CN108474723A - 制备和分析肿瘤组织样品用于检测和监测癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供处理和分析代谢能够完整生物样品(包括肿瘤组织样品)的方法。所述的方法具有多种用途，包括用于诊断和监测肿瘤和肿瘤转移。

Description

制备和分析肿瘤组织样品用于检测和监测癌症的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2015年12月2日提交的美国临时申请第62/262,314号的优先权，通过引用将该临时申请的内容完整地并入本说明书。
背景
领域
本发明涉及用于处理和分析大型生物组织样品(包括肿瘤组织样品)的方法，该方法例如用于诊断、预后和预测性临床癌症研究和护理实践标准。
相关领域的描述
实体瘤是异质性的，具有多种细胞类型，最近的数据表明周围微环境在肿瘤生长、转移和对治疗剂的反应或抗性中起关键作用。然而，目前用于临床前以及诊断、预后和预测性临床癌症研究和护理实践标准的技术在其在微环境背景下分析肿瘤的能力有限。利用福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPE)形式的薄组织切片(4-10微米)的2维分析的标准方法受限于不能检查肿瘤的3维特征，例如血管结构和周围胞外基质的变化，或淋巴或免疫细胞侵袭。此外，由于肿瘤或肿瘤微环境内的异质性，可能会遗漏罕见事件，例如罕见肿瘤细胞或罕见肿瘤标记物基因表达。样品处理和保存方法也可能破坏某些肿瘤特征。利用流式细胞术、RT-PCR或下一代肿瘤测序和分析的新技术已经推进了临床前和临床癌症领域；然而，它们也存在关联关键定量信息同时维持肿瘤和周围微环境结构和形态的能力问题。
保留空间信息，同时捕获高分辨率的定性和定量信息，可以更好地了解肿瘤微观结构，血管化，实体肿瘤微环境中的细胞类型以及横跨肿瘤组织3维结构的细胞相互作用。这将有助于表征肿瘤，确定或预测肿瘤生长和/或转移的可能性，预测和/或监测肿瘤对疗法的反应，并开发新的癌症治疗方法。此外，将提供对疗法反应机制和最终抵抗的多个理解。
显然，本领域中对用于诊断用途，预后用途以及预测对治疗的响应或抗性的评估较大生物样品(例如，5000-10,000微米)，如肿瘤组织样品以及能够可视化和量化整个组织样品及其微环境中生物标记物分布的改进方法和组合物存在需求。本发明提供了这样的方法，其允许检查或者大型、完整的生物样品，包括肿瘤组织样品。
简要概述
本发明提供了可用于分析组织和器官的方法和相关组合物。
在一个实施方案中，本发明包括用于分析生物样品的方法，它包括：(a)通过以下步骤处理生物样品：(i)在水凝胶亚单位存在下固定样品；(ii)使水凝胶亚单位聚合以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及(iv)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；(b)通过显微镜检查术，任选光学显微镜检查术使所处理的样品成像以产生生物样品的至少一个第一图像和/或测定生物样品中第一可检测标记物的量。在具体的实施方案中，生物样品是肿瘤组织样品，预先冷冻的生物样品或细胞系。在具体的实施方案中，生物样品是细胞系粒状沉淀，例如冷冻细胞系粒状沉淀。在某些实施方案中，生物样品具有大于10微米的长度和/或大于10微米的厚度。在某些实施方案中，生物样品具有大于20微米的长度和/或大于20微米的厚度。在某些实施方案中，所述的方法进一步包括：(c)在成像后清洗处理过的样品以除去所述一种或多种第一可检测标记物；(d)用一种或多种第二可检测标记物重新标记洗涤的样品；以及(e)通过显微镜检查术，任选光学显微镜检查术对重新标记的样品进行成像，以获得生物样品的至少一个生物样品的第二图像和/或测定生物样品中第二可检测标记物的量。在某些实施方案中，生物样品是肿瘤组织样品，并且所述的一种或多种第一和第二可检测标记物的至少一种与肿瘤特征相关。
在一个实施方案中，本发明包括用于诊断受试者中的肿瘤或确定肿瘤的预后的方法，它包括：(a)通过以下步骤处理从受试者获得的肿瘤组织样品：(i)在水凝胶亚单位的存在下固定该肿瘤组织样品；(ii)使水凝胶亚单位聚合以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及(iv)任选地，用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；(b)对经处理的样品进行成像以生成第一可检测标记物的至少一个肿瘤图像和/或确定第一可检测标记物的量；以及(c)相对于一个或多个对照图像或量或从正常组织、肿瘤组织、与良好预后相关的肿瘤组织或与不良预后相关的肿瘤组织获得的预定图像或量，比较肿瘤图像或量，从而确定肿瘤的存在或肿瘤的预后。
在相关的实施方案中，本发明包括用于确定受试者中的肿瘤对治疗性处理的响应的方法，它包括：(a)通过以下步骤在第一个时间点处理从受试者获得的第一肿瘤组织样品：(i)在水凝胶亚单位存在下固定该肿瘤组织样品；(ii)使水凝胶亚单位聚合以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及(iv)任选地，用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；(b)通过以下步骤在治疗性处理后的第二时间点处理从所述受试者获得的第二肿瘤组织样品：(i)在水凝胶亚单位的存在下固定所述肿瘤组织样品；(ii)使水凝胶亚单位聚合以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及(iv)任选地，用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；(c)对(a)和(b)的经处理的样品成像以产生(a)的经处理的样品的第一肿瘤图像和(b)的经处理的样品的第二肿瘤图像和/或确定(a)的处理过的样品中的一种或多种第一可检测标记物的第一量和(b)的处理过的样品中的一种或多种第一可检测标记物的第二量；(d)将第一肿瘤图像与第二肿瘤图像或一种或多种可检测标记物的第一量与第二量进行比较，其中如果第二肿瘤图像或第二量显示比第一肿瘤图像或量更少肿瘤特征，则肿瘤对治疗性处理存在有利响应，并且其中如果第二肿瘤图像或量显示比第一肿瘤图像或量更多肿瘤特征，则肿瘤对治疗性处理响应差。任选地，也以与第一和第二肿瘤组织样品相同的方式处理、成像和比较在第三或更多个时间点从受试者获得的肿瘤组织样品。
在本发明的任意方法的具体实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人，或人类疾病的动物模型。
在某些实施方案中，产生第一肿瘤图像的成像包括：将处理过的样品置于光均匀的样品操作部件中；比对在处理过的样品内多个位置处的显微装置的一个或多个光片和一个或多个检测聚焦平面；用处理过的样品执行成像操作以便从多个位置的每一个位置采集图像；基于从多个位置中的每一个位置采集的图像产生第一肿瘤图像。在某些实施方案中，成像还包括：将比对参数应用于每个位置；同时用光片照亮该位置并捕获该位置的图像；使用来自每个位置的图像构建样品的三维图像。
在任意一项所述方法的具体实施方案中，固定肿瘤组织样品包括使样品与多聚甲醛接触。
在任意一项所述方法的某些实施方案中，水凝胶亚单位包含丙烯酰胺。
在任意一项所述方法的某些实施方案中，使肿瘤组织样品聚合包括热交联。
在任意一项所述方法的某些实施方案中，清洁肿瘤组织样品包括使样品电泳。在具体的实施方案中，使用包含离子型表面活性剂，任选十二烷基硫酸钠的缓冲溶液进行电泳。在具体的实施方案中，使用约10至约60伏的电压使样品电泳；以及/或使样品电泳约15分钟至约10天的时间。
在任意一项所述方法的特定实施方案中，所述的方法还包括将经清洁的样品在封固剂中温育，所述封固剂具有与经清洁的样品的折光率基本上匹配的折光率，其中封固剂增加样品的光透明度，并且其中封固剂任选地包含甘油。
在任意一项所述方法的具体实施方案中，所述的方法还包括：(a)洗涤在成像之前或之后在第一和/或第二时间点获得的处理过的样品，以除去所述一种或多种第一可检测标记物；(b)用一种或多种第二可检测标记物重新标记洗涤过的样品；(c)通过显微镜检查术，任选通过光学显微镜检查术对重新标记的样品成像，以获得第二肿瘤图像；以及(d)如本说明书中所述检查第二肿瘤图像。
在任意一项所述方法的具体实施方案中，所述的标记和/或重新标记包括使清洁的水凝胶包埋的样品与一种或多种可检测标记物接触，所述标记物结合样品内的细胞成分或胞外成分。在某些实施方案中，细胞成分或胞外成分选自：免疫细胞标记物；癌症干细胞标记物；胞外基质蛋白；血管或微血管标记物；凋亡标记物；以及/或肿瘤标记物。在某些实施方案中，可检测标记物包含多肽，核酸或小分子。在特定的实施方案中，可检测标记物可在使用或不使用结合可检测标记物的可检测第二试剂的情况下检测。
在某些实施方案中，本说明书中所述的任何方法包括将生物样品固定或包埋入水凝胶单体的溶液中，交联包埋的水凝胶单体，清洁交联的样品，用一种或多种可检测的标记物染色经清洁的样品，并且使用COLM或本说明书中所述的另一成像方法对染色的样品成像。在特定实施方案中，将样品固定在水凝胶单体溶液中，所述水凝胶单体溶液包含丙烯酰胺和一种或多种交联剂，例如双丙烯酰胺和多聚甲醛；使丙烯酰胺交联或聚合直至水凝胶单体溶液固化；使用包含例如十二烷基硫酸钠(SDS)等洗涤剂的溶液清洁交联的样品数小时至数周或数月，然后使用一种或多种可检测的标记物对染色的样品进行染色；并且通过COLM或另一种显微镜检查技术对染色的样品成像。在特定的实施方案中，成像包括显微镜分析，其包括：将样品置于光均匀的样品操作部件中的样品室中；执行校准操作以便在样品内的多个位置处比对显微镜装置的一个或多个光片和一个或多个检测聚焦平面，以获取每个位置的比对参数；执行成像操作以便从样品内的多个位置的每一个位置采集图像；将比对参数应用于每一个位置，且同时用光片照亮该位置并捕获该位置的图像；并且使用来自每一个位置的图像构建样品的三维图像。
在任意一项所述方法的某些实施方案中，所述的方法还包括使一种或多种对照生物样品成像，例如阳性或阴性对照，以评估处理和标记。在特定的实施方案中，所述的方法还包括标记对照生物样品并对标记的样品成像。在特定的实施方案中，所述的方法包括固定，聚合，清洁和标记一种或多种对照生物样品。在特定实施方案中，对照生物样品是细胞粒状沉淀，例如培养细胞系的粒状沉淀。在某些实施方案中，对照是冷冻的或在先冷冻的细胞粒状沉淀。在特定的实施方案中，对照是在先固定和清洁的生物样品，例如，在先固定和清洁的培养细胞的粒状沉淀。在包括确定测试样品的可检测标记物的量的方法的某些实施方案中，将测定的量与对照样品的在相同条件下测定的可检测标记物的量进行比较。本发明还包括如本说明书中所述处理的细胞系粒状沉淀。在特定的实施方案中，在水凝胶亚单位的存在下固定细胞系粒状沉淀；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的细胞系粒状沉淀；(iii)如本说明书中所述清洁水凝胶包埋的样品。另外，可以冷冻如本说明书中所述处理的细胞系粒状沉淀。在某些实施方案中，细胞系粒状沉淀具有大于10微米的长度和/或大于10微米的厚度。在某些实施方案中，生物样品具有大于20微米的长度和/或大于20微米的厚度。
在某些实施方案中，所公开的内容包括试剂盒，其包含一种或多种如本说明书中所述处理的细胞系粒状沉淀，任选冷冻的粒状沉淀。在某些实施方案中，细胞粒状沉淀包含肿瘤细胞系的细胞，例如MCF7细胞。在某些实施方案中，该试剂盒还包含一种或多种可检测标记物，其结合或鉴定与肿瘤相关的生物标记物(例如，蛋白质，基因或mRNA)。在某些实施方案中，生物标记物也存在于一种或多种细胞系粒状沉淀中至少一种的细胞中。在一些实施方案中，试剂盒还包含水凝胶单体，例如包含水凝胶单体(例如，丙烯酰胺)和固定剂(例如，多聚甲醛)的固定溶液。在一些实施方案中，试剂盒还包含清洁溶液，例如包含离子表面活性剂，任选十二烷基硫酸钠的缓冲溶液。
在任意一项所述方法的某些实施方案中，肿瘤选自由如下各项组成的组：肾上腺皮质癌，肛门癌，再生障碍性贫血，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，脑肿瘤，脑癌，乳腺癌，儿童癌症，原发性起源未知的癌症，Castleman病，宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，尤因(Ewing)家族肿瘤，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，妊娠滋养层细胞疾病，头或颈癌，卡波西肉瘤，肾细胞癌，喉癌和下咽癌，肝癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肺类癌瘤，皮肤淋巴瘤，恶性间皮瘤，骨髓增生异常综合征，鼻腔和鼻旁窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔和口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，成人软组织肉瘤，基底和鳞状细胞皮肤癌，黑色素瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，甲状腺癌，子宫肉瘤，阴道癌，外阴癌，Waldenstrom巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
在一个实施方案中，所述的肿瘤是乳腺癌肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定HER2，雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，各类细胞角蛋白，Ki67，CD3，CD4，CD8，CD20，CD68或Foxp3，程序性死亡配体1(PD-L1)，程序性死亡-1(PD-1)，程序性死亡配体2(PD-L2)，细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4(CTLA-4)和雄激素受体(AR)的一种或多种。在某些实施方案中，所述的肿瘤是乳腺癌肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定人表皮生长因子受体-2(HER2或HER2/neu)，雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)或Ki-67。在某些实施方案中，可检测标记物结合靶多肽，而在其它实施方案中，其结合编码靶多肽的多核苷酸。在某些实施方案中，可检测标记物结合人靶多肽。可检测标记物可以直接检测或可以使用二级分子检测。
