CN109880905A - 一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组用于三阴性乳腺癌(简称TNBC)免疫组化分子分型的基因，包括：AR基因、CD8基因和FOXC1基因。本发明还公开了该组用于TNBC免疫组化分型的基因在制备TNBC分型检测试剂盒中的应用。本发明基于目前最大的TNBC多组学数据集，筛选出用于TNBC免疫组化分型的基因组合，建立了TNBC的免疫组化分型方法，并在TNBC组织样本中进行了实施和验证，结果与金标准——基于RNA测序的mRNA分子分型结果——有高度的一致性，该免疫组化分型对患者预后具有提示意义，各免疫组化亚型的TNBC具有的不同病理、分子特征，提示潜在的治疗策略。本发明弥补了通过表达谱测序进行TNBC分子分型技术复杂、价格昂贵、耗费时间、难以应用于临床等缺点，为TNBC亚型特异性治疗的临床应用提供了基础。

Description

一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因及其应用
技术领域
本发明涉及癌症分型和基因组学领域，以及免疫组化检测技术在临床上的应用。具体涉及一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因及其应用。
背景技术
三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancers,简称TNBC)，是指一类雌激素(estrogen receptor,简称ER)，孕激素受体(progesterone receptor,简称PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,简称HER2)的表达均为阴性的乳腺癌，占到全体乳腺癌的15％-20％。相比于激素受体阳性的乳腺癌患者，TNBC患者往往年龄偏大，较易发生内脏转移，有较高的术后复发风险及较差的预后。
越来越多的研究表明，TNBC是一组在病理特征、生物学行为以及基因表达层面均具有高度异质性的疾病，这使得在基础研究领域科研人员难以找到针对全体TNBC的可靠靶点，而针对全体TNBC靶向治疗的临床实验也获益甚微。因此，大量的研究致力于TNBC的分子分型以及亚型特异性的治疗靶点的发掘。近日，复旦大学附属肿瘤医院的科研人员对465例TNBC进行了多组学测序，建立了迄今为止最大的TNBC多组学数据库并利用mRNA表达谱数据进行聚类，将TNBC分为四种亚型：1)腔面雄激素受体型(luminal androgen receptor,简称LAR)，2)免疫调节型(immunomodulatory,简称IM)，3)基底样免疫抑制型(basal-likeimmune-suppressed,简称BLIS)和4)间质型(mesenchymal,简称MES)。揭示了各个亚型特征性的基因组事件，并提示各个亚型潜在的治疗方案。例如，1)LAR亚型高表达雄激素受体(androgen receptor,简称AR)，部分LAR亚型肿瘤携带ERBB2的激活突变，提示雄激素受体拮抗剂或来那替尼(不可逆的络氨酸激酶抑制剂)或许可用于该亚型TNBC的治疗。2)IM亚型具有高表达的免疫检查点分子以及高水平的肿瘤浸润淋巴细胞，提示免疫检查点抑制剂对IM型TNBC可能有较好的疗效。
尽管基于mRNA表达谱测序TNBC的分子分型可以同时揭示TNBC肿瘤的生物学特征并提示亚型特有的治疗策略，但是基因表达谱测序技术费用昂贵、技术流程复杂、批次效应大，这导致其临床应用、推广的可行性大大降低。因此我们亟需找到一种替代方法，能够在临床上简便、高效且较为准确的实现TNBC的分子分型。考虑到在全体乳腺癌中，已有用免疫组化(或荧光原位杂交)技术检测雌激素受体、雄激素受体、人表皮生长因子受体2和Ki67来将乳腺癌进行分子分型的先例，由此及彼，对于TNBC，我们也试图构建出一套基于免疫组化的分型体系，替代复杂而昂贵的表达谱测序技术，从而在临床上实现TNBC的分子分型，进而实现TNBC的个体化治疗。
目前临床上尚没有公认的TNBC免疫组化分型方案，而在科研领域，基于高通量测序以及表达谱聚类的TNBC分子分型方法，需要耗费大量的时间以及经济成本。因此，亟需一种可用于临床的TNBC分型方法，对于任意一位临床上的TNBC患者，能够简便、高效的进行TNBC分子分型，提示其基因组特点以及个体化的治疗策略。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一组三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因。
