CN106442991B - 用于预测肺腺癌患者预后及判断辅助化疗获益的系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于预测肺腺癌患者预后及判断辅助化疗获益的系统，包括检测c‑Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质表达量的系统和蛋白质表达量数据处理系统。检测上述六种蛋白质表达量的系统通过免疫组织化学染色方法测定蛋白质的表达量；蛋白质表达量数据处理系统将来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织中所述六种蛋白质表达量转换为预后分值，根据预后分值预测待肺腺癌患者的预后和/或待预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗。

Description

用于预测肺腺癌患者预后及判断辅助化疗获益的系统
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种用于预测肺腺癌患者预后及判断辅助化疗获益的系统。
背景技术
肺癌是当今世界上癌症相关死亡中最常见的原因，而其中80％为非小细胞肺癌(NSCLC)。TNM分期是目前为人们所普遍接受的临床分期系统，被用于预测预后并指导非小细胞肺癌患者的治疗。然而，目前的TNM分期系统远不足以准确预测非小细胞肺癌患者的预后情况。比如，对于肺癌患者来说，即使处于临床Ⅰ期，肺癌的复发率也高达35-50％。另外，相当一部分患者仅靠手术方式即能治愈，这些病人应该可以避免基于当前TNM系统而进行辅助性化疗所带来的极强副反应。
为了提高对非小细胞肺癌患者预后的预测效果，人们已经投入了极大努力去鉴定和识别其相关的分子标志物谱。很多研究肺癌的团队都曾报道过具有不同预后能力的基因表达谱。然而，到目前为止还没有一个基因表达谱应用于非小细胞肺癌临床预后的预测。
另外，由于术后辅助化疗只有约5.4％的五年生存获益，因此目前临床上十分关注辅助化疗中的过度治疗问题，亟待发展可识别化疗受益群体的新方法。
肺腺癌是肺癌的一种，属于非小细胞癌。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何对肺腺癌患者进行预后预测和/或如何预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了A和/或B的系统，包括检测c-Src、CyclinE1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统：
A、预测肺腺癌患者预后的系统；
B、预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统。
上述A和/或B的系统中，所述检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统可包括通过免疫组织化学染色方法测定所述六种蛋白质的表达量所需的试剂和/或仪器。
上述A和/或B的系统中，所述A包括蛋白质表达量数据处理系统1，所述蛋白质表达量数据处理系统1用于将来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织(手术切除的肺腺癌组织)中所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者的预后；所述B包括蛋白质表达量数据处理系统2，所述蛋白质表达量数据处理系统2将来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织(手术切除的肺腺癌组织)中所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗。
上述A和/或B的系统中，所述蛋白质表达量数据处理系统1内设模块1-a和模块1-b，所述模块1-a用于将来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织中所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，所述模块1-b用于根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者的预后；所述蛋白质表达量数据处理系统2内设所述模块1-a和模块2-b，所述模块2-b用于根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统。