在一个实施方案中，所述的肿瘤是肺肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定表皮生长因子受体，包括其致敏性和抗性突变，以及ALK/ROS/RET重排，BRAF突变，以及PD-L1，PD-1，PD-L2，CTLA4，CD4，CD8，CD20，各类细胞角蛋白的一种或多种。在具体的实施方案中，PD-L1是与对用帕博利珠单抗(pembrolizumab)的治疗临床反应相关的生物标记物。在某些实施方案中，所述的肿瘤是肺肿瘤，例如，非鳞状细胞肺癌，头颈肿瘤，例如头颈部鳞状细胞癌，肾肿瘤或黑素瘤，并且一种或多种可检测的标记物结合或鉴定程序性死亡配体1(PD-L1)，CD3，CD8或叉头盒P3(FoxP3)。
在其它实施方案中，所述的肿瘤是图19中列出的癌症，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定图19中所示的相关抗原。
在一个实施方案中，所述的肿瘤是黑素瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定B-raf(BRAF)，N-ras(NRAS)，KIT，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)，α11(GNA11)/G蛋白亚基αQ(GNAQ)，细胞周期蛋白依赖性激酶-4(CDK4)和分裂原活化蛋白激酶(MEK)突变的一种或多种以及一种或多种PD-L1，PD-1，CTLA-4，CD4，CD8，CD20或各类细胞角蛋白的表达。
在一个实施方案中，所述的肿瘤是结肠癌，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定V-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物(KRAS)突变和表皮生长因子受体(EGFR)中的一种或多种，例如，EGFR表达水平。
在一个实施方案中，所述的肿瘤是前列腺肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定雄激素受体(AR)。
附图的几个视图的简述
图1举例说明根据实施方案的灌流隔室设置。
图2A-2B举例说明根据实施方案的脑和脊髓清洁。
图3A-3D举例说明根据实施方案的电泳装置的操作。
图4A-4J举例说明根据其它实施方案的电泳装置的操作。
图5A-5B举例说明根据实施方案的成像系统。
图6A和6B举例说明根据实施方案的图5A-5B的系统的电控制。
图7A-7C举例说明根据实施方案的图5A-5B的系统的图像获取。
图8举例说明根据实施方案的图5A-5B的系统的光学设置。
图9举例说明根据实施方案的具有四个检测路径的成像系统。
图10举例说明根据实施方案的图像获取和处理的方法。
图11A-11B举例说明根据实施方案的另一个成像系统。
图12举例说明根据实施方案的使用图11A-11B的系统的图像获取和处理的方法。
图13A-13C显示MCF-7冷冻细胞粒状沉淀，其在以下时机用碘化丙锭(PI)包埋、清洁和染色：清洁前(图13A)；清洁后5天(图13B)；以及在PI染色后(图13C；1000mm Z-堆叠，10mm步长)。
图14A-14D显示小鼠患者来源的异种移植物(PDX)：清洁前(图14A)；7天清洁(图14B)；用抗各类细胞角蛋白抗体染色(图14C)；以及用抗-CB11HER2抗体染色(图14D)。
图15A-15F显示人乳腺癌切除活检标本冷冻肿瘤(图15A)；在HM包埋后(图15B)；清洁35天后(图15C)；用抗-HER2亲和FITC染色(图15D)；用抗各类细胞角蛋白染色(图15E)；以及用抗Ki67一抗染色(图15F)。
图16A-16D显示如下人转移性乳腺癌淋巴结：冷冻组织(图16A)；HM包埋(图16B)；被动清洁32天后(图16C)；以及用Sytox蓝、抗各类细胞角蛋白抗体和抗CD-31抗体多重染色后(图16D)。箭头表示血管、细胞核和肿瘤。
图17A-D显示如下人肺腺癌1B期肿瘤：冷冻组织(图17A)；HM包埋的(图17B)；被动清洁32天后(图17C)；以及在用Sytox蓝、抗各类细胞角蛋白抗体和抗CD-31抗体多重染色后(图17D)。箭头指示肿瘤、细胞核和血管。
图18A和18B显示在10X(图18A)和40X(图18B)放大倍数下HM包埋和清洁的正常小鼠肾组织的苏木精和曙红(H&E)染色。
图19提供了不同类型的癌症和相关抗原的列表，例如可以根据本发明的方法在肿瘤组织样品中分析的抗原。
详细说明
在以下说明中，阐述了某些具体细节以便提供对本发明的各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在没有这些细节的情况下实施本发明。
定义
除非另外定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。出于本发明的目的，将下列术语定义如下。
除非特别说明，否则词语“a”和“an”表示一个或多个。
所谓“约”是指量，水平，数值，数字，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度，与参比量，水平，数值，数字，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度相比其变化大至30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1％。在结合术语“约”使用的数值的上下文中讨论的任何实施方案中，特别考虑可以省略术语“约”。
除非上下文另有要求，否则在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”及其变化形式，例如“含有”和“包含”应以开放式的、包含性的意义解释，即其为“包括，但不限于”。
所谓“由......组成”意味着包括并限于(无论何种情况)短语“由......组成”之后的任何内容。因此，短语“由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，并且不存在其它要素。
所谓“基本上由......组成”是指包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于所列要素的公开内容中具体说明的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
“减少的”或“降低的”或“更少的”量典型地是“统计学上显著的”量，并且可以包括低于本说明书中所述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)的减少。在特定实施方案中，其表示与参比量相比至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％的减少(包括其间的所有整数和小数点，例如15％，26％等)。
整个本说明书中对“实施方案”或“一个实施方案”的引用是指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，整个本说明书中在不同位置出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都是指相同实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
“增加的”或“增强的”量典型地是“统计学上显著的”量，并且可以包括大于本说明书中所述的量或水平的约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如，100、500、1000倍)的增加。在特定实施方案中，其表示与参比量相比至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少100％，至少150％，至少200％，至少500％或至少1000％的增加(包括其间的所有整数和小数点，例如15％，26％等)。
所谓“分离的”是指基本上或主要不含在其天然状态下通常伴随它的成分的物质。例如，如本说明书中所用，“分离的多核苷酸”包括已从其天然存在状态下其侧翼的序列中纯化的多核苷酸，例如已从通常邻近DNA片段的序列中取出的该DNA片段。或者，如本说明书中所使用，“分离的肽”或“分离的多肽”等包括肽或多肽分子从其天然细胞环境以及从与细胞的其它成分的结合的体外分离和/或纯化；即，它与体内物质没有有意义地结合。
术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原的抗原结合位点的分子；以及合成抗体。免疫球蛋白分子可以具有任何类别(例如，IgG，IgE，IgM，IgD或IgA)或亚类的免疫球蛋白分子。抗体包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，双特异性抗体，合成抗体，人源化抗体和嵌合抗体，单链抗体，Fab片段和F(ab)2片段，Fv或Fv'部分，Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗Id)抗体，或任何上述抗体的表位结合片段。如果抗体优先与抗原结合，则抗体或通常任何分子与该抗原(或其它分子)“特异性结合”，并且例如具有少于约30％，20％，10％，5％或1％的与另一种分子的交叉反应性。在一些实施方案中，使用与多种标记物交叉反应的抗体。例如，与细胞表面蛋白家族的相关成员交叉反应的抗体可用于结合展示该家族的各个成员的细胞。
如本说明书中所使用，术语“mRNA”或有时所称的“mRNA转录物”包括但不限于mRNA前转录物，转录物加工中间体，准备好供翻译的成熟mRNA和一种或多种基因的转录物，或衍生自mRNA转录物的核酸。转录物加工可以包括剪接，编辑和降解。如本说明书中所使用，衍生自mRNA转录物的核酸是指对其合成而言mRNA转录物或其亚序列最终用作模板的核酸。
所谓“从......获得”是指样品，例如生物样品或肿瘤样品从特定来源(例如，期望的生物体(例如，受试者)或期望的生物体内特定组织中分离或衍生。例如，可以从受试者获得生物样品。“衍生自”或“从......获得”也可以指生物样品或肿瘤组织样品的来源。
本说明书中所用的叙述“多核苷酸”或“核酸”是指核苷酸的聚合形式，典型地长度为至少10个碱基，为核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA和RNA。多核苷酸包括但不限于mRNA，RNA，cRNA，rRNA，cDNA，DNA和微小RNA。多核苷酸包括非编码RNA(ncRNA)，其是从DNA转录但不翻译成蛋白质的功能性RNA分子。表观遗传相关的ncRNA包括miRNA，siRNA，piRNA和lncRNA。通常，ncRNA在转录和转录后水平上起调节基因表达的作用。那些看起来参与表观遗传过程的ncRNA可分为两大类；短ncRNAs(<30nts)和长ncRNAs(>200nts)。三大类短的非编码RNA是微小RNA(miRNA)，短干扰RNA(siRNA)和piwi-相互作用RNA(piRNA)。两大类都显示在异染色质形成、组蛋白修饰、DNA甲基化靶向和基因沉默中起作用。
术语“多肽”和“蛋白质”在本说明书中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物和它们的变体以及合成和天然存在的类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物，以及天然存在的氨基酸聚合物及其天然存在的化学衍生物。
如本说明书中所使用，“受试者”包括表现症状或有表现症状的风险的任何动物，其可根据本发明进行治疗或诊断。还包括为了诊断或其它目的而需要分析生物样品(例如，肿瘤组织样品)的受试者。适合的受试者(患者)包括哺乳动物(例如，人和非人灵长类动物)，实验动物(例如，小鼠，大鼠，兔或豚鼠)，农场动物和家畜或宠物(例如，猫或狗)。
如本说明书中所使用，“治疗”包括对疾病或病况(例如，癌症)的症状或病理情况的任何期望的效应，并且可包括一种或多种可测量的正在接受治疗的疾病或病况的标记物的甚至最小变化或改善。“治疗”或“治疗”不一定表示疾病或病况或其相关症状的完全根除或治愈。接受该治疗的受试者是任何有此需要的受试者。有此需要的受试者还包括疾病的动物模型，例如用于评估药物疗法的动物模型。临床改善的举例说明性标记对于本领域技术人员而言是显而易见的。
如本说明书中所使用，“预防”包括延迟或抑制疾病或病况(例如，癌症或肿瘤转移)的症状或病理情况的发作或进展，并且可包括甚至一个或多个可测量的正在接受治疗的疾病或病况的标记物的最小变化或改善。“预防”不一定表示完全预防疾病或病况或其相关症状的发作或进展。
除非特别地有相反指示，否则本发明的实施将采用本领域的技能范围内的分子生物学和重组DNA技术的常规方法，为了说明的目的在下文描述了其中许多方法。这些技术在文献中有充分说明。见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2000)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I&II卷(D.Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑，1984)；Oligonucleotide Synthesis：Methodsand Applications(P.Herdewijn,编辑，2004)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins，编辑，1985)；Nucleic Acid Hybridization：Modern Applications(Buzdinand Lukyanov，编辑，2009)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins，编辑，1984)；Animal Cell Culture(R.Freshney,编辑，1986)；Freshney，R.I.(2005)Culture ofAnimal Cells，a Manual of Basic Technique，第5版.Hoboken NJ，John Wiley&Sons；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(第3版2010)；Farrell，R.，RNAMethodologies：A Laboratory Guide for Isolation and Characterization(第3版2005)，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：ALaboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，David Lane，EdHarlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual，Ed Harlow(编辑)，David Lane(编辑)(1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-3，4-2)，1855.Handbook of DrugScreening，编辑为Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes(2001，New York，N.Y.，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；以及Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和LindaRodgers编辑，(2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3)。