本发明要解决的技术问题之二是提供一组三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因，包括如下3个基因：AR基因、CD8基因和FOXC1基因。
作为本发明优选的技术方案，所述基因采用如下步骤筛选得到：
步骤一，对具mRNA表达谱数据的三阴性乳腺癌进行亚型间差异基因分析，鉴定各亚型高表达基因,进行差异基因初筛；
步骤二，利用癌症基因组图谱数据库的mRNA表达数据以及质谱蛋白表达数据，进行mRNA表达水平与蛋白表达水平的Pearson相关性分析；
步骤三，利用基因的mRNA表达值鉴定对应亚型的ROC分析，确定了各个亚型前十位的候选基因；
步骤四，确定了AR基因、CD8基因和FOXC1基因组合。
作为本发明优选的技术方案，步骤一中，所述亚型间差异基因分析使用R语言DESeq2包，所述差异基因初筛以Log2(Fold change)≥1.5和校正后P值<0.05为标准。
作为本发明优选的技术方案，步骤二中，所述Pearson相关性分析以相关系数≥0.5，相关性检验P值<0.05作为标准，对差异基因进行进一步的筛选和过滤。
作为本发明优选的技术方案，步骤三中，所述ROC分析利用候选基因的mRNA表达值鉴别出对应亚型的准确度，以曲线下面积AUC作为准确度的衡量标准，根据AUC大小确定各个亚型前十位的候选基因。
作为本发明优选的技术方案，所述三阴性乳腺癌免疫组化分型的方法为:
AR阳性，任意CD8和FOXC1表达：免疫组化LAR型；
AR阴性，CD8阳性，任意FOXC1表达：免疫组化IM型；
AR阴性，CD8阴性，FOXC1阳性：免疫组化BLIS型；
AR、CD8、FOXC1均为阴性：免疫组化MES型。
其中，AR阳性定义为AR阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞百分比≥10％；CD8阳性定义为CD8阳性细胞占全体细胞百分比≥20％；FOXC1阳性定义为FOXC1阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞百分比≥10％。
在本发明的另一方面，提供所述的一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因在制备三阴性乳腺癌分型检测试剂盒中的应用。
在本发明的另一方面，提供一种三阴性乳腺癌分型检测试剂盒，该试剂盒包含如下生物标志物，所述生物标志物为所述的一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因。所述生物标志物是核酸、寡核酸链、PCR引物组或者抗体。优选为抗体。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂盒在制备诊断、预后三阴性乳腺癌的制剂中的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：目前尚没有公认的针对三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancers,简称TNBC)的免疫组化分型方法，本发明基于目前最大的TNBC多组学数据集，筛选出AR,CD8和FOXC1作为TNBC免疫组化分型的基因，构建了TNBC免疫组化分型方法，并在已有的TNBC组织样本中进行了实施和验证。该免疫组化分型的结果与金标准——基于RNA测序的分子分型结果——有较高的一致性，免疫组化分型对患者预后具有提示意义，各个免疫组化亚型具有的不同病理、分子特征，并且提示潜在的治疗可能，为TNBC亚型特异性治疗的临床应用提供了基础。本发明解决了通过表达谱测序技术进行TNBC分型操作复杂，耗费时间，成本高昂，批次效应大等问题。使用mRNA表达谱测序进行分型的费用为每例患4000-5000，而使用本发明所述免疫组化分型方法每例患者仅需400-500元，且分型结果高度一致，可重复性好，非常适于临床应用和推广。
附图说明
图1是本发明实施例1中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancers,简称TNBC)免疫组化分型基因筛选的流程图。
图2是本发明实施例1中四个mRNA亚型AR、CD8A和FOXC1的mRNA表达值示意图；其中，图2A代表AR，图2B代表CD8A，图2C代表FOXC1。图2中：＊＊＊代表P<0.001；＊＊代表P<0.01；＊代表P<0.05。