所述检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统在制备A和/或B中的应用也属于本发明的保护范围：
A、预测肺腺癌患者预后的系统；
B、预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统。
所述检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统和蛋白质表达量数据处理系统在制备A和/或B中的应用也属于本发明的保护范围：
A、预测肺腺癌患者预后的系统；
B、预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统；
所述蛋白质表达量数据处理系统为所述蛋白质表达量数据处理系统1和/或所述蛋白质表达量数据处理系统2。
上述A和/或B的系统中，所述检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统可包括通过免疫组织化学染色方法测定所述六种蛋白质的表达量所需的试剂和/或仪器。
上述预测肺腺癌患者预后的系统和/或预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中，所述六种蛋白质均来自于人(Homo sapiens)。
上述预测肺腺癌患者预后的系统和/或预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中，所述肺腺癌患者为经手术切除肺腺癌组织的肺腺癌患者。
上述A和/或B的系统中，检测上述六种蛋白质的表达量的系统具体可为免疫组织化学染色方法测定上述六种蛋白质的表达量所需的试剂和/或仪器，如c-Src的单克隆抗体或多克隆抗体、Cyclin E1的单克隆抗体或多克隆抗体、TTF1的单克隆抗体或多克隆抗体、p65的单克隆抗体或多克隆抗体、CHK1的单克隆抗体或多克隆抗体和JNK1的单克隆抗体或多克隆抗体。
上述预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中的肺腺癌患者可处于TNM分期的I-III期中的任一时期。
为解决上述技术问题，本发明还提供了Z1和/或Z2的方法：
Z1、预测肺腺癌患者预后的方法，包括：C、检测来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织样本的c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量；D、将所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者的预后；
Z2、预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的方法，包括：C、检测来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织样本的c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量；D、将所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者的预后；E、将D中预后不良的所述待预测肺腺癌患者预测为受益于辅助化疗的患者，将D中预后良好的所述待预测肺腺癌患者预测为非受益于辅助化疗的患者。
上述方法中，预后分值也可以通过“组合分子标志物筛选及模型构建软件”(软件著作权登记号为2014SR142190)获得。
上述方法中，所述六种蛋白质表达量可根据免疫组织化学染色方法获得。
上述方法中，所述分离的肺腺癌组织样本可来自所述待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织经过福尔马林固定石蜡包埋制备的样本或来自所述待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织的冰冻切片。
上述方法中，所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值的方法可包括将所述六种蛋白质表达量转化为蛋白质表达量向量，将所述蛋白质表达量向量代入公式1得到f(v)，将f(v)代入公式2，得到所述待预测肺腺癌患者的预后分值；
所述公式1中，v是蛋白质表达量向量，简称向量，sv_coef(i)是支持向量的系数，SV(i)是支持向量；