某些实施方案可采用常规生物学方法、软件和系统，用于本发明的诊断目的。本发明的计算机软件产品典型地包括计算机可读介质，其具有用于执行本发明方法的逻辑步骤的计算机可执行指令。适合的计算机可读介质包括软盘，CD-ROM/DVD/DVD-ROM，硬盘驱动器，闪存，ROM/RAM，磁带等。计算机可执行指令可以用合适合的计算机语言或几种语言的组合来编写。基本的计算生物学方法描述于例如Setubal和Meidanis等人，Introduction toComputational Biology Methods(PWS Publishing Company，Boston，1997)；Salzberg，Searles，Kasif，(Ed.)，Computational Methods in Molecular Biology，(Elsevier，Amsterdam，1998)；Rashidi和Buehler，Bioinformatics Basics：Application inBiological Science and Medicine(CRC Press，London，2000)；以及Ouelette和BzevanisBioinformatics：A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley&Sons，Inc.，第2版，2001)。见美国专利第6,420,108号。
某些实施方案可以采用各种计算机程序产品和软件用于各种目的，例如探针设计，数据管理，分析和仪器操作。见，美国专利第5,593,839号、第5,795,716号、第5,733,729号、第5,974,164号、第6,066,454号、第6,090,555号、第6,185,561号、第6,188,783号、第6,223,127号、第6,229,911号和第6,308,170号。
详细说明
本发明提供了制备和分析生物样品的方法。在特定的实施方案中，所述的方法有利于分析大的和/或完整的生物样品或样品，例如肿瘤组织样品。这些方法可用于使组织透明并适于光学显微镜检查技术，从而允许跨组织的三维结构原位检测生物标记、细胞相互作用和组织微环境。这些方法允许对生物样品的三维分析，其允许分析样品内的各种生物结构和染色模式，指示或预测疾病状态，例如肿瘤存在，肿瘤生长，肿瘤转移，肿瘤预后，肿瘤随时间的发展，和/或预测的或实际的对治疗的肿瘤响应或无响应以及抗性的发展。这些方法还允许重复分析生物样品，例如通过使用不同探针的连续分析。这允许使用各种类型的探针和试剂原位单细胞以及多细胞结构的高含量、多特征描述，以分析不同疾病标记物或指示物。此外，在肿瘤微环境(包括免疫系统)中天然状态下细胞类型之内和之间的关键生物标记物(例如，蛋白质，DNA和RNA)的检测允许更好的肿瘤表征和对药物响应和潜在抗性的理解。有效地，它捕捉肿瘤固有异质性的更好得多的快照，而不会丢失关键时空信息。因此，所述的方法提供了有价值的信息，其超过了通过肿瘤组织的薄切片或者使用不保留组织的形态和空间关系的分子技术的多切片的传统病理学分析所获得的信息。
本发明的方法可用于多种目的，包括但不限于检测和/或表征疾病组织(例如，肿瘤组织)，确定或预测肿瘤的预后或转移，随时间和/或应疗法而监测疾病(例如，肿瘤)，在实际患者和疾病的动物模型中测试候选治疗剂(例如，抗肿瘤剂)。在特定的实施方案中，本发明的方法可用于检测疾病或病况(包括出现症状前早期检测)，确定疾病或病况的预后、诊断或治疗诊断，或确定疾病或病况的阶段或进展。表征疾病组织样品还可以包括鉴定特定疾病、病况、疾病阶段和病况阶段的适当治疗或治疗功效，疾病进展，特别是疾病反复，转移性扩散或疾病复发的预测和可能性分析。本发明的方法还可用于鉴定临床上不同的类型或亚型病况或疾病(例如，癌症或肿瘤)。在进一步的实施方案中，使用组织样品实施本发明的方法，该组织样品是细胞系或3D细胞系培养物，其可以源自人或动物，并且用作例如对照或疾病模型。
本发明方法的独特核酸标记特征，包括包含CLARITY和基于水凝胶的方法的那些，有利于检测与例如肿瘤和癌症等疾病相关的各种突变，包括例如基因突变，包括那些在不表达蛋白质的非编码RNA中的突变。非编码RNA占哺乳动物转录组的98％，且GWAS研究报告了非编码RNA优先参与绝大多数人类疾病(与蛋白质编码基因相比。即使对于翻译的RNA群体，用于检测得到的抗体对于某些剪接变体，编辑的转录物，序列多态性和其它转录生物标记物仍然很大程度上是盲目的。核酸标记也非常充分适合于在异质肿瘤样品中在单细胞水平上每个特征检测的多重性。
I.一般方法
本发明的实施方案包括用于分析组织样品(例如，肿瘤组织样品)的方法，其包括：(i)处理组织样品以使其适于通过显微镜检查术进行分析；(ii)通过显微镜检查术分析处理过的组织样品。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(iii)标记组织样品，例如，用可检测的标记物标记，所述标记物特异性结合可用于表征组织样品的标记物。可以在处理组织样品之后对组织样品进行标记，或者在某些情况下，可以在处理之前对组织进行标记。另外，该方法可以使用在一个两个或多个不同时间点获得的组织样品来进行，例如，以评估疾病随时间的进展。本发明的方法可用于多种目的，包括例如检测组织样品中疾病(例如，癌症)的存在，预测疾病的预后，预测或确定疾病对特定疗法的疾病响应，预测或确定对疾病的适当疗法，以及预测或确定疾病对疗法的抗性的发展。
在特定的实施方案中，通过分析生物样品并确定样品中一种或多种生物标记物(例如，蛋白质或核酸)的存在、水平、量、位置或浓度来表征组织样品的一种或多种表型或基因型特征。在实施方案中，表征包括确定样品中的生物标记物与参比物相比是否被改变，参比物也可以称为标准品或对照。改变可以包括样品与参比物之间的任何可测定的差异，包括但不限于绝对存在或不存在，定量水平，与参比物相比的相对水平，升高或增加的水平，降低的水平，过量表达，低表达，差异表达，突变或其它改变的序列，修饰(糖基化，磷酸化，表观遗传变化)等。方法可以用于确定组织样品的生物标签，其可以包括生物标记的特定模式，例如表示需要检测的表型，例如疾病表型的生物标记的模式。当表征表型，例如诊断，预后，诊断治疗或应答者/无应答者状态的预测时，可以使用生物标签。生物标签还可用于确定治疗功效，疾病或病况的阶段，或疾病或病况的进展，或监测疾病或病况的进展或监测受试者对治疗的响应。
可以通过比较生物标记物的量或水平与参比水平或值来评估生物标记物。在某些实施方案中，参比值可以来自评估样品的相同受试者，或参比值可来自代表性样品群体(例如，来自未表现出疾病症状的正常受试者的样品；或来自具有不同组的预后或预测的生物标记物的具有相同疾病，例如乳腺癌的受试者的样品)。因此，参比值可以提供阈值测量值，该阈值测量值与在给定样品中测定的生物标记的受试者样品读数进行比较。可以根据从对应于特定群组的样品组收集的资料，包括但不限于年龄(例如，新生儿，婴儿，青少年，年轻人，中年人，老年人和不同年龄的成人)，种族/族裔群体，正常与患病的受试者，吸烟者与非吸烟者，接受疗法的受试者与未治疗的受试者，类似诊断或治疗的特定个体或受试者组的治疗的不同时间点或其组合，设置这样的参比值。此外，通过确定在特定个体的治疗的不同时间点的生物标签，可以监测个体对治疗的响应或被治疗的个体的疾病或病况的进展。
参比值可以基于来自相同受试者的所评估的样品，以便提供个性化追踪。在一些实施方案中，频繁测试来自受试者的样品中的生物标签提供与先前为该受试者建立的参比值的更好比较。这种时间过程测量用于允许临床医师更准确地评估受试者的疾病阶段或进展，或预测治疗响应/无响应，并因此提供更知情的治疗决定。在一些情况下，当比较受试者自身的生物标签随时间的变化时，生物标签的变化减小，从而允许为受试者定义个体化阈值，例如，进行诊断的阈值。
通过确定未受影响的个体中的目标生物标签，可以为没有特定表型的未受影响的个体建立参比值。例如，参比群体的参比值可以用作用于检测试验受试者中的一种或多种生物标记物的基线。如果来自受试者的样品具有与参比物相似的水平或值，则可以鉴定该受试者没有疾病，或者发生疾病的可能性低。
或者，通过测定具有表型的个体中一种或多种生物标记物的量，可以为具有特定表型的个体建立参比值或水平。另外，可以为特定表型生成值的指数。例如，不同的疾病阶段可以具有不同的值，其例如从具有不同疾病阶段的个体获得。可以将受试者的值与指数进行比较，并且可以确定疾病的诊断或预后，例如疾病阶段或进展，其中受试者的水平与指数最密切相关。在其它实施方案中，产生治疗功效的值的指数。例如，可以产生具有特定疾病的个体的生物标记物的水平并且注释什么治疗对个体有效。这些水平可用于产生比较属于受试者的值的数值，并且可以为个体选择治疗或疗法，例如，通过从受试者是否可能是治疗的应答者或无应答者的水平预测。
在一些实施方案中，通过用特异性靶向特定癌症的生物标记物的抗原分离或检测生物标记物，确定未受特定癌症影响的个体的参比值。作为非限制性实例，可以使用针对未受影响的个体描述的相同技术来调查具有不同癌症阶段的个体，并且可以确定每个组的生物标记物的水平。在一些实施方案中，将水平定义为至少两次独立实验的平均值+/-标准偏差，所述的实验至少一式两份或一式三份进行。可以使用统计学检验来进行这些组之间的比较，以确定观察到的区分生物标记物的统计学显著性。在一些实施方案中，使用参数统计学检验确定统计学显著性。参数统计学检验可以包括但不限于部分析因设计，方差分析(ANOVA)，t检验，最小二乘法，Pearson相关性，简单线性回归，非线性回归，多元线性回归或多元非线性回归。或者，参数统计学检验可以包括单因素方差分析，两因素方差分析，或方差的重复测量分析。在其它实施方案中，使用非参数统计学检验确定统计学显著性。实例包括但不限于Wilcoxon符号秩检验，曼-怀(Mann-Whitney)检验，克-瓦(Kruskal-Wallis)检验，弗里德曼(Friedman)检验，Spearman秩序相关系数，Kendall Tau分析和非参数回归检验。在一些实施方案中，p值小于0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005或0.0001，确定统计显著性。还可以针对多重比较校正p值，例如，使用Bonferroni校正，其改进形式或本领域技术人员已知的其它技术，例如Hochberg校正，Holm-Bonferroni校正，{hacek over(S)}idak校正，Dunnett校正或Tukey多重比较。在一些实施方案中，ANOVA之后进行Tukey校正，用于来自每个群体的生物标记物的事后(post)检验比较。
在特定实施方案中，还可以建立参比值用于疾病复发监测，用于治疗反应监测，或用于预测应答者/非应答者状态。
本发明的方法可以在与各种不同疾病相关的各种不同组织类型和组织上实施，包括但不限于本说明书中所述的各种肿瘤和癌症。本说明书中描述了用于通过显微镜检查术处理组织样品、标记组织样品和分析组织样品的举例说明性方法。可以以任何方式组合各种处理方法、标记方法和显微镜检查术方法中的任何一种以实施本发明。
在特定的实施方案中，本发明的方法涉及分析或检测生物样品的两种或更多种不同特征或成分。这些可以通过在物理或时间上同时、顺序地或以重叠的方式进行分析。可以同时分析两种或更多种成分(例如，特定细胞，多肽或多核苷酸的存在或表达)，例如，使用两种或更多种不同标记的可检测探针(区分两种或更多种成分)。本发明的一个优点在于可以使用一种方法，例如使用特定探针分析经处理的生物样品，然后可以从生物样品中去除或洗涤那些探针，然后可以使用第二种方法，例如，使用不同的探针分析。在特定的实施方案中，所述的方法包括分析或检测第一种特征或成分，然后分析或检测第二种特征或成分。在某些实施方案中，可以使用相同类型的探针(例如，抗体或核酸探针)分析两种或更多种特征或成分，而在其它实施方案中，使用不同类型的探针分析它们。
在特定的实施方案中，在不同时间点从受试者获得两种或更多种肿瘤组织样品，并根据本发明方法分析，例如，以确定用抗肿瘤药物治疗的有效性。这些可以从受试者内的相同或不同的肿瘤或部位获得。例如，在某些实施方案中，获得第一肿瘤组织样品作为在第一时间点切除治疗性去除原发性肿瘤，并且在第二时间点从受试者中的不同肿瘤获得第二肿瘤组织样品。例如，其可以是原发性肿瘤或继发性肿瘤的转移。在特定的实施方案中，第二肿瘤组织样品包含与第一肿瘤组织样品相同类型的肿瘤细胞，并且任选地从第一肿瘤衍生为转移瘤。
特异性结合本说明书中所述的蛋白质和核酸的抗体及其片段和其它结合剂(例如，肽和适配体)是本领域中已知的和可获得的，或者可以例如基于靶基因或mRNA的核酸序列容易地产生。在特定的实施方案中，抗体或其它结合剂被可检测地标记，或被可检测标记物的第二结合剂结合。可以使用多种可检测分子，例如放射性同位素，荧光染料，染料，酶，纳米粒状沉淀，化学发光标记，生物素，量子点或本领域中已知的可以直接(例如，通过光发射)或间接地(例如，通过结合荧光标记的抗体)检测的其它单体。
