JP2008539737A - 遺伝子に基づくアルゴリズム的ガン予後 - Google Patents

Abstract

本発明は、腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を測定すること、及び数値によるリスクスコアを得るために遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）又は再発スコア（ＲＳ）を適用することによる、腫瘍サンプルにおける予後決定のための方法及びシステムに関する。
【選択図】 図１ａ

Description

本発明は、ガン予後を改善するための新しい方法及びツールに関連する。

マイクロアレイプロファイリング、すなわち、数百及び数千の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの評価は、ガンがいくつかの遺伝子の発現レベルによって異なった分子的サブグループに分けられることを示している。これらのサブグループは異なった臨床結果を有すると思われ、また、ガンの治療において使用される種々の治療剤に対して差次的応答を有する場合がある。しかし、その根本的な生物学の現在の理解では特定のガン患者の介護の「個別化」ができない。結果として、例えば、乳ガンについては、多くの女性には、今日、全身的治療（例えば、化学療法又は内分泌治療など）が、最初の診断後に再発し得る乳ガンの危険性を低下させようとして与えられる。残念ながら、この全身的治療は、再発する少数の女性に利益をもたらすだけであり、従って、多くの女性を不必要かつ潜在的には毒性の治療にさらしている。マイクロアレイ技術を使用して開発された様々な新しい予後ツールは、患者個々に合わせた乳ガン患者の治療が容易になることを可能にすることにおいて可能性を示している（Ｐａｉｋ他、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３５１：２７（２００４）；Ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３４７：１９９（２００２）；Ｗａｎｇ他、Ｌａｎｃｅｔ、３６５：６７１（２００５））。これらのゲノムツールは、現在使用されている臨床的方法を上回る、より必要とされる改善であり得る。

乳ガンの組織学的悪性度分類はこれまで長い間、重要な臨床的予後情報を提供することが認められている（１）。しかしながら、腫瘍の悪性度を乳ガンにおける予後因子として使用するための米国病理医協会による勧告（２）にもかかわらず、ガンに関するアメリカ合同委員会（ＡＪＣＣ）を満足させる最近の胸部対策委員会は、施設間における克服できない不一致及びデータの不足を示して、その病期判断基準に腫瘍悪性度の使用を含めなかった（３）。これは、部分的には、観測者間のばらつき及び使用された様々な悪性度分類法に関連づけることができ、これらにより、施設の間での再現性の不良が生じている。標準化された方法（例えば、Ｅｌｓｔｏｎ及びＥｌｌｉｓ（１）によって開発された方法など）の出現により、施設間の一致が改善されている。それにもかかわらず、悪性度１（低リスク）及び悪性度３（高リスク）は異なる予後に明らかに関連する一方で、中間の悪性度として分類された腫瘍は、それらの生存プロファイルが集団全体（悪性度が分類されていない集団）の生存プロファイルと異なっておらず、また、それらの割合が大きい（４０％〜５０％）ために、治療のための臨床的意志決定に困難をもたらしている。より正確な悪性度分類システムがあれば、より良好な予後判定、及び、さらなる乳ガン治療についての女性の改善された選択が可能となるであろう。

今日、診断された乳ガンの大部分はホルモン応答性である。タモキシフェンが、これらの患者の補助的治療において、今日処方される最も一般的な抗エストロゲン剤である。それにもかかわらず、タモキシフェンがこの状況で与えられたとき、これらの患者の４０％までが再発する。現在では、補助的状況でのタモキシフェンの代わりに、あるいは、補助的状況でのタモキシフェンとの組合せ又は連続でのアロマターゼ阻害剤の使用を評価するいくつかの大規模な治験の肯定的な結果のために、多くの選択肢が、ホルモン応答性乳ガンを有する閉経後の女性については利用可能である。さらに、アロマターゼ阻害剤の使用の長期間にわたる健康上の損害が不明であることを考えた場合には特に、どの治療選択肢が最も良いかは不明である。タモキシフェンが与えられたときの再発の高リスク群を特定することができることは、タモキシフェンがおそらくは最良の選択肢でない患者を特定することの一助となり得る。その場合、これらの患者は明確に、代わりの治療方針のための対象となり得る。

補助的なタモキシフェンにより治療された女性について再発を予測するという問題に特に関連して、臨床結果を予測することができる数組の遺伝子を主張する２つの刊行物が報告されている（Ｍａ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、５：６０７（２００４）、Ｊａｎｓｅｎ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２３：７３２（２００５）。これらの研究では、少人数の患者が関わっていた。従って、これらの研究は、広く臨床的に使用されることが完全には証明されていない。

従って、予後を正確に評価することができ、従って、腫瘍医が個々のガン患者についてその治療決定を患者個々に合わせて調節することを助けることができる方法及びシステムが求められている。特に、乳ガン患者に向けられた方法及びシステムが求められている。

本発明は、最新式の方法の欠点を示さない、ガン予後を改善するための新しい方法及びツールを提供することを目的とする。

本発明の１つの実施形態では、下記の工程を含む方法が提供される：
（ａ）分析に付され、かつ、哺乳動物対象（好ましくは、ヒト患者）から得られた腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を測定する工程；
（ｂ）腫瘍サンプルの遺伝子発現悪性度指数（又はゲノム的悪性度）（ＧＧＩ）を、下記の式を使用して計算する工程：
式中、ｘはｍＲＮＡの遺伝子発現レベルであり、Ｇ_１及びＧ_３は、組織学的悪性度１（ＨＧ１）及び組織学的悪性度（ＨＧ３）においてそれぞれアップレギュレーションされる遺伝子のセットであり、ｊはプローブ又はプローブセットを示す。

腫瘍サンプルは、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマ又は脳ガンからなる群から選択されるガンによって冒された組織に由来し得る。好ましくは、腫瘍サンプルは組織学的悪性度２の乳腫瘍サンプルである。

この実施形態はさらに、腫瘍サンプルを遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）に基づいて低リスク（ＧＧ１）又は高リスク（ＧＧ３）として示すことを含むことができる。この実施形態はさらに、分析に付された乳腫瘍サンプルの低リスク又は高リスクの呼称と一致する患者に乳ガン治療療法を提供することを含むことができる。

遺伝子発現悪性度指数ＧＧＩは、ＨＧ１事例の平均ＧＧＩが約−１であり、かつ、ＨＧ３事例の平均ＧＧＩが約＋１であるように選ばれたカットオフ値及びスケール値を含むことができる。カットオフ値は、下記の異なるスケールを適用する異なるプラットホームから得られたデータを校正するために要求される：

Ｇ_１遺伝子セットは、「悪性度１の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含むことができる。好ましくは、Ｇ_１遺伝子セットはそのような遺伝子の少なくとも４つを含み、また、このセット全体を含むことができる。Ｇ_３遺伝子セットは、「悪性度３の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含むことができる。好ましくは、Ｇ_３遺伝子セットはそのような遺伝子の少なくとも４つを含み、また、このセット全体を含むことができる。

本発明の別の局面において、本発明による方法は下記の工程を含む：
（ａ）腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を測定する工程；
（ｂ）腫瘍サンプルについての再発スコア（ＲＳ）を、下記の式を使用して計算する工程：
式中、Ｇは、ガンの遠位再発に関連する遺伝子セットであり、Ｐ_ｉはプローブ又はプローブセットであり、ｉは遺伝子の特定のクラスター又は群を特定し、ｗ_ｉはクラスターｉの重みであり、ｊは特定のプローブセットの値であり、ｘ_ｉｊはクラスターｉにおけるプローブセットｊの強度であり、ｎ_ｉはクラスターｉにおけるプローブセットの数である。

この実施形態はさらに、前記腫瘍サンプルを、再発スコアに基づいて、ガンの再発について低リスク又は高リスクとして分類する工程を含むことができる。低リスクを高リスクから区別するためのカットオフは、−１００から＋１００までの再発スコア（ＲＳ）、又は、−１０から＋１０までの再発スコア（ＲＳ）とすることができる。再発は、当業者によって使用されるタモキシフェン又は他の化学療法、内分泌治療、抗体治療又は任意の他の治療方法による治療の後での再発であり得る。好ましくは、再発は、タモキシフェンによる治療の後である。

腫瘍サンプルは、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマ又は脳ガンからなる群から選択されるガンによって冒された組織に由来し得る。好ましくは、腫瘍サンプルは乳腫瘍サンプルである。

患者の治療療法を腫瘍サンプルのガン再発リスク状態に基づいて調節することができる。例えば、（ａ）患者が低リスクとして分類されるならば、低リスク患者を続いてタモキシフェン及び逐次アロマターゼ阻害剤（ＡＩ）により治療するか、又は、（ｂ）患者が高リスクとして分類されるならば、高リスク患者をタモキシフェン以外の代わりの内分泌治療により治療する。高リスクとして分類された患者については、患者の治療療法を、化学療法による治療に、又は、特異的な分子的に標的化された抗ガン治療に調節することができる。

遺伝子セットはエストロゲン受容体（又はガン組織サンプルの特異的な別のマーカー）陽性集団から作製することができる。遺伝子セットは様々な方法によって作製することができ、その構成遺伝子は、患者集団及び特定の障害に依存して変化し得る。

本発明の別の実施形態は、コンピューター化されたシステム又は診断デバイス（又はキット）を提供し、これは、（ａ）腫瘍サンプルについての遺伝子発現を遺伝子セットに基づいて検出するために構成されたバイオアッセイモジュール（好ましくは、バイオアレイ）；及び（ｂ）腫瘍サンプルのＧＧＩ又はＲＳを遺伝子発現に基づいて計算し、かつ、乳腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらすために構成されたプロセッサーモジュールを含む。バイオアッセイモジュールは、遺伝子セットを含む少なくとも１つの遺伝子チップ（マイクロアレイ）を含むことができる。遺伝子セットは、「悪性度１の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子（好ましくは、少なくとも４つの遺伝子）を含むことができ、又は、セット全体を含むことができる。遺伝子は、「悪性度３の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも４つの遺伝子を含むことができ、又は、セット全体を含むことができる。

