CN102558329A - 一组特异性多肽及其在制备肺癌早期诊断试剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组特异性多肽，多肽的氨基酸序列如序列表中序列1-29所示，还公开了上述特异性多肽在制备肺癌早期诊断试剂中的用途。本发明的特异性多肽是通过血清多肽图结合生物信息学软件进行比较分析、识别差异表达的多肽，进而应用质谱分析鉴定的。利用本发明公开的特异性多肽，可以制备肺癌早期诊断试剂，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一组特异性多肽，还涉及该组多肽在制备肺癌早期诊断试剂中的用途。
背景技术
血清多肽组谱图(简称多肽图)是指通过质谱技术快速分析获得的血清中多肽(蛋白质)组的精确质量数的谱图。在谱图中以精确质量数标识的多肽(蛋白质)峰在必要时可进一步通过生物质谱分析获得蛋白质序列。血清多肽图可在数分钟时间内通过微量血液的生物质谱分析获得，已在恶性肿瘤早期诊断中显示出了良好前景，预兆了医学分子诊断领域的一次重要突破，为肿瘤患者早期发现带来了福音。血清多肽图作为一种全新的诊断方法，已经取得了令人振奋的进展。Petricoin博士等科研人员应用血清多肽图技术成功地对早期卵巢癌进行了诊断。(Emanuel FP，Ardekani AM，Hitt BA，et al.Useof proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer.Lancet 2002；359：572-7.)他们利用生物质谱技术分析健康对照组和疾病组血清多肽组的组成模式，并基于这些模式寻找差异点进行临床卵巢癌的检测。该方法检测卵巢癌显著优于传统的CA125检测，特别是对早期卵巢癌(I期)的诊断也十分成功，提示此项技术还可望用于卵巢癌的早期或预警检测。美国斯坦福大学的Soltys通过血清多肽组图谱技术对鳞状上皮细胞癌进行诊断(Soltys SG，Le QT，Shi G，et al.The Use of Plasma Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Proteomic Patterns for Detection ofHead and Neck Squamous Cell Cancers.Clinical Cancer Research 2004；10：4806-4812.)；2005年台湾大学Cheng AJ等在Clinical Chemistry上发表了他们利用血清多肽组图谱技术对口腔癌进行诊断的结果。此外，JCI、Mollecular&Cellular Proteomics等杂志最近也发表了系列的通过血清多肽图技术对疾病进行诊断的研究结果(Villanueva J，Shaffer DR，Philip J，et al.Differential exoprotease activities confer tumor-specific serum peptidome patterns.J Clin Invest 2006；116：271-284.Villanueva J，Martorella AJ，Lawlor K，et al.Serum peptidome patterns that distinguish metastatic thyroid carcinoma fromcancer-free controls are unbiased by gender and age.Mol Cell Proteomics 2006；5：1840-1852.)。以上表明，利用多肽图技术对临床上一些重大和疑难疾病进行诊断已经初露曙光，前景广阔。但是多肽图技术作为肿瘤诊断工具，在技术上还存在瓶颈。概括起来有两方面：第一，血清多肽组快速分离和制备技术。它需要满足快速性、有效性、稳定性、标准化和通量化，才能真正符合未来临床诊断的需要；第二，多肽图中疾病特征峰的识别、鉴定和模型建立。它不同于单个疾病标志物的应用，而是数十甚至逾百个血清多肽的不断组合的变化。这样复杂的改变必须依靠生物信息学工具的应用，才可能识别出各种复杂疾病特征性的多肽组变化模式。在此基础上，才能获得标准化的多肽图疾病诊断模型，用于临床诊断和鉴别诊断，以及重大疾病的临床前预警。
