CN107641652B - 应用于肝细胞癌的一组实时定量pcr相对定量的内参基因及其筛选方法 - Google Patents
应用于肝细胞癌的一组实时定量pcr相对定量的内参基因及其筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107641652B CN107641652B CN201710971976.7A CN201710971976A CN107641652B CN 107641652 B CN107641652 B CN 107641652B CN 201710971976 A CN201710971976 A CN 201710971976A CN 107641652 B CN107641652 B CN 107641652B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- genes
- candidate
- primer
- screening
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 22
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 title claims abstract description 21
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 38
- 101000587436 Homo sapiens Serine/arginine-rich splicing factor 4 Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 102100029705 Serine/arginine-rich splicing factor 4 Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 16
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 16
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 4
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims 2
- 238000013102 re-test Methods 0.000 claims 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 claims 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 claims 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 102100021699 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Human genes 0.000 abstract description 7
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 abstract description 7
- 101000896557 Homo sapiens Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B Proteins 0.000 abstract description 7
- 101000988834 Homo sapiens Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 abstract description 7
- 101000625727 Homo sapiens Tubulin beta chain Proteins 0.000 abstract description 7
- 101000788517 Homo sapiens Tubulin beta-2A chain Proteins 0.000 abstract description 7
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 7
- 102100024717 Tubulin beta chain Human genes 0.000 abstract description 6
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 6
- 101000800847 Homo sapiens Protein TFG Proteins 0.000 description 6
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 4
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 102100021408 14-3-3 protein beta/alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100037685 60S ribosomal protein L22 Human genes 0.000 description 1
- 102100033408 Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B Human genes 0.000 description 1
- 102100022416 Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021895 Bcl-2-like protein 13 Human genes 0.000 description 1
- 102000056162 CELF1 Human genes 0.000 description 1
- 108700015925 CELF1 Proteins 0.000 description 1
- 101150107790 CELF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100021309 Elongation factor Ts, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100033994 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 Human genes 0.000 description 1
- 101000818893 Homo sapiens 14-3-3 protein beta/alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001097555 Homo sapiens 60S ribosomal protein L22 Proteins 0.000 description 1