図面の簡単な記述
図１は、訓練用セット（パネルａ）及び妥当性確認用セット（パネルｂ）における遺伝子発現のパターンを示すヒートマップである。水平軸は、最初にＨＧによって、次いで二次基準としてのＧＧＩによって区分された腫瘍に対応する。垂直軸は遺伝子に対応する。各腫瘍のＧＧＩ値及び無再発生存が下に示される。２つの遺伝子群が見出される：悪性度１において高発現である遺伝子（１６個のプローブセット；赤色で強調される）、及び、逆に、悪性度３において高発現である遺伝子（１１２個のプローブセット）。ＨＧ２腫瘍についてのＧＧＩ値はＨＧ１及びＨＧ３についての値の範囲を含み、大きいＧＧＩを有する腫瘍は、より早く再発する傾向がある（赤色のドット）。

図２は、妥当性確認用データセット２〜５（表１１）からプールされたデータについて、ＨＧに基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（パネルａ）、及び、ＧＧに基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（パネルｂ）を示す。ＨＧ１、ＨＧ２及びＨＧ３は、ＧＧによって低リスク及び高リスクのサブセットにさらに分けることができ、これは、ＧＧが、ＨＧを上回る改善であることを示す（それぞれ、パネルｃ、パネルｄ及びパネルｅ）。ＥＲの状態により、すべてではないが、予後が不良である患者の一部が特定される（パネルｆ）。

図３は、ＮＰＩ分類に基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（ａ）、及び、ＮＰＩ−ＧＧ分類に基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（ｂ）を示す。ＮＰＩ−ＧＧは予後の識別を低リスクＮＰＩサブセット（パネルｃ）及び高リスクＮＰＩサブセット（パネルｄ）の両方で改善するが、逆に、ＮＰＩは予後の識別を低リスクＮＰＩ−ＧＧサブセット（パネルｅ）及び高リスクＮＰＩ−ＧＧサブセット（パネルｆ）の両方で改善しない。Ｓｏｒｌｉｅ他のデータセットは、腫瘍サイズの情報が不完全であるために、この分析から除外された。

図４は、ＧＧ１及びＧＧ３に分けられたＨＧ２患者について危険率についてのフォレストプロットを示し、異なるデータセットおける一致した結果を示している。危険率がコックス比例ハザード回帰により推定され、水平線は危険率についての９５％信頼区間である。Ｐ値がログランク検定によって求められた。

図５は、Ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他の妥当性確認研究からのデータについて、７０個の遺伝子の発現特性に基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（左列、パネルａ、パネルｃ及びパネルｅ）、及び、ＧＧＩに基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（右列、パネルｂ、パネルｄ及びパネルｆ）を示す。ａ）及びｂ）はすべてが患者であり、ｃ）及びｄ）はリンパ節転移陰性の患者であり、ｅ）及びｆ）はリンパ節転移陽性の患者である。リンパ節転移陰性サブセットには、７０個の遺伝子の特性を得るために使用された患者が含まれることには留意すること。

図６は、以前に報告された分子的サブタイプに適用されたゲノム的悪性度を表す。

図７は、ＧＧＩ（高対低）について遠位転移非存在生存についてのカプラン・マイヤー生存曲線を表す。

定義
ほとんどの科学用語、医学用語及び技術用語が、当業者には一般に理解される。

用語「マイクロアレイ」は、基体（不溶性の固体支持体）上のハイブリダイゼーション可能なアレイ要素（好ましくは、ポリヌクレオチドプローブ）の整列した配置を示す。

用語「差次的に発現した遺伝子」、用語「差次的遺伝子発現」及びそれらの同義語（これらは交換可能に使用される）は、遺伝子の発現が、正常な対象又はコントロールの対象におけるその発現と比較して、疾患（特に、ガン、例えば、乳ガンなど）に罹患している対象において高レベル側又は低レベル側に活性化される遺伝子を示す。これらの用語にはまた、遺伝子の発現が同じ疾患の異なる段階で高レベル側又は低レベル側に活性化される遺伝子が含まれる。差次的に発現した遺伝子は核酸レベル又はタンパク質レベルでの活性化又は阻害のどちらかを受け得るか、あるいは、異なるポリペプチド生成物をもたらすために選択的スプライシングを受け得ることもまた理解される。そのような違いは、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌又は他の分配における変化によって明瞭に示すことができる。差次的遺伝子発現には、正常な対象と、疾患（特に、ガン）に罹患している対象との間で異なるか、又は、同じ疾患の様々な段階の間で異なる２つ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物の間における発現の比較、あるいは、正常な対象と、疾患（特に、ガン）に罹患している対象との間で異なるか、又は、同じ疾患の様々な段階の間で異なる２つ以上の遺伝子又はそれらの遺伝子産物の間における発現比率の比較、あるいは、正常な対象と、疾患（特に、ガン）に罹患している対象との間で異なるか、又は、同じ疾患の様々な段階の間で異なる、同じ遺伝子の２つの異なってプロセシングされた産物の比較さえ含むことができる。差次的発現には、例えば、正常な細胞及び疾患細胞の間での、あるいは、異なる疾患事象又は疾患段階を受けている細胞の間での遺伝子又はその発現産物における時間的発現パターン又は細胞発現パターンでの量的な差及び質的な差の両方が含まれる。本発明の目的のために、「差次的遺伝子発現」は、少なくとも約２倍（好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍）の差が、正常な対象及び疾患を有する対象における所与遺伝子の発現の間で、又は、疾患を有する対象における疾患発達の様々な段階で存在するときに存在すると見なされる。

遺伝子発現プロファイリング：これには、生物学的サンプルにおけるｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベルを定量するすべての方法が含まれる。
用語「予後」は、新生物疾患（例えば、乳ガン）の、ガンに起因し得る死亡又は進行（再発、転移拡大及び薬物抵抗性を含む）の可能性の予測を示すために本明細書中では使用される。

用語「予測」は、患者が、ある薬物又は１組の薬物に対して、好ましいか、又は好ましくないかのいずれかで応答する可能性、及び、同様に、そのような応答の程度を示すために、あるいは、患者が、原発性腫瘍の手術による除去、及び／又は、ガンの再発を伴わない一定の期間にわたる化学療法の後で生存する可能性を示すために本明細書中では使用される。本発明の予測方法は、患者が治療療法（例えば、所与の薬物又は薬物組合せによる化学療法、及び／又は、放射線治療など）に都合よく応答する可能性があるかを予測する際の、あるいは、手術後、及び／又は、化学療法もしくは他の治療様式の終了後、患者の長期生存が可能であるかどうかを予測する際の有益なツールである。

用語「高リスク」は、患者が遠位再発を５年未満（好ましくは３年未満）で有することが予想されることを意味する。

用語「低リスク」は、患者が遠位再発を５年後（好ましくは３年未満）に有することが予想されることを意味する。

本明細書中で使用される用語「腫瘍」は、悪性又は良性であろうとも、新生物によるすべての細胞成長及び細胞増殖、ならびに、すべての前ガン性及びガン性の細胞及び組織を示す。

用語「ガン」及び用語「ガン性」は、調節されない細胞成長によって典型的には特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態を示すか、又は記述する。ガンの例には、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマ又は脳ガンが含まれるが、これらに限定されない。

処理前の「ＧＧＩ」（遺伝子発現悪性度指数）は、ＨＧ３において高いすべての遺伝子の対数発現（又は対数比率）の和から、ＨＧ１において高いすべての遺伝子の対数発現（又は対数比率）の和を引いたものであり、下記のように書くことができる：
式中、
ｘはｍＲＮＡの遺伝子発現レベルであり、

Ｇ_１及びＧ_３は、Ｈ１及びＨＧ３においてそれぞれアップレギュレーションされた遺伝子のセットであり、ｊはプローブ又はプローブセットを示す。

ＧＧＩは、ＨＧ１事例の平均ＧＧＩが約−１であり、かつ、ＨＧ３事例の平均ＧＧＩが約＋１であるように選ばれたカットオフ値及びスケール値を含むことができる：
ＧＧＩにおけるカットオフは０であり、平均の平均に対応する。
ＧＧＩは値において−４から＋４までの範囲を有する。

実施例１
悪性度指数（ＧＧＩ）を開発するための材料及び方法
患者の人口統計
原発性乳ガンの６つのデータベースを使用した。そのうちの４つが公開されていた（表１１）（４、５、１０、１１）。どの患者も補助的な化学療法を受けておらず、一部の患者が補助的なタモキシフェン治療を受けていた。組織学的悪性度（ＨＧ）はＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓの悪性度分類システムに基づいていた。それぞれの施設内倫理委員会が組織材料の使用を承認した。

オックスフォードからのサンプルをＪｕｌｅｓ Ｂｏｒｄｅｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ブリュッセル、ベルギー）で処理し、スウェーデンからのサンプルをＧｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）で処理した。ＲＮＡ抽出、増幅、ハイブリダイゼーション及び走査を、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）。ＣＥＬファイルからの遺伝子発現値を、ＲＭＡ（１２）を使用して正規化した。

デフォルト選択（バックグラウンド補正及び分位点正規化を伴う）を使用した。出力は対数スケールであった。

正規化を異なる施設及び測定バッチからの．ＣＥＬファイルについて別々に行った。その後の分析において、発現データ行列を、それらが別個の研究の「ブロック」であったかのように取り扱った。訓練用セットＫＪＸ６４は、（２つの異なる施設に対応する）２つのブロックからなり、妥当性確認用セットＫＪ１２９も２つのブロックからなった。

