CN112760383B - 应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因及其应用 - Google Patents

应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT‑PCR内参基因及其应用，属于基因检测技术领域。本发明的内参基因选自基因RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA‑B、SERF2、RPS13和RPL7中的至少一种。本发明的内参基因相较于多数目前研究中常用的内参基因表达更加稳定，更加适用于从肺腺癌中分选出的肿瘤细胞和正常细胞，通过qRT‑PCR检测肺腺癌不同细胞亚群的基因的表达量，以获得更加可靠的标准化定量结果，从而为在复杂生理病理背景中探索肿瘤疾病的病因、肺腺癌的治疗和预后提供精确且可靠的数据支持。

Description

应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因及其应用
技术领域
本发明涉及应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因及其应用，属于基因检测技术领域。
背景技术
肿瘤细胞是基因组不稳定性和特定生理及病理环境中进化的复杂细胞群体，从时间维度上看，细胞间高度的异质性导致了不同组织来源肿瘤细胞的差异和不同患者同类癌症细胞群之间的差异。肿瘤在空间维度上还是作为存在的所有细胞的混合物进行研究的，即同一个肿瘤样本中的细胞组分并不都是癌性的。因此应用特定的分离技术例如流式细胞分选方法从肿瘤混合样本中获得特定细胞亚群，再通过检测不同细胞亚群的某些参数值，可以为在复杂生理病理背景中发现肿瘤疾病的病因、治疗和预后提供精确且可靠的理论基础。
反转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse quantitative real-timepolymerase chain reaction,qRT-PCR)是一种实时监控核酸扩增的技术，可以实现对初始模板的定量分析，并且具有对靶基因定量准、特异性强、灵敏度高等特征，是目前研究基因表达分析中的首选应用技术。因此将qRT-PCR技术应用在分选出的特定细胞亚群中，便可以检测该种细胞亚群中某些特定基因的表达量，从而进一步揭示肿瘤样本中各种细胞的遗传学背景和细胞与细胞间丰富的肿瘤生态系统。
值得注意的是，在qRT-PCR技术对靶基因定量的结果分析过程中，内参基因的表达量至关重要。检测内参基因的表达量可用于校正由于靶基因的含量和质量、反应效率和实验操作等因素而产生的误差，从而使得qRT-PCR技术得到的半定量的结果可信度更高。理想的内参基因即表达水平不受研究条件变化的影响并且可以在不同样本中恒定表达的参照基因。然而目前可作为内参基因的基因种类虽然较多，并且这些内参基因在相同种类的组织中表达量相对稳定，但是它们在不同种类的组织中的表达量仍会有所差异。因此目前内参基因的选择仍主要依据传统经验，而且也没有特定的内参基因可以用于在采用各种方法分选出的细胞亚群的研究中对qRT-PCR定量结果进行校正。
发明内容
本发明解决的技术问题是：目前内参基因的选择仍主要依据传统经验，而且也没有特定的内参基因可以用于从肺腺癌中分选出的细胞亚群的qRT-PCR的定量结果进行校正。
为了解决上述问题，本发明提供了应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因，其特征在于，选自基因RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13和RPL7中的至少一种。
优选地，所述内参基因选自基因RPL41或RPL41与TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13和RPL7中的至少一种的组合。
本发明还提供了一种上述应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因标准化定量的方法，包括如下步骤：
步骤1：检测样本中待测基因和内参基因的绝对浓度；