- 101000732653 Homo sapiens Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member B Proteins 0.000 description 1
- 101000755762 Homo sapiens Aminoacyl tRNA synthase complex-interacting multifunctional protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000971074 Homo sapiens Bcl-2-like protein 13 Proteins 0.000 description 1
- 101000895350 Homo sapiens Elongation factor Ts, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 101001017574 Homo sapiens Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 Proteins 0.000 description 1
- 101000710817 Homo sapiens Protein canopy homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001093116 Homo sapiens Protein transport protein Sec61 subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000685886 Homo sapiens RNA-binding protein RO60 Proteins 0.000 description 1
- 101000920618 Homo sapiens Transcription and mRNA export factor ENY2 Proteins 0.000 description 1
- 101000638180 Homo sapiens Transmembrane emp24 domain-containing protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000807337 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 B Proteins 0.000 description 1
- 101000772913 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 D3 Proteins 0.000 description 1
- 101000644684 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N Proteins 0.000 description 1
- 101000940063 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033661 Protein TFG Human genes 0.000 description 1
- 102100033856 Protein canopy homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100036308 Protein transport protein Sec61 subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 102100023433 RNA-binding protein RO60 Human genes 0.000 description 1
- 102100031954 Transcription and mRNA export factor ENY2 Human genes 0.000 description 1
- 102100031987 Transmembrane emp24 domain-containing protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037262 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 B Human genes 0.000 description 1
- 102100030425 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 D3 Human genes 0.000 description 1
- 102100020695 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N Human genes 0.000 description 1
- 102100031122 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基因技术领域，特别涉及应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法。本发明得出TFG和SFRS4可作为肝细胞癌细胞株研究中较稳定的内参基因。常用的内参基因的表达稳定性经过评估后发现ACTB可作为内参进行应用，而GAPDH、HPRT1和TUBB则不适合作为肝细胞癌研究相关的内参基因。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域，特别涉及应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法。
背景技术
基因表达检测是分子生物学研究的重要手段，实时定量PCR(qRT-PCR)作为一种可以精确定量基因表达水平的研究策略，近年来得到广泛应用。qRT-PCR可分为绝对和相对定量，相对定量法由于具有灵敏度高、重复性好、易于操作和结果可靠等特点，应用更为广泛。基于2-ΔΔCt的计算策略是目前用来获取两个转录本间表达水平差异最常见的相对定量方法。该方法需要以在表达体系中基本恒定不变的内参基因作为对照，且待研究基因与内参基因具有基本一致的扩增效率前提下进行检测和计算。我们首先通过在10种人肝细胞癌(HCC)细胞系的48张全基因组表达谱芯片数据中初筛到19个表达最稳定的候选内参基因，再加上4个目前公认的内参基因ACTB、GAPDH、HPRT1和TUBB，一起在9种HCC细胞系中进行其表达量稳定性的qRT-PCR评估。将测量到的Ct值用迭代排除法进行RefFinder整合分析，评估出TFG和SFRS4以其最佳的表达稳定性，可作为HCC细胞系qRT-PCR新的内参基因。常用的ACTB稳定性表现位居第三，可作为传统的备选内参，而GAPDH、HPRT1和TUBB则在表达稳定性上不能达到在HCC细胞系中作为内参基因使用的要求。
发明内容
本发明公开一种实时定量PCR相对定量的内参基因及其筛选方法，本发明得到TFG和SFRS4可作为肝细胞癌细胞株研究中较稳定的内参基因。