所述公式2中，prob(v)为待预测肺腺癌患者的预后分值。
所述蛋白质表达量向量以v表示，v＝(xCHK1,xCyclin E1,xJNK1,xp65,xc-SRC,xTTF1)。
上述方法中，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者的预后可为通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)确定诊断阈值，比较所述待预测肺腺癌患者的预后分值和所述诊断阈值的大小，如果所述待预测肺腺癌患者的预后分值小于或等于所述诊断阈值，所述待预测肺腺癌患者的预后不良，如果所述待预测肺腺癌患者的预后分值大于所述诊断阈值，所述待预测肺腺癌患者的预后良好。
预后判断也可通过“非小细胞肺癌预后判断软件”(软件著作权登记号为2014SR157070)获得。
所述通过受试者工作特征曲线确定诊断阈值是以具有统计学意义数量的正常肺组织中所述六种蛋白质表达量为对照，根据具有统计学意义数量的肺腺癌组织中所述六种蛋白质表达量和相应的肺腺癌患者分组信息制作受试者工作特征曲线，ROC曲线上的最优值为阈值；所述分组信息是肺腺癌患者从手术切除肺腺癌组织开始存活的时间，3年以上(大于等于3年)为一组，不足3年(小于3年)为一组；所述最优值是在特异性最大的基础上敏感性尽可能地大。
为解决上述技术问题，本发明还提供了D1-D4中至少一种中的应用：
D1)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质作为标志物在预测肺腺癌患者预后中的应用；
D2)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质作为标志物在制备预测肺腺癌患者预后的产品中的应用；
D3)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质作为标志物在预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗中的应用；
D4)c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质作为标志物在制备预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的产品中的应用。
本发明还提供了一种产生肺腺癌相关蛋白质特征谱的方法，包括检测来自TNM I-III期肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织样本中c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质表达量的步骤。
本申请中所述肺腺癌患者可为TNM I-III期肺腺癌患者。进一步，本申请中所述肺腺癌患者具体可为TNM IB-IIIA期肺腺癌患者。
本申请中所述预后不良是从手术切除肺腺癌组织时间开始存活时间不足3年，所述预后良好是从手术切除肺腺癌组织时间开始存活时间为3年及3年以上。
本申请中所述待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织可为手术切除的肺腺癌组织。
本申请中所述c-Src在NCBI的记录名(RecName)为SRC原癌基因非受体酪氨酸蛋白激酶(SRC Proto-Oncogene,Non-Receptor Tyrosine Kinase)；所述TTF1在NCBI的记录名(RecName)为甲状腺转录因子1(Thyroid Transcription Factor 1)；所述Cyclin E1在NCBI的记录名(RecName)为G1/S-特异细胞周期蛋白E1(G1/S-specific cyclin-E1)；所述p65在NCBI的记录名(RecName)为禽网状内皮组织增生病病毒癌基因同源物A(V-Rel AvianReticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog A)；所述CHK1在NCBI的记录名(RecName)细胞周期检查点蛋白激酶1(Checkpoint Kinase1)；所述JNK1在NCBI的记录名(RecName)为丝裂原活化蛋白激酶8(Mitogen-activated protein kinase 8)。