可检测标记物的应用在本领域中是众所周知的。用于缀合多肽和可检测标记物的方法是本领域中所熟知的，使用可检测标记物进行成像的方法也是如此。可检测标记物的实例包括但不限于放射性核苷酸，酶，辅酶，荧光剂，化学发光剂，色原，酶底物或辅因子，酶抑制剂，辅基配合物，自由基，粒状沉淀，染料等。几种放射性同位素可用作标记肽的可检测分子，包括例如32P，33P，35S，3H和125I。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基配合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮，荧光素，异硫氰酸荧光素，罗丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白，香豆素，Alexa488，俄勒冈绿488，罗丹明绿，Alexa 532，Cy3，Bodipy 588/586，Alexa586，TAMRA，Rox，Alexa 594，德克萨斯红，Bodipy 630/650，Cy5，Alexa647，IR Dye 680，IR Dye 680，IR Dye 700DX，Cy5.5，Alexa750，IR Dye 800CW，IR Dye 800，Atto 532，Atto 465；发光材料的实例是鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶，萤光素和水母发光蛋白；且适合的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。在一些实施方案中，可检测标记物包括荧光蛋白。适合的荧光蛋白包括TagBFP、mTagBFP2、扁青、EBFP2、mKalama1、Sirius、蓝宝石、T-蓝宝石、ECFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-cyan、TagCFP、mTFP1、GFP、EGFP、Emeral、Superfolder GFP、单体Azami绿、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover、mNeonGreen、EYFP、YFP、Citrine、Venus、SYFP2、TagYFP、单体Kusabira Orange、MKOK、mKO2、mOrange、mOrange2、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP1、mApple、mRuby、mRuby2、TagRFP675、IFP1.4、iFRP、mKeima绿、LSS-mKate1、LSS-mKate2、mBeRFP、PA-GFP、PAmCherryl、PATagRFP、Kaede绿、Kaede绿、KikGR1绿、KikGR1绿、PS-CFP2，mEos2绿、mEos2绿、mEos3.2绿、mEos3.2绿、PSmOrange。在本发明的一些实施方案中，可检测标记物还包括适合于荧光共振能量转移(FRET)配对的猝灭剂。适合猝灭剂的实例包括Dabcyl、BHQ1、BHQ2、BHQ3、CY5Q、CY7Q、Iowablack FQ、Iowablack RQ、IR Dye QC-1、QSY35、QSKY7、QXL570、QXL610、QXL680。
II.生物样品的制备
本发明的方法包括制备用于分析，例如显微图像分析的生物样品。
A.生物样品
生物样品包括从受试者例如哺乳动物获得的组织或器官样品。在某些实施方案中，所述受试者被诊断患有疾病或病况，例如癌性肿瘤，或被认为处于患有或发生所述疾病或病况的风险中。生物样品也可以从健康供体获得，例如作为正常对照样品。在某些实施方案中，疾病组织(例如，肿瘤组织)样品和正常样品均获自相同受试者。在特定的实施方案中，生物样品获自患者，例如哺乳动物，例如人。在其它实施方案中，从疾病的动物模型获得生物样品。各种疾病的动物模型是本领域中已知的并且是可获得的。特定的癌症动物模型包括但不限于例如小鼠或大鼠中的异种移植物模型，同基因模型和PDx模型。动物模型还可以包括导入动物模型的人类细胞，癌细胞或其它细胞，其中可以评估肿瘤特性，进展和治疗。体外3D组织排列，类器官和干或iPS细胞衍生的3D组合物也是相关模型，并且这些可以包括例如人或其它动物细胞。
适用于本说明书中所述的方法和系统的生物组织样品通常包括从活的或死的受试者采集的任何类型的组织样品，例如肿瘤组织和尸检样品。可以使用本说明书中所述的方法和系统采集和处理组织样品，并在加工后立即进行显微镜分析，或者可以保存组织样品并在将来的时间进行显微镜分析，例如在储存一段延长的时间之后。在一些实施方案中，本说明书中所述的方法可用于以稳定的、可接近的和完整的形式保存组织样品用于将来的分析。例如，可以如本说明书中所述处理组织样品，例如人肿瘤组织样品，并清洁以去除多种细胞成分，例如脂质，然后储存用于将来的分析。在一些实施方案中，本说明书中描述的方法和系统可用于分析新鲜的生物样品。在一些实施方案中，本说明书中描述的方法和系统可用于分析在先保存的(例如，预先固定的)或存储的生物样品(例如，组织样品)。例如，在一些实施方案中，可以如本说明书中所述处理和分析未经过本说明书中所述的样品制备过程的在先保存的组织样品。在特定方法中，冷冻组织样品，然后如本说明书中所述进行处理。
在某些实施方案中，生物样品是肿瘤组织样品。肿瘤样品可仅含有肿瘤细胞，或者它们可含有肿瘤细胞和非肿瘤细胞。在特定的实施方案中，生物样品仅包含非肿瘤细胞。在特定的实施方案中，所述的肿瘤是实体瘤。在特定的实施方案中，生物样品获自或包含肾上腺皮质癌，肛门癌，再生障碍性贫血，胆管癌，膀胱癌，骨癌，骨转移，脑肿瘤，脑癌，乳腺癌，儿童癌，未知原发性来源的癌症，Castleman病，宫颈癌，结肠/直肠癌，子宫内膜癌，食道癌，尤因肿瘤家族，眼癌，胆囊癌，胃肠道类癌瘤，胃肠道间质瘤，妊娠滋养层细胞疾病，头颈癌，卡波西肉瘤，肾细胞癌，喉癌和下咽癌，肝癌，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，肺类癌瘤，皮肤淋巴瘤，恶性间皮瘤，骨髓增生异常综合征，鼻腔或鼻窦癌，鼻咽癌，神经母细胞瘤，口腔或口咽癌，骨肉瘤，卵巢癌，胰腺癌，阴茎癌，垂体瘤，前列腺癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，成人软组织肉瘤，基底或鳞状细胞皮肤癌，黑色素瘤，小肠癌，胃癌，睾丸癌，咽喉癌，胸腺癌，甲状腺癌，子宫肉瘤，阴道癌由癌症治疗引起的外阴癌，Waldenstrom巨球蛋白血症，肾母细胞瘤和因癌症治疗导致的继发性癌症，其为得自被诊断患有或疑似患有任何这些肿瘤或癌症的受试者的生物样品。
本发明的方法可用于表征癌症或其转移，包括但不限于癌，肉瘤，淋巴瘤或白血病，生殖细胞肿瘤，胚细胞瘤或其它癌症。癌包括但不限于上皮肿瘤，鳞状细胞肿瘤，鳞状细胞癌，基底细胞肿瘤，基底细胞癌，移行细胞乳头状瘤和癌，腺瘤和腺癌(腺体)，腺瘤，腺癌，皮革样胃，胰岛素瘤，乳腺炎，胰岛素瘤，胰高血糖素瘤，胃泌素瘤，胰腺瘤，胆管上皮癌，肝细胞癌，腺样囊性癌，阑尾类癌瘤，催乳素瘤，嗜酸粒细胞腺瘤，hurthle细胞腺瘤，肾细胞癌，grawitz瘤，多发性内分泌腺瘤，子宫内膜样腺瘤，附件和皮肤附属肿瘤，粘液表皮样瘤，囊性、粘蛋白和浆液性肿瘤，囊腺瘤，腹膜假性粘液瘤，导管、小叶和髓质肿瘤，腺泡细胞肿瘤，复杂上皮肿瘤，warthin瘤，胸腺瘤，特殊的性腺肿瘤，性索间质肿瘤，泡膜细胞瘤，粒层细胞瘤，卵巢雄性细胞瘤，男性细胞瘤，血管球瘤，副神经节瘤，嗜铬细胞瘤，血管球瘤，痣和黑色素瘤，黑素细胞痣，恶性黑素瘤，黑色素瘤，结节性黑素瘤，发育不良痣，恶性雀斑样黑素瘤，恶性黑色素瘤，浅表扩散黑性素瘤和恶性肢端黑色素瘤。肉瘤包括但不限于Askin瘤，botryodies，软骨肉瘤，尤文氏肉瘤，恶性内皮瘤，恶性神经鞘瘤，骨肉瘤，软组织肉瘤，包括：肺泡软组织肉瘤，血管肉瘤，叶状囊性肉瘤，皮肤纤维肉瘤，类结缔织瘤，硬纤维瘤，结缔组织增生性小圆细胞肿瘤，上皮样肉瘤，骨外软骨肉瘤，骨外骨肉瘤，纤维肉瘤，血管外皮细胞瘤，血管肉瘤，卡波西肉瘤，平滑肌肉瘤，脂肪肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴肉瘤，恶性纤维组织细胞瘤，神经纤维肉瘤，横纹肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限于慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞白血病，淋巴浆细胞性淋巴瘤(如waldenstrom巨球蛋白血症)，脾边缘区淋巴瘤，浆细胞性骨髓瘤，浆细胞瘤，单克隆免疫球蛋白沉积疾病，重链病，结外边缘区B细胞淋巴瘤，又称MALT淋巴瘤，淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(nmzl)，滤泡淋巴瘤，外套细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤，血管内大B细胞淋巴瘤，原发性渗出性积液淋巴瘤，伯基特淋巴瘤/白血病，T细胞幼淋巴细胞白血病，T细胞大粒状沉淀淋巴细胞白血病，侵袭性NK细胞白血病，成人T细胞白血病/淋巴瘤，结节外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型、肠病型T细胞淋巴瘤，肝脾T细胞淋巴瘤，亚急性NK细胞淋巴瘤，蕈样真菌病/塞泽瑞综合征，原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性疾病，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤，淋巴瘤样丘疹病，血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤，外周T细胞淋巴瘤，未指明的间变性大细胞淋巴瘤，经典霍奇金淋巴瘤(结节性硬化，混合细胞型，富含淋巴细胞，淋巴细胞耗尽或未耗竭))和结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤。生殖细胞肿瘤包括但不限于生殖细胞瘤，无性细胞瘤，精原细胞瘤，非生殖细胞瘤的胚细胞瘤，胚胎癌，内胚层窦肿瘤，绒毛膜癌，畸胎瘤，多胚瘤和性腺母细胞瘤。母细胞瘤包括但不限于肾母细胞瘤，髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。其它癌症包括但不限于唇癌，喉癌，下咽癌，舌癌，唾液腺癌，胃癌，腺癌，甲状腺癌(髓样和乳头状甲状腺癌)，肾癌，肾实质癌，子宫颈癌，子宫体癌，子宫内膜癌，绒毛膜癌，睾丸癌，泌尿癌，黑色素瘤，脑肿瘤如胶质母细胞瘤，星形细胞瘤，脑膜瘤，髓母细胞瘤和外周神经外胚层肿瘤，胆囊癌，支气管癌，多发性骨髓瘤，基底细胞瘤，畸胎瘤，视网膜母细胞瘤，脉络膜黑素瘤，精原细胞瘤，横纹肌肉瘤，颅咽肌瘤，骨肉瘤，软骨肉瘤，肌肉瘤，脂肪肉瘤，纤维肉瘤，尤文肉瘤和浆细胞瘤。
在另一个实施方案中，进行分析的癌症可以是肺癌，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌(包括小细胞癌(燕麦细胞癌)，混合小细胞/大细胞癌和组合的小细胞癌)，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，胰腺癌，脑癌，肾癌，卵巢癌，胃癌，皮肤癌，骨癌，胃癌，乳腺癌，胰腺癌，神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，肝细胞癌，乳头状肾癌，头颈部鳞状细胞癌，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤或实体瘤。
可以通过本领域中已知和可获得的任何方法从受试者获得生物样品。在特定的实施方案中，通过细针抽吸，中心穿刺活组织检查，立体定向中心穿刺活组织检查，真空辅助中心活组织检查或手术活组织检查从受试者获得生物样品，例如肿瘤组织样品。在特定的实施方案中，手术活组织检查是切口活组织检查，其仅移除可疑区域的一部分。在其它实施方案中，手术活组织检查是切除活组织检查，其摘除整个患病组织(例如，肿瘤)或异常区域。在特定的实施方案中，切除肿瘤组织样品获自已切除以在早期疾病的情况下“治愈”患者的肿瘤，其中在其它实施方案中，切除的肿瘤组织样品获自晚期疾病中原发肿瘤的切除块。肿瘤组织样品可包括原发性肿瘤组织，转移性肿瘤组织和/或继发性肿瘤组织。肿瘤组织样品可以是细胞培养物，例如肿瘤来源的细胞系的培养物。在某些实施方案中，生物样品是细胞系，例如培养细胞系的细胞粒状沉淀，例如肿瘤细胞系。在特定的实施方案中，细胞系或细胞粒状沉淀是冷冻的或预先冷冻的。这种细胞系和沉淀是有用的，例如，作为用各种试剂成像的阳性或阴性对照。肿瘤组织样品也可以是异种移植肿瘤，例如从施用肿瘤细胞的动物获得的肿瘤，例如人肿瘤细胞系。本发明包括水凝胶包埋的细胞粒状沉淀，包括如本说明书中所述处理的细胞粒状沉淀，例如用作对照。在特定的实施方案中，在水凝胶亚单位存在下固定细胞粒状沉淀，然后使水凝胶亚单位聚合以形成水凝胶包埋的细胞粒状沉淀。在某些实施方案中，水凝胶包埋的细胞粒状沉淀物也被清洁，例如，如本说明书中所述。在某些实施方案中，将细胞粒状沉淀冷冻。在某些实施方案中，来自受试者的第一肿瘤组织样品是在旨在移除整个肿瘤的初始手术期间获得的原发性肿瘤组织样品，并且从相同受试者获得的第二肿瘤组织样品是转移性肿瘤组织样品或在稍后的手术中获得的继发性肿瘤组织样品。
生物样品，例如肿瘤组织样品，可以通过外科手术或使用腹腔镜获得。生物样品可以是从身体的任何部分获得的组织样品，以检查其疾病或损伤，例如癌组织或细胞的存在，或其程度或特征。在特定的实施方案中，生物样品包括腹部组织，骨，骨髓，乳房组织，子宫内膜组织，肾组织，肝组织，肺或胸组织，淋巴结，神经组织，皮肤，睾丸组织，头部或颈部组织，或甲状腺组织。在某些实施方案中，组织获自脑，乳腺，皮肤，骨，关节，骨骼肌，平滑肌，红骨髓，胸腺，淋巴管，胸导管，脾，淋巴结，鼻腔，咽，喉，气管，支气管，肺，口腔，食道，肝脏，胃，小肠，大肠，直肠，肛门，脊髓，神经，松果腺，垂体，甲状腺，胸腺，肾上腺，胰腺，卵巢，睾丸，心脏，血管，肾，子宫，膀胱，尿道，前列腺，阴茎，前列腺，睾丸，阴囊，输精管，乳腺，卵巢，子宫，阴道或输卵管。
在特定的实施方案中，生物样品具有大于典型地通过传统病理学薄切片或免疫组织化学分析检查的切片的尺寸，其典型地在4-10微米厚的范围内。在某些实施方案中，生物样品大于20微米，大于50微米，大于100微米，大于200微米，大于500微米，大于1毫米，大于2毫米，大于5毫米，大于10毫米或大于20毫米厚度和/或长度。在特定的实施方案中，生物样品具有20微米至20毫米，20微米至10毫米，或50微米至1毫米的长度和/或厚度。在某些实施方案中，生物样品是立方体样品，其具有每边大于10微米，大于20微米，大于50微米，大于100微米，大于200微米，大于500微米，大于1毫米，大于2毫米，大于5毫米，大于10毫米，或大于2毫米的厚度和/或长度。在一些实施方案中，生物样品较薄，例如厚度为约4-10或4-20微米。
B.制备生物样品的方法
