів, яка заздалегідь пройшла "просіяння" (скринінг) на імуногенність і (або) надмірну презентацію у конкретному виді пухлин. Термін "сховище" не означає, що конкретні пептиди, що входять до складу вакцини, були заздалегідь виготовлені і зберігалися у фізичному об'єкті, хоча така можливість мається на увазі. Прямо передбачається, що пептиди можуть бути виготовлені де помо для кожної отриманої персоналізованої вакцини або вони можуть бути виготовлені заздалегідь і зберігатися. "Сховище" (наприклад, у формі бази даних) складається з пухлино-асоційованих пептидів, що були високо експресовані тканинами пухлин хворих на рак підшлункової залози пацієнтів із різними алелями НГА-А, НІ А-В і НГА-С. Воно може містити пептиди, що зв'язані з молекулами МНС І класу і з молекулами МНС ІІ класу або подовжені пептиди, що зв'язані з молекулами МН І класу. На додаток до пухлино-асоційованих пептидів, отриманих із декількох тканин раку підшлункової залози, сховище може містити маркерні пептиди, що зв'язані з НІ А-

А"02 і НГ А-А"24. Ці пептиди дозволяють кількісно порівняти інтенсивність Т-клітинної відповіді, індукованої ТОМАР, і таким чином дозволяє зробити важливий висновок відносно здатності вакцини викликати протипухлинну відповідь. По-друге, вони виконують функцію важливих пептидів позитивного контролю, отриманих з "не-свого" антигену, у випадку, якщо у пацієнта не спостерігаються жодні вакцино-індуковані Т-клітинні відповіді на ТОМАР, отримані зі "своїх" власних антигенів пацієнта. І по-третє, воно дозволяє зробити висновки щодо стану імунокомпетентності пацієнта.

ТОМАР для "сховища" ідентифікуються за допомогою підходу інтегрованої функціональної геноміки, що поєднує аналіз генної експресії, мас-спектрометрію і Т-клітинну імунологію (ХРгезідепі Ф). Цей підхід гарантує, що тільки ТОМАР, насправді присутні у великому відсотку пухлин, але не взагалі неекспресовані або лише мінімально експресовані на нормальних

Зо тканинах, будуть вибрані для подальшого аналізу. Для первинного вибору пептидів зразки раку підшлункової залози пацієнтів і зразки крові від здорових донорів аналізували з використанням поетапного підходу: 1. НІ А-ліганди зі злоякісного матеріалу ідентифікували методом мас-спектрометрії 2. Аналіз експресії інформаційної рибонуклеїнової кислоти (ІРНК) в усьому геномі використовували для ідентифікації генів, що надмірно експресовані у злоякісній тканині (раку підшлункової залози) у порівнянні з рядом нормальних органів і тканин 3. Ідентифіковані НІ А-ліганди порівнювали з даними генної експресії Пептиди, надмірно або селективно презентовані на пухлінній тканині, переважно такі, що кодуються селективно експресованими або надмірно-експресованими генами, як було визначено на етапі 2, вважали прийнятними ТОМАР-кандидатами для включення до складу мультипептидної вакцини. 4. Пошук літератури був проведений для ідентифікації додаткових свідоцтв, що підтверджують доречність використання ідентифікованих пептидів як ТОМАР 5. Доречність надмірної експресії на рівні ІРНК була підтверджена повторним виявленням вибраних ТОМАР етапу 3 на пухлинній тканині і їх відсутністю (або рідким виявленням) на здорових тканинах. 6. Для оцінки того, чи є здійсненною індукція вибраними пептидами Т-клітинної відповіді іп мімо, був проведений аналіз імуногенності іп міго з використанням Т-клітин людини, отриманих від здорових донорів, а також від пацієнтів, хворих на рак підшлункової залози.

В одному з аспектів пептиди проходять попередній скринінг на імуногенність перед тим, як їх включать до "сховища". Як приклад, що не має обмежувального значення, імуногенність пептидів, доданих до "сховища", визначають методом, що включає примування Т-клітин іп міго шляхом повторних стимуляцій СО8--Т-клітин від здорових донорів клітинами, що презентують штучний антиген, навантаженими комплексами пептид/МНе і антитілами проти СО28.

Цей метод є переважним для видів раку, що рідко спостерігаються, і для пацієнтів з рідкісними профілями експресії. На відміну від мультипептидних коктейлів зі сталим складом, які у даний час вже розроблені, "сховище" дозволяє забезпечити значно кращий збіг з вакциною реальної експресії антигенів у пухлині. Вибрані "готові для застосування" індивідуальні пептиди або комбінації декількох пептидів будуть використані для кожного пацієнта у багатоцільовому підході. Теоретично, підхід, який базується на виборі, наприклад, 5 різних антигенних пептидів із бібліотеки з 50 пептидів, вже мав би привести приблизно до 17 мільйонів можливих складів лікарських препаратів.

В одному варіанті винаходу пептиди вибираються для включення до складу вакцини на основі їхньої прийнятності для конкретного пацієнта на основі способу за цим винаходом як вже описано в цьому документі або як викладено нижче.

З матеріалу пухлини і зразків крові пацієнта будуть зібрані дані щодо фенотипу НГА, транскриптомного і пептидомного аналізу з метою ідентифікувати найбільш прийнятні для кожного пацієнта пептиди "сховища" і унікальні для пацієнта (тобто мутовані) ТОМАР. Будуть вибрані ті пептиди, які селективно або надмірно експресуються в пухлинах пацієнтів і, де можливо, демонструють сильну імуногенність іп мйго, якщо вони були досліджені на зразках

МКПК індивідуальних пацієнтів.

Переважно, пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифіковані методом, що включає: (а) ідентифікацію пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта; (Б) порівняння пептидів, ідентифікованих в (а), зі сховищем (базою даних) пептидів як зазначено вище; і (с) вибір принаймні одного пептиду зі сховища (бази даних), який корелює з пухлино-асоційованим пептидом, ідентифікованим у пацієнта.

Наприклад, ТОМАР, які презентуються зразком пухлини, ідентифікуються за допомогою: (а1) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і (а2) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу і (або) ІІ класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною. Переважно, послідовності лігандів МНС ідентифікуються елююванням зв'язаних пептидів із їхніх комплексів із молекулами МНС, виділених із зразка пухлини, і секвенуванням елюйованих лігандів. Переважно, зразок пухлини і нормальна тканина отримані від того самого пацієнта.

На додаток до (або як альтернатива йому) вибору пептидів з використанням моделі "сховища", ТОМАР можуть бути ідентифіковані у пацієнта де помо і потім введені до складу вакцини. Як один приклад, ТОМАР-кандидати можуть бути ідентифіковані у пацієнта шляхом

Зо (а1ї) порівняння даних експресії зі зразка пухлини з даними експресії зі зразка нормальної тканини, що відповідає типу тканини зразка пухлини, для ідентифікації білків, які надмірно експресуються або аберантно експресуються у зразку пухлини; і (а2) проведення кореляції даних експресії з послідовностями лігандів МНС, зв'язаних із молекулою МНС І класу і (або) ЇЇ класу, в зразку пухлини для ідентифікації лігандів МНС, отриманих із білків, що надмірно експресуються або аберантно експресуються пухлиною. Як інший приклад, білки можуть бути ідентифіковані як такі, що містять мутації, які є унікальними для зразка пухлини, по відношенню до відповідної нормальної тканини конкретного пацієнта, а ТОМАР можуть бути ідентифіковані як такі, що специфічно націлені на цю мутацію. Наприклад, геном пухлинної клітини і геном клітин відповідної нормальної тканини можливо секвенувати методом повногеномного секвенування: для викриття несинонімічних мутацій у білок-кодуючій ділянці генів геномні ДНК і

РНК екстрагують із пухлинних тканин, а нормальну немутовану геномну ДНК лінії зародкових клітин екстрагували з мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК). Використаний метод секвенування нового покоління (МО5) зводиться до повторного секвенування білок-кодуючих ділянок (ресеквенування екзому). З цією метою екзонну ДНК із зразків людини уловлюють за допомогою комплектів збагачення цільовими фрагментами, придбаних у постачальника, з наступним секвенуванням, наприклад, за допомогою Нізед2000 (Шиптіпа). Крім цього, ІРНК пухлинних клітин секвенують для прямого кількісного визначення генної експресії і підтвердження того, що мутовані гени експресуються у пухлинах пацієнтів. Отримані мутації послідовностей зчитування обробляють з використанням програмно-реалізованих алгоритмів.

Таблиця результатів містить мутації і показники генної експресії. Пухлиноспецифічні соматичні мутації визначають шляхом порівняння з варіаціями зародкових ліній, що походять від МКПК, і розміщують у відповідності до пріоритету. Ідентифіковані де помо пептиди можуть згодом бути досліджені на імуногенність як викладено вище для "сховища", а і ТОМАР-кандидати, що мають прийнятну імуногенність, вибирають для включення до складу вакцини.

В одному з прикладів втілень пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифікуються таким чином: (а) ідентифікацією пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта описаними вище методами; (б) порівнянням пептидів, ідентифікованих в а), зі сховищем пептидів, які пройшли попередній скринінг на імуногенність і на надмірну експресію у пухлинах у порівнянні з відповідною нормальною тканиною; (в) бо вибором принаймні одного пептиду зі сховища, який корелює з пухлино-асоційованим пептидом, ідентифікованим у пацієнта, і г) необов'язково, вибором принаймні одного пептиду, ідентифікованого де помо в (а) і підтвердженням його імуногенності.

В одному з прикладів втілень пептиди, що входять до складу вакцини, ідентифікуються таким чином: (а) ідентифікацією пухлино-асоційованих пептидів (ТОМАР), які презентуються зразком пухлини від конкретного пацієнта; і (б) вибором принаймні одного пептиду, ідентифікованого де помо в (а) і підтвердженням його імуногенності.

Після вибору пептидів для персоналізованої вакцини на основі пептиді виготовляється вакцина. Ця вакцина переважно є рідкою лікарською формою, що складається з окремих пептидів, розчинених у ДМСО концентрацією від 20 до 40 95, переважно приблизно від 30 до 35 95, такій як приблизно 33 95 ДМСО.

Кожен пептид, який належить включити до композиції, розчиняють у ДМСО. Концентрацію розчинів окремих пептидів необхідно вибирати залежно від кількості пептидів, які належить включити до складу продукту. Розчини окремих пептидів у ДМСО змішують у рівних частинах, щоб отримати розчин, який містить усі пептиди, які належить включити до складу продукту, з концентрацією 2,5 мг/мл для кожного пептиду. Змішаний розчин потім розводять у співвідношенні 1:3 водою для ін'єкцій з метою досягти концентрацію 0,826 мг/мл для кожного пептиду у 33 96 ДМСО. Розведений розчин фільтрують через стерильний фільтр із розміром пор 0,22 мкм. Отримують нерозфасований кінцевий розчин.

Нерозфасований кінцевий розчин розливають по флаконах і зберігають при температурі - 20 7С аж до використання. Один флакон вміщує 700 мкл розчину, що містить 0,578 мг кожного пептиду. 500 мкл цього розчину (приблизно 400 мкг кожного пептиду) будуть використані для внутрішньошкірної ін'єкції.

На додаток до можливості використання для лікування раку, пептиди за цим винаходом можуть також використовуватися як діагностичні реактиви. Оскільки пептиди генерувалися з клітин раку підшлункової залози і оскільки було визначено, що ці пептиди не є присутніми у нормальних тканинах або присутні у низькій кількості, ці пептиди можуть використовуватися для діагностики наявності раку.

Присутність пептидів за цим винаходом на біоптатах тканин у зразках крові може допомогти патоморфологу в діагностуванні раку. Виявлення певних пептидів за допомогою антитіл, мас-

Зо спектрометрії або інших методів, відомих фахівцям у цій галузі, може надати патоморфологу інформацію, чи є тканина злоякісною або запаленою або взагалі ураженою хворобою, або може використовуватися як біомаркер раку підшлункової залози. Наявність груп пептидів може дозволити віднести хворі тканини до певного класу чи підкласу.

Виявлення пептидів на зразках хворої тканини дає можливість прийняти рішення відносно користі від методів лікування за участю імунної системи, особливо якщо відомо або передбачається, що Т-лімфоцити причетні до механізму дії. Втрата експресії МНС є добре відомим механізмом, за яким інфіковані або злоякісні клітини уникають імунного контролю.

Отже, наявність пептидів свідчить про те, що цей механізм не використовується клітинами, що аналізуються.

Пептиди за цим винаходом можливо використовувати для аналізу відповіді лімфоцитів на дію таких пептидів, такої як реакція Т-клітин або відповідь антитіл на пептид або комплекс пептиду і молекул МНС. Ці відповіді лімфоцитів можливо використовувати як прогностичні маркери для прийняття рішень щодо наступних терапевтичних дій. Ці відповіді можна також використовувати як сурогатні маркери в імунотерапевтичних підходах, що мають на меті викликати відповіді лімфоцитів у різний спосіб, наприклад, вакцинацією білками, нуклеїновими кислотами, аутологічними матеріалами, адоптивним перенесенням лімфоцитів. В закладах, де застосовують генну терапію, для оцінки побічних ефектів рекомендується проаналізувати реакції лімфоцитів на пептиди. Моніторинг реакцій лімфоцитів може також бути цінним інструментом під час обстеження при подальшому спостереженні після трансплантації, наприклад, для виявлення реакцій "трансплантат проти хазяїна" та "хазяїн проти трансплантата".

Цей винахід буде проілюстрований наведеними нижче прикладами, які описують його переважні втілення, з посиланнями на супроводжувальні фігури, але не обмежуються наведеними тут. Для цілей цього винаходу всі цитовані джерела включені в цей документ шляхом посилання в усій повноті.