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
一种实时定量PCR相对定量的内参基因，其特征在于：所述的内参基因为TFG和SFRS4中的一种，所述内参基因作用于肝细胞癌细胞系。
一种内参基因的筛选方法，包括如下步骤：
(1)全基因表达谱芯片数据收集以及候选内参基因初步筛选；
(2)选取细胞株进行传代培养，提取细胞株RNA并进行cDNA合成；
(3)定量PCR引物设计及引物扩增效率检验；
(4)定量PCR后对候选基因表达稳定性评估。
所述步骤(1)中采用以细胞种类为单元进行数据筛选，基因在10种肝癌细胞系中的表达量均以平行测量MAS 5.0信号值的算术平均为代表。筛选标准主要依据基因在10种肝癌细胞中表达量的变异系数CV<0.11，且基因具有一定的表达水平
以及控制任意两种细胞间表达量的极差不得过高MFC＝Max(Ii)/Min(Ii)<1.4，其中Ii表示在每一个细胞样本中基因的表达。
所述步骤(2)选取细胞株为肝细胞癌细胞株：Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、SNU-398、SNU-449、SNU-475。除Huh-7来自HCV感染的肝癌病人外，其余细胞株均来自于HBV感染的肝癌病人。
所述Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3在10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养，所述SNU-398、SNU-449、SNU-475在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行传代、培养，所述细胞均在5％二氧化碳培养箱中于37℃孵育培养。
所述步骤(2)中提取细胞株RNA并进行cDNA合成步骤包括每种细胞系收集5×106细胞，按照说明书操作方法利用Trizol试剂提取细胞内总RNA，随后进行DNA酶I处理和cDNA反转录。
所述步骤(3)中定量PCR引物设计通过PerlPrimer v1.1.16、NCBI primer BLAST、NCBI primer BLAST、文献和引物库进行基因引物设计，所引物扩增效率检验采用标准曲线法检验候选基因扩增引物的扩增效率，取一定量的模板cDNA，进行5个梯度稀释后，建立各个候选基因的标准曲线，根据斜率通过公式E＝10-1/Slope计算出特定引物的扩增效率，选取扩增效率1.8～2.1之间的候选基因引物进行下一步定量复验。
所述步骤(4)中定量PCR在肝癌细胞株中开展3次生物学重复的qRT-PCR复验，获取到不同细胞株中候选基因的Ct值，所述候选基因表达稳定性评估采用了四种不同的算法geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper及其稳定性指数整合工具RefFinder对候选内参基因稳定性进行打分，并最终的整合结果。由于一些算法是全局依赖性的，即某个基因的稳定性得分会随着参与计算的其它基因的不同而改变，我们采用了迭代排除法逐次去掉最不稳定的一个基因，直至候选列表缩减到只剩最后两个基因为止。
本发明的有益效果是：
1、本发明得到TFG和SFRS4可作为HCC细胞株研究中更稳定的内参基因。
2.本发明筛选出的内参基因是用于不同HCC细胞系之间，而不是不同扰动胁迫状态之间的。
附图说明
图1：是本发明分别在基因和探针水平筛选出的基因列表。
图2：是本发明23个候选内参基因Ct值的小提琴图，基因从左至右按Ct值标准差升序排列(白色圈显示中位数，方框上下限分别显示上下四分位数)。
图3：本发明候选内参基因通过RefFinder软件进行循环评估结果，每轮循环去掉上一轮评估中最不稳定的基因直至最后剩下两个稳定基因。
图4：本发明候选内参基因通过RefFinder(列2)以及其整合的四种算法(列3-5)计算出的最终不稳定性得分(越小越稳定)。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1
收集了10种HCC细胞株(系)共48张Affymetrix HG U133 Plus 2.0 Array全基因组表达谱芯片的数据如表1、2所示。其中MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、HCCLM6和Hep3B的两张芯片数据集是由自主研发产出，Huh-7、PLC/PRF/5、SNU-398、SNU-449、SNU-475和Hep3B的3张芯片数据来自于公共数据集ArrayExpess和GEO。由于每种细胞内部平行测量芯片数目不同，为避免权重差异，采用以细胞种类为单元进行数据筛选。基因在10种肝癌细胞系中的表达量均以平行测量MAS 5.0信号值的算术平均为代表。筛选标准主要依据基因在10种肝癌细胞中表达量的变异系数CV<0.11，且基因具有一定的表达水平
以及控制任意两种细胞间表达量的极差不得过高MFC＝Max(Ii)/Min(Ii)<1.4，其中Ii表示在每一个细胞样本中基因的表达。筛选后得到19个符合条件的候选基因，再加上4个常用内参ACTB、GAPDH、HPRT1和TUBB一起进入下一步的表达稳定性评估环节。
表1.筛选候选内参基因的全基因组表达谱芯片数据集
表2.候选内参基因的全基因组表达谱芯片基因表达强度数值。粗体显示满足筛选条件(CV<0.11,
MFC<0.14)的条目。
评估结果：上表中所列基因即为通过全基因组表达谱芯片分析，初筛满足条件的候选内参基因(另加上四个经典内参ACTB、GAPDH、HPRT1和TUBB)。
实施例2
包括如下9株肝细胞癌细胞株Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、SNU-398、SNU-449、SNU-475。Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3在10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养。SNU-398、SNU-449、SNU-475在10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中进行传代、培养。每种细胞系收集5×106细胞，按照说明书操作方法利用Trizol试剂提取细胞内总RNA，随后进行DNA酶I处理和cDNA逆转录。
16种基因的引物通过PerlPrimer v1.1.16设计，包括AIMP1、ANP32B、BCL2L13、CNPY3、CUGBP1、ENY2、HNRNPC、RPL22、SEC61B、SFRS4、TFG、TMED2、TROVE2、UBE2D3、UBE2V2和YWHAB。TSFM和UBE2B的引物通过NCBI primer BLAST设计。UBE2N和GAPDH的引物通过PrimerPremier 5.0设计。ACTB的扩增引物取自文献。HPRT1(164518913c1)和TUBB(34222261c1)的引物选自Primer Bank。采用标准曲线法检验候选基因扩增引物的扩增效率，取一定量的模板cDNA，进行5个梯度稀释后，建立各个候选基因的标准曲线，根据斜率通过公式E＝10-1/Slope计算出特定引物的扩增效率，选取扩增效率1.8～2.1之间的候选基因引物(表3)进行下一步定量复验。