本发明中，肺肿瘤组织样本中北京大学人民医院有121腺癌患者病例满足样本入选标准，将其作为北京腺癌样本群，将北京腺癌样本群命名为BJ腺癌群。在BJ腺癌群中随机选择三分之二的样本(80例)作为腺癌训练组，另三分之一的样本(41例)作为腺癌测试组。肺肿瘤组织样本中重庆西南医院有72名腺癌患者病例符合样本入选标准，将其作为重庆独立验证腺癌样本群，将重庆独立验证腺癌样本群命名为CQ腺癌群。通过对腺癌训练组样本的组织微阵列(TMA)进行免疫组化(IHC)染色，我们分析了75个在肿瘤发生发展过程中起关键作用的信号蛋白质的表达水平。通过随机森林算法和支持向量机算法的结合，得到了肺腺癌(ADC)相关蛋白质的特征谱并开发出分类模型，即6-蛋白质模型。然后用腺癌测试组样本和CQ腺癌群对P6-ADC预后腺癌方法进一步进行验证。
结果表明，由六个蛋白质c-SRC,Cyclin E1,TTF1,p65,CHK1和JNK1组成的P6-ADC成套蛋白质为准确预测肺腺癌的蛋白质特征谱。在腺癌测试组中，预后良好组患者的3年生存率为96.0％(置信区间为74.8％-99.4％)，而预后不良组患者的3年生存率为37.5％(置信区间为15.4％-59.8％)，预后良好组和预后不良组间风险比为7.67(置信区间为3.96-39.34)；在CQ腺癌群，预后良好组患者的3年生存率为97.3％(置信区间为82.3％-99.6％)，而预后不良组患者的3年生存率为42.9％(置信区间为26.4％-53.3％)，两组间风险比为2.81(置信区间为1.65-6.05)。Cox回归分析表明，腺癌相关蛋白质的特征谱的效能优于TNM分级系统并可作为独立的预后因子。
结果还表明，P6-ADC预后腺癌方法可准确预测肺腺癌的临床预后情况，显著提高了肺腺癌患者的预后预测水平；P6-ADC预后腺癌方法还对TMN分级的腺癌患者进一步预后；同时P6-ADC预后腺癌方法还能区分受益于辅助化疗的腺癌患者，只有TMN IB期/Ⅱ期患者/ⅢA期患者中的预后不良组能从辅助化疗中受益，因此P6-ADC预后腺癌方法可用于指导可进行化疗的患者，使不受益者免于化疗，避免过度治疗。
附图说明
图1为P6-ADC预后腺癌方法的确立和效能验证。
其中A为腺癌训练组的ROC曲线；B为腺癌训练组的预后；C为腺癌测试组的预后；D为BJ腺癌群的预后分值分布、预后预测结果、腺癌特征谱及患者试剂生存状态总图；E为CQ腺癌群的预后；F为CQ腺癌群的预后分值分布、预后预测结果、腺癌特征谱及患者试剂生存状态总图。
图2为P6-ADC预后腺癌方法对临床TMN分级的腺癌患者的预后。
其中A为TMN ⅠB期腺癌患者的预后；B为TMN Ⅱ期腺癌患者的预后；C为TMN ⅢA期腺癌患者的预后。
图3为P6-ADC预后腺癌方法的化疗获益分类。
其中A为TMN IB期&Ⅱ期&ⅢA期腺癌患者预后不良组辅助化疗与否的生存分析；B为TMN IB期&Ⅱ期&ⅢA腺癌患者预后良好组辅助化疗与否的生存分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的名词解释：
预后良好：从手术切除肿瘤时开始，患者生存时间超过3年。
预后不良：从手术切除肿瘤时开始，患者在3年内死亡。
总生存期(OS)：从接受肺癌根治性外科手术到任何原因造成的死亡或最近一次随访之间的时间段。
总体生存率：一个群体特定时间点时的存活率。
受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，简称ROC曲线)：是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以灵敏度(真阳性率)为纵坐标，1-特异性(真阴性率)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标，ROC曲线下面积越大，试验的诊断价值越大。
灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。
1-特异性(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异性越大越好，理想特异度为100％。
实施例1、腺癌相关蛋白质特征谱的发现、组合分子标志物模型、非小细胞肺癌预后判断、P6-ADC预后腺癌方法及有效性的验证
1、腺癌相关蛋白质特征谱的发现
1.1、病例及样品