图3是本发明实施例1中利用AR的mRNA表达值鉴别LAR亚型，利用CD8A的mRNA表达值鉴别IM亚型和利用FOXC1的mRNA表达值鉴别BLIS亚型的ROC曲线及对应的AUC值示意图；其中，图3A代表AR，图3B代表CD8A，图3C代表FOXC1。
图4是本发明实施例1中三个基因的蛋白表达与mRNA表达的相关关系示意图；其中，图4A代表AR，图4B代表CD8A，图4C代表FOXC1。
图5是本发明实施例1中四个mRNA亚型AR、CD8和FOXC1的免疫组化评分示意图；其中，图5A代表AR，图5B代表CD8，图5C代表FOXC1。图5中：＊＊＊代表P<0.001；＊＊代表P<0.01；＊代表P<0.05。
图6是本发明实施例1中利用AR的免疫组化评分鉴别LAR亚型，利用CD8的免疫组化评分鉴别IM亚型和利用FOXC1的评分鉴别BLIS亚型的ROC曲线及对应的AUC值示意图；其中，图6A代表AR，图6B代表CD8，图6C代表FOXC1。
图7是本发明实施例1中免疫组化标志物临界值(cutoff)选取示意图；其中，图7A代表AR，图7B代表CD8，图7C代表FOXC1。
图8是本发明实施例1和实施例2中TNBC免疫组化分型方法流程图。
图9是本发明实施例2中免疫组化分型与mRNA表达谱分型进行一致性检验的结果示意图。
图10是本发明实施例2中免疫组化分型的生存分析曲线以及时间依赖的ROC曲线。其中，图10A为免疫组化分型下四种亚型患者的无进展生存曲线；图10B为比较T分期+N分期+年龄的模型，与T分期+N分期+年龄+免疫组化分型的模型，预测患者术后复发准确度的时间依赖ROC曲线。
图11是本发明实施例2中免疫组化LAR亚型(IHC-LAR型)TNBC的分子、病理特征分析；其中，图11A显示该型TNBC的MKI67的mRNA表达水平和病理Ki-67指数较低；图11B显示该型CDKN2A缺失比例较高且CDKN2A的mRNA表达水平较低；图11C显示不同免疫组化亚型TNBC的乳腺癌内在分子分型，其中IHC-LAR型中HER2-扩增型比例显著高于其他亚型；图11D显示该型TNBC存在ERBB2通路的上调。图11A中：＊＊＊代表P<0.001；＊＊代表P<0.01；＊代表P<0.05。
图12是本发明实施例2中免疫组化IM亚型(IHC-IM型)TNBC的分子、病理特征分析；其中，图12A显示该型TNBC的间质肿瘤浸润淋巴细胞(stromal tumor-infiltratinglymphocytes,sTILs)和肿瘤内肿瘤浸润淋巴细胞(intratumoral tumor-infiltratinglymphocytes,iTILs)水平均较高；图12B显示该型TNBC免疫检查点分子和免疫刺激分子表达水平较高；图12C显示根据CD8的免疫组化染色结果定义的三种免疫表型示意图及比例；图12D显示IHC-IM型TNBC以“免疫炎症”表型为主。图12A中：＊＊＊代表P<0.001；＊＊代表P<0.01；＊代表P<0.05。
图13是本发明实施例2中免疫组化BLIS亚型(IHC-BLIS型)TNBC的分子、病理特征分析；其中，图13A显示该型同源重组修复缺陷评分(homologous recombinationdeficiency score,HRD score)较高；图13B显示该型富集BRCA突变。图13A中：＊＊＊代表P<0.001；＊＊代表P<0.01；＊代表P<0.05。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行更加具体的说明。应当理解,此处所描述的实施例是用于解释本发明,而非用于限定本发明。
实施例1三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancers,简称TNBC)免疫组化分型方法构建一、分型基因的挑选
用于TNBC免疫组化分型的基因为AR、CD8和FOXC1，具体的筛选流程包括以下步骤(详细流程见图1)：
1.基于复旦大学附属肿瘤医院360例TNBC的mRNA表达谱测序数据，以及表达谱聚类得到的mRNA分子分型结果，首先使用R语言DESeq2包进行差异基因分析，找出各亚型高表达基因,以Log2(Fold change)≥1.5和校正后P值<0.05为标准，进行了差异基因初筛(见表1-表4)。
表1.LAR亚型差异基因初筛结果
表2.IM亚型差异基因初筛结果