本发明的方法包括制备用于显微镜分析的生物样品(例如，肿瘤组织样品)。显微镜分析可以包括但不限于光学显微镜检查术(例如，明视野，斜面照明，暗视野，相差，鉴别性干扰相差，干扰反射，表面荧光，共焦，双光子，暂时聚焦，使用或不使用景深扩展检测方法等的光学片，显微镜检查术)，激光显微镜检查术，电子显微镜检查术和扫描探针显微镜检查术。这些方法发现了许多用途，例如在医学和研究中，例如，用于诊断或监测疾病(例如，癌性肿瘤)，用于研究健康或患病组织(例如，癌性肿瘤)，用于筛选候选药剂(例如，抗肿瘤剂)和在疾病改善中的毒性和效能。还提供了可用于实施主题方法的试剂、装置、试剂盒和系统。
在一些实施方案中，如2013年3月13日提交的PCT申请公开号WO2014025392(“‘392公开文本”)、标题为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREPARING BIOLOGICAL SPECIMENSFOR MICROSCOPICANALYSIS”中所一般性描述的制备生物样品，通过引用将该文献的全部内容并入本说明书。在特定的实施方案中，制备生物样品包括固定或保留生物样品的一种或多种结构特征或成分，例如肿瘤组织样品的细胞、血管和/或胞外基质，并且还除去生物样品的一种或多种成分，例如脂质。这些方法可用于保持组织的三维构造或结构或其一种或多种成分，同时去除一种或多种干扰生物样品的显微镜分析的成分。
在特定的实施方案中，在水凝胶亚单位(例如，水凝胶单体)存在下固定生物样品(例如，肿瘤组织样品)。在一些实施方案中，固定包括将样品(例如，样品的细胞)暴露于固定剂，使得细胞成分彼此交联。水凝胶/水凝胶网状构造可以包括任何适合的水不溶性聚合物链网状构造，有时发现为胶体凝胶，其中水是分散介质。换句话说，水凝胶可以属于一类可以吸收大量水而不溶解的聚合物材料。水凝胶可含有超过99％的水，并且可包含天然或合成聚合物或其组合。水凝胶还具有与天然组织非常相似的一定程度的柔韧性，因为它们具有显著的含水量。适合的水凝胶的详细描述可以在公开的美国专利申请20100055733中找到，通过引用将该专利申请并入本说明书并且如下详述。适合的水凝胶的实例包括丙烯酰胺。通过本领域的方法可容易地确定提供所需水凝胶特征的水凝胶亚单位和改性剂的浓度。水凝胶亚单位或水凝胶前体可包括亲水单体，预聚物或可交联或“聚合”的聚合物，以形成三维(3D)水凝胶网状构造。不受科学理论的束缚，认为在水凝胶亚单位存在下生物样品的这种固定将样品的成分交联至水凝胶亚单位，从而将分子成分固定在适当位置，保留组织构造和细胞形态。
在一些实施方案中，生物样品的制备可以包括组织或凝胶-组织复合物的溶胀或膨胀，如Tomer，R.T等人，Nature Protocols，第9卷，第71682-1697期(2014年6月)中所示，用于探针和标记的更高分辨率接近或更好的渗透渗透性，组织或凝胶-组织复合物的收缩，以便在给定工作距离下更好地进入物镜或减少数据集大小，消化或者分离例如蛋白质之类的成分与大量去除成分分开(例如，如美国专利申请公开号20140030192中所述，通过引用将其全部内容并入本说明书)，和/或设计为允许适当获得生物信息的任何其它方法。
可以在固定剂/水凝胶组合物中使用任何便利的固定剂，或“固定剂”可以用于以在水凝胶亚单位存在下固定生物样品，例如甲醛，多聚甲醛，戊二醛或任何其它醛，丙酮，乙醇，甲醇，氨基醇等。
在一些实施方案中，可以在缓冲液中稀释固定剂，例如盐水，磷酸盐缓冲液(PB)，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，柠檬酸缓冲液，磷酸钾缓冲液等，通常浓度约为1-10％，例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％或10％，例如4％多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液；2％多聚甲醛/0.2％苦味酸/0.1M磷酸盐缓冲液；在0.1M磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛/0.2％高碘酸盐/1.2％赖氨酸；4％多聚甲醛/0.05％戊二醛磷酸盐缓冲液；使用的固定剂的类型和暴露于固定剂的持续时间可以取决于生物样品中感兴趣的分子对固定剂变性的敏感性，并且使用常规组织化学或免疫组织化学技术可以容易地确定，例如，如Buchwalow和Bocker.Immunohistochemistry：Basics and Methods.Springer-Verlag BerlinHeidelberg 2010中所述。
水凝胶组合物，例如固定剂/水凝胶溶液可以包括任何便利的水凝胶亚单位/单体，例如，但不限于聚(乙二醇)及其衍生物(例如，PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)，PEG-RGD)，聚脂肪族聚氨酯，聚醚聚氨酯，聚酯聚氨酯，聚乙烯共聚物，聚酰胺，聚乙烯醇，聚丙二醇，聚四甲烯，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酰胺，聚(丙烯酸羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸羟乙酯)，胶原蛋白，透明质酸，脱乙酰壳多糖，葡聚糖，琼脂糖，明胶，藻酸盐，蛋白质聚合物，甲基纤维素等。在一些实施方案中，可以修饰水凝胶亚单元以向水凝胶增加特定性质；例如，可掺入肽序列以诱导降解(见，例如West和Hubbell，1999，Macromolecules，32：241)，或改变细胞粘附(见，例如Hem和Hubbell，1998，J.Biomed.Mater.Res.，39：266)。试剂例如亲水性纳米粒(例如，聚乳酸(PLA)，聚乙醇酸(PLG)，聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)，聚苯乙烯，聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)等)可用于改善水凝胶的渗透性，同时保持可图案化(见，例如，美国专利申请号13/065,030；Lee W.等人2010Proc.Natl.Acad.Sci.107，20709-20714)。例如PEG的嵌段共聚物、可降解的PEO、聚(乳酸)(PLA)和其它类似材料这样的材料可用于为水凝胶增加特定性质(见，例如，Huh和Bae，1999，Polymer，40：6147)。可以包括交联剂(例如，双丙烯酰胺，二氮杂环丙烯等)和引发剂(例如，偶氮二异丁腈(AIBN)，核黄素，L-精氨酸等)以促进后续聚合步骤中相互作用的大分子之间的共价键合。
在一些实施方案中，水凝胶亚单位和改性剂的浓度和分子量将取决于所选择的聚合物和期望的需特征，例如聚合它们的水凝胶网状构造的孔径，溶胀性质，电导率，弹性/硬度(杨氏模量)，生物降解性指数等。例如，可能需要水凝胶包含足够大小的孔以允许大分子(例如，如下文更详细描述的蛋白质，核酸或小分子)进入样品中。孔径通常随着水凝胶亚单位浓度的增加而降低，并且通常随着水凝胶亚单位与交联剂的比例的增加而增加，并且将制备包含允许这种大分子通过的浓度的水凝胶亚单位的固定剂/水凝胶组合物。作为另一个实例，可能需要水凝胶具有特定的硬度，例如，以提供处理包埋的样品中的稳定性，例如约2-70kN/m 2的杨氏模量，例如约2kN/m2、约4kN/m2、约7kN/m2、约10kN/m2、约15kN/m2、约20kN/m2、约40kNm2、不超过约70kN/m2，包括其间的所有值和子范围。
水凝胶网状构造的弹性可受多种因素的影响，包括聚合物的支化，水凝胶亚单位的浓度和交联度，并且制备包含一定浓度的水凝胶的固定剂/水凝胶组合物，以提供这类期望的弹性。因此，例如，固定剂/水凝胶组合物可包含浓度约1％w/v至约20％w/v，例如约2％至约15％、约3％至约10％、约4％至约8％的丙烯酰胺单体，包括其间的所有值和子范围；以及浓度在约0.01％至约0.075％之间，例如0.01％、0.02％、0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％或0.075％的双丙烯酰胺交联剂，包括其间的所有值和子范围；或例如，固定剂/水凝胶组合物可以包括PEG预聚物，其具有至少约2.5K至约50K，例如2.5K或更大、3.5K或更大、5K或更大、7.5K或更大、10K或更大、15K或更大、20K或更大、不超过约50K的分子量，包括其间的所有值和子范围；约1％w/w至约50％w/w，例如1％或更大、5％或更大、7.5％或更大、10％或更大、15％或更大、20％或更大、30％或更大、40％或更大、不超过约50％的浓度，包括其间的所有值和子范围。提供期望的水凝胶特征的水凝胶亚单位和改性剂的浓度易于通过适合的方法或如PCT公开号WO2014/025392中所述测定，通过引用将该文献的全部内容并入本说明书。在某些实施方案中，水凝胶单体溶液包括交联剂，例如双丙烯酰胺。水凝胶单体溶液包括引发剂，例如VA-044引发剂。水凝胶单体溶液还可以包含多聚甲醛。一种举例说明性的单体固体溶液如实施例1中所述。
可以将固定剂/水凝胶溶液通过任何便利的方法递送至样品，例如灌流，注射，滴注，吸收，施用，浸没/浸入等。使样品典型地在水凝胶存在下固定15分钟或更长时间，例如，30分钟或更长时间、1小时或更长时间、2小时或更长时间、4小时或更长时间、6小时或更长时间、12小时或更长时间，在一些情况中，为16小时或更长时间、20小时或更长时间、24小时或更长时间、48小时或更长时间或72小时或更长时间，包括其间的所有值和子范围。在某些实施方案中，将样品包埋在水凝胶中24-72小时。
在一些实施方案中，在固定样品后，聚合水凝胶亚单位，即共价或物理交联，以形成水凝胶网状构造。聚合可以通过任何方法进行，包括但不限于热交联，化学交联，物理交联，离子交联，光交联，辐射交联(例如，x射线，电子束)等，并且可以基于所用水凝胶的类型选择。例如，未聚合或部分聚合的树脂与特定交联化学品的混合导致形成交联物的化学反应。在通常通过暴露于辐射源的热塑性材料中可以诱导交联，例如电子束暴露，γ辐射或UV光；例如，电子束加工用于聚合C型交联聚乙烯。其它类型的交联聚乙烯通过在挤出期间加入过氧化物(A型)或通过在挤出过程中加入交联剂(例如，乙烯基硅烷)和催化剂然后进行挤出后固化来制备。许多聚合物经历氧化交联，典型地在暴露于大气氧时。在某些情况下，反应比期望的更快，因此聚合反应可能涉及使用抗氧化剂来减缓氧化交联物的形成。在其它情况下，例如，当需要通过氧化更快地形成交联物时，可以使用氧化剂如过氧化氢来加速该过程。可以包括偶氮引发剂如VA-044引发剂。聚合的时间长度取决于所用的水凝胶亚单位的类型和所选择的聚合方法，但典型地约15分钟至约48小时，例如，15分钟或更长时间、1小时或更长时间、2小时或更长时间、3小时或更长时间、4小时或更长时间、6小时或更长时间、12小时或更长时间、16小时或更长时间、24小时或更长时间，或在某些情况下，为48小时，包括其间的所有值和子范围。在特定的实施方案中，使样品聚合直至水凝胶单体溶液固化。
在一些实施方案中，通过例如Murray E.等人Cell 163，1500-1514(2015)中描述的SWITCH方法固定和/或交联样品。SWITCH(化学物质的相互作用时间和动力学的系统-广泛控制)通过一组缓冲液控制组织处理中的一系列化学反应：一种促进外源性化学物质与内源性生物分子之间的化学反应的SWITCH启动缓冲液，以及抑制反应的SWITCH关闭缓冲液。
在某些实施方案中，处理(例如，固定和交联)样品并如Ku，T.等人在2016年7月25日在线发表的Nature Biotechnology中所述进行成像。其中所描述的方法，蛋白质组的放大分析(MAP)将组织样品线性扩展四倍，同时保留其整体结构和三维蛋白质组组织结构。
一旦聚合，可以清洁水凝胶包埋的(即水凝胶-杂化的)生物样品，即除去一种或多种组织成分。清洁可包括确保使样品基本上可透光，即透明的。换句话说，用于照射样品的可见(即，白色)光、紫外光或红外光的约70％或更多将通过样品并仅照射其中的选定细胞成分，例如75％或更多在一些情况下，光的80％或更多，光的85％或更多，光的90％或更多，光的95％或更多，光的98％或更多，例如，光的100％(包括其间的所有值和子范围)将通过样品。样品的光学性质的这种变化提供了组织内部细胞和亚细胞结构的可视化。
任何将一种或多种细胞成分(例如，脂质)压出样品，从样品中抽出细胞成分(例如，脂质)或使细胞成分(例如，脂质)分解(即溶解)在样品中的任何处理都可以用于清洁样品，其包括但不限于暴露于有机溶剂如二甲苯、乙醇或甲醇，暴露于洗涤剂如皂苷、TritonX-100和吐温-20，暴露于离子表面活性剂，例如，十二烷基硫酸钠(SDS)，电泳(例如，使用如本说明书中所述的电泳装置)，流体压力，超声振动，溶质显影，微波辐射，血管循环等。在某些情况下，使用不淬灭荧光蛋白的溶剂进行清洁。已知淬灭荧光蛋白的有机溶剂的实例包括四氢呋喃，己烷，苄醇/苯甲酸苄酯(BABB)和二苄醚。因此，为了保持各种蛋白质的荧光，在一些实施方案中，使用除上述溶剂之外的溶剂进行清洁，例如，使用非有机溶剂进行清洁。
在一些情况下，使用离子表面活性剂(例如，SDS)进行清洁，以通过主动将带电荷的离子胶束输送出被经清洁的样品来加速清洁过程。清洁可以在与所选清洁方法相容的任何便利的缓冲液中进行，如本领域中已知的，例如盐水，磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲盐水(PBS)，硼酸钠缓冲液，硼酸缓冲液，柠檬酸缓冲液等，典型地，每厘米厚度的样品需要约1-10天，即通常约1天，在某些情况下为2天，有时为5天，典型地不超过10天/立方厘米。在某些实施方案中，清洁可能需要两天至两或三个月。在一些实施方案中，清洁溶液包含缓冲液，例如硼酸盐缓冲液和SDS。在实施例1中描述了包含200mM硼酸盐缓冲液、pH 8.5和8％SDS的一种特定清洁溶液。在一些实施方案中，为了清楚起见，可以通过目视检查样品容易地确定最佳清洁时间。
在某些实施方案中，通过主动清澈技术-大分子的压力相关的有效和稳定转移到器官(ACT-PRESTO)中的方法清洁组织，该方法描述于Lee，E.等人Sci.Rep.6 18631(2016)中。该方法是CLARITY的改进形式，其采用两步固定方案：多聚甲醛(PFA)固定，然后在没有双丙烯酰胺的情况下进行丙烯酰胺融合，然后通过主动清澈技术(ACT)清洁。使用具有铂板的改进ETC隔室系统进行清洁，以在ETC隔室中产生致密规则电流。
清洁后，样品通常基本上不含脂质。在一些实施方案中，清洁前样品中存在的脂质的原始量可减少约70％或更多，例如75％或更多，例如80％或更多，例如85％或更多，例如90％或更多，例如95％或更多，例如99％或更多，例如100％，包括其间的所有值和子范围。