所述福尔马林固定和石蜡包埋的人正常肺组织样本，由北京大学人民医院和西南医院组织库提供。所述福尔马林固定和石蜡包埋的肺肿瘤组织样本，由北京大学人民医院病理科和重庆西南医院病理科的组织库提供。肺肿瘤组织的提供者(即患者)在2004年到2010年期间在上述医院接受了肺癌根治性外科手术并有系统的。本发明不包括以下情况的病例：既往有恶性肿瘤的病例、在手术前接受过其他手段治疗的病例、手术不完全切除的病例、接受过表皮生长因子(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂治疗的病例、小细胞肺癌的病例、存在被国际肺癌研究协会(IASIC)标准定义的浸润性癌前病变的病例以及那些术后30天内死亡的病例。根据世界卫生组织(WTO)采用的组织病理学分类系统，所有病例经苏木精-伊红(H&E)染色的病理切片，都再次进行集中审查，并确认肿瘤类型、组织学分级以及肿瘤转移程度。临床及随访信息来自于医院的前瞻性病例数据库。
肺肿瘤组织样本中北京大学人民医院有121名腺癌患者病例满足样本入选标准，将其作为北京腺癌样本群，将北京腺癌样本群命名为BJ腺癌群。在BJ腺癌群中随机选择三分之二的样本(80例)作为腺癌训练组，另三分之一的样本(41例)作为腺癌测试组。肺肿瘤组织样本中重庆西南医院有72名腺癌患者病例符合样本入选标准，将其作为重庆独立验证腺癌样本群，将重庆独立验证腺癌样本群命名为CQ腺癌群。
1.2、制备组织芯片
将腺癌训练组的石蜡包埋肺肿瘤组织样本逐一做切片，H&E染色做形态学观察，将病变的典型位置标记出来作为穿刺点，然后用环钻装置穿刺肺肿瘤组织蜡块(直径2毫米)得到肺肿瘤组织蜡芯。
将石蜡包埋的人正常肺组织样本做切片，H&E染色标记出作为穿刺点，然后用环钻装置穿刺正常肺组织蜡块(直径2毫米)得到正常肺组织蜡芯。
将上述肺肿瘤组织蜡芯和正常肺组织蜡芯一一配对，转移至受体蜡块的阵列中排列，得到组织芯片。
每个受体蜡块包含一张组织芯片，每张组织芯片包含30个腺癌病例。
1.3、免疫组化染色及化学评分
将上述1.2制备的组织芯片进行免疫组化染色，具体步骤为：A：烘片、脱蜡与洗片：将组织阵列蜡块连续切成4微米厚切片并固定在载玻片上，载玻片经过2小时60℃烘烤后，通过二甲苯、梯度乙醇和水依次进行有序浸泡、脱蜡，PBS(pH7.4)洗片3次，每次3min；B：抗原恢复：将切片95℃进行抗原修复15min；C：加入3％过氧化氢室温处理30min阻断内源性过氧化物酶活性；D：加入10％正常山羊血清封闭非特异蛋白质，切片在4℃与75种抗体孵育过夜；E：按照ABC试剂盒(Vector Laboratories公司产品)步骤进行增强处理、加入二抗以及DAB显色；F：苏木精染色，切片冲洗干净并封片。
免疫组化分析时使用的部分抗体为：抗c-Src的抗体(兔源单抗、出售公司CST、产品号#2109)、抗Cyclin E1的抗体(兔源多抗、出售公司Abnova、产品号PAB4852)、抗TTF1的抗体(兔源单抗、出售公司Epitomics、产品号#5883-1)、抗p65的抗体(兔源单抗、出售公司Epitomics、产品号#1546-1)、抗CHK1的抗体(鼠源单抗、出售公司CST、产品号#2360)和抗JNK1的抗体(鼠源单抗、出售公司BD、产品号51-1570GR)。
免疫组化染色评价采用改良型免疫组织化学评分(组织病理染色评分)系统进行。该系统通过对病理切片的染色强度以及阳性细胞的百分比定量赋分后进行评估，其中依据染色强度可定义为0分、1分、2分、3分，分别对应于染色阴性、染色弱阳、染色中阳及染色强阳；同时，统计每个强度阳性细胞的百分比。所有的免疫组化染色切片均经3位专业的病理学家平行评估，且事先不了解患者的临床信息。若3位病理学家对切片的解读有分歧，3位病理学家将一起对该切片重新评估，直到达成共识。化学评分计算公式为：每种蛋白质的表达分值＝1×弱阳性百分率+2×中阳性百分率+3×强阳性百分率。
1.4、蛋白质表达谱的数据处理
蛋白质特征谱的数据处理：根据上述1.3的方法逐一评估每个蛋白质的表达分值，将表达分值首先归一化处理，缺失值被所有肿瘤中该蛋白质表达的中间值替代，然后计算出每个蛋白质的分值和腺癌训练组的该蛋白质平均值的表达比，之后表达水平以表达比的log10(表达比)量化。为了避免对数中0的出现，所有分数都加上0.01。
1.5、腺癌相关蛋白质的特征谱
将腺癌训练组应用随机森林算法得到各个蛋白质的重要性指标。使用袋外数据[out-of-bag(OOB)]误差最小化准则，依次消减最不重要的蛋白质，较小OOB误差的若干蛋白质即作为肺腺癌相关蛋白质的特征谱。上述过程是通过在随机森林软件包上使用RvarSelRF包程序实现的。