与其它技术比较：癌症的早期发现对于其治疗和控制至关重要。目前如CT、核磁共振、肿瘤特异性抗原检测等诊断方法在临床上还未能达到恶性肿瘤早期发现所需的灵敏度。高通量的基因组技术可以快速筛查癌细胞中的基因改变，如DNA芯片技术实现了在全基因组水平分析检测癌变过程中基因的异常活化或改变。但一些与肿瘤发生发展相关的改变可能与基因水平异常无关，而与基因表达产物——蛋白质的改变直接相关。酶联免疫吸附试验(ELISA)广泛用于在体液中单个、特异性已知的标志物的检测，但在临床上应用还依赖于新的标志物发现。血清多肽组技术使用复合的标志物较单个标志物更为可靠和有效，而且所反映的不仅仅是传统概念上的肿瘤标志物。多肽组的疾病相关改变，可能是蛋白质过量表达和蛋白质异常表达在血清中的反映，也可能是在疾病状态下机体整体机能反应的体现，而且随着疾病的发生和发展被修饰或移除。通过质谱分析获得的多肽图需要数字化并经成熟的生物信息学分析工具进行诊断，可与一个细胞或一个组织或一个机体在“正常”条件下的参考图谱进行比较，从而鉴别疾病样本的血清多肽组图谱。肿瘤是威胁人类健康的第一大杀手，而且发病年龄越来越提前。大多数肿瘤患者在发现时多已处于晚期，因此早期诊断显得十分重要，对患者的愈后与生存意义重大，理论和现实意义明显。血清多肽图技术在癌症早期诊断中已经显示的价值超过了传统的标志物检测，在肿瘤早期诊断方面传出了令人振奋的信息，给相对沉寂的肿瘤诊断领域带来了可以寄托的希望。
到目前为止，尚未见到血清多肽图技术用于肺癌早期诊断的报道。
发明内容
为了解决肺癌早期诊断的问题，本发明公开了一组特异性多肽，其氨基酸序列如序列表中的序列1-29所示，各多肽的氨基酸序列及分子量M/Z如下表所示。
本发明还公开了上述多肽在肺癌早期诊断中的用途。
该用途是通过以下实验进行的。首先建立特征性的血清多肽图，通过生物信息学软件找到肿瘤特异性的多肽组，建立诊断模型，提供一种用于肺癌早期诊断的方法。
本发明的特征性血清多肽是通过以下方法提取并筛选的。利用固相金属螯合磁珠试剂提取每例患者血清中的多肽，t-test进行健康组与肿瘤组的比较分析、识别差异表达的多肽，再应用支持向量机(SVM)算法建立模型，进行诊断。差异多肽可进一步通过傅立叶变换回旋共振质谱仪进行鉴定。
采用本发明的29个特异性多肽，建立的诊断模型，对临床肺癌样本进行检测，诊断准确率在90％以上。
本发明从多肽水平进行肺癌的早期诊断研究，对于筛选潜在的肿瘤药物靶标分子和功能蛋白质，研制和开发新的肺癌治疗药物，具有重要的意义，有巨大的市场前景和社会与经济效益。
附图说明
图1：NanoLC-FT-ICR MS/MS鉴定的protein kininogen HMW多肽序列为NLGHGHKHERDQGHGHQ，单同位素分子量为1944.0201 Da。(i)肺癌血清多肽碎片的色谱峰，箭头指的是双电荷分子量为972.4576 Da的多肽。(ii)串联质谱图y离子结果。
具体实施方式
实施例一金属铜螯合纳米磁珠的提取血清多肽
一、材料：
结合缓冲溶液：0.1mol/l磷酸缓冲溶液，PH为4
冲洗缓冲溶液：0.1％的甲酸水溶液
洗脱液：0.1％的甲酸和50％乙腈水溶液
肺癌患者血清254例
对照血清257例
金属铜螯合纳米磁珠：(自制，已申请专利，专利申请号为：200610002030.1)
二、方法结果：
(一)金属铜螯合纳米磁珠的制备：
一、材料：
FeCl3：分析纯AR，批号QD2004年3月11日，国药集团化学试剂有限公司生产；PEG 1500：Mr1400-1600，批号：25300-68-3，FLUKA产品；吡咯烷酮(2-pyrrolidone)：for synthesis，S34844146，MERCK-Schuchardt产品；乙醚：分析纯，批号：20050315，天津化学试剂有限公司生产；丙酮，分析纯，批号：20041017，北京化工厂生产。氢氧化钠：分析纯，批号20041112北京化工厂；环氧氯丙烷：分析纯，批号981219，天津化学试剂六厂；二甲基亚砜：99.7％，批号A0208798001，ACROS ORGANICS产品；亚氨基二乙酸(IDA)：化学纯，批号F20041203，国药集团化学试剂有限公司生产；硫酸铜：分析纯，批号950315，北京化工厂生产。
二、方法结果：
利用热水解法一步合成表面连有羟基核心为Fe3O4的纳米磁珠。(1)将1.35g FeCl3充分溶解在过量吡咯烷酮中，并在搅拌条件下加入聚乙二醇PEG-15007.5g，PEG-1500与FeCl3的摩尔比为1∶1，充分混匀后在氮气保护下加热回流，然后用弱极性有机溶剂比例为5∶1的乙醚/丙酮沉淀Fe3O4的纳米磁性粒子，一步反应得到表面包被羟基的纳米Fe3O4磁珠。回流时间应为5小时，得到的超顺磁性纳米粒子通过投射电镜观察直径在10-100nm范围，红外光谱检测表面成功包被聚乙二醇。得到的超顺磁性纳米粒子的尺寸和性能符合要求。
(2)在上述的纳米Fe3O4粒子中加入高浓度氢氧化钠溶液活化，使氢氧化钠浓度达到8mol/L，溶液的PH值为14，活化温度为60度，活化充分后离心分离磁珠。
(3)在上述碱活化后的纳米磁珠中加入过量一定比例的无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷继续活化磁珠使连接上环氧基团；所说的一定比例是指高浓度无机碱/二甲基亚砜/环氧氯丙烷按照2∶4∶5的比例进行活化反应。反应完成后将所得的连接环氧基团的纳米磁性粒子用离心的方法从溶液中分离出来。
(4)在上述已连接环氧基的磁珠中继续加入络合试剂亚氨基二乙酸(IDA)1g，并用氢氧化钠调PH值为8进行反应，使磁珠表面连接上络合试剂，反应完成后仍用离心方法将纳米磁珠分离。