在某些情况下，对于显微镜分析，不需要进一步操作样品。例如，样品可包含可通过显微镜直接观察的结构或生物分子。该结构或生物分子通常可包括但不限于组织或细胞内的细胞，脉管系统，胞外基质，淋巴管，蛋白质，脂质，类固醇，核酸等。
另外或可替代地，在一些实施方案中，可能需要在显微镜分析之前使样品的细胞和细胞内结构与一种或多种大分子接触，如本说明书中所进一步详细描述的。例如，可以提供促进特定组织成分或结构或细胞生物分子(例如，脉管系统，胞外基质，细胞(例如，免疫细胞或干细胞)，淋巴管，蛋白质，脂质，类固醇，核酸等)和亚细胞结构的可视化的大分子。在一些实施方案中，大分子是诊断性的。在一些实施方案中，大分子是预后性的。在一些实施方案中，大分子可预测对疗法的响应。在某些实施方案中，大分子是结合靶组织结构或细胞成分的可检测探针。在一些实施方案中，大分子是筛选(例如，对有助于诊断和/或预后疾病、疾病治疗等的试剂的筛选)中的候选试剂。
例如，可以将样品与DAPI和Hoechst等核酸染色剂接触，所述核酸染色剂结合DNA的小沟，从而标记细胞核。可以使用结合特定细胞结构并且用荧光报道分子衍生的药物或毒素，例如，荧光标记的鬼笔环肽，其用于染色哺乳动物细胞中的肌动蛋白纤维。存在许多荧光报道分子，称为荧光团或荧光染料，如荧光素，Alexa Fluors或DyLight 488，它们可以与结合样品中目标生物分子的分子化学连接。在某些实施方案中，使样品与试剂接触，例如结合各种角蛋白的抗体。
作为另一个实例，可以使样品与一种或多种多肽接触，例如，抗体，标记的肽等，其对通过颜色或免疫荧光(即探针)直接或间接标记的特定细胞或细胞生物分子具有特异性并与它们结合。免疫荧光可包括任何适合的技术，其使用抗体与其抗原或结合配偶体的高度特异性结合，以标记细胞内的特定蛋白质或其它分子。用对目标生物分子具有特异性的一抗处理样品。荧光团可以直接与一抗或肽缀合。
在特定的实施方案中，抗体结合与肿瘤或癌症相关的蛋白质。在某些实施方案中，用于染色样品(例如，肿瘤样品)的抗体是表3中列出的任何抗体。
在一些实施方案中，可以使用与检测部分或荧光团缀合的二抗，其与第一抗体特异性结合。关于可以遵循的方案的例子，见，例如，Buchwalow和Bocker.Immunohistochemistry：Basics and Methods，Springer-Verlag，BerlinHeidelberg 2010，以及Hayat，M.A.Microscopy，Immunohistochemistry，and AntigenRetrieval Methods for Light and Electron Microscopy.Kluwar学术出版社，纽约2002。也可以使用对靶细胞生物分子具有特异性并且与荧光团或其它检测部分缀合的肽。
在特定的实施方案中，探针例如可检测探针是荧光分子或蛋白质。绿色荧光蛋白(绿色FP或GFP)是指在510nm或约510nm的发射光谱中具有峰的多肽。在各种波长下发射的各种FP在本领域中是已知的。感兴趣的FP包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，橙色荧光蛋白(OFP)，青色荧光蛋白(CFP)，蓝色荧光蛋白(BFP)，红色荧光蛋白(RFP)，远红外荧光蛋白或近红外荧光蛋白。如本说明书中所使用，迎光海葵属(Aequorea)GFP是指来自迎光海葵属的GFP及其突变体或变体。来自其它种类的这类变体和GFP，例如珊瑚虫纲(Anthozoa)珊瑚礁，迎光海葵属海葵，海紫罗蓝属(Renilla)海三色堇，Galaxeacoral，鹿角珊瑚，曲纹珊瑚属(Trachyphyllia)和海扇蛤科(Pectimidae)石珊瑚和其它物种是众所周知的并且是本领域技术人员已知的和可得到的。实例GFP变体包括但不限于BFP、CFP、YFP和OFP。荧光蛋白及其变体的实例包括GFP蛋白，例如Emerald(Invitrogen，Carlsbad，Calif)，EGFP(Clontech，Palo Alto，Calif)，Azami-Green(MBL International，Woburn，Mass.)，Kaede(MBL International，Woburn，Mass.)，ZsGreenl(Clontech，PaloAlto，Calif)和CopGFP(Evrogen/Axxora，LLC，San Diego，Calif)；CFP蛋白，例如Cerulean(Rizzo，Nat Biotechnol.22(4)：445-9(2004))，mCFP(Wang等人，PNAS USA 101(48)：16745-9(2004))，AmCyan1(Clontech，Palo Alto，Calif)，MiCy(MBL International，Woburn，Mass.)和CyPet(Nguyen和Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))；BFP蛋白，例如EBFP(Clontech，Palo Alto，Calif)；YFP蛋白，例如EYFP(Clontech，Palo Alto，Calif)，YPet(Nguyen和Daugherty，Nat Biotechnol.23(3)：355-60(2005))，Venus(Nagai等人，Nat.Biotechnol.20(1)：87-90(2002))，Zs Yellow(Clontech，Palo Alto，Calif)和mCitrine(Wang等人，PNAS USA.101(48)：16745-9(2004))；OFP蛋白，例如cOFP(Strategene，La Jolla,Calif)，mKO(MBL International，Woburn，Mass.)和mOrange；以及其它(Shaner N C，Steinbach P A和Tsien R Y.，Nat Methods.2(12)：905-9(2005))。
另一类荧光蛋白是红色荧光蛋白Discosoma RFP(DsRed)，其已经从珊瑚形态的Discosoma中分离出来(Matz等人，Nature Biotechnology 17：969-973(1999))，以及来自任何其它种类的红色或远红外荧光蛋白，如紫点葵珊瑚和海葵或Entacmaea海葵及其变体。RFP包括，例如，Discosoma变体，如单体红色荧光蛋白1(mRFP1)，mCherry，tdTomato，mStrawberry，mTangerine(Wang等人，PNAS U S A.101(48)：16745-9(2004))，DsRed2(Clontech，Palo Alto，Calif.)和DsRed-T1(Bevis和Glick，Nat.Biotechnol.，20：83-87(2002))，Anthomedusa J-Red(Evrogen)和Anemonia AsRed2(Clontech，Palo Alto，Calif.)。远红外荧光蛋白包括，例如，海葵AQ143(Shkrob等人，Biochem J.392(Pt 3)：649-54(2005))，Entacmaea eqFP61 1(Wiedenmann等人Proc Natl Acad Sci USA.99(18)：11646-51(2002))，Discosoma变体例如mPlum和mRasberry(Wang等人，PNAS US A.101(48)：16745-9(2004))和Heteractis HcRedl和t-HcRed(Clontech，Palo Alto，Calif.)。
可以作为大分子提供的一类试剂的另一个实例是核酸。例如，可以使样品与反义RNA接触，所述反义RNA与目的基因的转录物互补并且特异性杂交，例如，以研究样品细胞中的基因表达。作为另一个实例，可以使样品与DNA接触，该DNA与目标基因组材料互补并且特异性杂交，例如，以研究基因突变，例如杂合性缺失，基因复制，基因扩增，染色体倒位等。杂交的RNA或DNA与检测部分，即可以在显微镜下直接或间接显现的试剂缀合。原位杂交技术的实例可以在例如Harris和Wilkinson，In situ hybridization：Application todevelopmental biology and medicine，Cambridge University Press 1990；以及Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)Application Guide.Liehr，T，编辑，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg 1990中找到。可用于在水凝胶包埋样品中进行原位突变检测的其它方法包括，例如Grundberg等人(Oncotarget，2013年12月，第4卷，第12期，pp.2407-2418)和Mignardi等人，Nucleic Acid Research，2015，第43卷，第22期，e151，pp.1-12所述的那些方法。在某些实施方案中，通过将靶转录物转化为cDNA分子启动各mRNA分子的原位突变检测，然后通过使用锁式探针和靶标引发的滚环扩增(RCA)来检测。锁式探针是短线性寡核苷酸，当末端通过与靶序列杂交聚集在一起且然后如果完全匹配则通过DNA连接酶连接在一起时变成环状。这些锁式探针含有标记序列，其在扩增后充当荧光标记的寡核苷酸的检测位点。如Mignardi等人所述，锁式间隙探针是锁式探针的替代形式，由此探针臂与靶标杂交，所述靶标在该探针的5'与3'-末端之间具有限定数目的核苷酸的间隙。在该方法中，可以利用间隙探针的混合物来竞争靶区域上的杂交并连接到锁式间隙探针。结合RCA，检测事件可以在原位可视化并且测序。在实施方案中，探针特异性结合与疾病或病况(例如，癌症或肿瘤)相关的靶RNA(或相应的cDNA)中的靶标突变，包括但不限于本说明书中所述的任何一种。这些技术已经在FFPE薄切片中得到证实，但从未在通过CLARITY方法制备的肿瘤组织中得到证实。
作为另一个实例，可以使样品与小分子接触。例如，如果样品包括β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶，则可能需要使表达这些蛋白质的组织的细胞和区域可视化。为此，可以使样品与β-半乳糖苷酶(例如，X-gal，4-三氟甲基伞形基-3-D-吡喃半乳糖苷(TFMU-Gal)，试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷(Res-gal)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷(MUG)，二-3-D-吡喃半乳糖苷(FDG)，羧基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷(CUG))或碱性磷酸酶(如氮蓝四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3'-吲哚磷酸酯(BCIP))的底物和允许观察β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶活性的其它试剂接触。作为另一个实例，可视化例如CNS样品中的神经元的树突轴和自旋可能是合乎需求的。为此，可以将样品暴露于Golgi-Cox浸渗中使用的化学品，例如3％重铬酸钾，然后是2％硝酸银溶液。
在一些情况下，被所提供的大分子靶向的生物分子对细胞是内源性的。在其它情况下，可以将大分子提供给样品以靶向/可视化异位提供给样品细胞的生物分子，例如，在体内或离体导入样品以标记某些细胞群或亚细胞结构的试剂。在一些情况下，通过量表达导入的外源基因，在遗传改造的细胞系中产生生物分子。例如，立体定向手术可用于向组织提供生物分子，例如蛋白质，病毒，化学物质，其在体内或离体标记或“追踪”例如脉管系统，神经元，细胞或细胞亚群这样的结构。在该技术中，包含标记大分子的针在精确位置下降到结构或组织中，并且标记分子被释放到结构或组织中。该分子将填充注射部位附近的结构、组织或细胞，并且根据递送的大分子的类型的不同，可以跨突触转运以标记其靶标。可用于标记结构或细胞的试剂的实例是本领域中所熟知的，包括，例如，编码荧光蛋白的核酸；病毒示踪剂，例如1型单纯疱疹病毒(HSV)和棒状病毒；小麦胚芽凝集素(WGA)；菜豆(Phaseolus vulgaris)白细胞凝集素(PHA-L)；辣根过氧化物酶缀合的凝集素；生物素化葡聚糖胺(BDA)；霍乱毒素B；NEUROBIOTIN(Vector labs)。以这种方式标记的样品可以与大分子，例如，多肽或化学物质接触，它们促进这些异位提供的标记的可视化。
在一些情况下，用于使细胞生物分子或亚细胞结构可视化的大分子被动地运输到样品中。换句话说，大分子扩散到样品中。在其它情况下，大分子被主动转运至样品中，例如，通过电穿孔，流体压力，超声振动，溶质造影，微波辐射，血管循环等。在一些实施方案中，在样品被清洁后，使样品与大分子接触。在其它实施方案中，可以在清洁样品之前使水凝胶包埋的样品与大分子接触。在这样的实施方案中，可以通过使样品透化，即改变样品的性质以改善样品对大分子的渗透性来促进与大分子的接触。所谓“透化”样品是指施加到样品上的约50％或更多的大分子，例如60％或更多的大分子、70％或更多的大分子或80％或更多的大分子、在某些情况中为85％或更多的大分子、90％或更多的大分子或95％或更多的大分子，例如98％或更多的大分子，例如100％的大分子将渗透到样品的最深区域，例如，上述百分比的大分子将通过样品。样品和其中细胞的透化可以通过上面讨论的用于从样品中去除细胞成分例如脂质或如本领域中已知的用于透化细胞的任何方案来实现。在特定的实施方案中，样品是肿瘤组织样品。
在一些实施方案中，通过随机电转运使样品与一种或多种大分子(例如，抗体)接触，所述随机电转运是一种电动方法，其使用旋转电场将高度电动的分子选择性地分散在整个多孔样品中而不移动构成该样品的低电动质分子(Kim，S.-Y.等人，PNAS，2015年11月2日在线发表)。在一些实施方案中，通过eTANGO方法使经清洁的样品与一种或多种大分子(例如，抗体)接触，该方法利用动态电场将分子(例如，抗体)移动通过清洁的组织并确保标记在空间和时间上在样品中均匀分布。在一些实施方案中，通过包括随机电转运和动态亲和移位的过程使经清洁的样品与大分子接触。随机电转运驱动带电荷的分子(例如，抗体和RNA探针)而不破坏周围带电荷基质，并且可以调节探针-靶标结合亲和力以使样品范围内的反应时间同步。这两个概念的整合使得样品中的内源分子靶标经历相同的反应条件(时间和浓度)。
在某些实施方案中，通过美国专利申请公开号US 20150285765中描述的方法使样品与生物分子(例如，抗体)接触。这些方法利用电场在样品基质内移动生物分子。