支持向量机(SVM)是用来开发带特征谱的训练组的分类模型。选择径向基函数(RBF)内核进行SVM训练，因为当类特征谱与属性之间非线性时，通过非线性映射样品到高维空间，内核可以处理这些情况。RBF内核的两个参数C和γ都可以使用网格搜索策略进行调谐。分类模型经SVM的最优C和γ训练而成。在训练阶段，SVM的性能通过5倍交叉验证精度进行评估。
1.6、统计分析
由于患者的死因难以完全准确定义，使用特定的生存点作为生存终点可能带来潜在偏离，因此我们以从手术切除肿瘤时间开始的总生存作为我们主要的分析事件。用Kaplan-Meier分析患者总体生存率。用双侧对数秩(two-sided log-rank)检验分析预后良好患者的生存时间、预后不良患者的生存时间以及辅助化疗的效能。相关的变量，包括腺癌相关蛋白质的特征谱确定、患者年龄、吸烟指数、组织学类型、肿瘤大小和疾病阶段等，都通过单变量和多变量Cox比例风险分析的结果进行比较。Wald似然比(Wald likelihoodratio)检验应用于检验单变量和多变量分析，以评估是否具有统计学意义。Cox比例风险分析和双侧对数秩检验同时也用于比较是否接受辅助性化疗的患者之间的总体生存率。所有的统计测试，以预设的双侧α小于0.05视为有统计学意义。上述分析都是在R编程语言(3.0.2版本)下完成。
根据上述1.1—1.6的方法，本发明以腺癌训练组为样本，通过检测与肿瘤发生发展密切相关的75个信号蛋白质的表达水平发现肺腺癌相关蛋白质的特征谱。肺腺癌相关蛋白质的特征谱包括六种蛋白质，六种蛋白质的名称分别为c-Src，Cyclin E1，TTF1，p65，CHK1和JNK1。肺腺癌相关蛋白质的特征谱以下简称腺癌特征谱。将这六种蛋白质c-Src，Cyclin E1，TTF1，p65，CHK1和JNK1组成的成套蛋白质命名为P6-ADC。
2、组合分子标志物模型和非小细胞肺癌预后判断
2.1、组合分子标志物模型
将发现的肺腺癌特征谱采用支持向量机算法开发分类模型，该模型全称为组合分子标志物模型，简称为6-蛋白质模型。再对每个患者的预后评分进行计算，预后分值代表了6-蛋白质模型中每个蛋白质的综合信息。
上述6-蛋白质模型可以十分简单明确的应用于临床。6-蛋白质模型的使用方法为：⑴对于每个肺腺癌患者使用免疫组化的方法检测6个标志物蛋白质的表达分值；⑵6个蛋白质分子的表达水平采用下列公式进行归一化：
fs(x)＝-1+2·(x-lower)/(upper-lower)；
公式中x是质控标准化后蛋白质分子的表达水平，每个蛋白质对应的Upper(上限)和Lower(下限)在表1中列出；
表1.腺癌标志物蛋白质分子归一化系数
⑶得到6个蛋白质分子归一化的表达量后，每个患者可以表示为由该6个蛋白质分子组成的蛋白质分子向量v：
v＝(xCHK1,xCyclin E1,xJNK1,xp65,xc-SRC,xTTF1)
⑷将患者蛋白质分子向量v代入下列公式计算f(v)：
其中，sv_coef(i)是支持向量的系数，SV(i)是支持向量(表2)；
表2.组合分子标志物模型中的支持向量和系数
⑸将f(v)代入下列公式计算该患者的预后分值：
2.2、非小细胞肺癌预后判断
阈值的获得：腺癌特征谱的性能由receiver-operating characteristic(ROC)分析进行评估。以正常肺组织中P6-ADC的表达分值为对照，根据腺癌训练组每个患者的P6-ADC的表达分值和患者的分组信息(分组信息是指患者从手术切除时间开始存活的时间，3年以上为一组，3年以下为一组；见表3)用SPSS 16.0软件进行ROC曲线分析。腺癌训练组腺癌特征谱ROC曲线下的面积(AUC)是0.967，表明在腺癌训练组中该腺癌特征谱可以准确的对预后进行预测(图1中A)。ROC曲线上的最优值即为阈值，综合考虑敏感性和特异性，是指在特异性最大的基础上灵敏度尽可能地大。基于这个方法，腺癌训练组ROC曲线的最优值为0.71，即阈值为0.71。在腺癌训练组的这一节点上，肺腺癌特征谱显示出96.6％的灵敏度和76.2％的1-特异性，91.9％的阳性预测值和患者3年内死亡的总体精度为91.3％。
表3.腺癌训练组肺腺癌相关蛋白质的表达分值和分组信息
注：“NA”表示无法得到数值。
将步骤2.1得到的预后分值和阈值经比较分析后，得到预后良好或预后不良。比较分析结果判定标准如下：如果所述待测腺癌患者的预后分值小于或等于阈值(即预后分值小于等于0.71)，则判定该腺癌患者预后不良；若预后分值大于阈值(即预后分值大于0.71)，则判定该腺癌患者预后良好。
3、P6-ADC预后腺癌方法
a、以待测腺癌患者的肺肿瘤组织为检测样本，按照上述步骤1中所述方法进行免疫组化染色和化学评分，得到P6-ADC的表达分值；