На Фігурах ТА-С показана надмірна презентація різних пептидів у нормальних тканинах (темно-сірий колір) і тканинах раку підшлункової залози (світло-сірий колір). На Фігурі 10 показані усі лінії клітин (темно-сірий колір), нормальні тканини (сірий колір) і ракові тканини (світло-сірий колір), на яких був виявлений типовий пептид (Р ЕРСОБЗАМІ М) (ЗЕО ІО МО.: 9). бо Фігура 1А) Ген: СТІ А/СТІ В, пептид: РІ АООЄЗЕЇ (А"02) (ЗЕО ІО МО.: 1); тканини, показані зліва направо: 1 жирова тканина, З надниркові залози, 2 артерії, З кісткових мозки, 7 головних мозків,

З молочні залози, 13 товстих кишок, 1 яєчник, 4 стравоходи, 2 жовчних міхури, З серця, 12 нирок, 4 зразки лейкоцитів, 19 печінок, 43 легені, 1 лімфатичний вузол, 1 яєчник, 2 периферичних нерви, 1 очеревина, 1 гіпофіз, З плеври, 1 передміхурова залоза, 6 прямих кишок, З скелетні м'язи, З шкіри, 2 тонкі кишки, 4 селезінки, 5 шлунків, 1 сім'яник, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 2 матки, 2 вени, 6 підшлункових залоз, 18 раків підшлункової залози; Фігура 18 Ген: РІ ЕС, пептид: БІ ОБЕНМАМА (А"О2), (З5ЕО ІО МО.: 2); тканини, показані зліва направо: 1 жирова тканина, З надниркові залози, 2 артерії, З кісткових мозки, 7 головних мозків, З молочні залози, 13 товстих кишок, 1 яєчник, 4 стравоходи, 2 жовчних міхури, З серця, 12 нирок, 4 зразки лейкоцитів, 19 печінок, 43 легені, 1 лімфатичний вузол, 1 яєчник, 2 периферичних нерви, 1 очеревина, 1 гіпофіз, З плеври, 1 передміхурова залоза, б прямих кишок, З скелетні м'язи, З шкіри, 2 тонкі кишки, 4 селезінки, 5 шлунків, 1 сім'яник, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 2 матки, 2 вени, 6 підшлункових залоз, 18 раків підшлункової залози; Фігура 1С Ген: СОЇ 6АЗ, пептид:

ЕГМравззАї (А"02) (5ЕБО ІО МО.: 10); тканини, показані зліва направо: 1 жирова тканина, З надниркові залози, 2 артерії, З кісткових мозки, 7 головних мозків, З молочні залози, 13 товстих кишок, 1 яєчник, 4 стравоходи, 2 жовчних міхури, З серця, 12 нирок, 4 зразки лейкоцитів, 19 печінок, 43 легені, 1 лімфатичний вузол, 1 яєчник, 2 периферичних нерви, 1 очеревина, 1 гіпофіз, З плеври, 1 передміхурова залоза, 6 прямих кишок, З скелетні м'язи, З шкіри, 2 тонкі кишки, 4 селезінки, 5 шлунків, 1 сім'яник, 2 тимуси, З щитоподібні залози, 2 матки, 2 вени, 6 підшлункових залоз, 18 раків підшлункової залози; Фігура 10 СОЇ бАЗ, пептид: ГІ ЕОСБАМІ М (А"О2) (ЗЕО ІО МО.: 9); тканини, показані зліва направо: 5 ліній раку підшлункової залози, 7 нормальних тканин (1 товста кишка, 6 легенів), 85 ракових тканин (2 раки молочної залози, б раків товстої кишки, 4 раки стравоходу, З раки печінки, 56 раків легенів, 5 раків підшлункової залози, З раки прямої кишки, 1 меланома, 5 раків шлунка). Набір нормальних тканин був таким самим, як у А-С, але тканини без виявлення не показані. Розбіжність між списками видів пухлин на Фігурі 10 і у таблиці 4 можна пояснити більш суворими критеріями вибору, застосованими щодо таблиці 4 (докладну інформацію див. у таблиці 4). На Фігурі 10 показані усі зразки з виявлюваною презентацією пептиду М, незалежно від показників надмірної презентації і технічної перевірки якості зразків.

Зо На Фігурах 1Е - І показані усі лінії клітин (темно-сірий колір), нормальні тканини (сірий колір) і ракові тканини (світло-сірий колір), на яких був виявлений типовий пептид. Фігура 1 ЄЕ) Пептид:

ЗМОМ5РРКМ (А"02) (5ЕО І МО.: 4); тканини, показані зліва направо: 1 лінія клітин, З первинні культури, 1 шкіра, 1 рак жовчних протоків, З раки головного мозку, 1 рак молочної залози, 4 раки стравоходу, 5 раків нирки, 11 раків легенів, 1 рак лімфатичного вузла, 1 рак яєчника, З раки підшлункової залози, 1 рак передміхурової залози, З раки шкіри, 2 раки сечового міхура, З раки матки; Фігура 1Р) Пептид: МОРІ НТМ (А"02) (ЗЕО ІО МО.: 5); тканини, показані зліва направо: 2 лінії клітин, 1 первинна культура, 1 рак жовчних протоків, 2 раки головного мозку, 1 рак молочної залози, З раки стравоходу, 2 раки жовчного міхура, 2 раки нирки, 2 раки печінки, З раки легенів, 7 раків яєчника, 2 раки підшлункової залози, З раки шкіри, 1 рак шлунка, 1 рак матки, Фігура 12) Пептид: ІМООІ ТІМ. (А"02) (ЗЕО ІО МО.: 8); тканини, показані зліва направо: 1 лінія клітин, 1 рак товстої кишки, 2 раки стравоходу, 2 раки жовчного міхура, 5 раків легенів, 1 рак лімфатичного вузла, 1 рак підшлункової залози, 2 раки шкіри, 4 раки шлунка, 1 рак сечового міхура, 4 раки матки, Фігура 1Н) Пептид: ІП АСОТМНМ (А"02) (5ЕО ІО МО.: 13); тканини, показані зліва направо: 6 ліній клітин, 1 легеня, 1 плацента, 2 раки жовчних протоків, З раки молочної залози, 2 раки товстої кишки, 2 раки стравоходу, 2 раки жовчного міхура, 1 рак печінки, 36 раків легенів, З раки яєчника, З раки підшлункової залози, 1 рак прямої кишки, З раки сечового міхура; і Фігура 1І) Пептид: М АКРОМІБМ (А"02) (5ЕО ІО МО.: 14); тканини, показані зліва направо: 7 ліній клітин, 1 легеня, 1 рак жовчних протоків, 4 раки молочної залози, 1 рак товстої кишки, 2 раки стравоходу, 1 рак жовчного міхура, 36 раків легенів, 1 рак яєчника, З раки підшлункової залози, 2 раки прямої кишки, 1 рак шлунка, 1 рак сечового міхура.

На Фігурі 2 показані приклади профілів експресії (відносна експресія у порівнянні з нормальною ниркою) вихідних генів за цим винаходом, які в значній мірі надмірно або виключно експресуються у пухлинах раку підшлункової залози у панелі нормальних тканин (темно-сірий колір) і 11 зразках раку підшлункової залози (сірий колір). Фігура 2А) ГАМС2; тканини зліва направо: 1 надниркова залоза, 1 артерія, 1 кістковий мозок, 1 головний мозок (весь), 1 молочна залоза, 1 товста кишка, 1 стравохід, 1 серце, З нирки, 1 зразок лейкоцитів, 1 печінка, 1 легеня, 1 лімфатичний вузол, 1 яєчник, 1 підшлункова залоза, 1 плацента, 1 передміхурова залоза, 1 слинна залоза, 1 скелетна м'яза, 1 шкіра, 1 тонка кишка, 1 селезінка, 1 шлунок, 1 сім'яник, 1 тимус, 1 щитоподібна залоза, 1 сечовий міхур, 1 шийка матки, 1 матка, 1 вена, 18 раків бо підшлункової залози; Фігура 28) МСАМ, тканини зліва направо: 1 надниркова залоза, 1 артерія, 1 кістковий мозок, 1 головний мозок (весь), 1 молочна залоза, 1 товста кишка, 1 стравохід, 1 серце, З нирки, 1 зразок лейкоцитів, 1 печінка, 1 легеня, 1 лімфатичний вузол, 1 яєчник, 1 підшлункова залоза, 1 плацента, 1 передміхурова залоза, 1 слинна залоза, 1 скелетна м'яза, 1 шкіра, 1 тонка кишка, 1 селезінка, 1 шлунок, 1 сім'яник, 17 тимус, 1 щитоподібна залоза, 1 сечовий міхур, 1 шийка матки, 1 матка, 1 вена, 18 раків підшлункової залози; Фігура 2С) ЕАР, тканини зліва направо: 1 надниркова залоза, 1 артерія, 1 кістковий мозок, 1 головний мозок (весь), 1 молочна залоза, 1 товста кишка, 1 стравохід, 1 серце, З нирки, 1 зразок лейкоцитів, 1 печінка, 1 легеня, 1 лімфатичний вузол, 1 яєчник, 1 підшлункова залоза, 1 плацента, 1 передміхурова залоза, 1 слинна залоза, 1 скелетна м'яза, 1 шкіра, 1 тонка кишка, 1 селезінка, 1 шлунок, 1 сім'яник, 1 тимус, 1 щитоподібна залоза, 1 сечовий міхур, 1 шийка матки, 1 матка, 1 вена, 18 раків підшлункової залози.

На Фігурі З показані типові дані дослідження імуногенності: результати проточної цитометрії після пептид-специфічного мультимерного забарвлювання. На фігурах З (С і 0) показані типові результати відповіді іп міго пептид-специфічних СО8-Т-клітин здорового НІ А-А"02-- донора.

СОв-позитивні Т-клітини були примовані з використанням штучних АПК, навантажених моноклональними антитілами проти СО28 і НГА-А"02 у комплексі з пептидом з послідовністю

Бед ІЮ Мо З (С, ліва панель) або 5ед ІО Мо 50 (0, ліва панель), відповідно. Після трьох циклів стимуляції були проведене визначення клітин, що реагують із пептидом, за допомогою подвійного фарбування мультимерів з А"02/5ед ІЮО Мо З (С) або А"02/5ед ІЮ Мо 50 (0). На правих панелях (С і Ю) показане контрольне забарвлення клітин, стимульованих невідповідними комплексами А"02/пептид. Проводили "гейтування" життєздатних поодиноких клітин на належність до СО8- лімфоцитів. Булеві гейтування допомогли виключити хибнопозитивні відповіді, виявлені з мультимерами, специфічними до різних пептидів. Наведені частоти виявлення специфічних мультимер-позитивних клітин серед СО8 лімфоцитів.

Приклади

Приклад 1: Ідентифікація і кількісне визначення рівнів пухлино-асоційованих пептидів, презентованих на поверхні клітин

Зразки тканин

Зразки тканин пухлин пацієнтів були отримані з Авіегапа (Детройт, Мічиган, США і Ройстон,

Зо Хартфордшир, Велика Британія), Сепеїсізі Іпс. (Глендейл, Каліфорнія, США), Університетської клініки Гейдельберга, Університетської клініки Тюбінгена. Нормальні тканини були отримані з

Віо-Оріопз Іпс. (Брі, Каліфорнія, США), Віобзегме (Белтсевілл, Меріленд, США), Сарйа! Віозсієпсе

Іпс. (Роквілл, Меріленд, США), Сепеїїсібї Іпс. (Глендейл, Каліфорнія, США), Університетської клініки Женеви, Університетської клініки Гейдельберга, Університету медицини префектури

Кіото (КРОМ); Університетської клініки Мюнхена, РгоїеоСепех Іпс., (Калвер Сіті, Каліфорнія,

США), Університетської клініки Тюбінгена. До хірургічного видалення тканин або аутопсії була одержана письмова інформована згода від усіх пацієнтів. Тканини були заморожені шоковим способом безпосередньо після вирізування та зберігались до виділення ТОМАР при температурі -70 "С або нижче.

Виділення пептидів НГА із зразків тканин

Пули пептидів НГА із заморожених шоковим способом зразків тканин були одержані імунним осадженням із твердих тканин відповідно до незначно зміненого протоколу (гаїК еї аї., 1991; зЗеедег єї а!Ї., 1999) з використанням НІ А-А"02-специфічного антитіла ВВ7.2, використанням

НІА-А, -В, С-специфічного антитіла УМУб/32, використанням СМВг-активованої сефарози, кислотної обробки та ультрафільтрації.

Аналіз методом мас-спектрометрії

Одержані пули пептидів НІГА розділялися відповідно до їхньої гідрофобності із використанням зворотно-фазної хроматографії (папоАсдийу ШРІС зуєїет, УмМаїегв), та елюйовані пептиди були проаналізовані на гібридному мас-спектрометрі ГТО-уєЇо5 (ТпегтоЕїІесігоп) з джерелом іонів типу електроспрей (Е5ЗІ). Пептидні пули були завантажені безпосередньо на аналітичну мікрокапілярну колонку з плавленого кварцу (75 мкм в. д. х 250 мм), заповнену зворотно-фазним сорбентом С18 розміром 1,7 мкм (УмМаїегв), із застосуванням швидкості потоку 400 нл на хвилину. Згодом пептиди були розділені з використанням двоетапного 180-хвилинного бінарного градієнту з 10 95 до 33 96 розчинника В при швидкості потоку 300 нл на хвилину. Градієнт був забезпечений розчинником А (0,1 95 мурашиної кислоті у воді) та розчинником В (0,1 96 мурашиної кислоті в ацетонітрилі). Був використаний скляний капіляр із золотим покриттям (РісоТір, Мем/ ОБіесіїме) для введення в джерело іонів нано-ЕбІ.