表3.BLIS亚型差异基因初筛结果
表4.MES亚型差异基因初筛结果
2.利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库的mRNA测序数据以及质谱蛋白表达数据，进行mRNA表达水平与蛋白表达水平的Pearson相关性分析。以相关系数≥0.5，相关性检验P值<0.05作为标准，对差异基因进行进一步的筛选和过滤。
3.最后，通过受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)方法，考察了利用候选基因的mRNA表达值鉴别出对应亚型的准确度，以曲线下面积(areaunder the curve,AUC)作为准确度的衡量标准。根据AUC大小确定了各个亚型前十位的候选基因(表5—表8)。
表5.LAR亚型AUC前十位的高表达基因
表6.IM亚型AUC前八位的高表达基因
注：经过图1所示筛选流程后，IM亚型高表达的候选基因只剩余八个。
表7.BLIS亚型AUC前十位的高表达基因
表8.MES亚型AUC前十位的高表达基因
4.对于IM型和BLIS型，AUC排名第一位的基因分别为CD8A和FOXC1(见表6和表7)，它们均被既往研究证明和乳腺癌的预后相关，且有商业化的可用于免疫组化染色的抗体以及既往研究中报道的可靠的染色结果；CD8还被证明与免疫治疗的疗效密切相关。因此他们分别被作为用于鉴别IM型和BLIS型的标志物。对于LAR型，尽管AR基因的AUC值排在LAR亚型候选基因的第五位(见表5)，但是考虑到AR已被证明是TNBC中重要的靶点，已有相应的药物上市，同时也被广泛应用于临床检测，因此我们选择了AR作为LAR型的标志物。对于MES亚型(见表8)，经过查阅了相关文献，其候选基因均极少被报道和TNBC的预后或治疗相关，并且鉴于以上三个指标已经可将TNBC分成四种亚型，我们考虑使用排除法来判定MES亚型，即以AR、CD8和FOXC1均为阴性的肿瘤来代表MES亚型。
5.基于前期表达谱测序结果，比较了AR、CD8A和FOXC1三个基因在四种亚型样本的mRNA表达水平差异，AR在LAR亚型的表达值显著高于其他亚型(见图2A)，CD8A在IM亚型的表达值显著高于其他亚型(见图2B)，FOXC1在BLIS亚型的表达值显著高于其他亚型(图2C)。
6.ROC分析结果显示，利用AR的mRNA表达值鉴别LAR亚型的AUC值为0.942(见图3A)，利用CD8A的mRNA表达值鉴别IM亚型的AUC值为0.874(见图3B)，利用FOXC1的mRNA表达值鉴别BLIS亚型的AUC值为0.895(见图3C)。
7.Pearson相关性分析结果显示，AR、CD8A和FOXC1这三个基因的蛋白表达与mRNA表达的均具有良好的相关关系。其中AR的蛋白/mRNA表达的相关系数为0.762(见图4A)，CD8A的蛋白/mRNA表达的相关系数为0.589(见图4B)，FOXC1的蛋白/mRNA表达的相关系数为0.510(见图4C)。
8.在上述360例TNBC中，选取本院保留有石蜡包埋组织的210例TNBC，进行免疫组化检测并评估AR、CD8和FOXC1的蛋白表达。对于AR和FOXC1这两个在肿瘤细胞核着色的标志物，以阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞的百分比作为免疫组化评分；对于CD8这一在免疫细胞标志物，则以CD8阳性细胞占全体细胞百分比作为免疫组化评分。进一步考察了在蛋白层面上，AR、CD8和FOXC1的免疫组化评分在四种亚型的差异，发现AR的免疫组化评分在LAR型显著高于其他亚型，CD8的免疫组化评分在IM型显著高于其他亚型，FOXC1的免疫组化评分在BLIS型显著高于其他亚型(见图5)。还考察了利用三个标志物的免疫组化评分鉴别对应亚型的能力，利用AR的免疫组化评分鉴别LAR亚型的AUC为0.932；利用CD8的免疫组化评分鉴别IM亚型的AUC为0.823；利用FOXC1的免疫组化评分鉴别BLIS亚型的AUC为0.812(见图6)。
二、分型流程的构建
1.定义AR、CD8和FOXC1免疫组化评分的界值(cutoff)
根据210例TNBC的免疫组化染色结果，以鉴别对应亚型敏感度+特异度最大化为标准(见图7)，进行如下定义：
AR阳性：AR阳性肿瘤细胞/全体肿瘤细胞≥10％
CD8阳性：CD8阳性细胞/全体细胞≥20％
FOXC1阳性：FOXC1阳性肿瘤细胞/全体肿瘤细胞≥10％
2.构建分型流程
根据利用AR、CD8及FOXC1三个分子的免疫组化评分鉴别对应亚型的准确度(AUC值)，决定其在分型流程中的先后顺序。