(5)分离后的纳米磁珠在过量的0.5mol/l硫酸铜溶液中反应使表面络合铜离子，得到金属铜螯合磁珠。
(二)用金属铜螯合纳米磁珠提取血清多肽
取金属铜螯合纳米磁珠20μL，用结合缓冲溶液洗3次，使磁珠处于结合缓冲溶液的条件下，每次用磁场进行分离，然后加入10μL血清使充分混匀，并在室温孵育10分钟，然后再通过磁场进行分离。
上述操作完成后，再加入冲洗缓冲溶液洗三次，将未结合的蛋白质、多肽充分洗去，并同时除去体液中的盐以适应质谱的分析需要。接着加入洗脱液将结合的蛋白质、多肽洗脱下来，得到可直接用于质谱分析的蛋白质和多肽样本。整个操作所需时间仅为1小时。多肽样本与α-羟基肉硅酸混合点靶，MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker公司)分析获得血清多肽图；
若通过2-DE的方法来提取分离蛋白和多肽至少需要一天，并且不能直接用于质谱分析，还需酶切等复杂步骤的处理才可用于质谱分析，所以要得到与磁珠方法相比质谱中同样多的蛋白和多肽峰，则至少需要1周的时间。因此该磁珠提取蛋白的效率高，所需时间短，可通量化。
实施例二肺癌血清多肽图的生物信息学分析
一、软件：
Biosun分析软件SVM软件包，http://www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm
二、方法
将254例肺癌血清与257例对照(健康志愿者，肺炎，慢性阻塞性肺气肿COPD，肺部良性肿瘤)分别随机选取各150例用于建立肺癌诊断模型，并筛选差异多肽。获得的诊断模型cross validation与recognition capability均在95％以上，用剩余肿瘤和对照病例进行验证，诊断准确率在90％以上。
实施例三肺癌特异血清多肽的序列鉴定
一、材料：
肺癌患者血清10例；健康对照血清10例；
磁珠(自制，已申请专利，专利申请号为：200610002030.1)；9.4TQ-FT-ICR-MS(Bruker公司)。
二、方法结果：
1、参照实施例一，用磁珠提取血清多肽，将10例肺癌提取的多肽混合，10例正常对照提取得多肽混合。混合后的多肽样品分别在离心干燥机中浓缩除去有机相。准备质谱分析鉴定标志多肽序列。
2、将多肽样品进样nano LC-9.4T Q-FT-ICR-MS，梯度洗脱，同时串联质谱鉴定多肽，得到的谱图通过DataAnalysis软件(Bruker公司)分析获得序列。得到29个蛋白多肽，各多肽氨基酸序列、蛋白名称及单同位素分子量M/Z如下表所示：
表2
以Kininogen HMW多肽为例，其M/Z为1945.02，氨基酸序列如序列表中序列18所示，其质谱图序列结果见附图1。
实施例四肺癌特异血清多肽在肺癌早期诊断中的应用
一、材料：
肺癌血清样本：254例
对照血清样本：257例
磁珠：(自制，已申请专利，专利申请号为：200610002030.1)；
MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker公司)
二、方法结果：
(一)用金属铜螯合纳米磁珠提取血清多肽
取金属铜螯合纳米磁珠20μL，用结合缓冲溶液洗3次，使磁珠处于结合缓冲溶液的条件下，每次用磁场进行分离，然后加入10μL血清使充分混匀，并在室温孵育10分钟，然后再通过磁场进行分离。
上述操作完成后，再加入冲洗缓冲溶液洗三次，将未结合的蛋白质、多肽充分洗去，并同时除去体液中的盐以适应质谱的分析需要。接着加入洗脱液将结合的蛋白质、多肽洗脱下来，得到可直接用于质谱分析的蛋白质和多肽样本。整个操作所需时间仅为1小时。多肽样本与α-羟基肉硅酸混合点靶，MALDI-TOF-MS(Autoflex，Bruker公司)分析获得血清多肽图；
(二)生物信息学软件分析建立肺癌早期诊断模型
Biosun分析软件SVM软件包，http://www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm
将254例肺癌血清与257例对照(健康志愿者，肺炎，慢性阻塞性肺气肿COPD，肺部良性肿瘤)分别随机选取各150例用于建立肺癌诊断模型，并筛选差异多肽，获得29个差异多肽。采用本发明的29个特异性多肽对肺癌样本进行诊断，诊断模型，获得的cross validation与recognition capability均在95％以上，剩余肿瘤和对照病例进行验证，诊断准确率在90％以上。
Claims (4)
1.一组特异性多肽，其特征在于各多肽的氨基酸序列如下所示：
2.权利要求1所述特异性多肽在制备肺癌早期诊断试剂中的用途。
3.根据权利要求2所述用途，其特征在于利用权利要求1所述特异性多肽建 立肿瘤血清多肽图数据库，确定正常组与肿瘤之间的差异表达多肽组，建立诊断模型。
4.根据权利要求3所述用途，其中诊断模型的诊断准确率在90％以上。
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