b、按照步骤2.1的方法，得到预后分值；
c、将上述步骤b得到的预后分值按照步骤2.2的方法，得到预后良好或预后不良。
Kaplan-Meier生存分析显示在腺癌训练组中预后良好组3年总体生存率为91.9％(置信区间为81.7％-96.6％)，而预后不良组总体生存率为11.1％(置信区间为1.9％-29.8％)(P<0.0001，图1中B)。
4、P6-ADC预后腺癌方法有效性的验证
4.1、以腺癌测试组为样本，对步骤3中P6-ADC预后腺癌方法的有效性进行验证。
4.2、以CQ腺癌群为样本，对步骤3中P6-ADC预后腺癌方法的有效性进行独立验证。与上述4.1不同的是，进行蛋白质表达谱的数据处理时，只保留不超过2个缺失蛋白质读值的患者，对逐一评估CQ腺癌群中腺癌相关蛋白质的表达分值，将表达分值用腺癌训练组和腺癌测试组程序进行归一化处理，缺失值由BJ腺癌群中该蛋白质表达的中值替代，然后计算出每个蛋白质的分值和CQ腺癌群的该蛋白质平均值的表达比，之后表达水平以表达比的log10(表达比)量化。为了避免对数中0的出现，所有分数都加上0.01。
Kaplan-Meier生存分析结果表明，腺癌测试组中预后良好组3年存活率达96％(置信区间为74.8％-99.4％)，而预后不良组为37.5％(置信区间为15.4％-59.8％)，预后良好组和预后不良组间风险比为7.67(置信区间为3.96-39.34)(P<0.0001,图1中C)；CQ腺癌群中在预后良好组3年存活率达97.3％(置信区间为82.3％-99.6％)，预后不良组3年存活率达42.9％(置信区间为26.4％-53.3％)，两者间风险比为2.81，置信区间为1.65-6.05(P<0.0001，图1中E)。
将BJ腺癌群的预后分值分布、预后预测结果、腺癌特征谱以及患者的实际生存状态进行总结，实验结果见图1中D。预后分值与患者3年生存率的比较结果显示，腺癌特征谱可以预测患者的预后情况。预后方法对其中高预后分值的32％患者和低预后分值的15％患者的预测准确程度为100％。
CQ腺癌群的预后评分分布、预后预测结果、腺癌特征谱以及患者的实际生存状态都与BJ腺癌群的相似(图1中F)。进一步证实步骤3的预后方法对腺癌患者预后预测的有效性。
为了进一步分析腺癌特征谱能否作为一个独立的预后因子，我们用单变量和多变量Cox回归分析对模型和现有临床风险因子(包括病例分级、年龄、吸烟和组织学等)的预后价值进行比较。单变量分析结果显示，虽然该腺癌特征谱和临床分级区分患者的预后均具有显著的统计学差异，但对3年总体生存率预测来说，腺癌特征谱是一个相对更好的预后因子；多变量回归分析显示，在消除了病例分级、年龄、肿瘤大小和吸烟因素后，腺癌特征谱仍可作为一个独立的的预后因子(表5)。
表5.肺腺癌模型在重庆样本群中的Cox比例风险分析
注：*预后不良组与预后良好组比较；+作为连续变量
实施例2、P6-ADC预后腺癌方法对TNM分级的腺癌患者的进一步预后
对TNM分级的腺癌患者的进一步预后的方法为：对经TNM分级的任何级别的腺癌患者(如IB期腺癌的患者)，按照实施例1的方法获得P6-ADC的表达分值，然后将该表达分值按照实施例1步骤2.1的方法，得到预后分值；将各预后分值按照实施例1步骤2.2的方法，判定该腺癌患者预后良好或预后不良。
将BJ群和CQ群的样本整合得到总腺癌样本，P6-ADC预后腺癌方法能将总腺癌样本中的每个患者在TNM分级基础上进一步分成预后不良组或预后良好组(IB期P<0.0001；II期P＝0.0001；IIIA期P＝0.0008)(图2)。结果表明，P6-ADC预后腺癌方法可在TNM分级基础上，对腺癌患者进一步进行预后。
实施例3、P6-ADC预后腺癌方法预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗
根据美国临床肿瘤学会(ASCO)发布的指南，非小细胞肺癌IB期或II期或IIIA期患者推荐术后辅助化疗，然而数据显示只有极少比例的患者可从化疗中获益。
实验表明，P6-ADC预后腺癌方法有助于识别出那些能真正受益于辅助化疗的TNMIB期和TNM II期和IIIA期患者。在预后不良组中，辅助化疗能明显提高总体生存率(风险比为0.51，置信区间为0.24-0.86；P＝0.018；图3中A)。P6-ADC预后腺癌方法预后良好组中，辅助化疗并未对延长预后有任何显著的作用(风险比为0.99，置信区间为0.40-2.46；P＝0.987；图3中B)；。