ＳＴＮＯ スタンフォード／ノルウェーのデータセット（Ｓｏｒｌｉｅ他、２００１）をｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｂｒｅａｓｔ．ｃａｎｃｅｒ／ｍｏｐｏ．ｃｌｉｎｉｃａｌ／ｄａｔｅ．ｓｈｔｍｌからダウンロードした。

これは８５個のアレイからなり、いくつかの異なるチップ設計を有する。すべてに対して共通するプローブのみを使用した。使用された遺伝子発現値はアレイのデータファイルにおけるＬＯＧ ＲＡＴ２Ｎ ＭＥＡＮの欄からのものである。さらなる変換は、ＧＧＩをコンピューター処理する前には適用されていない。２つ以上のスポットが１つのプローブに対応するときには、それらの平均値を使用した。

８５名すべての患者がヒートマップにおいて使用されたが、欠落がなく、かつ、経過観察時間がゼロでない患者のみが生存分析において使用された。このデータセットは、腫瘍サイズを伴う分析からは除外された。この情報が得られなかったからである（ＴＮＭカテゴリーのみが与えられたが、ＮＰＩ式について適切であるものに関係するときには特に、腫瘍サイズへの変換は直接的ではない）。

ＮＫＩ／ＮＫＩ２ データセットＮＫＩ（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ他、２００２）及びデータセットＮＫＩ２（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他、２００２）をＲｏｓｅｔｔａのウエブサイト（ｗｗｗ．ｒｉｉ．ｃｏｍ）からダウンロードした。対数比率を、さらに変換することなく使用した。ＮＫＩ２については、フラグ化（ｆｌａｇｇｅｄ）発現値は欠失していると見なされた。年齢、腫瘍サイズ及び組織学的悪性度がＮＫＩ２については得られなかった。

臨床データの表における「ｃｏｎｓｅｒｖＦｌａｇ」の欄を使用して、データセットを２つの群に階層化した。それぞれの群は、ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他（２００２）における元の結果においてなされたように、「良好」対「不良」の予後を決定するためのそれ自身の閾値を有していた。

ＮＣＩ Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他（２００３）からのこのデータセットをＰＮＡＳのウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｎａｓ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／１７３２９１２１００／ＤＣ１）からダウンロードした。発現値を修正しなかった。

統計学的分析
遺伝子の選択を、すべてがエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性であり、ＨＧ１又はＨＧ３のいずれかであるＫＪＸ６４データセットにだけ基づいて行った。データセットＫＪ１２９（４３のＥＲ陰性、すべてがリンパ節転移陰性で、全身的治療がない）を、他の以前に発表されたデータ（表１１を参照のこと）と一緒に妥当性確認用セットとして使用した。ＥＲ状態及び悪性度は独立しておらず、ＥＲ陰性のＨＧ１腫瘍がほとんどなかったので、ＥＲ陽性腫瘍を訓練用セットのために使用した。すべてのＨＧ１腫瘍及びＨＧ３腫瘍をＥＲ状態にかかわらず使用することは、偽の関連性をもたらしていると考えられる。

Ｈｅｄｇｅｓ及びＯｌｋｉｎ（１３）の標準化された平均差を、ＨＧ１又はＨＧ３に関して差のあるそれらの発現に基づいて遺伝子をランク付けするために使用した。このメタ分析スコアはｔ−統計学と類似するが、２つの異なる施設に由来するアレイデータからなる本発明者らの訓練用セットにはより良好に適する。

多重検定を制御するために、Ｗｅｓｔｆａｌｌ及びＹｏｕｎｇ（１４）のｍａｘＴアルゴリズムを、Ｋｏｒｎ他（１５）によって提案された拡張とともに、偽発見カウント（ＦＤＣ）をコンピューター計算するために適用した。２２２８３個のプローブセットのすべてを検討した。０．０５未満のファミリー様エラー率ｐ値をＦＤＣ＞２とともに有するプローブセットを特定した。プラットホーム間のプローブのマッピングをＰｒａｚ他（１６）における方法に従ってＵｎｉｇｅｎｅ（ビルド＃１８０）によって行った。

遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）は下記のように定義される：
式中、ｘは遺伝子発現測定値の対数であり、Ｇ_１及びＧ_３は、ＨＧ１及びＨＧ３においてそれぞれアップレギュレーションされた遺伝子のセットである。これらの遺伝子セットはプラットホームごとに異なった。便宜上、カットオフ及びスケールは、ＨＧ１事例の平均ＧＧＩが約−１であり、ＨＧ３事例の平均ＧＧＩが約＋１であるように選ばれた。この再スケール化をそれぞれのデータ源について別々に行った。

Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ（ＮＰＩ）をＴｏｄｄ他（１７）に従って計算した：
ＮＰＩ＝０．２ｘサイズ［ｃｍ］＋リンパ節状態＋組織学的悪性度。

ＮＰＩ／ＧＧと呼ばれる指数を定義した。この場合、ＨＧがＧＧによって置き換えられた。ＮＰＩ及びＮＰＩ／ＧＧの両方で高リスクであるためにＮＰＩ≧３．４を有する事例を検討した。生存データを、カプラン・マイヤープロットを使用して可視化した。危険率（ＨＲ）を、コックス回帰を使用して推定し、データ源によって階層化した。仮定を用いない比較を、階層化ログランク検定を使用して行った。

ヒートマップ
可視化において、それぞれのプローブについてヒートマップで使用された値は、患者全体における中央平均であった。遺伝子特異的なスケール化（標準化）は、すべてのプローブの相対的なシグナル強度に関する情報を保つために何ら行われなかった。色調を、飽和した赤色及び緑色にはマトリックス全体の発現値の標準偏差の３倍の値で達するように校正した。スケール化されたＧＧＩ値は遺伝子特異的な中心化によって影響を受けなかったことに留意すること。

生存分析
Ｒについての生存パッケージが、Ｔｅｒｒｙ Ｔｈｅｒｎｅａｕと、カプラン・マイヤープロットのための特注プログラムとによって使用され、これを正確性について生存パッケージの出力に対して調べた。

マイクロアレイプラットホーム全体でのマッピング
Ｐｒａｚ他（２００４）に記載されたＣｌｅａｎＥｘデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｅａｎｅｘ．ｉｓｂｓｉｄ．ｃｈ）の方法を使用した。プローブと同じものを最初に配列アクセション番号にマッピングした。その後、Ｕｎｉｇｅｎｅ（ビルド１８０）が、プラットホーム間の対応をマッピングするために使用した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップについては、２つ以上のＵｎｉｇｅｎｅ ｉｄに曖昧にマッピングされたオリゴを含有するプローブセットを除外した。

結果
高悪性度サブセット及び低悪性度サブセットの間で差次的に発現した遺伝子
０．０５のファミリー様エラー率ｐ値（これは０．００８の低い偽発見割合に対応する）で、ＦＤＣが２を超える１８３個の特有の遺伝子に対応する２４２のプローブセットが特定された（表３）。これらの中で、より控えめな基準（０．０５のｐ値で、０を超えるＦＤＣ）に基づいた１２８のプローブセット（９７遺伝子）からなる一覧を、他者によって発表された特性を有する共通した遺伝子を調べる場合（この場合には、１８３遺伝子の一覧が使用された）を除いて、すべてのその後の分析において使用した。

図１ａは、ＨＧ１及びＨＧ３と明確に関連する発現の強いパターン及び逆パターンの２つを示す。ＨＧ３においてアップレギュレーションされた多くの遺伝子は大部分が細胞周期の進行及び細胞増殖と非常に関連していた（表３）。ＨＧ２腫瘍を、ＨＧ１腫瘍及びＨＧ３腫瘍を組み合わせるプールと対比するための同じ遺伝子選択アルゴリズムを適用した。これは、差次的に発現した遺伝子を何らもたらさなかった。従って、全体としてＨＧ２集団は、ＨＧ１及びＨＧ３の区別とは無関係であるそれ自身の独特の特徴を何ら有していない。

その後、１２８のプローブセットからなる一覧を、治療されていない乳ガン患者（データセットＫＪ１２９）に適用した。図１ｂに示されるように、目視検査により、訓練用セットに関して観測された発現パターン（図１ａ）に類似する、ＨＧ１及びＨＧ３についての発現パターンが明らかにされた。悪性度２の集団のＧＥＰは、これら２つの間での中間ではなく、むしろ、悪性度１事例及び悪性度３事例の混合物と似ているようであった。この観察結果をより客観的にするために、ＧＧＩ（これにより本質的には、報告されている遺伝子のＧＥＰにおける差が、それらの発現レベルを平均化することによってまとめられる）を定義した。図１においてヒートマップの下に示されるように、ＨＧ２のＧＧＩ分布はＨＧ１及びＨＧ３のＧＧＩ値の範囲を含んでおり、これにより、目視による印象が確認された。類似する観察結果が、臨床的集団及びマイクロアレイプラットホームにおける違いにもかかわらず、３つの以前に発表されたデータセットに対してなされた（図６ａ、図６ｂ及び図６ｃを参照のこと）。

組織学的悪性度、遺伝子発現悪性度（ＧＧ）及び予後
これらの発見により、中間的な組織学的悪性度が、遺伝子発現に基づく低悪性度及び高悪性度によって置き換えられ得ることが結果として示される。ＧＧスコアに基づく遺伝子発現悪性度（ＧＧ）を定義した。患者を、そのＧＧＩ値が負であるならば、ＧＧ１（低悪性度）として分類し、そうでない場合にはＧＧ３（高悪性度）として分類した。ゼロのＧＧＩスコアはＨＧ１の平均ＧＧＩ値とＨＧ３の平均ＧＧＩ値との間における中間点に対応することに留意しなければならない（方法を参照のこと）。この選択は、臨床的には最適でないかもしれず、また、治療費用とリスクとの間でのかね合いに基づいて改善することができるが、ＧＧＩの予後値を評価するためには十分であると考えられる。