Мас-спектрометри ГТО-Огріїгар працювали в інформаційно-залежному режимі з використанням стратегії ТОР5. Стисло, цикл сканування був ініційований з повним скануванням при високій бо точності маси на Огрігар (К-30 000) з наступними сканами МС/МС також на Огріїгар (К-7500)

на 5 найбільш поширених прекурсорних іонах з динамічним виключенням раніше вибраних іонів. Тандемні мас-спектри були інтерпретовані програмою БЕОШЕ5Т з додатковим контролем в ручному режимі. Ідентифікована пептидна послідовність була підтверджена порівнянням генерованої моделі фрагментації природного пептиду з моделлю фрагментації синтетичного контрольного пептиду з ідентичною послідовністю.

Відносне кількісне визначення на основі даних РХ-МС без використання ізотопної мітки здійснювалось підрахунком іонів, тобто екстракцією і аналізом компонентів РХ-МС (Миеїег еї аї., 2007). Цей метод базується на припущенні, що площі піків РХ-МС сигналів пептиду корелюють з його кількістю у зразку. Екстраговані компоненти були потім піддані обробці методами деконволюції за зарядовими станами і вирівнювання часу утримання (Миеїгїег еї аі., 2008; 5їШтт еї а!., 2008). Нарешті, компоненти РХ-МС були піддані обробці методом перехресних посилань з результатами ідентифікації послідовностей з метою об'єднати кількісні дані різних зразків і тканин у профілі презентації пептидів. Кількісні дані пройшли двоярусну нормалізацію відповідно до основної тенденції, з урахуванням варіабельності технічних і біологічних повторних вимірів. Отже, кожний ідентифікований пептид можна зв'язати з кількісними даними, що дозволяє провести відносний кількісний аналіз між зразками і тканинами. Крім того, усі кількісні дані, отримані для пептидів-кандидатів, були перевірені вручну для забезпечення погодженості даних і перевірки точності автоматичного аналізу. Профілі презентації були розраховані для кожного пептиду, які дозволяють оцінити середній рівень презентації у зразку, а також варіацію повторних вимірювань. Профіль зіставляє зразки раку підшлункової залози з фоновим рівнем зразків нормальних тканин. Профілі презентації типових надмірно презентованих пептидів показані на Фігурі 2. Показники презентації типових пептидів наведені у

Таблиці 8.

Таблиця 16. Показники презентації. У таблиці наведений перелік пептидів, які надзвичайно надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (ж), в значній мірі надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (1-8) або надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (тк).

Таблиця 17 8 ПМО0ІТІМ ОЇ 7777-71 9 РІРСОБАМІМ | 7771

Таблиця 18 (продовження) 66 АПЗСІВЕА | -(М - 68 0КИШТЕМНААЇГ/-/| -:И - 80 ТУРНІЗОМЇ7 | -:. к 86 5ПАОМІЗУМІ | б з

Приклад 2

Профілі експресії генів, що кодують пептиди за винаходом

Надмірна презентація або специфічна презентація пептиду пухлинних клітинах у порівнянні з нормальними клітинами є достатньою для можливості його використання в імунотерапії, а деякі пептиди є пухлино-специфічними незважаючи на те, що їхній вихідний білок зустрічається також у нормальних тканинах. Все ж, отримання профілю експресії ІРНК додає додатковий рівень безпеки у виборі пептидних мішеней для імунотерапії. Це особливо важливо для варіантів терапії з високим ризиком для безпеки, таких як ТКР із дозрілою афінністю, де ідеальний пептид буде отриманий з білка, унікального для пухлини і який не виявлений у нормальних тканинах.

Джерела та приготування РНК

Зразки тканин, видалені хірургічним шляхом, були придбані у зазначених вище джерел (див.

Приклад 1) після одержання письмової інформованої згоди від кожного пацієнта. Зразки пухлинної тканини були миттєво заморожені в рідкому азоті безпосередньо після хірургічної операції та пізніше гомогенізовані з використанням ступки та товкача під рідким азотом.

Тотальна РНК була приготована з цих зразків з використанням реактиву ТК! (Атріоп,

Дармштадт, Німеччина), з наступним очищенням за допомогою КМеазу (ОІАСЕМ, Хільден,

Німеччина); обидві методики виконувались за протоколом виробника.

Тотальна РНК зі здорових тканин людей була одержана комерційним шляхом (Атріоп,

Хантингтон, Велика Британія; Сіопіесп, Гейдельберг, Німеччина; 5бігаїадепе, Амстердам,

Нідерланди; ВіоСпаіїп, Хейард, Каліфорнія, США). РНК від кількох осіб (від 2 до 123 осіб) були змішані таким чином, щоб РНК від кожної особи була рівнозважена.

Якість та кількість усіх зразків РНК були оцінені на біоаналізаторі Адіепі 2100 (Адіїепі,

Вальдброн, Німеччина), з використанням комплекту ЕМА 6000 Рісо І арсСпір Кії (АдіїепО).

Експерименти з використанням мікрочипів

Аналіз генної експресії усіх зразків РНК пухлинних і нормальних тканин був виконаний з використанням олігонуклеотидних мікрочипів Айутеїгіх Нитап Сепоте (НС) О133А або НОо- 133 Ріюиз 2.0 (Апутеїгіх, Санта Клара, Каліфорнія, США). Усі етапи виконувалися відповідно до посібника АПутеїгіх. Стисло, дволанцюгова кКДНК була синтезована з 5-8 мкг тотальної РНК, з використанням Зирегзогірі КЕТІ! (Іпмігодеп) та оліго-4Т-Т7-праймеру (МУУС Віоїесі, Еберсберг,

Німеччина), як описано в посібнику. Транскрипція іп мійго була виконана з використанням комплекту маркування РНК-транскриптів ВіоАггау Нідп місій КЕМА Тгапвзосгірі Гарейпо Ки (ЕМ2О ріадповійсв, Іпс., Фармінгдейл, Нью-Йорк, США) для чипів О1З3ЗА або комплекту СепесСпір ІМТ

І абеїїїпо Кії (АПутеїгіх) для чипів 0133 Рів 2.0, після чого були здійснені кРНК- фрагментація, гібридизація та забарвлювання стрептавідин-фікоеритрином та біотинільованим анти- стрептавідиновим антитілом (МоїІесціаг Ргобе5, Лейден, Нідерланди). Зображення були скановані приладом Адііепі 2500А СепеАттау Зсаппег (Ш1З3ЗА) або АпПутеїйіх Ссепе-СНпір Зсаппег 3000 (0133 Ріє 2.0). Дані аналізувалися за допомогою програми 5СО5 (АПутейіх), з використанням стандартних установок для усіх параметрів. Для нормалізації були застосовані 100 службових генів, наданих компанією АйЙутеїгіх. Відносні значення експресії були

Зо розраховані по відношенням логарифмів зареєстрованих сигналів, наданим комп'ютерною програмою, причому значення для нормального зразка тканин нирки було довільно встановлене на 1,0. Типові профілі експресії вихідних генів цього винаходу, які в значній мірі надмірно або виключно експресуються при раку підшлункової залози, показані на Фігурі 1. Показники презентації додаткових типових генів наведені у Таблиці 9.

Таблиця 19. Показники презентації У таблиці наведений перелік пептидів, які отримані з генів, що надзвичайно надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (ї-ї), в значній мірі надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (їж) або надмірно презентуються на пухлинах у порівнянні з панеллю нормальних тканин (жк).

Таблиця 20 6 МИВІКОАРІМЇ | з

Таблиця 21 (продовження) 66 АПБЗСІВЕА | з-н 2 "

Приклад З

Імуногенність Іп міго презентованих МН І класу пептидів

Щоб отримати інформацію стосовно імуногенності ТОМАР за цим винаходом, автори винаходу провели дослідження з використанням примування Т-клітин іп мійго на основі повторної стимуляції СО8-Т-клітин штучними антиген-презентуючими клітинами (штучними

АПК), навантаженими комплексами пептид/МНе і антитілами проти СО28. У такий спосіб була показана імуногенність на цей час 22 ТОМАР за цим винаходом, рестриктованих за НІ А-А"0201, що продемонструвало, що ці пептиди є епітопами Т-клітин, проти яких в організмі людини існують попередники СО8 «Т-клітин (Таблиця 10).

Примування СО8 Т-клітин іп міго

Для проведення стимуляцій іп міго штучними антиген-презентуючими клітинами, завантаженими комплексом пептид-МНС (рмМмнНео) та антитілами проти СО28, спочатку були виділені СО8Т-клітини зі свіжих продуктів лейкаферезу НІ А-А"02 шляхом позитивного відбору з використанням анти-СО8 мікрогранул (Мінепуі Віоїес, Бергіш-Гладбах, Німеччина) здорових донорів, отриманих із Університетської клініки міста Мангейм, Німеччина, після одержання інформованої згоди.

МКПК і виділені СОв--лімфоцити інкубували аж до використання в Т-клітинному середовищі (ТОМ), що складається з КРМІ-СІшщатах (Іпмігодеп, Карлсрує, Німеччина) з додаванням 10 95 термічно інактивованої АВ-сироватки людини (РАМ-Віоїесі, Ейденбах, Німеччина), 100 Од/мл пеніциліну/100 мкг/мл стрептоміцину (Сатбгех, Кельн, Німеччина), 1 мМ пірувату натрію (СС

Рго, Обердорла, Німеччина), 20 мкг/мл гентаміцину (Сатрбгех). Цитокіни у концентраціях 2,5 нг/мл ІЛ-7 (РготосеїЇ, Гейдельберг, Німеччина) та 10 Од/мл ІЛ-2 (Момапів Рпагта, Нюрнберг,

Німеччина) також додавалися до ТОМ на цьому етапі культивування.

Приготування мікросфер, покритих рМНе і антитілами проти СО28, Т-клітинні стимуляції та зчитування виконувалися у добре вивченій системі іп міго з використанням чотирьох різних молекул рМНеС для кожної стимуляції і 8 різних молекул рРМНеС для кожної умови зчитування.

Очищені костимулювальні антитіла мишачого І(дДо2а проти СО28 людини АБ 9.3 (Чипа еї аї.,

Зо 1987) були хімічно біотинільовані за допомогою сульфо-М-гідроксисукцинімідобіотину, як рекомендовано виробником (Регбіо, Бонн, Німеччина). Використовували полістирольні гранули діаметром 5,6 мкм, покриті стрептавідином (Вапоз І арогайогіе5, Іллінойс, США). рМНС, використаними як позитивний і негативний контроль, були А"0201/МІ А-001 (пептид

ЕГАСІСІЇ ТМ з модифікованого Меіап-А/МАВТ-1) та А"0201/00Х5-001 (МІГ РАЇМНІ (ЗЕО ІО Мо. 89) з ООХ5), відповідно.

В 96-лункові планшети вносили 800 000 мікрогранул/200 мкл у присутності 4 х 12,5 нг різних біотинільованих комплексів РМНС, промивали та додавали 600 нг біотинільованих антитіл проти СО28 в об'ємі 200 мкл. Стимуляція була проведена в планшетах на 96 лунок шляхом спільного інкубування 1 х 105 СОВ8-Т-клітин із 2 х 105 промитих мікрогранул з покриттям у 200 мкл ТОМ з доданням 5 нг/мл ІЛ-12 (Рготосеї|) протягом З днів за температури 37 "С. Половина середовища була потім замінена свіжим ТОМ з доданням 80 Од/мл ІЛ-2, та інкубування бо продовжували 4 дні за 37 "С. Цей цикл стимуляцій був виконаний загалом три рази. Для зчитування з РМНО-мультимерів з використанням 8 різних молекул РМНС для кожної умови зчитування застосовувалося двомірне структурне кодування як описано раніше (Апаегзеп 6ї аї., 2012) з невеликими модифікаціями, які стосуються зв'язування з п'ятьма різними флуорохромами. Нарешті, був проведений аналіз мультимерів за допомогою забарвлювання клітин барвником для визначення їхньої життєздатності І іме/ЯАеай у ближньому ІК-діапазоні (Іпмігодеп, Карлесрує, Німеччина), клону антитіл СО8-РІТС 5КІ1 (ВО, Гейдельберг, Німеччина) і флуоресцентних РМНОС-мультимерів. Для аналізу використовували цитометр ВО І ЗКІІЇ БОКР, обладнаний відповідними лазерами і фільтрами. Пептидо-специфічні клітини були розраховані як відсоток від загальної кількості СО8-позитивних клітин. Оцінка результатів мультимерного аналізу була виконана за допомогою комп'ютерної програми Біомліо (Тгее 5іаг, Орегон, США).

Примування іп міго специфічних мультимер-позитивних СО8- лімфоцитів було визначене порівнянням зі стимуляціями негативних контролів. Імуногенність для даного антигену визначалася, якщо було виявлено, що принаймні одна оцінювана іп міго стимульована лунка одного здорового донора містить специфічні СО8--Т-клітини після стимуляції іп міго (тобто коли ця лунка містила хоча б 195 специфічних мультимер-позитивних серед СО8-Т-клітин та відсоток специфічних мультимер-позитивних клітин був принаймні в 10 разів більше медіанного значення стимуляцій відповідних негативних контролів).

Імуногенність іп міго для пептидів раку підшлункової залози

Для перевірених пептидів НГА | класу імуногенність іп міго можна продемонструвати генерацією пептидо-специфічних Т-клітинних ліній. Типові результати цитометрії після ТОМАР- специфічного мультимерного забарвлення для двох пептидів за винаходом показані на фігурі 3, разом із відповідними негативними контролями. Результати для 2 пептидів за винаходом зведені у Таблицю 10.