步骤2：将待测基因的绝对浓度与内参基因的绝对浓度进行比较，以获得待测基因的相对浓度。
优选地，所述步骤1中的样本为从肺腺癌组织中分选出的肿瘤细胞和/或正常细胞。
本发明还提供了上述应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因在制备检测基因的试剂盒中的应用。
优选地，所述应用包括在制备定量检测基因的试剂盒中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
1.本发明的内参基因相较于多数目前研究中常用的内参基因表达更加稳定，更加适用于从肺腺癌中分选出的肿瘤细胞和正常细胞；
2.本发明的内参基因应用于qRT-PCR检测技术中，通过qRT-PCR检测肺腺癌不同细胞亚群的基因的表达量，以获得更加可靠的标准化定量结果，从而为在复杂生理病理背景中探索肿瘤疾病的病因、肺腺癌的治疗和预后提供精确且可靠的数据支持。
附图说明
图1为肺腺癌的单细胞样本及细胞种类聚类结果图；
图2为符合稳定表达筛选标准和常用内参基因的表达情况示意图，其中，横坐标X为基因在某类单细胞中表达量的变异系数，纵坐标Y为基因在某类单细胞中表达量的平均值；
图3为9个符合稳定高表达筛选标准的基因在单细胞数据中的表达情况示意图，其中，横坐标X为基因在某类单细胞簇中表达量的变异系数，纵坐标Y为基因在某类单细胞中表达量的平均值；
图4为9个符合稳定高表达筛选标准的基因在不同单细胞样本中(肿瘤和正常单细胞簇)的表达情况示意图；
图5为流式细胞术验证细胞表面标记并分选肿瘤细胞和正常细胞的结果示意图；
图6为qRT-PCR方法分别检测样本中肿瘤细胞和正常细胞9个符合稳定高表达筛选标准的基因和3个常用内参基因的表达量的结果示意图。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
应用单细胞数据筛选稳定高表达基因：
1.1肺腺癌组织的单细胞测序：
通过对20例肺腺癌患者(17个肿瘤组织样本和12个正常组织样本)的单细胞RNA测序数据结果进行分析，经过质量控制后，共得到了204157个单细胞的基因表达数据。应用常用基因标志识别出了22491个肿瘤细胞和181666个正常细胞(肺泡细胞、B细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、髓细胞、T细胞)，如图1所示。
1.2分析常用内参基因在单细胞数据中的表达情况：
在上述肿瘤细胞和正常细胞中检测了15个目前研究中常用的内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、GUSB、HMBS、HPRT1、IPO8、PGK1、POLR2A、PPIA、RPLP0、TBP、TFRC、UBC、YWHAZ)的表达数据，结果如表1所示。表1中“MEAN”表示某种基因在某类单细胞中的平均表达量，“CV”表示某种基因在某类单细胞中表达量的变异系数；(A)表示所有细胞，(N)表示正常细胞，(T)表示肿瘤细胞。
表1 15种常用内参基因在肺腺癌单细胞数据中的表达数据
1.3应用单细胞数据筛选稳定高表达基因：
首先，在所有单细胞中筛选出稳定表达的基因148个[筛选标准：CV(A)≤1.5]，其中包含1个前述的常用内参基因(B2M)；在正常单细胞中共筛选出稳定表达的基因163个[筛选标准：CV(N)≤1.5]，其中包含2个前述常用内参基因(B2M和YWHAZ)；在肿瘤单细胞中共筛选出稳定表达的基因950个[筛选标准：CV(T)≤1.5]，其中包含6个前述常用内参基因(ACTB、B2M、PPIA、RPLP0、UBC、YWHAZ)。其中，“CV”表示某种基因在某类单细胞中表达量的变异系数；(A)表示所有细胞，(N)表示正常细胞，(T)表示肿瘤细胞。所筛选出的稳定表达的基因和常用内参基因的表达情况如图2所示。
从上述符合稳定表达筛选标准的所有基因中，进一步筛选出在肿瘤和正常单细胞中均稳定高表达的基因，筛选标准如下：
(1)MEAN(N)>10且MEAN(T)>10；
(2)CV(N)≤1.5且CV(T)≤1.5；
(3)MEAN(N)/MEAN(T)<1.4且MEAN(T)/MEAN(N)<1.4。
其中，“MEAN”表示某种基因在某类单细胞中的平均表达量，“CV”表示某种基因在某类单细胞中表达量的变异系数；(N)表示正常细胞，(T)表示肿瘤细胞。