この目的のために、本発明者らの妥当性評価集団のプール（ＫＪ１２９）、ならびに、さらなるデータベースのＳＴＮＯ、ＮＣＩ及びＮＫＩ（表１１）に由来する乳ガンサンプルを使用した。図２ａにおいて、組織学的悪性度と、無再発生存（ＲＦＳ）との間での関連を調べた。予想されたように、ＨＧ３腫瘍はＨＧ１よりも著しく悪いＲＦＳを有し、一方、ＨＧ２腫瘍は中間的なリスクを有し、集団の３８％を構成していた。図２ｂにおいて、ＧＧ１サブグループ及びＧＧ３サブグループは異なったＲＦＳを示し、ＨＧ１腫瘍及びＨＧ３腫瘍のＲＦＳとそれぞれ類似していた。ＧＧと、ＨＧとの間における不一致が予後に対してどのように関連づけられるかを調べるために、ＧＧを組織学的カテゴリーのそれぞれについて分けた（図２ｃ、図２ｄ及び図２ｅ）。最も際立った結果は、ＧＧにより、ＨＧ２が２つの群に、すなわち、ＨＧ２／ＧＧ１及びＨＧ２／ＧＧ３に分けられ、それらのＲＦＳもまた、ＨＧ１及びＨＧ３のＲＦＳにそれぞれ類似していたことであった（図２ｄ）。ログランク検定では、生存における何らかの重要な違いを、ＨＧ１と、ＨＧ２／ＧＧ１との間で、ならびに、ＨＧ３と、ＨＧ２／ＧＧ３との間で明らかにすることができなかった（図７を参照のこと）。比較のために、ＥＲ状態もまた、ＨＧ２腫瘍における予後能力を有していた（図２ｆ）。だが、危険率はＧＧの危険率よりも小さかった（図２ｄ）。特に、ＥＲ陽性群は集団全体として類似するＲＦＳを示した。

ＧＧは、予後が不良である一部の患者をＨＧ１集団において分類することによってＨＧよりも良好であった（図２ｃ）一方で、逆のことがＨＧ３集団において当てはまると思われる：ＧＧにより、それらの不良な予後にもかかわらず、一部の患者が低リスクと分類された（図２ｄ）。従って、低悪性度及び高悪性度のカテゴリーを伴う不一致の場合、ＧＧ又はＨＧはどちらも、一貫して他者よりも優れていなかった。どちらかが、高悪性度として分類するために決定されたとしても、それは予後的にはより正確である傾向があると考えられる。これは、ＨＧ及びＧＧの両方について、高悪性度の何らかの徴候を正しく検出することが、そのような徴候が存在しないと正確に断言することよりも容易であったことを示唆する。この観察結果が将来の研究によって確認されるならば、修正が、例えば、ＨＧ３ではなく、ＨＧ１及びＨＧ２をＧＧによって代用する規則を使用することによって、臨床実務においてなされるはずである。しかしながら、この場合に使用されたデータにおけるこのタイプの不一致の頻度は比較的小さく、また、そのような変更は、ＧＧを純粋にそれだけで特徴づけることを目的とする本研究では使用されなかった。

多変量モデルにおけるＧＧの予後値
ほぼすべての臨床病理学的変数が単変量解析において臨床的結果と著しく関連した（表１２）。ＧＧ状態及びＨＧ状態は最も強い影響を有していた。しかしながら、多変量解析では、ＧＧ、リンパ節転移状態及び腫瘍サイズのみがそれらの重要性を保っており、ＧＧが最も大きい危険率を有していた。図２と一致して、ＧＧ及びＨＧの両方が検討されたとき、ＧＧがＨＧの代わりになり、ＧＧでは、ＥＲの予後的影響がかなり低下した。

ＧＧ及びＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ
疾患の結果を説明することにおける、ＧＧ、リンパ節転移状態及び腫瘍サイズの独立性は、ＨＧ、リンパ節転移状態及びサイズを組み合わせるＮｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ（ＮＰＩ）を反映した。ＧＧが、この十分に特徴づけられたリスクスコアを改善するために使用できるかどうかを調べるために、本発明者らは、ＨＧがＧＧによって置き換えられることを除いてＮＰＩに類似し、２つの可能な値のみ（１又は３のいずれか）を有するＮＰＩ／ＧＧと呼ばれるスコアを提案した。図３ａ及び図３ｂに示されるように、ＮＰＩ／ＧＧは古典的なＮＰＩよりも著しく識別可能であった。そのうえ、ＮＰＩ／ＧＧは、ＮＰＩの低リスク群及び高リスク群の両方を、著しく異なる臨床結果を有するサブグループに分けることができ（図３ｃ、図３ｄ）、一方で、その逆は正しくなかった（図３ｅ、図３ｆ）。

実施例２
異なる集団及びマイクロアレイプラットホームにおけるＧＧの一致した予後値
上記のプールされた分析の結果が、図４における危険率のフォレストプロットによって示されるように、個々のデータセットにおいて一貫して存在していた。より完全な結果が図８に示される。図４は、それぞれの独立した妥当性評価用データセットにおいて、ＧＧにより、悪性度２の集団が、統計学的に異なる臨床結果を有する２つの異なった群に分割されたことを示す。異なるデータセットが不均一な患者集団を含み、様々な病理医によって悪性度分類され、かつ、異なるマイクロアレイプラットホームを使用したとしても、著しい不均一性が危険率の間には何ら存在しなかった。

７０遺伝子特性との関連性
彼らの先駆的研究において、ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ他は、リンパ節転移陰性の乳ガン患者における遠位転移と著しく相関した７０遺伝子の発現特性を特定した（５）。９７個の遺伝子（１２８のプローブセット）からなるこの一覧はそれらのＡｇｉｌｅｎｔアレイにおいて９３個の遺伝子（１１３のプローブ）にマッピングすることができた。リスクと、治療費用との間でのかね合いのもとでの、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＫＩ）の分類と同じ比較を可能にするために、同じ数の患者を高リスク群及び低リスク群において与える、ＧＧＩについてのカットオフを選択した（方法を参照のこと）。図５は、ＮＫＩの予後的特性と、遠位転移非存在生存に関してのＧＧＩとの間での比較を、集団全体（図５ａ、図５ｂ）、ならびに、リンパ節転移陰性サブグループ（図５ｃ、図５ｄ）及びリンパ節転移陽性サブグループ（図５ｅ、図５ｆ）について示す。本発明者らのプローブが、臨床結果を使用することなく選択され、また、プラットホーム全体にマッピングされなければならなかったという事実にもかかわらず、これらの結果は際立って近かった。類似する結果が、全体的な生存を検討したときに見出された（図９を参照のこと）。データが、無再発生存を比較するために利用できなかった。

低悪性度及び高悪性度の乳ガンは多くの差次的に発現した遺伝子（その大部分が細胞周期及び細胞増殖に関与する）と予想外に関連した。これらの遺伝子について、ＨＧ２腫瘍は、ＨＧ１腫瘍及びＨＧ３腫瘍の変動範囲を含んだ不均一な転写プロファイルを有していた。類似する観察結果が少なくとも１つの以前の報告でなされていた（１８）。本発明では、悪性度に関連したＧＥＰもまた疾患の結果と相関したという、この知見が有し、かつ、発見された臨床的意味合いが調べられる。

図４によって明らかにされるように、ＧＧによる改善は、異なるデータセットの間で一致していた。これは、悪性度分類の特性がこれらの研究の間で著しく異なったならば、当てはまらなかったと考えられる。同様に、図２ａは、ＨＧ１と、ＨＧ３との間における良好な予後分離を示しており、これは、組織学的悪性度分類が非常に優れていたことを示す。さらに、中心となる病理医による検討は依然として、腫瘍の著しい部分がＨＧ２として分類されることをもたらす。最後に、中心となる病理医による悪性度分類は実際にはほとんど行われないので、これらの結果は臨床的実態をより反映していた。

予後に関連したＧＥＰを特定する際の方法は、他の研究者によって使用された方法とは極めて異なっている。予後遺伝子を生存とのそれらの相間によって直接に選択することの代わりに、予後遺伝子を組織学的悪性度（細胞生物学に根差した広く確立されている予後因子）によって間接的に特定することができる。これにより、独立し、かつ、不均一な妥当性評価用セット、及び、異なるマイクロアレイプラットホームにまたがったＧＧＩのロバスト性及び再現性を説明することができる。さらに、ＧＧＩは「分子的悪性度」として解釈することができるので、組織学的悪性度を使用する既存の予後システム（例えば、ＮＰＩなど）に容易に組み込むことができる。

この遺伝子選択プロセスは、予後の「特性」として使用されるべき特定の遺伝子セットを定義しようとするものではなかった。本発明は、異なるセットの特性を選ぶことができる包括的な「カタログ」を組み立てることを目的する。これは、そのようなカタログが異なるプラットホームで適用可能であることによって例示された。様々なプラットホームで使用された実際のプローブセットは数及び遺伝子組成において異なったが、結果は依然として再現性があった。良好な予後識別を、遺伝子の重みが、６４名の患者からなる訓練用セットに対する悪性度とのそれらの関連に基づいて単純に＋１又は１である線形分類子を用いて、非常に異なるデータセットにおいて得ることは注目に値する。従って、特定された「悪性度シグナル」は、特定の１組の遺伝子にも、また、それらの発現レベルの何らかの特別な組合せにもとらわれなかった。これは、それらの遺伝子が非常に相関していたし、また、ＧＧＩが単一の予後因子として効果的に挙動するからである。ノイズに対する冗長性を提供するためにだけならば、多くの遺伝子を使用することは依然として有益である。実用的な予後システムの開発のための結果は、技術的検討によってのみ制約されるかもしれないが、本発明の「悪性度遺伝子カタログ」の任意のサブセットが使用され得ることである。