Типові результати експериментів по визначенню імуногенності іп міго, проведених подавцем заявки, для пептидів за винаходом. «20 95 - -; 20 95 - 49 95 - ---; 50 96 - 69 9Уо- нан; »- 70 96 - нижня

Таблиця 10

Імуногенність іп міго пептидів НІ А класу І за винаходом в 11755000 нн

Результати для 7 додаткових пептидів за винаходом зведені у Таблицю 108.

Типові результати експериментів по визначенню імуногенності іп міго, проведених подавцем заявки, для пептидів за винаходом. «20 965 - -; 20 95 - 49 95 - ---; 50 96 - 69 9Уо- нан; »- 70 96 - нижня

Таблиця 108

Імуногенність іп міго пептидів НІ А класу І за винаходом

Приклад 4

Синтез пептидів

Усі пептиди були синтезовані стандартним і широко використовуваним методом твердофазного синтезу пептидів за стратегією Етос. Ідентичність і чистоту кожного окремого пептиду визначали методами мас-спектрометрії і аналітичної ЗФ-ВЕРХ. Пептиди одержували у вигляді білих або брудно-білих ліофілізатів (солей фторацетатів) чистотою »50 95. Усі ТОМАР переважно вводять у вигляді трифторацетатних солей або ацетатних солей, використання інших солей також можливе.

Приклад 5

Аналіз зв'язування з МНС

Пептиди-кандидати для Т-клітинної терапії за цим винаходом були додатково перевірені на здатність зв'язуватися з МНС (афінність). Окремі комплекси пептид-МНС були отримані УФф- індукованим обміном лігандів, за якого УФ-чутливі пептиди розщеплюються під дією Уф- випромінювання, і аналізується продукт обміну з пептидом, що вивчається. Тільки пептиди- кандидати, які здатні ефективно зв'язуватися з пептид-сприйнятливими молекулами МНС і стабілізувати їх, попереджають дисоціацію комплексів із МНС. Для визначення виходу реакції обміну проводили аналіз методом ЕЇІ5А на основі виявлення легких ланцюгів (82т) стабілізованих комплексів із МНС. Аналіз проводили згідно з загальним описом у роботі

Водепко і співавт. (Нодепко еї аї., 2006). 9б-лункові планшети МАХІЗогр (МОМС) були покриті протягом ночі розчином 2 мкг/мл стрептавідину у РВ5 при кімнатній температурі, 4 рази промиті і блоковані протягом 1 год. при 37"С у 295 розчині БСА, що містить блокувальний буфер. Ренатуровані мономери НІА-

А"02:01/МІ А-001 використовувались як стандарти, охоплюючи діапазон 115-500 нг/мл.

Мономерні комплекси пептид-МНСОС, продукти реакції обміну, що протікає під дією Уф- випромінювання, розводили у 100 разів у блокувальному буфері. Зразки інкубували протягом 1 год. за температури 37 "С, промивали чотири рази, інкубували з 2 мкг/мл кон'югованих із пероксидазою хріну антитіл проти В2т протягом 1 год. за температури 37 "С, знову промивали і визначали з розчином ТМБ, реакцію зупиняли за допомогою МНаг5О». Поглинання вимірювали при 450 нм Пептиди-кандидати, що демонстрували високий вихід реакції обміну (переважно вище 50 95, найбільш переважно вище 75 95) є зазвичай переважними для синтезу і продукції антитіл або їх фрагментів і (або) рецепторів Т-клітин або їх фрагментів, оскільки вони показують достатню авідність до молекул МНС і попереджають дисоціацію комплексів МНС.

Таблиця 11

Показники зв'язування з молекулами МНе І класу «20 9Ую--; 20 95 - 49 95 - ---5 50 96 - 75 Ур- нн; » 75 95 - 777600 1МОВІКОАРІМ 10101011 78 морю 5 78 ВІРООВАММ 11010111 5 Гн 161111

Таблиця 11 (продовження) 60 |МЕЕоМУЮЄ 01311133 766 АШЗСІВА 00001111

Список посилань

Адезеп, Т. Н. еї а!., сш 61 (2012)

АІпитаїаї, А., Іпаїап У Оєсптайі.Уепегеої.Герго!. 78 (2012)

АЇІзоп, у). Р. егаі., Зсієпсе 270 (1995)

Атаївснек, 5. єї аіІ., Сапсег Вез 64 (2004)

Апаегзеп, В. 5. еї а!., Маї. Ргоїос. 7 (2012)

Аррау, М. вї аі., ЄБиг.у Іттипої!. 36 (2006)

Арреїессніа, М. еї аї., у Ехр.Сіїп Сапсег Нез 29 (2010)

Агагаї, Н. єї аї., Зигаегу 150 (2011)

Агіда, М. еї аї!., Іпї У Сапсег 95 (2001)

Ваєк, В. єї а!., Сеї! Вер. 9 (2014)

Ваї, Ї.. єї а)ї., У Сеї! Віоспет. 113 (2012)

ВапснНегеаи, -. єї аї., Сеї! 106 (2001)

Ваийзси, 0. еї а!., Сіїп Сапсег Вез 17 (2011)

Веацу, а. евї а!., У Іттипої! 166 (2001)

Ведо95, «у. 0., Маїште 275 (1978)

ВеїЇ, ч. ї.. єї аї!., Сеї! Мо! І їє бсі. 70 (2013)

Вепіатіпі, М. єї аї., Чоштаї! ої Ше Воуаї! 5аїйвіїса! босієїу.Зегієз В (МеШодоіодісаї!), Мої.57 (1995)

Вега, Т. К. єї а)І., Сапсег Без 66 (2006)

Ветаї, 5. І. єї а)., Маї Сепеї. 45 (2013)

Віапси, А. єї аї., РІ о5.Опе. 8 (2013)

Віепк, 5. єї аІ., ВМСО.Сапсег 8 (2008)

Во, Н. ві аІ., ВМСО.Сапсег 13 (2013)

Вопатеит, у. Б. еї а)ї., / Іпмез5і Оегтацйо). 134 (2014)

Вошнег, У. М. еї а!., Реоїєїп Епа 16 (2003)

Вгаштипет", Н. еї аї., Маїиге (2013)

Вгепаїеє, А. еї а!., Сагсіподепевів 29 (2008)

Вгоззані, Р. еї аї., Віоса 90 (1997)

Вгомл, 5. а. еї а!., Рговіаїе 75 (2015)

Впоискаопег", Т. егаі!., Сит.РНагт.Віоїеснпої. 5 (2004)

СаІтоп, М. Е. єї а!., Меоріавіа. 11 (2009)

Сабо, Н. Н. еїа)ї., Опсоїаговї. (2014)

Саррег!о, Р. єї аї., Сит.РІагт.Оез 19 (2013)

Саррег!о, РЕ. єї аі!., Сапсег Віо!. Тег 7 (2008)

Сарре!о, КЕ. єї аї., Егопі Віовсі. (сої. Ес) З (2011)

Сарипії, М. еї а!., / Вопе Міпег.Вез 27 (2012)

Сага, К. Р. єї а)., Сапсег Іттипої! ІттипоїНег. 53 (2004)

Сазадгапає, С. єї а), Наета!йіодіса 91 (2006)

Сазаплгаго, у. М. еї а!., Маї Соттип. 5 (2014)

СНапа, К. МУ. єї а!., Апіісапсег Нев. 31 (2011)

СНапа, К. МУ. єї а!., Нераюі!.Вез 36 (2006)

СНапоск, 5. У. еї аІ., Нит.Іттипої. 65 (2004)

Снацапигу, А. єї а!., Маї Сеї! Віої. 12 (2010)

Се, С. Ї... ві аї., Іпі У Сіїп Ехр.Раїної. 6 (2013)

Снеп, В. єї а!., Сапсег І ей. 354 (2014а)

Снеп, О. єї аі., Р о5.Опе. 9 (20140)

Снеп, В. евї аї., І аб Іпмеві 95 (2015)

Снеп, 5. єї а)І., Сапсег Ерідетіо!. 37 (201За)

Снеп, 5. Т. ві а)., Сапсег 5сі. 102 (2011)

Снеп, У. Ї... ві а. Іл У З!иго. 11 (20135)

СНеоп, 0. У. єї аї!., Сіп Сапсег Вез 20 (2014)

Спеицпо, Н. С. єї аІ., ВМСО.Сепотісз 9 (2008)

Сної, МУ. І. єї аї., Сеї! Ррузіо! Віоспет. 23 (2009)

Спом, 5. М. єї а)., Єиг.У Ссупаесої.Опсої! 31 (2010)

Сіпе, М. єї а!., Опсої Вер. 32 (2014)

СІетепі, 5. єї а!., Мігспому5 Агсй. 442 (2003)

Сопеп, С. У. єї аї., У Мої Весоопії. 16 (200За)

Сопеп, С. У. єї аї., У Іттипої 170 (200360) 60 Сопеп, 5. у. ві а)І., Рапсгеаз 37 (2008)

Сопеп, 5. М. еї а!., Ргос.Маї|.Асад.5сі.0.5.А 69 (1972)

Соїїдап ЧЕ еї аї., (1995)

Соіотренці, 5. єї аї., ) Іттипої. 176 (2006)

Стопетг, В. 5. єї аї., Іпї ) Сапсег 135 (2014)

Свівгаг, А. еї а!., Вгєаві Сапсег Нез 16 (2014)

СиссеніагеїЇї, М. еї а!., Сеї! Моїй. СуїозКеїеіюп 65 (2008)

СиПег, М. 0., Ногт.Меїаб Нез 43 (2011)

Оеїамаї, В. еї а!., Маї Сеї! Віо!. 13 (2011)

Оепаіеї, «у. еї аї., Сіїп Сапсег Нез 12 (2006)

ОепкКбего, а. єї а!., У Іттипої 171 (2003)

Оегуске, І.. єї аї., п У Оєм.Віо!. 55 (2011)

Опир, 5. еїаі., Сит.РНпагт.Оез 18 (2012)

Огаоці, М. єї аї., Оів.Моде!. Меси. 4 (2011)

Рицпоп-Ведевзівг, К. еї а)., сепе5 Спготозотев.Сапсег 51 (2012)

ЕЗІоїї, А. М. єї а)., Сапсег Нез 66 (2006)

КіЇв, М. У. єї аї., Маїшге 486 (2012) еакк, К. еїаї., Маїите 351 (1991)

Еепоа, Н. еї аї., У Сіїп Іпмеві 124 (2014)

ЕШтоге, НА. А. еїа!., ЕЄхр.Віо!.Медй. (Маужооса.) 239 (2014)

Ніпавіб-Нозвеу, «. у. еї а!., Віоїтесп.Нізіоспет. 87 (2012)

Еопа, Ї. еї аі!., Ргос.Маїй.Асай.5сі.0.5.А 98 (2001)

Егап?, М. еї аї., У Ога! Раїйо!.Меа. 39 (2010)

Ес, М. еі а)., Сапсег Вісі. Тнег 5 (2006)

Сабтомісн, 0. І. ега!., Маї Меад. 2 (1996)

СаїІтанпі, С. М. єї а!., Вг.) Сапсег 88 (2003)

Сатег-Ро?о, А. еїа!., РІ о5.Опе. 7 (2012)

Сао, Н. у. еї а!., ) Сапсег Вез Сіїп Опсої (2014а)

Сабо, у. ега!., РІ о5.Опе. 9 (20140)

Сабо, 7. Н. єї аї., Нізтораїйоїіоду 65 (2014с)

Сагаїпа, Р. у. еї аі., ВМО.Сепотісв 7 (2006)

Сага, М. еї аї., У Сіїп Епдостіпо!.Метаб 99 (2014)

Саціпопі, І. єї аї., Маї Вем.Іттипої! 6 (2006)

СеуїК, Е. ві а)І., йепе 540 (2014)

Степ, А. єї аї., Ргозіаїе 70 (2010)

Спіутри, 5. еї а!., Іптесі.Сепеї. Емої. 16 (2013)

Спайс, 5. єї а)., Ргос Маї.Асайд.5сі.0.5.А 100 (2003)

Соакіп, А. еї аї., Іл Іттипої 9 (1997)

Сопо, У. еї а!., ду. Апаї. Раїної. 21 (2014)

Сопом, І. Р. ега)., Сапсег ВНез 67 (2007)

Стееп МЕ евї аї., АН, (2012)

СтеепівЇа ЕА, 2па, (2014)

Спо, С. еїа|., Сіїп Спіт.Асіа 417 (2013)

Со, С. еїаї., Маї Соттип. 6 (2015)

Сидетапт, А. еї аї., Атсп.Оеєгтаїйо!.Нез 293 (2001)

Наїй, МУ. М. єї а)., Ттап5.Ат Сіїп Сіїтацо!.Авзос. 117 (2006)

Нап, -. С. еї а. ММопа У Зигу.Опсої 13 (2015)

Нао, Х. єї аї., У Метрг.Віо!. 247 (2014)

Не, Х. ві аї., Меоріазта 61 (2014)

Не, Х. ві а)., Сапсег Рез 68 (2008)

Нойптанпи, М. Е. еї а!., Сапсег 112 (2008)

Норкег, К. еї а!І., ЕМВО У 31 (2012а)

Норкег, К. еї аї!., СеїЇ Сусіє 11 (20125)

Ногіре, Т. егаІ., Снетріоспет. 15 (2014)

Ногіпоисні, М. єї а!., Редіант.Нетайо!.Опсої 27 (2010)

Ни, 5. еї аї., У Сапсег Вез Сіїп Опсої! 140 (2014)

Ни, МУ. еї а!., Сеїї Оєва.Оів. 4 (2013)

Ниапо, Н. С. єї а)., ТесппоїЇ.Сапсег Вез Тгеєаї. 9 (2010)

Нитзі, У. Н. єї а)ї., СеїЇ Мої! Віоі.Г ей. 14 (2009)