表3.qRT-PCR验证基因稳定性的引物列表
实施例3
通过对10个细胞株的48张全基因组表达谱芯片数据分别进行基因和探针水平的基因表达稳定性和表达强度分析，从中筛选出19个候选基因进行后续验证具体结果如图1所示。
实施例4
通过对9个细胞株进行qRT-PCR检测23个候选内参基因的Ct值，并进行3次生物学重复。所得到的Ct值利用整合了四种基础算法的RefFinder在线软件进行表达稳定性评估。具体结果如图2、3、4所示。
筛选结果：得出TFG和SFRS4可作为HCC细胞株研究中较稳定的内参基因。常用的内参基因的表达稳定性经过评估后发现ACTB可作为表达内参进行应用，而GAPDH、HPRT1和TUBB则不适合作为HCC研究相关的内参基因。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (6)
1.应用于肝细胞癌的一组实时定量PCR相对定量的内参基因，其特征在于：所述的内参基因为TFG和SFRS4，所述内参基因作用于肝细胞癌细胞系。
2.一种权利要求1所述的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：
(1)全基因表达谱芯片数据收集以及候选内参基因初步筛选；
(2)选取细胞株进行传代培养，提取细胞株总RNA并进行cDNA合成；
(3)定量PCR引物设计及引物扩增效率检验；
(4)定量PCR后对候选基因表达稳定性评估；
所述步骤(1)中采用以细胞种类为单元进行数据筛选，基因在10种肝癌细胞系中的表达量均以平行测量MAS 5.0信号值的算术平均为代表；筛选标准主要依据基因在10种肝癌细胞中表达量的变异系数CV＜0.11，且基因具有一定的表达水平
以及控制任意两种细胞间表达量的极差不得过高MFC＝Max(Ii)/Min(Ii)＜1.4，其中Ii表示在每一个细胞样本中基因的表达；
所述步骤(2)选取细胞株为肝细胞癌细胞株：Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3、SNU-398、SNU-449、SNU-475；除Huh-7来自HCV感染的肝癌病人外，其余细胞株均来自于HBV感染的肝癌病人。
3.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97L、MHCC-97H、HCCLM3在10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代和培养，所述SNU-398、SNU-449、SNU-475在10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行传代、培养，所述细胞均在5％二氧化碳培养箱中于37℃孵育培养。
4.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中提取细胞株总RNA并进行cDNA合成步骤包括每种细胞系收集约5×106对数生长期细胞，加1毫升Trizol裂解，轻轻吹打均匀，室温静置5分钟，使其充分裂解；4℃12000g离心5分钟，弃沉淀；按照200微升氯仿/1毫升Trizol加入氯仿，剧烈震荡30秒后室温静置15分钟待其分层；4℃12000g离心15分钟；吸取上层水相，至一新管中；按照0.5毫升异丙醇/1毫升Trizol加入异丙醇，混匀后室温放置5～10分钟；4℃12000g离心10分钟，弃上清，可见RNA沉淀于管底；按照1毫升75％乙醇/1毫升Trizol加入75％乙醇，温和震荡离心管，悬浮沉淀；4℃7500g离心5分钟，弃上清，并重复一次；室温吹干沉淀，但不要过分干燥；加适量无RNA酶双蒸水，溶解RNA样品；测OD比值定量RNA浓度及验证RNA纯度；按照一定的体积比配制DNA I反应体系溶液，包括2微克总RNA，5×gDNA Eraser缓冲液，gDNA Eraser，无RNA酶蒸馏水；42℃反应2分钟后4℃保存；得到的反应液进一步进行反转录反应，加入PrimeScript RT Enzyme Mix I、RT Primer Mix、5×PrimeScript缓冲液以及无RNA酶蒸馏水，于37℃反应15分钟、85℃反应5秒，4℃保存备用。
5.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤(3)中定量PCR引物设计通过PerlPrimer v1.1.16、NCBI primer BLAST、文献和引物库进行基因引物设计，所引物扩增效率检验采用标准曲线法检验候选基因扩增引物的扩增效率，取一定量的模板cDNA，进行5个梯度稀释后，建立各个候选基因的标准曲线，根据斜率通过公式E＝10-1/Slope计算出特定引物的扩增效率，选取扩增效率1.8～2.1之间的候选基因引物进行下一步定量复验。
6.根据权利要求2所述的内参基因的筛选方法，其特征在于：所述步骤(4)中定量PCR在肝癌细胞株中开展3次生物学重复的qRT-PCR复验，获取到不同细胞株中候选基因的Ct值，所述候选基因表达稳定性评估采用了四种不同的算法geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper及其稳定性指数整合工具RefFinder对候选内参基因稳定性进行打分，并最终的整合结果；由于一些算法是全局依赖性的，即某个基因的稳定性得分会随着参与计算的其它基因的不同而改变，我们采用了迭代排除法逐次去掉最不稳定的一个基因，直至候选列表缩减到只剩最后两个基因为止；具体操作是：geNorm、NormFinder、DeltaCt和BestKeeper分别会对输入的候选基因有一个不稳定性得分，分数越高则表明该基因的表现越不稳定；我们将分数升序排列即可得到该轮评估中候选内参的稳定性排序，而RefFinder则将候选基因在四种算法中的排序数取几何平均作为其综合不稳定性得分；我们去掉该轮得分最高的基因，将剩下的基因按上述步骤重新计算不稳定性得分；如此循环处理，直至剩下无法区分稳定性差异的两个最稳定基因；除了用RefFinder整合法评估外，也在四种算法中分别单线采用迭代排除法得到评估结果以作参考。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710971976.7A CN107641652B (zh) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | 应用于肝细胞癌的一组实时定量pcr相对定量的内参基因及其筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710971976.7A CN107641652B (zh) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | 应用于肝细胞癌的一组实时定量pcr相对定量的内参基因及其筛选方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107641652A CN107641652A (zh) | 2018-01-30 |