Ｊｅｎｓｓｅｎ及びＨｏｖｉｇ（１９）は最近、予後のための遺伝子発現特性の使用に関する２つの問題を議論した。これらは、１）異なる特性に含まれる遺伝子の間での一致の欠如、及び、２）特性と、生存との間における相関の生物学的基礎を理解することにおける困難さであった。本発明の遺伝子カタログは、細胞周期の進行及び細胞増殖において役割を有すると考えられる遺伝子が多い。このクラスの遺伝子は、プロファイルに基づいた乳ガンについての何らかの既存のリスク予測方法の最も重要な構成要素でない場合でも、そのようなリスク予測方法の重要な構成要素の１つである。Ｐａｉｋ他（７）において、その５つの遺伝子がすべて、本発明者らの１８３遺伝子のカタログ（表３）に含まれる「増殖セット」は、最も大きい危険率をそれらの大規模な訓練用セット及び妥当性評価用セットにおいて有したが、最も大きい重みを「再発スコア」の式において有するものであった。図５におけるＮＫＩデータへの適用はまた、悪性度に関係づけられた遺伝子がＮＫＩの７０遺伝子特性の予後能力の著しい部分を構成し得るという考えを支持する。本発明者らの１８３遺伝子のカタログに対して比較されたとき、他の予後的特性と共通する遺伝子の下記の数：１１／７０及び３０／２３１遺伝子（ｖａｎ’ｔ Ｖｅｅｒ他）、５／１５（Ｐａｉｋ他）ならびに７／７６（Ｗａｎｇ他）（４、７、８）が見出された。

まとめると、遺伝子発現に基づく悪性度分類は、ガン（特に、乳ガン）の予後評価のための現行の悪性度分類システムを著しく改善することができる。

これらの発見が、多数の独立したデータベースにまたがって、また、異なるプラットホームにまたがって再現されることにより、本発明者らの結論が確固たるものであることが示唆される。ＧＧＩスコアでは、特定のセットの遺伝子を必要とせず、また、特定の検出プラットホームにもとらわれない。ＧＧＩに基づく悪性度分類は、ＨＧをＧＧで置き換えることによって既存の予後システムに組み込むことができる。遺伝子発現の測定に基づく精緻化された悪性度分類は、将来における乳ガンの管理のための重要な臨床的適用を有し得る。

実施例３
エストロゲン受容体陽性の乳ガンにおける臨床的に異なったサブタイプの明確化
材料及び方法
腫瘍サンプル
３３５個の早期段階の乳ガンサンプルが自身のデータセットを構成した。これらのサンプルのうちの８６個が別の研究で以前に使用されており、その処理前のデータがアクセションコードＧＳＥ２９９０によりＧｅｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ保存データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）において入手可能である。これらのサンプルは補助的な全身治療を何ら受けていなかった。２４９個のサンプル（これらは以前には発表されていない）は補助的なタモキシフェンのみを受けていた（ｔａｍ治療のデータセット）。すべてのサンプルは、タンパク質リガンド結合アッセイによってＥＲ陽性であることが要求される。

マイクロアレイ分析を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ^ＴＭ Ｕ１１３Ａ Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて行った。このデータセットは、Ｊｏｈｎ Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｏｘｆｏｒｄ、英国）、Ｇｕｙｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｌｏｎｄｏｎ、英国）及びＵｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）からのサンプルを含有した。Ｏｘｆｏｒｄ及びＬｏｎｄｏｎからのサンプルはＪｕｌｅｓ Ｂｏｒｄｅｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ベルギー）で処理された。Ｕｐｐｓａｌａからのサンプルについては、ＲＮＡをＫａｒｏｌｉｎｓｋａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて抽出し、Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（シンガポール）においてハイブリダイゼーションした。それぞれの腫瘍サンプルから得られたＲＮＡの性状を、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーによって得られたＲＮＡプロファイルにより評価した。ＲＮＡ抽出、増幅、ハイブリダイゼーション及び走査を、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って行った。ＣＥＬからの遺伝子発現値を、ＲＭＡ^１２の使用によって正規化した。それぞれの集団を別々に正規化した。それぞれの病院の施設内倫理委員会が組織材料の使用を承認し、また、文書によるインフォームドコンセントが得られた。ｔａｍ治療のデータセットについての処理前のデータがアクセションコードＧＳＥＸＸＸによりＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ保存データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ）において入手可能である。

本発明者らはまた、最近の刊行物に記載された４つの他の公開されているデータセット（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ^５（ｎ＝２９５）、Ｗａｎｇ^８（ｎ＝２８６）、Ｓｏｔｉｒｉｏｕ^１０（ｎ＝９９）、Ｓｏｒｌｉｅ^１１（ｎ＝７８））を分析において使用した。生存分析のために、本発明者らは、ＥＲ陽性と分類される腫瘍のみを使用した（ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ^５（ｎ＝１２２）、Ｗａｎｇ^８（ｎ＝２０９））。全身的な補助的治療を何ら受けていない患者を伴う生存研究のために、ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他^５からの患者、Ｗａｎｇ他^８からの患者、及び、以前に発表されたデータセットを一緒にした（ｎ＝４１７のＥＲ陽性患者、これによって、これらは「非治療」のデータセットとして示される）。すべての臨床データが補足情報の表Ｓ１に示される。

データ分析
エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰｇＲ）のレベル
最初に、患者をタンパク質リガンド結合アッセイによって決定される陽性のＥＲ状態に従ってそれらの施設で選択した。続いて、本発明者らは、マイクロアレイデータを使用することによって陽性のＥＲレベルを確認した。ＥＲレベルを、本発明者らのヒトＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ^ＴＭ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｕ１３３ Ａ＆Ｂマイクロアレイでのプローブセット（３０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド）によって測定した。本発明者らはＥＲについてはプローブセット「２０５２２５＿ａｔ」を使用している。ＰｇＲをプローブセット「２０８３０５＿ａｔ」によって表した。ＥＲの免疫組織化学的測定は、ＥＲのｍＲＮＡレベルと相関することが知られている^４。ＥＲ及びＰｇＲの何らかの陽性発現レベルを有する腫瘍を検討した。

組織学的悪性度
組織学的悪性度はＥｌｓｔｏｎ−Ｅｌｌｉｓの悪性度分類システムに基づいていた。中心となる病理医が、Ｕｐｐｓａｌａ（スウェーデン）、Ｇｕｙｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｌｏｎｄｏｎ、英国）からのすべてのサンプル、及び、Ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他のデータセット^５について組織学的悪性度及びＥＲ状態を検討した。

ゲノム的悪性度を定量化するための増殖関連遺伝子の発現に基づく指数：遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）
「遺伝子発現悪性度指数」（ＧＧＩ）は、組織学的悪性度１と、組織学的悪性度３との間で差次的に発現することが見出された１２８のプローブセット（９７個の遺伝子）の発現の線形組合せである。この指数は事実上、腫瘍発現プロファイルと、腫瘍悪性度との間での類似性を定量化するものである。大きい遺伝子発現悪性度の指数は高悪性度に対応し、逆に、低い遺伝子発現悪性度の指数は低悪性度に対応する。この指数は、それぞれのデータセットを高悪性度サブグループ及び低悪性度サブグループに分けるために使用された。

マイクロアレイプラットホーム間でのプローブのマッピングをＰｒａｚ他^１６における方法に従ってＵｎｉｇｅｎｅ（ビルド＃１８０）によって行った。
階層的クラスター化
「Ｃｌｕｓｔｅｒ」プログラムを、非中心化Ｐｅａｒｓｏｎ相関を類似性測定として使用するそれぞれの遺伝子のメジアン中心化の後で平均連鎖階層クラスター分析^２８を行うために使用した。クラスター結果を、「ＴｒｅｅＶｉｅｗ」を使用して可視化した。発現データをダウンロードし、Ｓｏｒｌｉｅ他^１１のデータセット及びＳｏｔｉｒｉｏｕ他^１０のデータセットから引き出した。サンプルを、ＧＧＩにおける遺伝子の発現と、サブタイプとの間における関係を調べるために、元の刊行物^{１０、１１}でのようにサブタイプに従って整理した。

統計学的分析
生存と、いくつかの連続変数との間における関係を評価するために、予想された生存を個体についてコンピューター計算するために導入された方法の変法を使用した：「遠位再発率」プロット^２９（参考文献：Ｔｅｒｒｙ Ｍ．Ｔｈｅｒｎｅａｕ及びＰａｔｒｉｃｉａ Ｍ．ｇｒａｍｂｓｃｈ、２０００、“Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｄａｔａ：Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｔｈｅ Ｃｏｘ Ｍｏｄｅｌ”、第１０章）。ＧＧＩ、ＥＲ及びＰｇＲに関しての転移の予想された割合を、研究中の変数のみにより近似されたコックスモデルを使用してプロットした。

生存曲線を、カプラン・マイヤープロットを使用して視覚化し、ログランク検定を使用して比較した。単変量及び多変量の危険率（ＨＲ）を、コックス回帰分析を使用して推定した。すべての統計学的検定は両側であった。統計学的分析を、ＳＰＳＳ総計学ソフトウエアパッケージ（バージョン１１．５）を使用して行った。

結果
以前に報告された分子的サブタイプへのゲノム的悪性度の適用
遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）の発現をサブタイプに関連して調べるために、発現データをＳｏｒｌｉｅ及びＳｏｔｉｒｉｏｕ他のデータセット（それぞれ、最初かつ確認の刊行物^{１１、１３}）から引き出した。遺伝子を、平均連鎖クラスター化を使用してクラスター化し、サンプルを、発表された原稿^{１２、１３}に示されるようにサブタイプに従って整理した。ゲノム的悪性度を以前に報告された分子的サブタイプに適用する（６ａ：Ｓｏｒｌｉｅ他；６ｂ：Ｓｏｔｉｒｉｏｕ他）。サブタイプを、元の刊行物での場合と同じに整理する。ＧＧＩ遺伝子のヒートマップが枝分かれ図の下に置かれる。ＧＧＩスコアのボックスプロット（メジアン及び範囲）がそれぞれのサブタイプの下に置かれる。高悪性度が、１を超えるＧＧＩによって示され、逆に、高悪性度によって、１を超えるＧＧＩが示される。