Низзеу, О. 5. вї а!., Мої Сеї! 41 (2011) бо Нулапа, М. Г. еї аї., У Іттипої. 179 (2007)

Нушйпо, 5. МУ. єї а!., Мої Сеї! Ргоїеотісв. 10 (2011)

ЇЇ, М. еї аї., Ехр.Віо!.Меда. (Маужооса.) 231 (2006)

Іво, В. .). ві аІ., Опсодепе 15 (1997)

Івпімагїа, ГТ. еї а!., Опсої Вер. 18 (2007)

Ігакі, Т. єеї аІ., Віоспет.Віорпуз.Ке5 Соттип. 329 (2005)

Уасорб, М. еї аї., Сит.Мої! Меа. 12 (2012)

Уаедет", Е. егаі., Маї Сепеї. 44 (2012)

Уаїп, НВ. еїгаї., Аррі./ттипопізІоспет.Мо! Могрнпої!. 18 (2010)

Уаписпомуекі, В. еї а!., Віотеа. Нез Іпі 2014 (2014)

Уеда, А. еї а!., Сіпекої.Рої. 85 (2014)

Уепо, У. М. еї аї!., Вг.) Зига. 96 (2009)

Уеопа, Н. С. еї а!., ) Рготеоте.Нез 10 (2011) щдопезв, А. єї аІ., ЕМВО Мої Меа. 5 (2013)

Уипо, С. єї аї., Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А 84 (1987)

Катіпо, Н. ві а)., Сапсег Сепеї. 204 (2011)

Капеко, К. вї а!., Рапстєаз 24 (2002)

Капо, С. У. ега!., У Савігоіпієві.Зига. 18 (2014)

Капо, С. Н. єї а!., І аб Іпмезі 88 (2008)

Капгама, М. еї а!., Рашобіоіоду 80 (2013)

Кагадіаппів, Сх. 5. еї а!., Опсоїагаєї. З (2012)

Казпуар, М. К. єї а!., Сапсег Віої. Тег 8 (2009)

Казпуар, УМ. єї а!., Мої Опсої! 7 (2013)

Каїада, К. еї а!., У Ргоїеотісв. 75 (2012)

Кемапзв, 0. евї аї!., Ії У Б!иго.Раїної. 19 (2011)

Кпаїаїен, А. еїга!., Сапсег Вез 73 (2013)

Кпиоп, 5. єї а!., У Сеї! бсі. 123 (2010)

Кірбе АН, га, (2000)

Кідо, Т. єї аІ., Сепез (Вазеї) 1 (2010)

Кіт, М. єї а)ї., Мої Сапсег Нез 6 (2008)

Ко) Кіт, 5. МУ. єї аі., ОМІС5. 15 (2011)

Кігом, А. еї аї., / Сеї! Віоспет. (2015)

Коїіта, М. єї а!., РІ о5.Опе. 9 (2014)

Козпікауча, К. єї аі., Опсодепе 21 (2002)

Кгауа, А. А. єї аї., Ашорнаду. 11 (2015)

Киїєд, А. М., Маї Нем.Огид Оівсом. 5 (2006)

Кигатіїви, У. єї а!., Апіїсапсег Нез 30 (2010)

Кигатіїви, У. єї а!., Апіїсапсег Нез 31 (2011)

Кигода, М. еї а)ї., Нівіюі.Нівіораїтої. 20 (2005)

Кигода, М. еї аІ., Раїпо!. пі 63 (2013)

КУП, «. єї аї., Іпї у Опсої 43 (2013)

І анзпід, С. єї аІ., Опсодепе 28 (2009)

Ї ее, С. МУ. єї аїІ., УМопа У Зигу.Опсої 11 (201За)

Ї ее, Н. МУ. єї аі!., Сіїп Сапсег Вез 19 (201365)

Ї ее, Н. МУ. єї аї., Іпі У Опсої 41 (2012)

Ї еє, К. У. еї аї., У Меа. 35 (2004)

Ї ее, М. А. єї а)І., ВМО.Сапсег 14 (2014)

І еіїмо, І. еї аІ., Сапсег Сепеї.Суїодепеї. 156 (2005)

Ї еудиє, Е. еї а)., Сапсег Нез 58 (1998)

М, а. Н. єї а/!., Віоіптогтаїйсв. 30 (2014) її, Х. ві аі!., Сіїп Сапсег Вез 20 (2014)

Їиї, Х. ег а, РГо5.Опе. 8 (2013)

Ії, М. ес а)І., Сапсег Сепеї. Суюдепеї. 198 (2010)

Паау, М. єї аї., Маї Мед. 18 (2012)

Пемеїа, М. еї аї., Мікспомув Агсп. 465 (2014)

Мт, В. ега!., Віоспет.Віорпуз.Ке5 Соттип. 406 (2011)

Кт, МУ. єї аї., / Сапсег Ргєу. 18 (2013)

Пп, Н. С. еїга!., ) Ргоїєоте.Вез 12 (201За)

Шп, С. ега!., Опсої І ей. 6 (201360)

Ііподе, А. єї а)ї., Іпме5і ОрпіпаІтої.Мів. осі. 53 (2012) 60 Пи, Н. ег аї., Сагсіподепезів 34 (201За)

Пи, М. еї а!., Вергод. сі. 20 (20136)

Пи, Х. РЕ. егаї., Ароріовів. 14 (2009)

Ципадгеп, Н. С. еї аї., У Ехр.Меад. 162 (1985)

Г оп, 2. МУ. еїаї., Титоиг.Віо!ї. 35 (2014)

Ї опдепескег", В. М. єї аі!., Апп М.У.Асад.5сі. 690 (1993)

Ги, б. ега!., Рід.Оів.5сі. 58 (201За)

Г и, Х. єї а)., Сапсег Віоїнег.Радіорнатт. 28 (20136)

Ї иКав, Т. у. егаі., Ргос.Маїй.Асай.5сі.0.5.А 78 (1981)

Ї па, А. В. еї аї., Реоїєотісв. 12 (2012)

Гипабіаяй ВІ, Зга, (2004)

Ї по, Н. Г. єї а!., Іпї.) Сапсег 127 (2010)

Ї но, У. еїаї., Мої Мей. Нер. 9 (2014)

Їм, Т. егаї.,, РГо5.Опе. 7 (2012)

Маппіпа, Т. .., Ук. егаї., Сеїї Моїй. СуюзкКеїеюп 45 (2000)

Мага, А. еї а!., Віоспет.Віорпуз.Нез Соттип. 401 (2010)

Маїазза, 0. 5. єї а!., СеїЇ Оєса.Оів. 4 (2013)

Маїснеї;, К. В. еїа!., Адм.Ехр.Меа.Віо!. 773 (2014)

Ма?ієгев, у. ві аІ., Опсодепе 24 (2005)

МесСінддаде, М. Сх. еї аІ., Зетіп.Оіадп.Раїної. 22 (2005)

Мсіпіуге, ». С. єї аї., Маї Мед. 18 (2012)

МеадіКапе, 5. єї а!., Маї Сеї! Віо!. 11 (2009)

Меп), ЕК. еї а!., Іл У Опсої 43 (2013)

Мепгогїег, М. Н. еї а!., РІ о5.Опе. 9 (2014)

Мепіїеїп, В. еї а!., ВіоЇ.Спет. 392 (2011)

Меієге, С. єї а!., У Іттипої 159 (1997)

Мігапі, С. еї аІ., ВМО.Сапсег 13 (2013)

Міуаді, Т. еїгаї., Мої Огої. 5 (2001)

Моспігикі, 5. єї а!., Сапсег 5сі. 98 (2007)

Мааії, І. М. еї аї., АІтепі.Рпаптасої. Тег 31 (2010)

Зо Могаап, В. А. вії а!., 5сіепсе 314 (2006)

Моті, М. еї а!., Тгап5ріапіайоп 64 (1997)

Мопага, І. єї аї., Сіїп Сапсег Вев. 12 (2006)

Ми, У. еї а!., ЕІесіторпогевів 34 (2013)

Миеї!ег, Г.. М. еї аї!., У Ргоїєоте.Нез 7 (2008)

Мие!ег, І. М. еї аї!., Ргоїеотісв. 7 (2007)

Митрего, 0. єї аї., Ргос.Ма!ї.Асайд.5сі.0.5.А 96 (1999)

Мивгпіпзкі, У. Р. єї аї., У Віої.Снет. 284 (2009)

МаКатига, Н. еї а!., Сит.РНагт.Оез 19 (2013)

МаКауата, Н. евї а!., У Сіїп Раїної. 55 (2002)

Маззаг, 2. 0. егаі., Опсоїагоеї. 4 (2013)

Мієдегдеїттанпп, М. еї аї!., Вг.) Сапсег 97 (2007)

Мікоїома, 0. М. єї а!., Опсої Вер. 20 (2008)

МівпіокКа, М. єї а)І., Опсодепе 19 (2000)

Оіезеп, 5. Н. вї а!., Мої Сеї! Ргоїєотісв. 4 (2005) би, М. еї а)., ОгоІ.Опсої 32 (2014)

Расе, А. єї а)., Сцт.РНнапт.Оез 19 (2013)

Рап, 5. еїгаіІ., ОМІС5. 13 (2009)

Рапісо, Е. єї аІ., Аду.Сапсег Вез 105 (2009)

Раїві, В. А. вї а!., Сапсег Вез 72 (2012)

Регеїга, Р. М. єї а!., Ога.Віотої!.СНет. 12 (2014)

Ріпнеїго У еї аї., (2015)

Ріїше, Р. еї а!., Апіїсапсег Нез 33 (2013)

Рімопе!о, С. єї аї!., ІпТесі.Адепі.Сапсег 9 (2014)

Ріевбап:кі, М. еї аї., Єиг.) Іттипої 25 (1995)

Ропіїв5о, Р., Апп Нераїйо!. 13 (2014)

Ропа, С. еї а!., Мігоїоду 202 (1994)

Ропеїіа-Ссотев, а. М. еї а!., Веди. Рері. 146 (2008)

ОЇ, У. егаї., Ргоїєотісв. 5 (2005)

Ои, 2. ві аІ., Сапсег Меа. З (2014) (510) Опйіпп, М. б. еї аї., Ійї у) Опсої 42 (2013)

Ваттепзев, Н. а. єї аї!., Іттиподепеїїсв 50 (1999)

Ведау, 5. Р. еї аі!., Сіїп Сапсег Вез 14 (2008)

ВеїзЗед, Пе МСВІ Напабсок (Іпіегпеї|, Спарієг 18 (2002)

Вентанг, І. єї аі., РІ о5.Опе. 7 (2012)

Віпі, В. І. егаіІ., Сапсег 107 (2006)

Вобіпзоп, Т. 4). ег а!., Сеї! Сусіє 12 (2013)

Воск, К. І. єї а)., 5сіепсе 249 (1990)

Вотап-Соте, «. єї аї., Віоса 109 (2007)

Воисзіїй, М. М. еї аї., У Епдосііпої. 223 (2014)

Воу, 0. єї а!., Віоса 118 (2011)

Вискі, А. А. єї аї., МУопа у Савігоепіеєгої. 20 (2014)

З3-І ейшіпіє ЕхоКгіпе5 РапКгеазКаггіпот, 0032-0100, (2013) заїкі, В. К. егаі., Зсієпсе 239 (1988)

ЗаїІтанп, В. єї а)., Опсоїттипоіоду. 2 (2013) зай, У. еї а!., ) Сеї! сі. 126 (2013)

Замоу, В. М. ві а!., Епдостг.Веїаї Сапсег 20 (2013)

Зспіотапп, Ц. єї а)І., Маї Соттип. 6 (2015)

Зеспгодег, МУ. А. єї а)І., Сапсег Мед. З (2014) зЗепипе, у. еї аї., Нівїоспет.Сеїї Віої. 138 (2012)

Зетіаеїї, С. А. єї аї., / Мешигоопсої. 88 (2008) зЗеедег, Е. Н. ві аІ., Іттиподепеїйсз 49 (1999) зЗеуа, Т. егаіІ., Опсої! Вер. 16 (2006)

ЗПпептап Е єї а!., (1986)

Зпептап-Вашийсві, С. А. єї а)., Сапсег Сеї! З (2003)

Зітісгу|ем, А. еї а!., Нізіоспет.Сеї! Віої. 142 (2014) зЗіпдп-Уавзціа, Н. еї аї!., Сапсег Іттипої.ІттипоїНег. 53 (2004) зКопага, М. еїа)ї., Апіісапсег Вез 34 (2014) зтаї), Е. 9. єї аї., / Сіїп Опсої!. 24 (2006) т, М. .. еї а!., Вг.) Сапсег 100 (2009)

Зо опо, В. І. ві а!., Віоспет.у 394 (2006) зЗопа, О. еї аІ., Титоиг.Віо!. 35 (2014)

Зоо, А. К., Іттипої! Вез 46 (2010) зЗоиснек, .). у. еї а!., Вг.) Сапсег 111 (2014)

ФЮОЇК, у). А. еї аї., Рговіаїе 60 (2004)

ЗіШпт, М. еї а!., ВМСО.Віоіптоптаїсв. 9 (2008)

Зип, О. МУ. ві а)І., Сапсег Ерідетіо!. (2015а)

Зип, у. еї аї., У Мої Нівіо!ї. 46 (20156)

Зип, 2. ві аї., У Ргоїтєоте.Нез 13 (2014)

Зи2ИКІі, Н. еї аї., Іпі У Опсої 12 (1998)

З7агмав, ГТ. еї аї., ІпЕ ) Сапсег 135 (2014)

ТакКапасвні, К. єї а!., Реріїдез 27 (2006)

ТаКешисні, А. єї а!., Мої Сеї|Ї Епдосіїіпої. 384 (2014)