| CN107641652B true CN107641652B (zh) | 2021-02-19 |
Family
ID=61123809
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710971976.7A Expired - Fee Related CN107641652B (zh) | 2017-10-18 | 2017-10-18 | 应用于肝细胞癌的一组实时定量pcr相对定量的内参基因及其筛选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107641652B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109609685B (zh) * | 2019-01-31 | 2020-11-27 | 四川农业大学 | 基于芒草转录组序列开发的内参基因及其应用 |
| CN112760383B (zh) * | 2021-03-02 | 2023-07-21 | 上海欧易生物医学科技有限公司 | 应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2455878A3 (en) * | 2006-12-27 | 2014-06-18 | Reference Biolabs Co., Ltd. | Data processing, analysis method of gene expression data to identify endogenous reference genes |
-
2017
- 2017-10-18 CN CN201710971976.7A patent/CN107641652B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2455878A3 (en) * | 2006-12-27 | 2014-06-18 | Reference Biolabs Co., Ltd. | Data processing, analysis method of gene expression data to identify endogenous reference genes |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| He＇dia Boujedidi等.Housekeeping Gene Variability in the Liver of Alcoholic Patients.《Alcoholism: Clinical and Experimental Research》.2012, * |
| Validation of putative reference genes for gene expression studies in human hepatocellular carcinoma using real-time quantitative RT-PCR;Vito R Cicinnati等;《BMC Cancer》;20081127;第258-266页 * |
| 肝癌实时定量RT-PCR 中适宜内参基因的选择;陈罡等;《中国现代医学杂志》;20121130;第4-9页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107641652A (zh) | 2018-01-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105861710B (zh) | 测序接头、其制备方法及其在超低频变异检测中的应用 | |
| CN107574243B (zh) | 分子标志物、内参基因及其应用、检测试剂盒以及检测模型的构建方法 | |
| CN104141014B (zh) | 一种快速检测常见缺失型α-地中海贫血的试剂盒及其使用方法 | |
| CN107058538B (zh) | 一种引物组合物及其组成的试剂盒和应用 | |
| CN112592971B (zh) | 一种与系统性红斑狼疮相关的生物标志物及其应用 | |
| CN107641652B (zh) | 应用于肝细胞癌的一组实时定量pcr相对定量的内参基因及其筛选方法 | |
| US20220136063A1 (en) | Method of predicting survival rates for cancer patients | |
| CN112048560B (zh) | 一种多内参结合序贯概率比检验分析her2基因拷贝数变异的试剂盒及使用方法 | |
| CN106191311A (zh) | 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo‑3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂 | |
| CN107904303A (zh) | 用于检测胆道闭锁患儿血浆miR‑140‑3p的引物组及包含该引物组的检测试剂盒 | |
| CN116168843B (zh) | 一种儿童急性髓系白血病预后模型及其构建方法和应用 | |
| CN115679002A (zh) | 一种牦牛Wnt7A基因CNV标记的检测方法与应用 | |
| CN112760381B (zh) | 一种检测肺腺癌预后的miRNA试剂盒 | |
| CN104164481B (zh) | Rt-pcr检测树鼩黄嘌呤脱氢酶/氧化酶基因转录水平的方法 | |
| CN113528509A (zh) | 一种用于预测胃癌免疫治疗的肿瘤微环境评分系统的构建方法以及分子探针 | |
| WO2020064006A2 (zh) | 乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群及诊断产品和应用 | |
| CN112609000A (zh) | scaRNA9基因在早期判断急性髓系白血病预后中的应用 | |
| CN109880905A (zh) | 一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因及其应用 | |
| CN111763741B (zh) | 一种用于预测乳腺癌预后的miRNA标志物及其应用 | |
| CN117809741B (zh) | 一种基于分子进化选择压预测癌症特征基因的方法与装置 | |
| CN113957145B (zh) | m6A相关lncRNA在预测小细胞肺癌预后和化疗反应的应用 | |
| CN112760383B (zh) | 应用于肺腺癌细胞亚群的一组qRT-PCR内参基因及其应用 | |
| KR101504818B1 (ko) | 위암에 대한 예후 예측 시스템 | |
| CN107164546A (zh) | miRNA、组合物及其在诊断疾病中的应用 | |
| CN115851936A (zh) | Cidec基因在制备检测乳腺癌辅助诊断或者预后制剂中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210219 |