図６はこの分析の結果を示す。一般に、ＥＲ陰性サブタイプ、基底サブタイプ及びｅｒｂＢ２サブタイプはＧＧＩの大きい発現を有したか、又は、高悪性度であった。しかしながら、ＥＲ陽性サブタイプはＧＧＩレベルの多様な範囲を示し、特に、管腔Ｃサブタイプ及び管腔３サブタイプはともに、これらの増殖関連遺伝子を大きく発現し、これに対して、管腔Ａサブタイプ又は管腔１サブタイプ、及び、正常様サブタイプは、ＧＧＩの発現については大部分が陰性であったか、又は、低悪性度であった。このことにより、ＥＲ陽性腫瘍の生物学的組立てに対する細胞周期遺伝子の寄与の様々な程度が存在し、これに対して、ＥＲ陰性腫瘍はこれらの遺伝子の過剰発現を一貫して有すると思われるという仮説が確認された。高悪性度ＥＲ陽性サブタイプと、ＥＲ陰性サブタイプとの間でのＧＧＩ遺伝子の発現プロファイルにおける類似性に留意することは興味深いことである。

ゲノム的悪性度によって規定されるようなＥＲ陽性管腔サブタイプの臨床的妥当性
ゲノム的悪性度により、ＥＲ陽性腫瘍におけるサブタイプを臨床的に区別することができ、また、これらのゲノム的悪性度の予後値により規定されるサブタイプは、現行の従来的方法（例えば、エストロゲン受容体レベル及びプロゲステロン受容体レベルの量的レベルに基づいた方法など）を上回る改善であった。カプラン・マイヤー生存分析を行い、これにより、ＥＲ陽性腫瘍の様々なクラスを、遠位転移までの時間（ＴＤＭ）（これは、乳ガン特異的な生存についての代替として使用されることが多い）に関して、ＧＧＩスコア（高悪性度対低悪性度）、ならびに、エストロゲン受容体及びプロゲステロン受容体の発現レベル（富発現対不良発現）に従って比較した（図７−ＫＭ及びＣｏｘ）。ＧＧＩ（高対低）、ＥＲ発現レベル及びＰｇＲ発現レベル（富対不良）について、遠位転移非存在生存についてのカプラン・マイヤー生存曲線。図７ａは、非治療のデータセット（ｎ＝４１７）についての結果を示す。図７ｂは、タモキシフェン治療のデータセット（ｎ＝２４９）についての結果を示す。非治療のデータセットについて、示された結果は、２つの一般的な市販のオリゴヌクレオチドマイクロアレイプラットホーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ^ＴＭ 及びＡｇｉｌｅｎｔ^ＴＭ）（方法を参照のこと）を使用してハイブリダイゼーションさせた４１７個のＥＲ陽性サンプルを伴う多数のデータセットから一緒にされた。示されるように、非治療集団及びタモキシフェン治療集団の両方について、ＥＲの発現レベルは何ら予後値を有していなかった（それぞれ、ｐ＝０．７４及び０．５１）。対照的に、ＧＧＩ及びＰｇＲの発現レベルはともに予後値を有していた（非治療：ＧＧＩ及びＰｇＲの両方についてｐ＜０．０００１；ｔａｍ治療：ＧＧＩ ｐ＜０．０００１、ＰｇＲ ｐ＝０．００５８）。管腔の低悪性度サブグループは、管腔の高悪性度サブグループと比較した場合、はるかにより良好なＴＤＭの１０年推定値を有していた。

表１３は、年齢、悪性度、腫瘍サイズならびにゲノム的悪性度の他の標準的な予後共変量による単変量解析及び多変量解析を示す。多変量コックス回帰分析において、ＧＧＩのみが著しい予後値を保持した（非治療：ＨＲ ２．３（９５％ＣＩ：１．２〜４．３）；ｐ＝０．００８；ｔａｍ治療：ＨＲ ２．１４（９５％ＣＩ：１．０４〜４．０２）；ｐ＝０．００３８）。これには、プロゲステロン受容体の発現レベル（ｐ＝０．３）を含めて、単変量レベルにおいて著しかったこれらの因子が包含された。非治療集団については、腫瘍サイズもまた、重要性を多変量モデルにおいて保持した（ＨＲ ２．２（９５％ＣＩ：１．２〜３．８）；ｐ＝０．００６８）。これは、ＧＧＩによって測定されるようなゲノム的悪性度により、陽性レベルのエストロゲン受容体を発現する患者における患者の臨床的に異なったグループが区別され得ることを示唆する。さらに、ＧＧＩは非常に著しい予後値を有していた。これは、これらの従来的な因子を上回って臨床結果をより良好に識別することができることを示唆する。タモキシフェン治療のデータセットにおけるＥＲ陽性の高悪性度サブグループの悪化した疾患結果は、陽性のＥＲ状態を有するにもかかわらず、補助的なタモキシフェンがこのサブタイプの天然の疾患履歴を変化させないことを示唆すると思われる。これは潜在的には、生物学的観点及び治療的観点の両方からのさらなる調査の価値がある一群の腫瘍を示し得る。

ＥＲ陽性腫瘍におけるＧＧＩの予後値のさらなる実証として、本発明者らは、ＧＧＩの連続関数としての遠位再発率を表示する図を作製し、これを、非治療集団及びｔａｍ治療集団の両方について、ＥＲ及びＰｇＲの連続レベルに対して比較した。

腫瘍の２つのサブタイプを、乳ガンが少なくともあるレベルのエストロゲン受容体を発現する患者において区別することができる。腫瘍が、ＧＧＩを含む遺伝子（すなわち、高いゲノム的悪性度に対応する遺伝子）の高いレベルを発現する患者では、その疾患結果は明確に異なっており、再発の発生率が、低いゲノム的悪性度の腫瘍と比較した場合にはより大きかった。さらに、その悪化した疾患結果は、補助的なタモキシフェンが与えられたときでさえ、変化しないようであった。これは、この女性群は、その陽性のエストロゲン受容体値にもかかわらず、補助的なタモキシフェンからの利益を受けないと思われることを示唆する。本研究における患者は誰も、補助的な化学療法を受けていなかったことに留意すること。従って、化学療法がこの群の天然の疾患履歴を変化させ得るかは不明である。この発見の潜在的な臨床的重要性はまた、高悪性度のＥＲ陽性群と、高悪性度のＥＲ陰性腫瘍（基底及びｅｒｂＢ２）との間における類似性によって強調され、これはさらに、高いゲノム的悪性度に関連する遺伝子の高レベルの発現が不良な予後に関連することを示唆する。ＧＧＩでは、これら２つのグループを、６６６のＥＲ陽性サンプルを伴ういくつかのマイクロアレイプラットホームを使用してハイブリダイゼーションされた多数のデータセットにまたがって一貫して特定することができ、これは、本発明者らの結論が確固たるものであり、かつ、階層的クラスター分析^１、３によって以前にもたらされた結論よりも非常に再現的であることを示唆する。

ＧＧＩに存在する遺伝子は細胞周期の進行及び細胞増殖に関連する：上位２０の過剰発現する遺伝子には、ＵＢＥ２Ｃ、ＫＰＮＡ２、ＴＰＸ２、ＦＯＸＭ１、ＳＴＫ６、ＣＣＮＡ２、ＢＩＲＣ５及びＭＹＢＬ２が含まれた（補足表１４を参照のこと）。ＥＲ陽性腫瘍については、ゲノム的悪性度が様々な無再発生存と関連したが、ＥＲ陰性腫瘍については、ほぼすべてが高いゲノム的悪性度と関連するので、ＧＧＩは何ら予後値を有していなかった。従って、細胞周期に関係づけられる遺伝子が、予後値を、ＥＲの発現が陽性である乳ガン患者においてのみ有すると思われる。このグループでは、遠位転移の発生が、増殖遺伝子及び悪性度由来遺伝子からなるこのセットによって主にもたらされると思われる。しかしながら、ＥＲ陰性腫瘍では、細胞周期に関連する遺伝子の他に、転移の根本的な生物学を動かすさらなる因子が存在し得る。患者のサブセットにおける「細胞増殖特性」の予後能力が、その年齢のわりには比較的大きいエステロゲン受容体発現を発現する女性において以前に報告されている^５。ＥＲ陽性サブグループの分析が、以前に記載された管腔サブグループに対するゲノム的悪性度によって分けられ、この概念が、６５０名を超える患者において証明された。さらに、ゲノム的悪性度は依然として、臨床的予後因子を考慮に入れる単変量解析及び多変量解析における最強の変数である（表４）。