Таїепгогзі, І. єї а!., У Меигораїної!.Ехр.Мештго!. 63 (2004)

Тегарауабвні, Т. єї аї., РІ о5.Опе. 7 (2012)

Тегада, Т. еї а!., У Нерай!. 24 (1996)

Тешеї, В. евї а!., Сеї! Мої І Те Зсі. 62 (2005)

ТНогзеп, К. єї аї., Мої Сеї! Ргоїеотісв. 7 (2008)

Тгап, Е. єег аі., Зсієпсе 344 (2014)

Тетоцдакоз, І. Р., Сегопіоіоду 59 (2013)

Титтагїа, В. єї а)., Сапсег СпетоїНег.РНаптасої. 64 (2009) паєег, К. єї а)., Епдосг.Реїаї Сапсег 17 (2010)

Опівегоаззетг, а. еї аІ., Месн.Адвєїпа Ювєм. 126 (2005)

Маззаг, Н. еї а!., / Мешоспет. 130 (2014)

Моп Нотїї, 0. 0. еїаї., М.Епаді.) Мед. 369 (2013)

Миїі-Кее, К. єї аі., Каонзіипд.) Мед.зсі. 28 (2012) мУмаїКег, Е. У. єї аїІ., Мопа у) Сазігоепієгої. 20 (2014)

Муапнетг, 5. еї аї., У Іттипої 171 (2003)

Муанег, 5. єї а!., Маї Меа. 18 (2012)

Мапа, а. Н. єї а!., Опсо! І еїйї. 5 (201За) 60 Мапа, Н. ві аі!., Гюопі Опсої 4 (2014а)

М/апо, ». еї а!., У Ехр.Сііп Сапсег Нез 34 (2015)

Мапа, 9. єї аї., РІ о5.Опе. 8 (20136)

Мапа, Х. еї а!., Окої.Лиї. 92 (20146)

Мапа, Х. У. еї аї., Іпї У Нурепнетгттіа 29 (2013)

М/аїзоп, М. В. еї а!., Асіа Опсої 46 (2007)

Уанй, Н. ї. єї аї., Мої СеїЇ Епадостіпої. 286 (2008)

Меретг, А. М. еї аі., Рнаптасої. Тег (2014)

Мікрего, М. Г.. еїаї., Титоигк.Віо!ї. 34 (2013)

М сох, В. Е. єї а!., Ргоївіп 5сі. 8 (1999)

МУ ПШіатв, 5. єї аї!., РІ о5.Опе. 8 (2013)

Муопа, С. б. єї аї., Маї Сепеї. 46 (2014)

УМопа Сапсег Вероні, (2014)

Хіа, 7. К. егаї., Оі5.Езорпадив. 25 (2012)

Хіє, Х. еї а!., Опсої І ей. 7 (2014)

Хіопа, 0. еї а)І., Сагсіподепевів 33 (2012)

Хи, б. 7. єї аї., ІпЕ у) Сіїп Ехр.Раїйної!. 6 (2013)

Мапа, С. У. еї аї., ) Іттипої 192 (2014а)

Уапа, Н. ві а!., РІ о5.Опе. 9 (20145)

Мапа, 5. еї аї., Віоспіт.Віорнувз.Асіа 1772 (2007)

Уазиі, МУ. єї а)., Сапсег осі. 95 (2004)

Уеишпо, Т. І. єї а)І., Сапсег Вез 73 (2013)

Уи, Х. єї а)., Сапсег Вез 73 (2013)

Уцап, В. єї а!., Іттипобіоіоду 217 (2012)

Учап, 0. еї аї., ) З!ига.Опсої! 108 (2013)

Учап, В. Н. єї а)., Апп З!иг9.Опсої! 16 (2009) 7апатадіп, 5. М. єї а)., Нит.Раїйної. 44 (2013) 7агаміпов, А. єї а!., РІ о5.Опе. 6 (2011) 7агетрва, 5. ве аі., Сапсег Вев. 57 (1997) 7папо, С. єї а!І., Віоспет.Віорпуз.Ве5 Соттип. 434 (2013) 7папо, С. б. єї а)І., Сапсег Без 59 (1999) «папа, У. єї а, 2попдпиа Сап 7апо.Віпд.7а пі. 14 (2006) 7папо, У. еї а!., Сапсег І ей. 303 (2011) «паб, 0. еї аі!., У Меигоопсої. 118 (2014) «паб, 2. К. ега|., Титоигк.Віо!. 34 (2013) ли, Н. Н. еїгаії., Азіап Рас.у Тоор.Меа. 7 (2014) 7осспі, М. В. еї аї., Віоса 119 (2012) 70и, Т. Т. егаі., Опсодепе 21 (2002)

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«1105 тІетваїїсз Віотесвпоісотез ОЖеН «120 Нові пептиди та комбінації пептидів для застосування для імунотерапії раку підшлункової запози та інших видів раку «їх тла «190: БВ 15058502.4 «ї15іх 2015-03-17 «іл» у5 52, 134,25 «15і» 2115-03-17 «150» я «170» Раїепіїп туегязтоп 3,5 «210» З «її З «візу РЕТ І «213» Ноте «харлепе

РВе вин Аїд Сів вів Бі бек біз іє ії 5 «210» 2 «гіїх 16 «13» Ното здрленпь «ах й

Завроївевц обіп бін бів Ні Уді діа Ууаї діа і з то «Рійх З «12 РЕТ й «13» Ното зартепе «а» 3

Аїа Їеноіен тк о РБе Ммеї бін бів хві і 5 «Ох 4 «Ах Я «812» РЕК «213 Ношщше зартвп5

ЗекоЖа1ї А5зо Уді Зег о Бго Рго і уз Уді ї З «аїйх 5 «-21ї» Її «2122» РЕ «13» Ното здрленпь «а» 5 івц іец жа! Авп о АЗробдег РБе іец Ні ТВгоУд! і в Ех

«ІТ» 11 стеї3» Ношо 5арзеп5 «М б уаї ей тів бек ів 1у5 біб Аїд Рго ів уді і 5 зо «ії» 10 «212» РЕТ «із» Нота звоіепх «МО» 7

АЇа бін бів бів ЗегобБін те Аіа сіу Ті і 5 ЕК; «210» В «її» З «РІЇ ВЕТ «2їЗ» Нота зарієепх «а» В

Ії Уві Ахр аз ій ТВготіє А5п ген 3 5 «їх з «її» 10 «Ід ВЕТ «213» Номо зарлевз

Ре їецн вне А5р біу бек Аїд Ахп ген Уді 1 5 10 «КУ Її «Дії» З «гід» РІ «213» Ноша «вл апа «Нюх ії

Ре іви Уві Азробіу бег баг АаЇд і вец і 5 «30» 31 «гій» РІ «2ї13» Ноша звризлаейх «щ0х 11

Ре іац Туг іух 112 тів А5р бід і вн і 5 «іх 12 «211» З «832» РТ «2іЗ» Ношо заріепе «Нюх 12

Ре Уа! зЗекобіц тів Уві Ар о тпг оУза! «їх 13 «гії» З «аїЗ РВТ «213» Ношо зартепх «ню» 13 іеноівцш АБа біу бів Тк отТук Нія Узі ї КЕ «їх і184 «іти Зо «аї2»У ВК «ВІї3» Ново задтепь «ВНЮ» 14 чаї гей Аа іуз рРго біу Уаф тТіе 5ег Уа! «»Віх 15 «зії» З «аїах РАТ «13» Ношео зарівп5 «Нюх і5 чегоіви дія дзп ода Уді ТБг о Зег уві ї 5 «10» ів «Аїт» 17 «212» вит «8Ї3» Номло запівпх «ню» і5

Аіа Рго уві АхпоУуаР Твг отТвк бій ува! іуз бек Уді «їй» 15 «11» 10 «2їЗах РТ «13» Ношео зарівеп5 «Нюх 17

Ре їв іх Бег сі А«р Аа Аїд тів Уді ї 5 10 «їх 15 «2ї1тУ 15 «їв» ват «213х Ново хартепх «НК» 15

Зекг івги івецн Ар Аврозіц ре) Меї Зег і ец «їй» 15 «каї1х ії «2ї3х РЕТ «213» Ношео зардіепе5

«З00з ІЗ

Ніх іебв Аа Рко бі) ТБК о Азр обі Ар оазроієц 1 5 10 «830» о «21ї» 10 «215» НТ «213» Ноше зарієпь «НІ» 20 акад оіїен аа віх Ахр обі чаї біу Аїа Узі 1 із 10 «Вій 21 «а1їх 5 «їз» вк «213» Ново зартепх «щюз 21

Нів івц Меж а5ровів Рго ів бек оУві 1 5 «Аа» 22 «Вії Її «2122 РТ й «21їх Наше вартейь «00» 2

Тк ген аАзв ові Аів Азія Уаії Аа бів уд 1 5 10 «Віз 23 «2іїх й «212» РТ «2133 Ношо заріейпь «нюх 23

Зегоівц ек Аїа Ре ТБгоїеб ВНе і го ї в «їду а «вії» З «212 РЕК «гії» Нащо зарзєп» «005 28 сСіу їгц іви він бі ігц Уді ТВгохУді 1 З «казійх 25 «а1їх її «217» РН «І13з Ношо харівпо «Нніх 5 цекоівноіуз бін сів Уаі біу біш бів АТа ті 1 5 16 «0» 028

«тії» 13 ау щи ак, Кай «212 РЕтТ «їй» Нощше зврзлеве «МІ» 95

Звкоївец губ ЗР Сі Узі біу віз біз АТа ті уз! і З ій «ВНІ» ду -2ї1ї» 10 «217» ЕТ «КІі1З» Ношео хартеп: «З» й

Тук ігн віп СТУ біп Адго зей А5родозп Уві 1 К- їз «ій» 35 «її її «віх РЕТ «2135» Нощшео зартевпе «ЯМІ» ой

Тук їєц біп сі бів Аго їез аАБроахп о жаї Уві і 5 о «ій» 29 «е1ї» 5 «РІіХз РТ «Різ» Ноша зартепе «З» 5

ЕВе івец о біп бін Туг ів Ахр Аїд їів 1 з «10» 50 «вії» З «каійх РЕТ «213» Ношюе аріввпа «0йх 30

Уа Уаі Ар осів бік Рго ТВгозіу уді і 5 «210» ЗЕ «231їи 1 «вій РВТ «213» Нео заріевх «00» 31 зег ів Аїд Аїа Аія діва бі іу5 вів біз і гц і з 10 «ВН 82 «іх 12 «312 РТ «КїіУ» Ново зартавпе «а0йх 32

Звкоїєм діа діа ліз лій сіу іуз бів біц іенв Аів і 5 та

«ій 38 «ії» З «212 РЕТ , «аїї» Ното хашіенйь «400» 33 зак оігвгци др Заг Аго іву бін ігн Аї8 «10» 38 «ії» 9 «212 РЕЖ , «ії» НошМо харзенпа «800» 34

Меї ігц Меї Рго Уві Ні РВе ївгц і ец 1 5 «10» 35 «ії 12 «812з РЕТ І «213 Ното зартепе «Ва 35

Уа Мет Азов Зак бі Ар оці ді ТВгоНія ТВг Уві 1 5 10 «кеВ» 35 «її» 13 «817 ЕТ «гії3х Нота харзтенае «пох 36 їуз біп бій Тук АЗзр обі его біу Рго бек тТіє Уві Ні 1 5 10 «ій» 3 «ЕІ» З «8175 ЕТ «813з Ново зарієпе «аа» 37 піу іецііви уз іУух Іів Азп обет Уві 1 5 «10» 38 «ії» 10 «215» РЕ Й «ВІ3з Нешщо зартепех «400» 8

Ахпоівц о уді Бі іузх ТВгоРго дід іги уд! 1 5 10 «210 35 «Ії» З «212» ЕТ І «КІ3з Нео зартепх «Нх 35

ТЬгкоіец іец бЗег ап о ігев сів біз діа ії 5 «-210х 40 «її» її «212» РАТ «Віз» ноша зартенве «ЗК» 4

Ре Ії іец Азрозег Аїд бів тк о ТБготТВг ої ец 1 Бі 10 «ій» 41 «231» З «2ї2» БВ Й «Віз» ноша зартенве «400» 41

Рпе їгц оівец Ар обі бЗег о зіб сі Уді 1 з «210» 48 «вії» З «їй» БВ Й «ВЗ» Нева зартеве «а0йх 42

Гуз гц Уаі Аа ої уз бек о тТБг сів ге ії З «210» 43 «231» З «212» ВЕТ , «йі13» Ното зарігевп5 «а0ох 43

Аг із йзо бів Ага жві Рге біп Тв ії 5 «10» 44 «В1їз 1 «212 ВТ «аї85» Ножоз зардтенпе «Ню» 44

Уа іец іец А5р оїух 112 Гуз Аяп і ву біп Уві ії 5 10 «210» 45 «1ї» й «Ві?» РЕК «813» Наше запдієпйв «4005 45 тУаї дід Ав оїу5 118 Ні Чег Уді і 5 «іл» ав «аз» 14 «їй» РН

«2313» Ното зарітева «Нюх 46

ТВг РБе діа Рго ха! Ахпоуа! тТйготвкобіц Уаф ух бек Уді і х 10 «Рій» 45 «ії» 11 «212» РТ «"13х Ніщо запдтейх «Зх 45

Гуз Меї Ар Аїд Бек огвецч бі АБН і ву Реве лід ії 5 ЕК «30» 48 «Вії» іо «їй» РТ «13» Наво здатенп: «002 ак

Аіа ієц тТвгобіп тТВкобіу біу Рго ніх Уві 1 5 10 «ВІ» 49 «й1іїх З «12» РЕТ «ій» Ното дарів «00» 0 «а