预测TNM IB期或TNM II期或IIIA期肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的方法为：按照实施例1中的方法获得TNM IB期或TNM II期或TNM IIIA期腺癌患者P6-ADC的表达分值，然后将该表达分值按照实施例1步骤2.1的方法，得到预后分值；将各预后分值按照实施例1步骤2.2的方法，判定该腺癌患者预后良好或预后不良。预后不良组受益于辅助化疗，预后良好组则不能从辅助化疗中受益。

Claims (15)

1.预测肺腺癌患者预后的系统，包括检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于：所述检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统包括通过免疫组织化学染色方法检测所述六种蛋白质的表达量所需的试剂和/或仪器。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于：所述预测肺腺癌患者预后的系统包括蛋白质表达量数据处理系统1，所述蛋白质表达量数据处理系统1用于将来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织中所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者的预后。
4.权利要求1或2中所述的检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统在制备预测肺腺癌患者预后的系统中的应用。
5.权利要求1或2中所述的检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统和权利要求3中所述的蛋白质表达量数据处理系统1在制备预测肺腺癌患者预后的系统中的应用。
6.预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统，包括检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：所述检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统包括通过免疫组织化学染色方法检测所述六种蛋白质的表达量所需的试剂和/或仪器。
8.根据权利要求6或7所述的系统，其特征在于：所述预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统包括蛋白质表达量数据处理系统2，所述蛋白质表达量数据处理系统2将来自待预测肺腺癌患者的分离的肺腺癌组织中所述六种蛋白质表达量转换为所述待预测肺腺癌患者的预后分值，根据所述待预测肺腺癌患者的预后分值预测所述待预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗。
9.根据权利要求6或7所述的系统，其特征在于：所述预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中的肺腺癌患者处于TNM分期的I-III期中的任一时期。
10.权利要求6或7中所述的检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统在制备预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中的肺腺癌患者处于TNM分期的I-III期中的任一时期。
12.权利要求6或7中所述的检测c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1这六种蛋白质表达量的系统和权利要求8中所述的蛋白质表达量数据处理系统2在制备预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：所述预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的系统中的肺腺癌患者处于TNM分期的I-III期中的任一时期。
14.c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质作为标志物在制备预测肺腺癌患者预后的产品中的应用。
15.c-Src、Cyclin E1、TTF1、p65、CHK1和JNK1六种蛋白质作为标志物在制备预测肺腺癌患者是否受益于辅助化疗的产品中的应用。
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