現在、乳ガン患者における予後を予測することができることを主張する、マイクロアレイ技術に由来するいくつかの分子的特性が存在する^{８、４、７、２４}。報告されたこれらの遺伝子特性のいくつかにより、補助的なタモキシフェンにより治療されたＥＲ陽性腫瘍における臨床結果を予測することができる^{７、２４、３０}。Ｐａｉｋ他^７によって開発された再発スコアにおいて、５つの遺伝子からなる増殖セットが、最も大きい危険率をそれらの大きい訓練用セット及び妥当性評価用セットにおいて有し、また、最も大きい「重さ」又は係数をそれらの再発スコア式において有した。これは、補助的なタモキシフェンにより治療された早期段階の乳ガンの女性についてのそれらの予後分類を得ることにおけるそれらの大きい重要性を示している。増殖に関係づけられる遺伝子は、遺伝子発現プロファイルに基づいた乳ガンについての多くの既存の予後遺伝子特性の最も重要な構成要素でない場合でも、そのような予後遺伝子特性の重要な構成要素であると思われる。１１個の遺伝子を、５５歳未満の早期段階の乳ガンの女性について、ＧＧＩと、７０遺伝子の予後遺伝子分類子との間で共通して使用することによって^４、妥当性確認の刊行物^５に対する類似した生存曲線が得られた。これは、悪性度に関係づけられる遺伝子がこの特性の予後能力の著しい量を構成することを示唆する。これらの予後特性によって達成されたサブグループ、及び、ゲノム的悪性度によるＥＲ陽性腫瘍の分類によって得られたサブグループは、転移及び再発を促進させるための細胞周期遺伝子に対する強い依存性のために、著しく重なっている。この方法の利点は、様々な分子的機能及び生物学的プロセスをおそらくは表す遺伝子セットではなく、むしろ、不良な結果の原因となる生物学的機構が明白であることである^８、４。抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェンなど）は細胞周期特異的な作用を乳ガン細胞に対して有しており、いくつかの細胞周期調節分子の発現及び活性に影響を及ぼすので、異常な細胞周期制御機構の発生が、細胞が抗エストロゲン剤に対する抵抗性を発達させる明白な機構である。ＥＲの発現が陽性であることが、臨床状況におけるタモキシフェン応答の予測要因の最も良い予測要因であるとき、なぜ３０％〜４０％までのＥＲ陽性乳ガンがタモキシフェンに対する抵抗性を発達させるかが、現在、不完全ながら理解される^３１。サイクリンＤ１（細胞周期の重要な制御因子）の過剰発現がタモキシフェン抵抗性に関連しており、また、抗エストロゲン剤の成長阻害効果をエストロゲン受容体陽性の乳ガン細胞において無効にし得る^３２。細胞周期装置を動かす発ガン経路に対するさらなる研究は、高悪性度サブグループを治療するための新しい薬剤を開発することにおいて有益である。

臨床的に関連した腫瘍サブクラスをＥＲ陽性の乳ガンにおいて明らかにすることは、今日、治療する腫瘍医にとって非常に重要である。補助的な抗エストロゲン治療の新しい方法^{３３〜３７}、ならびに、新しい化学療法剤及び生物学的薬剤の出現により、早期段階の乳ガンの女性についての治療決定がなされており、これはときには困難な課題である。以前では、タモキシフェンが抗エストロゲン治療の主力であり、早期段階のＥＲ陽性乳ガンの女性については、リスク又は再発、死亡及び対側性乳ガンにおける著しい減少を有していた^３８。しかしながら、アロマターゼ阻害剤の出現、及び、アロマターゼ阻害剤が閉経後の女性ではタモキシフェンよりも効果的であることを見出すいくつかの治験の報告のために、アメリカ臨床腫瘍学学会は、アロマターゼ阻害剤が早期段階のホルモン応答性乳ガンの閉経後女性の治療に含められることを勧告している^３９。しかしながら、アロマターゼ阻害剤及びタモキシフェンの最も良い組合せ及び連続化、ならびに、ＥＲ陽性腫瘍の女性のすべてがこれらの薬剤から同じ利益又は異なった利益を得るかどうかは依然として不明である。臨床的に関連し、かつ、生物学的な異なるホルモン応答性の乳腫瘍表現型を解明することは、そのような表現型では異なる治療方針が要求され得るので、そのような治療の最適化を容易にすることを助けることができる。

まとめると、ゲノム的悪性度の使用により、ＥＲ陽性乳ガンの２つのサブタイプを、多数のデータセット及びマイクロアレイプラットホームにまたがって再現可能な様式で区別することができる。このことが、６５０を超えるＥＲ陽性の乳ガンサンプルにおいて証明される。これらのサブグループは、全身的に治療されていない集団、及び、タモキシフェンのみにより治療された集団の両方で、統計学的に異なった臨床結果を有する。臨床試験におけるサブタイプの階層化により、これらのサブグループに対する、内分泌治療、化学療法及び生物学的薬剤の潜在的に多様な影響に関する重要な情報が提供され得る。これらの異なった表現型に対する集中した生物学的研究により、別個かつ異なる治療標的の特定がもたらされ得る。

本明細書中で特定される遺伝子は、不明な乳房細胞サンプルの乳ガンの悪性度をサンプルにおける特定された遺伝子の発現に基づいて予測することができるモデルを作製するために使用することができる。そのようなモデルは、不明又は疑わしい乳ガンサンプルが正常であるか、あるいは、乳ガンの１つ又は複数の段階及び／又は悪性度にあるかを特定するために本明細書中に開示される遺伝子（及びそのサブセット）を使用して、本明細書中に記載されるか、又は、そうでない場合には、この分野で知られているアルゴリズム、ならびに、この分野において同等であるとして認められるアルゴリズムのいずれかによって作製することができる。このモデルは、サンプルからのサブセットの遺伝子の発現プロファイルを、モデルを組み立てるために使用された基準データのプロファイルに対して比較するための手段を提供する。このモデルは、サンプルのプロファイルを、基準プロファイルのそれぞれに対して、又は、基準プロファイルに基づいて作製された、モデルを規定する概要に対して比較することができる。加えて、サンプルのプロファイルからの相対的な値を、モデルのプロファイル又は基準プロファイルとの比較において使用することができる。

本発明の好ましい実施形態において、同じ対象からの、正常及び非正常及び／又は非定型として特定された乳房細胞サンプルを、モデルを作製するために使用された遺伝子のそれらの発現プロファイルについて分析することができる。これにより、異常なサンプルの段階を正常なサンプルの発現プロファイルからの相対的な違いに基づいて特定する好都合な手段が提供される。このような違いは、その後、正常なデータと、モデルを作製するために同様に使用された個々の異常な基準データとの間における違いに対する比較において使用することができる。サンプルからの遺伝子発現の検出は、遺伝子発現をアッセイすることができる１個のマイクロアレイの使用によって行うことができる。そのようなデータを分析する１つの方法が、利便性及び正確性について本明細書中に開示されるすべての組毎の比較から得ることができる。

本発明の他の使用には、乳ガン細胞サンプルを、さらなる調査又は研究のために、ガンの特定の段階及び／又は悪性度のサンプルであるとして特定することができることを提供することが含まれる。これは、乳ガンの段階及び／又は悪性度を、細胞学的観察ではなく、むしろ、客観的な遺伝子的基準又は分子的基準に基づいて特定することを要求する多くの状況において具体的な利点を提供する。特定の乳ガン段階の異なる悪性度を、さらなる研究、調査又は特徴づけのために区別することは特に有用である。

本発明の方法において使用される材料は、広く知られている手順に従って製造されるキットを調製するために理想的に適する。従って、本発明は、乳ガンの段階を特定するために、開示された遺伝子の発現を検出するための薬剤を含むキットを提供する。本発明の方法における本キットの使用に関連する識別用の記載又はラベル又は説明書を、そのような薬剤とともに場合により含むそのようなキットが提供される。そのようなキットは、例えば、事前に製造されたマイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；又はｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ及びＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、及び、本発明のプライマー複合体の１つ又は複数（例えば、適切な長さのポリ（Ｔ）、又は、ＲＮＡポリメラーゼと反応し得るプロモーターに連結されたランダムプライマー）をはじめとする本方法において利用される様々な試薬の１つ又は複数を（典型的には、濃縮された形態で）それぞれが有する容器を含むことができる。１組の説明書もまた、典型的には含まれる。

本発明によって提供される方法はまた、全体又は一部において自動化することができる。本発明のすべての局面はまた、乳ガンの段階を細胞含有サンプルにおいて特定することに無関係な材料を除いて、開示されている遺伝子のサブセットから本質的になるように実施することができる。

本発明のシステム全体又は一部を実行するための例示的なシステムは、プロセシングユニットと、システムメモリーと、システムメモリーを含む様々なシステム構成要素をプロセシングユニットに接続するシステムバスとを含むコンピューターの形態での汎用演算デバイスを含むことができる。システムメモリーはリードオンリーメモリー（ＲＯＭ）及びランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）を含むことができる。コンピューターはまた、磁気ハードディスクドライブからの読み込み及び磁気ハードディスクドライブへの書き込みのための磁気ハードディスクドライブ、取り外し可能な磁気ディスクからの読み込み及び取り外し可能な磁気ディスクへの書き込みのための磁気ディスクドライブ、ならびに、取り外し可能な光ディスク（例えば、ＣＤ ＲＯＭ又は他の光媒体など）からの読み込み及び取り外し可能な光ディスクへの書き込みのための光ディスクドライブを含むことができる。これらのドライブ及びそれらの関連した装置読み取り可能な媒体は、装置が実行可能な指示、データ構造体、プログラムモジュール及び他のデータの不揮発性記憶をコンピューターに提供する。

本発明の様々な実施形態を、プロセッサーを有する１つ又は複数の遠隔コンピューターに対する論理的接続を使用してネットワーク環境で実施することができる。論理的接続には、限定としてではなく、例としてこの場合には示されるローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び広域ネットワーク（ＷＡＮ）を含むことができる。そのようなネットワーク環境は、事務所規模又は企業規模のコンピューターネットワーク、イントラネットならびにインターネットにおいて一般的であり、広範囲の様々な異なる通信プロトコルを使用することができる。当業者は、そのようなネットワークコンピューター処理環境が典型的には、多くのタイプのコンピューターシステム形態（パーソナルコンピューター、携帯型デバイス、マルチプロセッサーシステム、マイクロプロセッサー型又はプログラム可能な家庭用電化製品、ネットワークＰＣ、ミニコンピューター及びメインフレームコンピューターなどを含む）を包含することを理解する。本発明の様々な実施形態はまた、タスクが、通信ネットワークを介して（有線連結もしくは無線連結によるか、又は、有線連結及び無線連結の組合せによるかのどちらかで）つながれるローカル処理デバイス又は遠隔処理デバイスによって行われる記載されたコンピューター処理環境で実施することができる。分散されたコンピューター処理環境では、プログラムモジュールをローカルメモリー記憶デバイス及び遠隔メモリー記憶デバイスの両方に置くことができる。