Азпоівеноіу5 біу ТВе о РБе Аїда тагої гео і З «В10х 50 «231 З «аї2» РЕТ «213» Ново зардіввае «аю 50

Аіїва іецз аів Аїд тів рез Тк Аг і ви ії З «210» 5 «її» З «рій» РЕТ «13» Нове завртенпх «4005 5

Аіїа їси Межї реб бій біу Ма! Азр'івц ії 5 «2102 52 «Ії» 10 «212» РЕК «аїа» Номо хартепйь «В» ЗИ

Ага Меї Уші бі біз 112 бБіу хаї сід ів 1 5 16

«іх 53 «11» 31 «аїЗх РТ «еізи Ношо харітепх «Нюх 53 зег зЗег Ре біу піу іви біу біу бік бег о уд! ї 5 16 «ах а «ії З «212У РЕК «ІіЗ3» Ново запівнх «Я» 054

УаїЇ епі бек бій їієе сіб ха! Аїд «ах 55 «11» З «а13х РТ «213» Ноше задіеп5

Тук іен Ар ад Меї Мет Асп о біц діа ї 5 «ФП» зб «11» і «12» РЕТ «Іі13» Ново запівн» «абп» 58

Сі зей ів Ахр отуг діа Твгобіу Аїд 11 бі бЗег Уді «еайх 57 «11» З «а1Зах РТ «13» Ноше задітепз5 «НМ 7

Ре іївец біу тує узі Маї ІТе Ар Уа! ї 5 «10» а «аїї» З «ід» РЕТ «еІї3» Ново заптенпье «НЕ» 55 їі івецй Аїа Аїд Ре іуб5 Аа вне і ги «ій» 55 «211» 11 «212 РЕТ , «213» Ното зарівпх5 «щі» 59

Гуз Ген ве йзпоіецн Зег ог бів Ар о Ахр Уа ї 5 10 нюх. а «її» - «із» вет «21» В «13» Ново зврівпх «00» оо

Тут іви піц бів Ар оУві Туг біп і ви ї 5 «21ї1» ЗМІ «їз» РВТ «аї3х Нащо запівпь «ап БІ

Аїд івн сі: Уч Ар ТУуг бій сій уві сіу Уді ї 5 10 «їі0б» БА «гії» З «212» РЕтТ «КІЗ» Напо зврівпе «сх во

Аїд івн осі: БУ Ах) Ту бій бін хв ї 5 «21» 63 сії» 8 «212 РВТ «213» Нощше зарівп» «002» 653

РБе дів сіу Авр Ар дія вКОо Ага ї 5 «гас» ба «11» З «212» РЕ «2ї13х Бешюо зарівйа «800» Ба

Бе ігц Ууді 5ег дв) Меї ів іви дід Сі дія

Бе івец уві 5ег ад5в Меї івгип і ей Аїд бів дід ї 5 1 «Ах ва «ії» 0 «212» РЕТ хаї3х Навю зарзапе «ВІ» 5

Туг ів Туг о Аяд Зегобзіц ТВгоїух Ап АЇв ж 7 с 7 ---5 ї іч тд -- - щих «У» ве сеї» З «212» РЕ а Те Яку Ума шок т «гі бо зарзіенпо

«НМ ОБ дів іви івц бек обі івецч зго біз Аїв ії з «10» 57 «11» З «2125 РЕТ «йї85У Ношо заврівй5 «400х 87 уз Мет Ре РБе із т1і2 А5роїух Уді ії 5 «210з 05 «21їх З «Іс» РТ «2132 Ноше 5арігп5 «00» па ух івев ів ТНго бів Ууваі ніх діва Аіз і 5 «Зах бе «вії» З «Ві?» ВРЕт «аЇ3» БНешо заріейпе5 «Мю» 63

Уа Мет АіЇз Бго вве так Мет Тйг тів ії 5 «їй» «ВІ З «іх БЕт «вії13» Нове зартенв «мм У

РБе ієн ха! Ахробіу 5ег Тгр бЗег ха ії 5 «8303 71 «3їх З «217 РЕТ «213» Нешо зарзіеп5 «00У 1 пе ігцп іво Аяробіт Зег Аїд дп ха 1 5 «10» й «її» З «2І12гз РЕТ «213» Нео заріейв «30025 72

Тек ха! тТук бій А5в Аза Іїе Туг ген і 5 «2105» 73 «81їз З

«212» РЕТ «КІїЗ» Ношщо зартейх «ВО 7/3

ТВгоігип уві діа тів уді Уаії пі Уді і 5 «Вій» 74 хАї1їх» З «12» РЕТ «213» Нощю заріей5 кА 74 ії5 тів бів бтцш тіе зіец тТбгобів Уві 1 5 «2105 75 «211» З «212» РЕТ «13х Нео завівпх «400» в

Ап іен Ар аз ін іуз Меї ТЕГ Уді і 5 «2102 75 кд1їх 8 «вій» ЕТ «213» Ново зарівей»5 «300» 76 зго ів івгц АзробЗег уді 5ег Агурівв 1 5 «1» 47 «81ї» З «212» РЕТ «813» Номео зартепе «З й сіУу їн ТВгоАхр Аза їі Ніб івц худі 1 5 «810» У «81їз З кха1ах ВЕТ «213» Ношто зартігепо5 «4005 78

ТНК Ген бек обЗег тів гує уд! бін ді 1 5 «ах 79 «вії» З «212» РТ «213» Ношо хартепе5 хаух 79

Уаі ївен Аівд Рго Ака Уді їец Ага дід 1 5

«ві» ВО «21їз» З «гій» РВТ «13» Ново зарівпх «Ні» КО

ТВгоівн Туг оБго Ніз ТБгоЗек осів Уді і 5 «га» Ві «21ї1з З «212» РЕТ «їх Нова «хартепах «Ох ВІ

Аіа Меї бЗег чего і у» РБе РНе і ву Уві і 5 «210» 83 «вії» З «йі12» РТ хаї3» Нома заріеп: «400» 82

Зек Тіе бек а5р Уві тів дів сій хві 1 5 «В3ї0х 83 «каїїх З «Іа» вит «І13з Ношюо зарівна «Ох 853

Р іїец її Ар о 5ег бек обід зі ді 1 5 «Війх 84 «гії» З «212 РА «2і3» Номо 5артіенпуе к«яНІх БА

Ап оївн іен А5роієен Ар тТук бін р ец 1 5 «10» 5 «81їз З «2125 РТ «Р1їх Ношто зартепзе «й00» 5 тТВе У Аа тн ожаї І11е бій Зег Узі 1 5 «гій» Ве «її Її «РіЗх ВЕК «ві3» Нощо чхартепв «щі» Ве зек івцієц АЇа біп Аза ТК обег Тгрієц ген ї З 10 «їй» 87 «ії» З «аеї2» РЕ «каїіЗ» НоЩво 5артепе «ММ 8

Їецч іви ів бі Зег Рго дід Аіа дів «ій» 8 «21ії» 18 «217» ВвЕтТ «ії» Ношо здотей «НИ» ВВ бініги АЇа біу тіеє бі тіє ігу ТВг Уді і З о «гії» З «іс» РЕТ «2їіЗ» Ношо зартепь5 «З» в

Тук івц о ієц Рко Аїд І1іе УВі Ні Ії ї З

Claims (16)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Пептид, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 21, або його фармацевтично прийнятна сіль, причому згаданий пептид здатний зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності (МНС) людини І класу.

2. Нуклеїнова кислота, що кодує пептид за п. 1.

3. Нуклеїнова кислота за п. 2, яка зв'язана з гетерологічною послідовністю промотору, або вектор експресії, здатний експресувати вказану нуклеїнову кислоту.

4. Рекомбінантна клітина-хазяїн, що містить пептид за п. 1 або нуклеїнову кислоту або вектор експресії за п. 2 або п. 3.

5. Рекомбінантна клітина-хазяїн за п. 4, яка є антигенпрезентуючою клітиною, переважно дендритною клітиною.

6. Спосіб отримання пептиду за п. 1, де спосіб включає культивування клітини-хазяїна за п. 4 або п. 5, яка презентує пептид за п. 1, і виділення пептиду з клітини-хазяїна або її культурального середовища.

7. Активована Т-клітина, одержана способом, який включає контактування Т-клітин /л Уйго з навантаженими антигенами молекулами МНС людини І або Ії класу, експресованими на поверхні придатної антигенпрезентуючої клітини, протягом періоду часу, достатнього для активації згаданих Т-клітин шляхом набуття ними специфічності до антигену, де згаданий антиген є пептидом відповідно до п. 1, який селективно розпізнає клітину, що презентує поліпептид, що містить амінокислотну послідовність, визначену в п. 1.

8. Застосування пептиду за п. 1, нуклеїнової кислоти або вектору експресії за п. 2 або п. 3, клітини за п. 4 або п. 5, або активованої Т-клітини за п. 7 у діагностиці раку, де згаданий рак вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак легенів, рак нирки, рак головного мозку, рак товстої кишки, рак прямої кишки, рак стравоходу, рак молочної залози, рак яєчника, рак шлунка, рак печінки, рак передміхурової залози, меланому, лейкоз і інші пухлини, які виявляють надмірну експресію білка ГАМС2, з якого походить пептид з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 21.

9. Застосування пептиду за п. 1, нуклеїнової кислоти або вектору експресії за п. 2 або п. 3, клітини за п. 4 або п. 5, або активованої Т-клітини за п. 7 у лікуванні раку, де згаданий рак вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак легенів, рак нирки, рак головного мозку, рак товстої кишки, рак прямої кишки, рак стравоходу, рак молочної залози, рак яєчника, рак шлунка, рак печінки, рак передміхурової залози, меланому, лейкоз і інші пухлини, які виявляють надмірну експресію білка ГАМС2, з якого походить пептид з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 21.

10. Застосування пептиду за п. 1, нуклеїнової кислоти або вектору експресії за п. 2 або п. 3, клітини за п. 4 або п. 5, або активованої Т-клітини за п. 7 у виробництві лікарського засобу проти раку, де згаданий рак вибраний з групи, що включає рак підшлункової залози, рак легенів, рак нирки, рак головного мозку, рак товстої кишки, рак прямої кишки, рак стравоходу, рак молочної залози, рак яєчника, рак шлунка, рак печінки, рак передміхурової залози, меланому, лейкоз і інші пухлини, які виявляють надмірну експресію білка (АМС2, з якого походить пептид з послідовністю ЗЕО ІЮО МО: 21.

11. Терапевтичний комплект, що містить контейнер, який містить фармацевтичну композицію, що містить пептид за п. 1, нуклеїнову(ї) кислоту(и) або вектор(и) експресії за п. 2 або п. 3, клітину(и) за п. 4 або п. 5, або активовану Т-клітину за п. 7 у розчині або у ліофілізованій формі.

12. Комплект за п. 11, який додатково містить другий контейнер, що містить розріджувач або розчин для відновлення ліофілізованої композиції.

13. Комплект за будь-яким з пп. 11-12, який додатково містить інструкції із () застосування розчину або (ії) відновлення і/або застосування ліофілізованої композиції.

14. Комплект за будь-яким з пп. 11-13, який додатково містить один або більше з (ії) буферу, (їм) Зо розріджувача, (му) фільтра, (мі) голки або (мії) шприца.

15. Фармацевтична композиція, що містить принаймні один активний інгредієнт, вибраний з групи, що складається з: а) пептиду з послідовністю ЗЕО ІЮ МО: 21; б) нуклеїнової кислоти, що кодує а), або вектору експресії, що містить згадану нуклеїнову кислоту, в) клітини-хазяїна, що містить вектор експресії за б), г) активованої Т-клітини, отриманої згідно зі способом, що включає контактування Т-клітин /л уйго з пептидом за а), експресованим на поверхні відповідної антигенпрезентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації згаданої Т-клітини шляхом набуття нею специфічності до антигену, а також способу перенесення цих активованих Т-клітин в організми аутологічних або інших пацієнтів; і фармацевтично прийнятний носій.

16. Фармацевтична композиція за п. 15, яка додатково містить фармацевтично прийнятну допоміжну речовину і/або стабілізатор.

зт зв тре Пептид: ПАСОБЗЕНА"О2) ОО Ю ОХ 1 Се : г ШК : ІЗ В ї : КИШКУ 8 З ЖЕ жо: 5 І ЕЗ ГІ ГУ хх М еШ З ЕКЗ м: ІЗ ЖК УЗН ГУ хх дО ІЗ хх шо: «хх шо: х ГЕ ге ІЗ ГКУ Ге З 1 в З 1 шко З | ІК. ОО: ГУ хх : ГУ хх то: х хх Ж 3 ДКЗ ГУ В АН А АН А а КН У т Хбо нортальиикх твамим 18 ї жироватканикня, Ї надниркові звасхи, й артерії, З кісткових кабамм, 7 головних моаців, З пахлечні залози, ткамнм ІЗ терстих кміщок, З яке, Я серзвюходи, а жовчних міхури. З серця, 12 нирок, З зразки леймдктх, НІ ВУ тнечінок, 43 легені, 2 лімфатичний вузом, ї печник, 2 периферичних нерви, Її охеревіма, З гіпаефів, З плеврн, х передеікуреца залоза, б прах киш, З скелетні мязи, З шкірі, З тхнкі миціви, Ж селезінки, З щеиувнків, Ї сбм'ямик, З тмохуси, Зіцитоподійні залози, Я катки, 2 вени, б підшлуннових залоз

Фіг. ТА Пептнм: ЗОЕЕНУВУА(АТОХ ЗВО Ю МО: ЖК М ш ! ФО : - з Н шок З : о: ї : г: : і Б : їі ї І В ї І В і ІЗ 5. З ї І їі ше ЕК ІЗ І ті : ГЩЕЗ : 1 : х 5 ро х х ККУ що ї 5 5 ПОНИНІ оо ЕЕ ЕК ЕІ ЕН КН Ко о о Юа і: 19 внзркаяльних ткання 18 і жекрова тканина, З мадмерковізнлоянм, 2 артерії, З кткових мозки, 7 попловних гаознів, З молочні запози, ткани і) човстих кншом, Її вечник, З стра всокодм, З жовчних мікжри, З серня, 12 нирок, З зразки лейкоцитів, виш 19 пехінсвк, ЯЗ негсні, І ліга фатичний вузол, з яееник, 2 перифевнчних нерви, і счеревинния, і гіпофіз, плеври, Її передкіхурова зансза, й прямня кищизк, З скелетні м'язи, З шкіри, й тині кишнк, Я селезінки, з ї їху Ву з їх язи, З 2 4 ч шніх, Х сів дно, 2 тивусим, З щитетодійні запози, З матки, 2 вени, й піднілумкових залоз

Фіг. 18 пептид; ЕЕУРОЗЗАКІАМОІ ЕС ОВ МО шо : Е Н ї Е : : Еш ! !