最终筛选出了九个符合上述标准的基因：RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13、RPL7。这九个稳定高表达基因在单细胞数据中的表达数据如表2所示，表达情况如图3所示，这九个基因在不同单细胞样本中(肿瘤和正常单细胞簇中)的表达情况如图4所示。
表2 9个符合稳定高表达筛选标准的基因在单细胞数据中的表达数据
由表2、图3和图4可知，所筛选出符合稳定高表达条件的九个基因在同类单细胞中表达均较稳定，并且在肿瘤和正常单细胞簇间的表达量相差相对较小，其中RPL41、RPS29两个基因在肿瘤和正常单细胞中的表达量相差甚微，非常稳定。因此，这九个基因可能适用于作为内参基因应用在采用各种方法从肺腺癌中分选出的肿瘤细胞和正常细胞的相关研究中。
实施例2
验证实施例1所筛选出的九个基因可作为内参基因：
2.1流式细胞术分选出肿瘤细胞和正常细胞：
选取5位肺腺癌患者的肿瘤组织和正常组织进行流式分析验证。首先将EPCAM、FLOR1、CD45分别作为肿瘤细胞、正常上皮细胞、淋巴细胞的表面标记，将5对样本组织解离成细胞后，用相应荧光素耦联抗体分别染色后，采用流式细胞术分选出EPCAM+CD45–的肿瘤细胞和EPCAM–FLOR1+/CD45+的正常细胞，如图5所示。
2.2验证基因表达的稳定性：
通过qRT-PCR方法在2.1中分选出的肿瘤细胞和正常细胞中检测实施例1筛选出的九个基因(RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13、RPL7)和三个在单细胞分析结果中显示表达相对较稳定的常用内参基因(ACTB、B2M、YWHAZ)的表达量，并采用“GeNorm”和“NormFinder”两种软件的方法分析基因表达结果，用于比较这些基因及常用内参的稳定性。基因的表达检测结果如图6所示，“GeNorm”和“NormFinder”对基因稳定度分析结果如表3所示。由图6和表3可知，前述的九个基因在分选出的肿瘤和正常细胞中表达情况均较稳定，均适合作为内参基因。其中RPL41在这些内参中稳定性极高，其表达丰度和稳定性都优于常用内参基因ACTB，明显更具有优势。另外在这九个基因中RPL34、SERF2、TPT1、HLA-B四个基因的稳定性也优于另外两个常用内参基因B2M和YWHAZ。
表3筛选的九个基因和3个常用内参基因在细胞样本中表达稳定程度排名
将上述筛选出的九个基因(RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13、RPL7)中的任意一种或其组合作为内参基因，应用于qRT-PCR检测肺腺癌肿瘤细胞和正常细胞的基因表达量，首先检测样本(从肺腺癌组织中分选出的肿瘤细胞和/或正常细胞)中待测基因和内参基因的绝对浓度；再将样本中待测基因的绝对浓度与内参基因的绝对浓度进行比较，以获得待测基因的相对浓度。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因标准化定量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：检测从肺腺癌组织中分选出的肿瘤细胞和/或正常细胞中待测基因和内参基因的绝对浓度；
步骤2：将待测基因的绝对浓度与内参基因的绝对浓度进行比较，以获得待测基因的相对浓度；
所述的内参基因由基因RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13和RPL7组成，或为基因RPL41与TPT1的组合。
2.应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因在制备检测肺腺癌细胞亚群中的基因的试剂盒中的应用，所述的内参基因由基因RPL41、TPT1、RPL34、RPS29、RPL27A、HLA-B、SERF2、RPS13和RPL7组成，或为基因RPL41与TPT1的组合。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备定量检测肺腺癌细胞亚群基因的试剂盒中的应用。
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