在一些实施方案中，在用一种或多种大分子染色之前使经清洁的样品与封闭溶液接触，所述大分子用于鉴定或可视化细胞成分，例如结构或核酸序列。在某些实施方案中，封闭溶液包含血清，例如山羊血清，和/或牛血清白蛋白(BSA)和/或Triton-100。实施例1中描述了举例说明性的封闭溶液。
为了在显微镜下观察通过主题方法制备的样品，在一些实施方案中，将样品包埋在封固介质中。典型地基于其对用于使细胞生物分子可视化的试剂的适合性、样品的折光率以及待进行的显微镜分析来选择封固剂。例如，对于相差工作，封固剂的折光率应当与样品的折光率不同，而对于明视野工作，折光率应当类似。作为另一个实例，对于表面荧光工作，应选择封固剂，以减少显微镜检查术或储存期间的褪色、光漂白或猝灭。在某些实施方案中，可以选择封固剂或固定溶液以增强或增加清洁的组织样品的光透明度。可以使用的适合的封固剂的非限制性实例包括甘油，CC/MountTM，FluoromountTM，FluoroshieldTM，ImmunHistoMountTM，VectashieldTM，PermountTM，AcrytolTM，CureMountTM，FocusClearTM，RapidClearTM或其等效物。
在某些情况下，水凝胶包埋的样品是持久性固定的。换句话说，一旦固定在封固剂中，则不能移除水凝胶包埋的样品以进行进一步操作。在其它情况下，样品是暂时或可逆地固定的。换句话说，可以从封固剂中除去水凝胶包埋的样品，并在显微镜检查术后重新染色以显现替代/另外的生物分子或亚细胞结构。在这种情况下，可以在显微镜分析后除去预先加入到样品中的大分子，例如，通过暴露于有机溶剂如二甲苯、乙醇或甲醇，暴露于洗涤剂如十二烷基硫酸钠，皂苷，Triton X-100和吐温-20，电泳，流体压力，超声振动，溶质造影，微波辐射，血管循环等。然后将水凝胶包埋的样品与对其它生物分子或亚细胞结构具有特异性的不同大分子接触。照此，可以对同一样品进行迭代染色。
在特定的实施方案中，通过被动清洁来清洁样品，而在其它实施方案中，通过电泳组织清洁(ETC)或被动清洁和ETC的组合清洁样品。在特定的实施方案中，两种方法都依赖于SDS胶束扩散到组织中，采集脂肪脂质和其它未附着的生物分子，并将它们带出样品，留下明显透明的水凝胶-组织杂合物。胶束的被动扩散是一个缓慢的过程，且ETC通过在SDS胶束上使用离子电荷来加速它。当置于电场中时，带负电荷的胶束主动地从一个电极(它们被排斥的地方)运行至另一个电极(它们被吸引的地方)。因此，在澄清溶液中的水凝胶包埋的组织上施加电场刺激胶束在组织内外的主动转运。
在一些实施方案中，本发明的主题方法涉及使厚组织(例如，完整的器官或组织样品)基本上光学透明以用于成像，其中组织/完整器官交联并与水凝胶亚单位/单体杂交以稳定组织中的生物大分子。在一些实施方案中，本发明的主题方法涉及使厚组织(例如，完整的器官或组织样品)基本上光学透明以便以被动方式成像(例如，使用被动CLARITY或PACT)，如在2014年7月30日提交的标题为“METHODS FOR PHENOTYPING OF INTACT WHOLETISSUES”的PCT申请公开号WO2015041755(“'755公开文本”)中所一般性公开的，通过引用将其全部公开内容结合到本说明书中。在一些实施方案中，本发明的主题方法涉及使厚组织基本上光学透明以用于成像，如“Stochastic electrotransport selectivelyenhances the transport of highly electromobile molecules”，Kim等人，PNAS 2015112(46)E6274-E6283中所一般性公开的。Kim等人的方法包括通过使用旋转电场将清洁剂随机电转运到生物样品中以选择性地将高度电动分子分散在整个多孔生物样品中，而不移动样品的相对低电动分子。通过相对于位于样品室旁边的两个平行电极连续旋转包含生物样品的样品室，可以获得随机电转运，以产生相对于样品的外部旋转电场。可以将样品室浸入温度受控的循环缓冲溶液中，以防止焦耳加热对生物样品造成热损伤。随机电转运可以有效地放大电迁移率的差异，以选择性地将高电动分子(例如，清洁剂)转运到生物样品中。在一些实施方案中，与随机电转运一起使用的清洁剂可包括含有SDS的硼酸锂缓冲液。
在一些实施方案中，这类主题方法还可包括用洗涤剂如皂苷、Triton X-100和吐温-20从组织-水凝胶基质中提取组织脂质。在一些实施方案中，这类主题方法还可包括将清洁的组织/器官包埋入折光率匹配溶液(RIMS)中用于成像和/或长期储存。在一些实施方案中，这类主题方法消除了对需要电泳的主动清澈方法和/或可能对组织具有非预期效果的其它方法的需求，例如最终组织质量的变化和由于加热引起的组织褐变。
在一些实施方案中，使厚组织基本上光学透明的主题方法可以如下进行：将4％多聚甲醛(PFA)固定的组织切片在4℃下在补充有0.25％光引发剂2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(VA-044，Wako Chemicals USA，Inc.)的水凝胶单体溶液A4P0(PBS中的4％丙烯酰胺)中温育过夜。将A4P0-输注的样品用氮气脱气1-5分钟，然后在37℃下温育2-3小时以启动组织水凝胶杂交。通过短暂的PBS洗涤除去过量的水凝胶后，将组织-水凝胶基质转移到含有在0.1M PBS(pH 7.5)中的8％SDS的50mL锥形管中，并根据组织大小的不同，在37℃下温育2-5天，同时振摇。为了进行免疫染色，用PBS中洗涤1-3毫米厚的PACT-处理的样品，在一天内更换4-5次缓冲液，然后转移到含有小分子染料或一抗的缓冲液中，然后加入荧光缀合的二抗(例如，1：200-400稀释，例如，在含有2％正常驴血清，0.1％TritonX-100和0.01％叠氮化钠的PBS中)3-7天或加入小分子染料1-3天。每天需要更换抗体或小分子染料溶液。通过PBS洗涤除去未结合的抗体，然后将样品与二抗(优选Fab片段二抗，1：200-400)温育2-5天，然后在PBS或磷酸盐缓冲液(PB)中洗涤1天，然后在成像介质(RIMS)中温育。所有染色和固定步骤均在室温下进行，同时适度振摇。
在一些实施方案中，RIMS具有适合于组织成像的折光率(RI)，并且约为1.2或更高，约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8，包括其间的所有值和子范围。在一些实施方案中，RIMS具有约1.38至约1.49的RI，是生物相容性的，并且对于生物学用途是安全的。在一些实施方案中，如'755公开文本中所一般性公开的表征RIMS。
在一些实施方案中，本发明的主题方法涉及用于整个器官/整个动物成像的原位灌流辅助的试剂释放(PARS)方法。在一些实施方案中，PARS方法如'755公开文本中所一般公开。在这类实施方案中，利用器官/动物的完整脉管系统输注水凝胶亚单位/单体和清洁溶液(例如，SDS溶液)，然后溶液在整个目标组织中扩散。在一些实施方案中，使整个动物基本上光学透明的主题方法可以如下进行：在用4％PFA(在PBS中，pH7.4)进行标准心脏灌流后，将固定的动物转移到灌流室上(图1)，其经蠕动泵通过啮齿动物脉管系统连续地(约1ml/min)再循环所有随后的PACT和免疫标记试剂。灌流管将隔室连接到通过左心室插入主动脉的进食针并松散地缝合到位。用4％PFA后固定1小时，然后用PBS灌流-洗涤1小时。将A4P0单体通过脉管系统循环过夜，然后进行2小时PBS灌流洗涤。在聚合之前并且在没有断开灌流管线的情况下，将灌流室置于拉锁袋中(图1)，并且将含有所述室的袋与动物在氮气气氛中脱气2分钟。通过在PBS中在200℃下将200mL 0.25％VA-044引发剂在37℃下灌流-再循环2-3小时来引发聚合。可以通过用PBS中的8％SDS(pH 7.5)在37-42℃下<2周灌流来清洁动物的全身，然后在2-3天内进行广泛的PBS灌流-洗涤。然后通过3天灌流和1天洗涤递送抗体和小分子染料(类似于PACT)。在一些实施方案中，例如用于脑或脊髓清洁(图2A-2B)，将经心脏固定的动物(例如，啮齿动物)断头，并将硬膜下套管插入感兴趣的区域上方并粘合到颅骨上。所有PACT试剂以与PARS试剂相同的顺序和时间范围以约1ml/min递送。
在一些实施方案中，本发明的主题方法涉及使厚组织(例如，完整的完整器官或组织样品)基本上光学透明以用于成像。在这类实施方案中，通过用包括脲和/或基于脲的衍生物的清洁剂处理使组织/整个器官基本上光学透明。在一些实施方案中，清洁剂包括脲，并且可以如"SCALE：A CHEMICAL APPROACH FOR FLUORESCENCE IMAGING ANDRECONSTRUCTION OF TRANSPARENT MOUSE BRAIN"，Hama等人，Nature Neuroscience 14，1481-1488(2011)中所一般公开进行配制，通过引用将其全部公开内容并入本说明书。在一些实施方案中，清洁剂包括脲、Triton X-100和甘油的水溶液，并且可以如2012年5约18日提交的标题为“CLARIFYING REAGENT FOR BIOLOGICAL MATERIALS AND USE THEREOF”的美国专利申请公开号2014/0178927中所一般公开进行配制，通过引用将其全部公开内容并入本说明书。在一些实施方案中，清洁剂包括脲和氨基醇的水溶液。例如，在一些实施方案中，清洁剂包括N,N,N’,N’-四(2-羟丙基)乙二胺、Triton X100和脲的水溶液，并且可以如“WHOLE-BRAIN IMAGING WITH SINGLE-CELL RESOLUTION USING CHEMICAL COCKTAILS ANDCOMPUTATIONAL ANALYSIS”，Susaki等人，Cell，第157卷，第3期，2014年4月24日，726-739页中所一般公开进行配制，通过引用将其全部公开内容并入本说明书。在一些实施方案中，清洁剂是Olympus Corporation出售的ScaleView-A2。
使用主题方法制备的样品(例如，肿瘤组织样品)可以通过许多不同类型的显微镜检查术法中的任何一种进行分析，例如光学显微镜检查术(例如，明视野，斜面照明，暗视野，相差，鉴别性干扰相差，干扰反射，表面荧光，共焦，双光子，时间聚焦，使用或不使用扩大检测景深的方法的光片等显微镜检查术)，激光显微镜检查术，电子显微镜检查术，扫描探针显微镜检查术和CLARITY优化光学显微镜检查术(COLM，如下所述)。
还提供了用于实施一种或多种上述方法的试剂和试剂盒。试剂和试剂盒可包括以下的一种或多种：固定剂；水凝胶亚单位；清洁试剂；检测大分子，例如标记的和/或未标记的抗体或适配体，核酸探针(寡核苷酸，载体等)，化学品等；缓冲剂，例如用于固定、洗涤、清洁和/或染色样品的缓冲液；封固剂；包埋模具；解剖工具等。主题试剂及其试剂盒可以有很大不同。在具体的实施方案中，本发明的试剂盒可包含本说明书中所述的任何探针，其用于分析具有相关疾病的组织样品。
还提供了通过所述主题方法制备的样品，其用于例如在细胞和亚细胞水平上研究组织。例如，提供固定和聚合的样品或已经固定、聚合和经清洁的样品，用于研究感兴趣的基因的表达，用于鉴定靶向靶向感兴趣的细胞和/或亚细胞结构的候选试剂的筛选等。也可以将这样制备的样品作为阳性对照提供在如本说明书中所述的试剂盒或系统之一中。
除了上述成分之外，主题试剂盒还可以包括用于实践主题方法的说明书。这些说明书可以各种形式存在于主题试剂盒中，其中一种或多种可以存在于试剂盒中。可以存在这些说明书的一种形式是在适合的介质或基底上的印刷信息，例如，在其上印刷信息的一张或多张纸，在试剂盒的包装中，在包装说明书中等。另一种形式是计算机可读介质，例如磁盘，CD，数字存储介质等，其上已经记录了信息。可能存在的另一种形式是可以通过因特网使用以访问被移除站点处的信息的网站地址。试剂盒中可以存在任何便利的用品。
本发明的方面还可以包括用于进行上述主题方法的方面的一种或多种装置。在一些实施方案中，本发明包括一般如‘392公开文本中公开的一种或多种装置。实例装置包括，但不限于电泳仪、超声、微波、针、管、灌流泵等，其用于固定、清洁和/或染色样品。
在一些实施方案中，所述一种或多种装置包括适用于从样品中去除细胞成分的电泳装置，例如未与水凝胶网状构造交联的细胞成分。电泳装置可以是配置用于将电场施加到样品的任何装置，例如施加到生物样品，例如肿瘤活检样品。电泳最常用于动员样品中的生物大分子，例如核酸，蛋白质，以分离和分析那些大分子。电泳装置可包括毛细管电泳，凝胶电泳，纸层电泳和免疫电泳中的一种或多种。在一些实施方案中，电泳装置包括凝胶电泳。电泳装置和凝胶电泳方法的实例可以在如下文献中找到：例如，美国专利3129158、3208929、3346479、3375187、3616454、3616457、3616454、3616457，3563880、3576727、3674678、3865712、4088561、4151065、4292161、4339327、4375401、4415418、4479861和4588491；以及Martin，Robin.Gel electrophoresis：nucleic acids.BIOS Scientific，1996；Hames，B.D.Gel Electrophoresis of Proteins：A Practical Approach，OxfordUniversity Press 1998；以及Burmeister，M.和Ulanovsky，L.Pulsed-field GelElectrophoresis，The Humana Press Inc.1992，通过引用将上述文献的公开内容并入本说明书。
在一些实施方案中，电泳装置可包括可放置缓冲溶液和水凝胶包埋的样品的电泳室。见，例如，图3A-3D和图4A-4J。电泳室通常可以是任何适合的尺寸以容纳水凝胶包埋的样品，并且可以由将在室内保留溶液的任何材料构成，例如玻璃和塑料，例如，丙烯酸类，聚碳酸酯类，聚苯乙烯类，聚甲基丙烯酸甲酯，聚乙烯，聚氟乙烯，聚丙烯，聚氨酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，聚四氟乙烯等。在一些实施方案中，隔室可以由树脂或硬塑料模制或机械加工或以其它方式形成，适合于特定应用。在一些实施方案中，电泳室可以进一步包括配置成在电泳室内支撑水凝胶包埋的样品(例如，平台)的部件。
在一些实施方案中，电泳装置可包括盖子，所述盖子装配在电泳室上以关闭室。本发明的实施方案的盖子可包括密封件，当盖子联接到隔室时，该密封件与电泳隔室的主体形成液密和/或气密密封。在一些实施方案中，一个或多个密封部件可以连接至盖子，连接至隔室，或连接至盖子和隔室。当盖子连接到隔室时，密封部件可以形成液体和/或气密密封。