Еф. де! : т. Те Е КЕ с У ТІ ШЕ БЕ І ЗЕ СН ІЗ хх о ШЕ ши Фо: Е Н хх ЕЗ Фо : : З Я. : що ї : х «У 5 ЕЗ ГУ В ВЕНУ А АННА ОН АН АНА В АН АН З КЕ са 15а нермазльних ткани ІВ і жирацатианнна, З надиирисві залози, артерії, З місткових мозни. Я головних лозі, Х лизаачні залози, тканих іЗховстих кишок, Її ясеним, Я стравоходи, 2 вовкних кміхурк, З серця, 2? мкрок, Я зразим лейкоцитів, РиНІЗ 19 почінок, 43 плетені, З німфатичний вузол, Її яєчним, Х периферичних нери, З счеревима, й пгиУфія, З пасврия, ЇЇ передні нжрова залози, й пригаюх кицизи, я скалетні м'язи, З шікірм, 2 тони каціки, 4 солезінки, Б шілумнків, З сім'янин, У мм усм, З шнтомодісні залозн, мати, вонм, 5 підшлунковнх залея

Фіг. 1С Греватид: ГЕРМЕС ЗВО ЕІ БК: З

ЕІ. : : Б «4 : х КЗ т . ї- - : : - Ж КЗ у ваше Х т - : Кк : : КУ КУ у В - КЗ о з ши ще щі чи

«Ж. : КК г: В т - - - Ж в ліні хв, р Ех с ЩЕ й с - сх ще -- ВВ х : ; в Лінй Нармальні Ракові тканини я ками ЗКаНИиМИ І: Пиантид, вмнвлемник а: т лініях рану підшлумковсї залози, ? кортальних тканинах Гі товста кишка, в легенів). 55 ракових тканинах (2 раки глолонної залози, б ранів товстої ким, З рами стравоходу, З раки печінки, У раків денні, 5 раків підшнуннової залози, З раки прям кишки, келамока, З раків шнуюма| зліва нанкавої

Фіг. 10 сяк ко МОЯ У хід су ї Пептип: ЗУПУЗРРКМ АТО се ї т 5: ЩІ ЕН я ї ГЕ: ВИ щі : о КУ шо: - ЩО ков нн й у Я вв ал Й ЩЕ 5 | най Е ЕТО. вну ; ; се сх Й Й х п у : г Яінй 0 Мардмальні Ракові тканння КО клітин тванимв їй Пентид, вмявлЕенни на: З лінії клітки, З параиникх култувах, і шкірі, З ваку лозанних пратоків, Я раках коладаномо мозку, ї вант молочної залози, 4 ракля стравоходу, храках имрни, 13 паких погонів, Її раку айафатичного вузли, Її раку дичини, З рамах япідшлуннової аялази, 1 Баку перздлікурсвої залзам, З знах вийре, Х ринках сечового міхура, З ракзя кіхтки (зліва нама

Фіг. 1Е слча ж КЕН, ті Пелтид: ВУВОЗА НТУ ТАМ у г - Ов: 5 шо! Ес не Ж РУ -к р З ве НО с Балі п - ОО т с. -О0ОШЕКЕ т м шо Ж БЕ Ше Я М о сш «Шан І | як Шо ж | ; а ке М пік ов ЗК і й Ен я! сего Й меш я оте завсло ЖИ | Я І 5 лінї : в Рикові тканини Що клітки В Пет, вилелений ма: 2 плініах клітин, і первинній культурі, і раку жовчних протонів, 2 паках пивного мазку, Х раку малочної ззвоазчи, Я ракак страцвсокодху, 2 ваках жовчного мікура, 2 паках мирии, Х раких печінки, З раких легенів, 7 раках яхчимкиа, х раках підшлумниосвої зансози, З ранах шкіри, ї раку шатнка, Ї раку матки, їзліва маправої Фіг 1 в -к ї т Лептид: ОСТ ГАЗ с в ан В ща НК я СДН т : Ж дв : зо : ЕЕ Ж ! "т ИН М -- ГЗ З м І т Я - й и м РТ ніж НИЙ шк Й З Ліц Накові тк зниинм я клітин - Пеатид, ниапавний ма Ї лінії клітвн, і рзиу товстої кишим, 2 раках стравоходу, х раках вового гаїхурвя, З ракзх легенів, Я раму лігафатичноко вузай, і рикупицимунисвзі залом, 2 Миках ші ри, З паках штука, х раку сачтвсго віхуря, Я раках катки (зліва направтя

Фіг. 15 , рі дк утміїІ й же Пептид; ШАССТУНУ ТАТО ; кітч я 5 а мо: 13 -щ їж Ж Ж в, щ : Й І й КЗ ту : Я т : й ин и М б. м... в ДИНИ я ї ж жа Ме ї в і) я:

шко. рі ЕЕ м є ! ЕЗ і їнії з г - ГУ лік ! Нораальні уко тами Щромайкн тканини я Пептид, виявлений на: Є лініях клітни, З легені, і плаценті, 2 Банах жоавниих претоків, З раках гаслочнеатзалозм, ях паких стравоходу, 2 ваках жинічнаго тіхеря, Її раку печінки, Зб ринках ланів, З раках вечнима, Я иняхк підшнуннової знлеви, кину примогкмиціки, З Бимах сековом каїхуука зліва направо

Фіг. 1Н . ; рт кг Пептид: МАКРОЧУІВЗУ ТАЧО ЗО А 14 8

Е х. о з : - Я КН хх й й - "7 ЩО Ж й А - - У - У о :10ОШЩО ЖИ т - 2 - Й ї н І ШО Ж. Хай . й у Ї рої ояе .- іі. «НАНИ. ки -АННькийи «Пии НИЙ Не НАЙК Й... «В... ЩО0ОЗБИЕЛИКИИт и З Як Ї о шк г як ї КЕ | Ж: З КЗ Ково: Ж же. я Явлк ще. з. 5 ліф Норкажені ракові шщамини В влІТИ тканини за МПептнд, виявлений ма: 7 лініях клітин, і легані, ї пакх нотачиих протоків, Я ракак молочної залізм, раку товстої нищшки, » паках стравоходу, з ЕЗкКу жоевиноко міхтра, 35 раках легенів, і раку яєчника, З Бамах підшлункової залози, х раках прямої мущики, і ранх ілуння, ї вих сочевого кліхура (зліва направо 5 Фіг. ТІ

ТеніАМІ в о і і Ве -ї і - ЖЕ КК Н ща Кер І Н НО ж ББКОХ й - Н ОК 8 БЕ к й ! МО ВВ я «в і М М ОК Ж Н ММ: КМ щ Н мМ М КЗ З Н ММ ЕЕ ря | з М ЕК і й ек е МО КО ЕК т чини не іш ВЕ з ДН Дар Салямі рання А ВВ КМ ра в нн От М М ЕВ Б сссасчя ЗЕ марказльні тканини її наднимнова залоза, З азртервік, 1 кіст акай мозох, 3 палав 11 ткани ЕП мазоківаксь), ЕК милочна заляза, з товста кишка, к страва, Її сере, З нирки, х хразак лейкоцитів, вечіний, З легеня, ї лігафлтичний вузод, З дочннік, Її ліинлчннна залах, ї плаценти, ії передміхурова залоза, плідна залоза, ї скелета раза, ї шакірз, ї танка кишки, З ктелевінко, Х цолунок, Я сім'ями, фо тиву, Х песик зало ї сечо кір, Я шмійїня мнкеня, ЇХ важка, Ї вена гзніка ма правої

Фіг. 2А Гем САМ ще з ге В Фі в "З і МЕ ЖЕ БК Е | КО ЕК Зо оо ВО У Ї-Я Я Ме Б М В - ' ПЕК ЗК І ОО ХХ Же 5 5 Н ж І В МЕ Ж Н . хи а КК М КО КУ ШЕ 0 та ! БО НЯ Н ш МК ОК З ра Н З Ве НО ж ! е г: з вх Зоре кер о Н гі 7 - в и М В КО КК Я т АК б З М - ВОМ М а їх т є шщо щ Мп ц. ща З ом ок . - ж А дон М м жав КОКО КО КЗ ЖК ден денс лк. КМ Кдвит и. х М ХМ. сек В ДЕ боса вккю м ОК пе ВУ ЗМУ БМ ЕН М Б Б ЗУ набмальні тианими- 5 наднирнова залоза, ї вртерія, З кістковня мозок, 31 канин НИ Я пхловний кнузом весь), Її мналечния залози, ї товста кишка, З стравохід, ї сере, З нирки, А Зрязак лей мокитів, З зечінкоь Т легене, А лімфншчний вухад, з яечнин, підшілукнова залаха, Її плацінта, ї передміхурова залоза, 3 слинна залоза, і сислатна м'яза, З шкіра, З тил нишзий, З селезінна,. Ї шлунок, З сім'ямии, Х зму, Я щнтоподієна залоза, З сечо кнкур, Її шийка мити, ї взтка, Її вона ізаіва направо

Гек КАК з . 2 -к - - 85 б нс Е - ЕН Г20 й ПІК Фо з баз ЯМУ Ж - Ж щи БУМ с - ЯН оч я ї І й Е й З : ВВ під КО З 2 бра ка бодя ст с ЩІ З 88 а А ВОМУ ЗО ВАМ Я З норгмавдьні тканням ї надниркова залюза, Я артерія, З. кісти ваги, головний: 34 тен ВЕНИ мазок весь), Х кизлочна залоза, ї товста ника, Її стравохід, 3 серце, З яння, 1 заааок нийкІьйв, її печіння, Її легеня, З з іинфатичнмі вол, Ї яеччик, Ї Вів луннова залоза, і плаценти, Її нередніхурова здлоза, Її слинні залоза, Е скелетни м'яза, я пзніа, і тонка кни, Її селезінки, Х шамном, Х сіля вник», З зими. З шщитепадібна зач ї сечотвий оліхур, ХЕ имБна мати, З каатка, і вена їла вайравої

Фіг. 2С Стимуляція Стимупння НЕ А-САРОД тегатив: контроль НЕА-АО2ЯОвоВРаОг д пен нан кни Мн пон І Я ГБ» | Гб Б ЩЕ Н ще : і - : ! Од ї - г с: Рон СН Н ве : Ге : і : Ї : ПОЖ Ма ШЕ ше дн й ЩЕ Ви ЕЩ. сно с Ше 5 ЯАЩН, : ПК КК, : ЛИЖІ. в І нш с ! Що і що НУК АРОДЯСЕЯВРОНЮТ (ЗБОЮ МОСК АХ в стимуляція Слимупяція НААН АМС? ОВ НЕГА АЧІЛНепятив. коптроль З заз 55 ідеї т 7 її : - | і НЕ і . Бо і я ше ше ! с Ко 1 Н й З КЕ Не вив ШЕ: ПОМ стран з ши : К ООН НЕ ДЕК ЕН ВО Р ПЕОМ жк ї не п НЕ ООН І ПК. НЕ: ПО Ж т Оу я Ох нн шше ше 5 К й пожатле зу дв но ЖЕ КІ тку ! З РЕ АЧОЯ АМС БОЮ Ме: Я фіг. З

С. п - плини Слимуляця Слимупяція х РО тет Шк ї ХГ ру В е НААН Мо З НЕААЧІЮ негатив. контроль та шФчемеєннн а нин пив їх ; паї : - мус

1. | і 13555 : ор БОБ. й ї ! АК ї : й ! КІ З : й Н й : : і 3 РЕ ЩЕ леви : ї ШКО 3 Же по ще Ме й : ООН. . 3 ж ШО З: НИЙ : ей ї КАЖЕ ВЕНИ о НИ ї ВЕК МК, З гоже ШЕ КЕ : ВОЗ Е ШЕ ШН Е ШК і ве ЩЕ ота : оо З чу Ж АТЗ их ЦЗ хі РЕ СУ Аа Ю МО З стю. іч их сек за - Стимупяція Стимуляція Ге г РЕ - 5 ВЕ ї ж. десь - НА Аа НІ Мо БО НН ААПОНенятивВ. контроль щк ІВ їі У опа як Е й і 17 шк що і п - Її ще Е і В я: ШИЯ Е наше 3 РІ бод тити ся І й ОЗ АЛИЖИ ТИ х и ши що хх х Ра ЖЕ ЩЕ м Е ог ЕВ З Ж 5 ї ше В ВІ а ПИ ЗИ Е о ОНА В - НИ я х оС ТІМ КІ ше 1, Е Ом ЕІ ня я и М ве іт Б БУВ АТЗ НІ МО БО

Фіг. З (продовж. )