3.最终确定的分型方法如图8所示，即
a.AR阳性，任意CD8和FOXC1表达：免疫组化LAR型(IHC-LAR型)
b.AR阴性，CD8阳性，任意FOXC1表达：免疫组化IM型(IHC-IM型)
c.AR阴性，CD8阴性，FOXC1阳性：免疫组化BLIS型(IHC-BLIS型)
d.AR、CD8、FOXC1均为阴性：免疫组化MES型(IHC-MES型)
三、免疫组化分型所需试剂及器材
1.免疫组化抗体见表9：
表9
分子 抗体代号 公司 稀释倍数
AR ab133273 Abcam 1:200
CD8 SP57 Ventana 不稀释
FOXC1 Ab227977 Abcam 1:500
2.免疫组化实验平台
Ventana Benchmark ULTRA检测系统
实施例2免疫组化分型验证
本免疫组化分型方法已在复旦大学附属肿瘤医院的210例三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancers,简称TNBC)患者队列进行实施，验证了免疫组化分型结果与金标准——mRNA分型结果——之间的一致性及免疫组化分型的临床意义。
1.获取了210例TNBC患者手术后肿瘤组织样本，并制作了组织芯片。这210例TNBC均有通过二代测序得到的mRNA表达谱数据，以及基于mRNA数据进行k均值聚类得到的mRNA分子分型结果。
2.利用复旦大学附属肿瘤医院病理科的Ventana Benchmark ULTRA免疫组化检测系统，在组织芯片上进行AR、CD8、FOXC1的免疫组化染色。所使用的抗体分别为：AR抗体(Abcam,ab133273,1:200稀释),CD8抗体(SP57,Ventana，不稀释),和FOXC1抗体(Abcam,ab227977,1:500稀释)。
3.组织复旦大学附属肿瘤医院两位病理学专家对免疫组化染色结果进行阅片，评估每个样本每个指标的免疫组化染色评分并取平均值。
4.按照图8所示分型方法，对本实施例中210例TNBC进行免疫组化分型，具体分型方法及结果如下：AR阳性，任意CD8和FOXC1表达：免疫组化LAR型(IHC-LAR型)，共61例；AR阴性，CD8阳性，任意FOXC1表达：免疫组化IM型(IHC-IM型)，共41例；AR阴性，CD8阴性，FOXC1阳性：免疫组化BLIS型(IHC-BLIS型)，共81例；AR、CD8、FOXC1均为阴性：免疫组化MES型(IHC-MES型)，共27例。
5.将得到的免疫组化分型与表达谱聚类得到的mRNA分子分型进行一致性检验。结果如图9所示，一致性检验Cohen’s kappa指数0.647，分型的一致性达到74.8％。
6.考察免疫组化分型的预后意义
考虑到生存分析需要充足的样本数量来确保可靠性，我们在之前具有表达谱数据的210例TNBC基础上，另外构建了一个含182例TNBC的队列，采用同样的方法对这182例TNBC进行了免疫组化分型，随后将两个队列合并构成成了一个含有392例TNBC的大队列，进行生存分析。结果发现在免疫组化分析下，四种亚型无复发生存(relapse-free survival,RFS)差异显著(log-rank P＝0.004)(图10A)，IHC-IM型与IHC-LAR型TNBC患者的RFS要显著好于IHC-BLIS型和IHC-MES型患者。另外，利用时间依赖的ROC曲线以及Cox回归模型方法，比较了仅纳入传统预后因子即T分期+N分期+年龄的模型，与传统预后因子结合免疫组化分型即T分期+N分期+年龄+免疫组化分型的模型预测患者术后复发的准确度，以时间依赖的ROC曲线下面积作为预测准确度的衡量标准，结果显示传统预后因子结合免疫组化分型的模型其预测准确度明显优于仅包含传统预后因子的模型(图10B)
7.考察各免疫组化亚型的病理、分子特点及对治疗的潜在提示意义
7.1免疫组化LAR亚型(IHC-LAR型)：IHC-LAR型TNBC的Ki67表达较低(见图11A)；CDKN2A缺失显著高于其他亚型(见图11B)；考察TNBC的乳腺癌内在分子分型，IHC-LAR型TNBC的内在分子分型有接近半数为HER2-扩增型，而其他免疫组化亚型则以basal-like型为主(见图11C)；IHC-LAR型TNBC存在ERBB2通路的激活(见图11D)。
以上结果提示，IHC-LAR亚型TNBC，可能对化疗敏感度较低，但可能对CDK4/6抑制剂较为敏感；并且尽管临床HER2检测为阴性，ERBB2通路仍有可能作为该型TNBC的治疗靶点。