本発明の種々の実施形態が本発明に従って記載されている。多くの改変及び変化が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載及び例示された技術及び構造に対して行うことができる。従って、本明細書中に記載された装置は例示にすぎず、本発明の範囲に対する限定でないことを理解しなければならない。

訓練用セットにおける遺伝子発現のパターンを示すヒートマップである。 妥当性確認用セットにおける遺伝子発現のパターンを示すヒートマップである。 妥当性確認用データセット２〜５（表１１）からプールされたデータについて、ＨＧに基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（パネルａ）、及び、ＧＧに基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（パネルｂ）を示す。 ＨＧ１、ＨＧ２及びＨＧ３は、ＧＧによって低リスク及び高リスクのサブセットにさらに分けることができ、これは、ＧＧが、ＨＧを上回る改善であることを示す（それぞれ、パネルｃ及びパネルｄ）。 ＨＧ１、ＨＧ２及びＨＧ３は、ＧＧによって低リスク及び高リスクのサブセットにさらに分けることができ、これは、ＧＧが、ＨＧを上回る改善であることを示す（パネルｅ）。ＥＲの状態により、すべてではないが、予後が不良である患者の一部が特定される（パネルｆ）。 ＮＰＩ分類に基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（ａ）、及び、ＮＰＩ−ＧＧ分類に基づくカプラン・マイヤーＲＦＳ分析（ｂ）を示す。 ＮＰＩ−ＧＧは予後の識別を低リスクＮＰＩサブセット（パネルｃ）及び高リスクＮＰＩサブセット（パネルｄ）の両方で改善することを示す。 ＮＰＩは予後の識別を低リスクＮＰＩ−ＧＧサブセット（パネルｅ）及び高リスクＮＰＩ−ＧＧサブセット（パネルｆ）の両方で改善しないことを示す。 ＧＧ１及びＧＧ３に分けられたＨＧ２患者について危険率についてのフォレストプロットを示し、異なるデータセットおける一致した結果を示している。 Ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他の妥当性確認研究からのデータについて、７０個の遺伝子の発現特性に基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（左列、パネルａ）、及び、ＧＧＩに基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（右列、パネルｂ）を示す。 Ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他の妥当性確認研究からのデータについて、７０個の遺伝子の発現特性に基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（左列、パネルｃ）、及び、ＧＧＩに基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（右列、パネルｄ）を示す。 Ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｖｅｒ他の妥当性確認研究からのデータについて、７０個の遺伝子の発現特性に基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（左列、パネルｅ）、及び、ＧＧＩに基づく遠位転移非存在生存（ＤＭＦＳ）分析（右列、パネルｆ）を示す。 以前に報告された分子的サブタイプに適用されたゲノム的悪性度を表す。 以前に報告された分子的サブタイプに適用されたゲノム的悪性度を表す。 以前に報告された分子的サブタイプに適用されたゲノム的悪性度を表す。 以前に報告された分子的サブタイプに適用されたゲノム的悪性度を表す。 ＧＧＩ（高対低）について遠位転移非存在生存についてのカプラン・マイヤー生存曲線を表す。 ＧＧＩ（高対低）について遠位転移非存在生存についてのカプラン・マイヤー生存曲線を表す。

Claims (34)

1. 下記の工程を含む方法：
   （ａ）腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を測定する工程；
   （ｂ）腫瘍サンプルの遺伝子発現悪性度指数（ＧＧＩ）を、下記の式を使用して計算する工程：
   式中、
   ｘはｍＲＮＡの遺伝子発現レベルであり、
   Ｇ_１及びＧ_３は、ＨＧ１及びＨＧ３においてそれぞれアップレギュレーションされる遺伝子のセットであり、
   ｊはプローブ又はプローブセットを示す。
2. 腫瘍サンプルは、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマ又は脳ガンによって冒された組織に由来する、請求項１に記載の方法。
3. 腫瘍サンプルは、乳腫瘍サンプルである、請求項２に記載の方法。
4. 乳腫瘍サンプルは、組織学的悪性度ＨＧ２である、請求項３に記載の方法。
5. 乳腫瘍サンプルをＧＧＩ指数に基づいて低リスク（ＧＧ１）又は高リスク（ＧＧ３）として示す工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
6. 乳腫瘍サンプルの低リスク又は高リスクの呼称と一致する患者に乳ガン治療療法を提供する工程をさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ＧＧＩは、ＨＧ１事例の平均ＧＧＩが約−１であり、かつ、ＨＧ３事例の平均ＧＧＩが約＋１であるように選ばれたカットオフ値及びスケール値を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
   
8. Ｇ_１遺伝子セットは、「悪性度１の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. Ｇ_３遺伝子セットは、「悪性度３の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. Ｇ_１及びＧ_３遺伝子セットはエストロゲン受容体陽性集団から作製される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 乳腫瘍サンプルをＥＲ陽性腫瘍内の異なるサブタイプとして示す工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 腫瘍サンプルを他のサブタイプと異なる治療を受けるサブタイプとして示す工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
13. 下記の工程を含む方法：
    （ａ）腫瘍サンプルにおける遺伝子発現を測定する工程；
    （ｂ）腫瘍サンプルについての再発スコア（ＲＳ）を、下記の式を使用して計算する工程：
    式中、
    Ｇは、ガンの遠位再発に関連する遺伝子セットであり、
    Ｐ_ｉはプローブ又はプローブセットであり、
    ｉは遺伝子の特定のクラスター又は群を特定し、
    ｗ_ｉはクラスターｉの重みであり、
    ｊは特定のプローブセットの値であり、
    ｘ_ｉｊはクラスターｉにおけるプローブセットｊの強度であり、
    ｎ_ｉはクラスターｉにおけるプローブセットの数である。
14. カットオフ値によって、再発スコアに基づいて、ガンの再発について低リスク又は高リスクとして腫瘍サンプルを分類する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 低リスクを高リスクから区別するためのカットオフ値は、−１００から＋１００までの再発スコア（ＲＳ）である、請求項１４に記載の方法。
16. 低リスクを高リスクから区別するためのカットオフ値は、−１０から＋１０までの再発スコア（ＲＳ）である、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 再発は、タモキシフェン及び／又はアロマターゼ阻害剤の投与、内分泌治療、化学療法、又は抗体治療からなる群から選択される治療による治療の後での再発である、請求項１３〜１６のいずれかに記載の方法。
18. 再発は、タモキシフェンによる治療の後の再発である、請求項１７に記載の方法。
19. 腫瘍サンプルは、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマ又は脳ガンからなる群から選択される、請求項１３〜１８のいずれかに記載の方法。
20. 腫瘍サンプルは乳腫瘍サンプルである、請求項１９に記載の方法。
21. 患者の治療療法を腫瘍サンプルのガン再発リスク状態に基づいて調節する工程をさらに含む、請求項１３〜２０のいずれかに記載の方法。
22. 患者の治療療法を調節する工程は、
    （ａ）患者が低リスクとして分類されるならば、低リスク患者を続いてタモキシフェン及び逐次アロマターゼ阻害剤（ＡＩ）により治療するか、又は、
    （ｂ）患者が高リスクとして分類されるならば、高リスク患者をタモキシフェン以外の代わりの内分泌治療により治療すること
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
23. 患者は高リスクとして分類され、患者の治療療法は、化学療法による治療に、又は、特異的な分子的に標的化された抗ガン治療に調節される、請求項２２に記載の方法。
24. 遺伝子セットはエストロゲン受容体陽性集団から作製される、請求項１３〜２３のいずれかに記載の方法。
25. 遺伝子セットは、表１，２、及び４における遺伝子のうちの少なくとも４つを含む、請求項１３〜２４のいずれかに記載の方法。
26. 遺伝子セットは、ＰＧＲ、ＨＥＲ２、ＥＳＲ、及びＭＫＩ−６７遺伝子を含む、請求項２５に記載の方法。
27. 以下のものを含むコンピューター化されたシステム（好ましくはデバイス又はキット）：
    （ａ）好ましくはアレイとして固体支持体表面に結合された配列から作製される、遺伝子セットに基づいて腫瘍サンプルについての遺伝子発現を検出するために構成されたバイオアッセイモジュール、好ましくは、マイクロアレイキット又はリアルタイムＰＣＲ分析を含むデバイス；及び
    （ｂ）ＧＧＩ又はＲＳを遺伝子発現に基づいて計算し、かつ、乳腫瘍サンプルについてのリスク評価をもたらすために構成されたプロセッサーモジュール。
28. 腫瘍サンプルは、乳ガン、結腸ガン、肺ガン、前立腺ガン、肝細胞ガン、胃ガン、膵臓ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、尿路ガン、甲状腺ガン、腎臓ガン、ガン腫、メラノーマ又は脳ガンによって冒された組織に由来する、請求項２７に記載のシステム。
29. 腫瘍サンプルは、乳腫瘍サンプルである、請求項２７又は２８に記載の方法。
30. バイオアッセイモジュールは、遺伝子セットを含む少なくとも１つの遺伝子チップ（マイクロアレイ）を含む、請求項２７〜２９のいずれかに記載のシステム。
31. 遺伝子セットは、「悪性度１の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項３０に記載のシステム。
32. 遺伝子セットは、「悪性度３の腫瘍におけるアップレギュレーション」として示される表３における遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子を含む、請求項３０に記載のシステム。
33. 遺伝子セットは、表１，２、及び４における遺伝子のうちの少なくとも１つを含む、請求項３０に記載のシステム。
34. エストロゲン受容体及び／又はプロゲステロン受容体遺伝子発現の検出と組み合わせられる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。