7.2免疫组化IM亚型(IHC-IM型)：IHC-IM型肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocyte)水平较高(见图12A)；免疫检查点分子及免疫刺激分子的mRNA表达水平较高(见图12B)；根据CD8的免疫组化染色可将TNBC分成三种免疫表型：a.免疫荒漠型(定义为肿瘤实质中CD8阳性细胞比例<10％,癌巢周围间质中CD8阳性细胞比例<30％)，b.免疫排斥型(肿瘤实质中CD8阳性细胞比例<10％,癌巢周围间质中CD8阳性细胞比例≥30％)和c.免疫炎症型(肿瘤实质中CD8阳性细胞比例≥10％)(见图12C)；IHC-IM型TNBC以免疫炎症型为主，其他免疫组化亚型则以免疫排斥型为主(见图12D)。
以上结果提示，IHC-IM亚型TNBC患者更有可能从免疫检查点抑制剂治疗中获益。
7.3免疫组化BLIS亚型(IHC-BLIS型)：IHC-BLIS型TNBC同源重组缺陷评分(homologous recombination deficiency scores,HRD score)较高(见图13A)，并且富集BRCA突变(见图13B)。
以上结果提示，IHC-BLIS亚型TNBC可能对PARP抑制剂、铂类等DNA损伤药物较为敏感。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因，其特征在于，包括如下3个基因：AR基因、CD8基因和FOXC1基因。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因采用如下步骤筛选得到：
步骤一，对具有mRNA表达谱数据的三阴性乳腺癌进行亚型间差异基因分析，鉴定各亚型高表达基因,完成差异基因初筛；
步骤二，利用癌症基因组图谱数据库的mRNA表达数据以及质谱蛋白表达数据，进行mRNA表达水平与蛋白表达水平的Pearson相关性分析；
步骤三，利用基因的mRNA表达值鉴定对应亚型的ROC分析，确定各个亚型前十位的基因；
步骤四，确定了AR基因、CD8基因和FOXC1基因组合。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，步骤一中，所述亚型间差异基因分析使用R语言DESeq2包，所述差异基因初筛以Log2(Fold change)≥1.5和校正后P值<0.05为标准。
4.如权利要求2所述的基因，其特征在于，步骤二中，所述Pearson相关性分析以相关系数≥0.5，相关性检验P值<0.05作为标准，对差异基因进行进一步的筛选和过滤。
5.如权利要求2所述的基因，其特征在于，步骤三中，所述ROC分析利用候选基因的mRNA表达值鉴别出对应亚型的准确度，以曲线下面积AUC作为准确度的衡量标准，根据AUC大小确定各个亚型前十位的候选基因。
6.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述三阴性乳腺癌免疫组化分型的方法为:
AR阳性，任意CD8和FOXC1表达：免疫组化LAR型；
AR阴性，CD8阳性，任意FOXC1表达：免疫组化IM型；
AR阴性，CD8阴性，FOXC1阳性：免疫组化BLIS型；
AR、CD8、FOXC1均为阴性：免疫组化MES型；
其中，AR阳性定义为AR阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞百分比≥10％；CD8阳性定义为CD8阳性细胞占全体细胞百分比≥20％；FOXC1阳性定义为FOXC1阳性肿瘤细胞占全体肿瘤细胞百分比≥10％。
7.如权利要求1-6任一项所述的一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因在制备三阴性乳腺癌分型检测试剂盒中的应用。
8.一种三阴性乳腺癌分型检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含如下生物标志物，所述生物标志物为如权利要求1-6任一项所述的一组用于三阴性乳腺癌免疫组化分型的基因。
9.如权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述生物标志物是核酸、寡核酸链、PCR引物组或者抗体。
10.如权利要求8或9所述的试剂盒在制备诊断、预后三阴性乳腺癌的制剂中的用途。
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