本发明的一些实施方案的电泳装置可以包括两个或多个相反极性的电极(即，“阳极”(带负电的)和至少一个“阴极”(带正电的))，其可操作地与电泳室连接，可以向其中施加电流以在隔室内产生电场。电极可以由任何材料构成，这些材料将导致在向电极施加电流时建立电场，并且可以在隔室内并相对于样品以任何便利的方式位置放置配置，所述任何便利的方式为促进电场经其中定位的样品建立，例如，如在核酸或蛋白质电泳领域中众所周知的那样。见，例如，美国专利号3129158、3208929、3346479、3375187、3616454、3616457、3616454、3616457、3563880、3576727、3674678、3865712、4088561、4151065、4292161、4339327、4375401、4415418、4479861和4588491；以及Martin，Robin.Gelelectrophoresis：nucleic acids.BIOS Scientific，1996；Hames，B.D.GelElectrophoresis of Proteins：A Practical Approach.Oxford University Press1998；以及Burmeister，M.和Ulanovsky，L.Pulsed-field Gel Electrophoresis.TheHumana Press Inc.1992。例如，可以将电极配置在隔室内以便基本上位于样品侧翼。
在一些实施方案中，一个或多个电极可包括延伸部件，其用于扩大在电极之间产生的电场的大小。例如，在某些实施方案中，电极可以包括电极的蛇形部分形式的延伸部件，其自身向后折回以形成多个S形弯曲。在图3c组(参考号103a和103b)中可以观察包括蛇形延伸部件的电极的实例。延伸部件扩大了当向电极施加电压时产生的电场的大小，使得整个三维组织样品可以放置在电场内。可以根据需要调节延伸部件的长度和宽度，以适应各种尺寸的组织样品。例如，在一些实施方案中，包括延伸部件的电极的长度和宽度近似相等，如图4e组中所示。在某些实施方案中，电泳室可以通过例如固体分配器或空气分隔成两个不同的区域分配，其中每个区域包括缓冲液中的一个电极，并且样品位于缓冲液内以使得样品跨越或者分跨两个区域，使得由电极产生的电场通过样品产生。在一些情况下，隔室可包括平台或支撑结构，在其上或其中放置水凝胶包埋的样品，例如，两个电极之间的平台，跨越包括电极的隔室区域的平台等。
电泳仪可以可操作地连接到电源，可以从电源将电压施加到电极。在某些情况下，电源可以与电泳仪分开，即电泳仪可以是与电源分开的模块。在其它情况下，电源可以集成到电泳仪中，即电泳仪将包括电源。
在某些情况下，可能需要更换或再循环电泳室中的缓冲液。在一些实施方案中，使缓冲液循环或再循环包括从隔室移除缓冲液然后将缓冲液返回隔室，例如，在通过冷却单元(制冷单元，冰浴等)，加热单元，过滤器等之后。在一些实施方案中，更换缓冲液包括从隔室中移除缓冲液并在其位置添加新鲜缓冲液。例如，可能需要控制电泳室内缓冲液的温度(例如，以防止室达到可能导致水凝胶解聚或样品中的生物分子变性的温度，例如35℃或更高、40℃或以上或50℃或更高、60℃或更高、70℃或更高、80℃或更高、90℃或以上或100℃或以上)；以便从样品中排出大分子时除去大分子；改变缓冲液的离子强度等。为此目的，电泳仪可任选地包括一个或多个端口，缓冲液可通过该端口进入和/或离开隔室。在一些情况下，隔室可包括两个或多个端口，例如，缓冲液通过其进入隔室的第一端口和缓冲液通过其离开隔室的第二端口。
可以通过使用一个或多个端口以及任选地管道、泵、阀或任何其它适合的流体处理和/或流体操作设备(例如，可拆卸地连接的或永久地连接至装置的一个或多个部件的管道)来添加/移除/再循环/替换缓冲液。例如，具有第一和第二端的第一管可以连接到第一端口，并且具有第一和第二端的第二管可以连接到第二端口，其中第一管的第一端连接到第一端口，且第一管的第二端可操作地连接到容器，例如冷却单元，加热单元，过滤单元，废物容器等；而第二管的第一端连接到第二端口，并且第二管的第二端可操作地连接到容器，例如冷却单元，冰上烧杯，过滤单元，废物容器等。
作为另一个实例，具有第一和第二端的一个管可以可拆卸地连接到第一和第二端口，即，管的第一端可拆卸地连接到第一端口，并且管的第二端可拆卸地连接到第二端口，其中管道可操作地连接到例如制冷单元(例如，管道穿过该单元)，过滤器(例如，管道包括过滤器)，缓冲液储存器(例如，管道例如通过分流器接收来自储存器的替换缓冲器)等。在一些情况下，管道也可以可操作地连接到泵，例如，蠕动泵，电渗泵，振荡泵，隔膜泵等，其通过管道有利于液体运动，有利于缓冲液从电泳室中的添加/移除/再循环等。按照这种方式，所述电泳仪可以可操作地连接到冷却单元，加热单元，过滤单元，缓冲液储存器/容器，泵等。在一些实施方案中，制冷单元，加热单元，过滤单元，缓冲液储存器/容器，泵等将被整合到电泳仪中。换言之，电泳仪可包括制冷单元，加热单元，过滤单元，缓冲液储存器/容器，泵等。在其它实施方案中，制冷单元，加热单元，过滤单元，缓冲液储存器/容器，泵等可以是与电泳仪分开的模块。
如图3A-3D所举例说明的，显示了实例电泳组织清洁装置101。实例装置101包括盖102，第一电极103a，第二电极103b，基座104，出口端口105，入口端口106，第一电极连接器107a和第二电极连接器107b。
本发明还提供了用于执行主题方法的系统。该系统可以包括本说明书中所述的一个或多个模块，例如，电泳仪，电源，制冷单元，加热单元，泵等。系统还可以包括本说明书中所述的任何试剂，例如，固定剂；水凝胶亚单位；清洁试剂；检测大分子，例如抗体，核酸探针(寡核苷酸，载体等)，化学品等；缓冲液，例如用于固定、洗涤、清洁和/或染色样品的缓冲液；封固剂；包埋模具等。根据某些实施方案的系统还可以包括显微镜和/或相关的成像设备，例如，照相机部件，数字成像部件和/或图像捕获设备，被配置为根据一个或多个用户输入来采集图像的计算机处理器等。
可以根据本发明使用的CLARITY方法的某些实施方案描述于PCT公开号WO2014/025392，Tomer，R.T等人，Nature Protocols，第9卷，第7期，pp.1682-1697(2014年6月)，Kim，S.Y等人，P.N.A.S Plus，第112卷，第46期，pp.E6274-E6283(2015年10月)中，通过引用将它们的全部内容并入本说明书。
III.生物样品的成像
本发明的方面涉及用于对如上所述所制备的组织样品(例如，肿瘤组织样品)、大器官、整个动物等进行高速、高分辨率成像的方法、装置和系统。在一些实施方案中，本发明的方面涉及用于进行组织样品的高速、高分辨率成像的方法、装置和系统，如2015年5月28日提交的标题为"METHODS AND DEVICES FOR IMAGING LARGE INTACT TISSUE SAMPLES"的PCT申请号PCT/US2015/032951中所一般公开的，通过引用将其全部公开内容并入本说明书。
在一些实施方案中，主题系统包括配置用于以下一个或多个的成像装置：荧光成像，反射成像，亮视野成像，暗视野成像，鉴别性干扰相差(DIC)成像，相差成像，偏振成像等。在一些实施方案中，主题系统包括配置用于以下中的一个或多个的成像装置：X射线成像，计算机断层摄影(CT)成像，磁共振成像(MRI)，超声成像等。在一些实施方案中，主题系统被配置用于多模态成像并且包括两种或更多种成像方法。在一些实施方案中，主题系统被配置用于经由两种或更多种成像方法获取的图像的相关性和/或共同记录。
在一些实施方案中，主题系统包括显微镜装置，其包括具有光源的照明光束路径，具有照相机的检测光束路径，任选包括样品室的光均匀样品操作部件，控制器，处理器和计算机可读介质，包括指令，当由处理器执行时(在一些实施方案中)使控制器执行校准程序以获取样品室中的样品的多个比对参数，并执行利用该比对参数生成三维样品图像的成像程序。
在一些实施方案中，照明光束路径部件可包括准直器，快门，照明滤光轮，光束扩展器，二维扫描仪，扫描透镜，管透镜，一个或多个反光镜和光源，如下面进一步描述的。任何这些部件、任何这些部件中的任何成员或其组合或排布可以在主题系统和设备中以适合的方式使用。
在一些实施方案中，照明光束路径包括柱面透镜，其配置成产生静态光片。在一些实施方案中，照明光束路径包括检流计扫描器/f-θ透镜，其被配置为产生具有高斯或贝塞尔光束的动态光片。在一些实施方案中，系统可包括两个照明光束路径，其中照明光束路径被配置为从样品的相反侧或相对侧照射样品。
在一些实施方案中，系统可以被配置为从单个照明光束路径生成多个光片，例如一个，两个，三个，四个或多个光片。在某些实施方案中，可以独立地操作光片以照射样品的所需部分。在一些实施方案中，可以使用两个或多个光片以协调的方式照射样品的一部分，使得第一光片照射样品的第一部分，并且第二光片照射样品的第二部分，其中样品的第一部分不同于样品的第二部分。在一些实施方案中，多个光片可用于照射样品的一部分，例如，最多三个或以上，例如四个或以上，例如五个或以上，例如六个或以上，例如七个或以上，例如八个或以上光片可以用于以协调的方式照射样品的一部分。在一些实施方案中，可以独立地操作每个光片以照射样品的给定部分。在一些实施方案中，可以以协调的方式操作多个光片以根据说明书进一步描述的方法完成样品的成像。
在一些实施方案中，系统可包括两个照明光束路径。在某些实施方案中，两个照射光束路径可用于从相对侧照射样品，从而允许样品的一半从一侧成像，而另一半样品从另一侧成像。
本发明实施方案的照明光束路径还可以包括各种光源，其被配置为产生可见光谱中的光，具有约390nm至约700nm的范围的波长(包括其间的所有值和子范围)，或者在红外光谱约700nm–约1500nm的范围内(包括其间的所有值和子范围)。在一些实施方案中，光源可包括激光器。在一些实施方案中，光源(例如，激光光源)被配置为发射具有例如405nm，488nm，514nm，561nm，594nm或647nm的波长的光。各种适合的光源中的任何一种都可以与主题系统一起使用。
如上所概述，本发明的方面包括系统，该系统包括检测光束路径。检测光束路径部件在本领域中是众所周知的，并且在此不再详细描述。在一些实施方案中，检测光束路径部件包括照相机，管透镜，发射滤光轮和检测物镜。可以在主题系统和设备中以适合的方式利用这些部件中的任意种或其组合或排布。
在一些实施方案中，照相机是CCD照相机或科学CMOS相机(sCMOS)，其提供极低噪声，快速帧速率，宽动态范围，高量子效率(QE)，高分辨率和大视野。这类照相机可从科学技术供应商处购得。
在一些实施方案中，检测物镜被配置为具有与经历成像的样品的RI匹配的折光率(RI)。例如，在一些实施方案中，检测物镜可以是25X，10X或4X检测物镜，其RI与经历成像分析的浸没液体和/或组织样品的RI相匹配。
在一些实施方案中，检测物镜可以是低数值孔径检测物镜。在一些实施方案中，检测物镜的数值孔径约0.1至约1.4，例如约0.6至约1.0，包括其间的所有值和子范围。
在一些实施方案中，检测物镜的工作距离(WD)在约0.1mm至约100mm的范围内，例如约6-8毫米，包括其间的所有值和子范围。
在一些实施方案中，系统可包括两个检测光束路径。在某些实施方案中，可以使用两个检测光束路径来同时对来自相对侧的样品成像，从而允许样品的一半从一侧成像，并且另一半样品从另一侧成像。该实施方案提供了可以成像的样品尺寸的两倍增加，因为通过在第二检测光束路径中添加第二物镜，两个物镜的组合的总工作距离增加了两倍。
本发明的方面包括光均匀的样品操作部件，其配置成在光均匀的环境中包含样品。所谓“光均匀”是指环境中各种材料的折光率(RI)匹配或相似，使得穿过光均匀环境的光束基本上不受所穿过材料的RI的任何变化的影响。
在一些实施方案中，光均匀的样品操作部件包括底部或基座和外壁，外壁限定具有开口顶部的盒子形状的样品室。在一些实施方案中，来自一个或多个照明光束路径的透镜设置在外壁的一部分上或内部，使得从照明光束路径发射的光经由透明窗口直接进入样品室的内部。在一些实施方案中，透明窗口由与光均匀环境的RI匹配的材料制成。在一些实施方案中，透明窗口由例如石英盖玻片制成。在一些实施方案中，检测光束路径的检测物镜设置在外壁上或外壁的一部分中。在一些实施方案中，检测物镜以与照明光束路径正交的关系定位(例如，与照明光束路径成90°角定位)。
在一些实施方案中，光均匀样品操作部件包括xyz-θ样品支架，其配置成在多个方向中的任何方向上移动样品，包括x、y和z方向以及角度或8个旋转方向。在一些实施方案中，xyz-θ台式支架具有大的行程范围并且被配置为在x、y和z方向中的每一个方向上移动至少45mm。在一些实施方案中，xyz-θ台式支架配置成使样品在角度或θ方向上旋转整个360°。这类xyz-θ样品支架可从科学技术供应商处商购获得。
在一些实施方案中，系统的光学器件配置成相对于样品移动，而在一些实施方案中，样品操作部件配置成相对于系统的光学器件移动样品。光学器件或样品操作部件的移动可以例如以逐步方式或以连续方式移动。在一些实施方案中，光学器件和样品操作部件可以以同步方式移动，而在某些实施方案中，光学器件和样品操作部件可以以异步方式移动。
在一些实施方案中，光均匀样品操作部件的样品室填充有溶液。在一些实施方案中，该溶液具有与样品的RI或检测光束路径的检测目标匹配的RI。例如，在一些实施方案中，用于填充样品室的溶液是FocusClear或MountClear(均可从CelExplorer Labs商购获得)。在一些实施方案中，用于填充隔室的溶液是折光率约为1.42至约1.46，例如约1.45的液体，包括其间的所有值和子范围。在一些实施方案中，用于填充样品室的溶液是约87％甘油。具有所需折光率范围的溶液可从供应商(例如，Cargille Labs)商购获得。
在一些实施方案中，光均匀的样品操作部件的样品室包括较小的内室，其体积小于较大的外部样品室的体积。例如，在一些实施方案中，内室是比色皿，其配置成容纳样品用于分析。在一些实施方案中，使用由熔凝石英制成的比色皿作为内腔。在一些实施方案中，如上所述，内腔填充有溶液，其RI与样品的RI或检测束路径的检测物镜匹配。例如，在一些实施方案中，用于填充内室的溶液是FocusClear或MountClear(均可从CelExplorerLabs商购获得)。在一些实施方案中，用于填充内室的溶液是RI 1.454，其可从例如Cargille Labs的供应商商购获得。在一些实施方案中，用于填充内室的溶液是约87％的甘油。在某些实施方案中，可以使用第一溶液来填充内腔，并且可以使用不同的溶液来填充较大的外腔。例如，在一些实施方案中，内腔填充有FocusClear，而外腔填充有RI 1.454溶液或87％的甘油溶液。
在一些实施方案中，本发明的各方面包括控制器、处理器和计算机可读介质，其被配置或适于控制或操作主题系统的一个或多个部件。在一些实施方案中，系统包括控制器，该控制器与系统的一个或多个部件通信，如本说明书中所述，并且被配置为控制系统的各方面和/或执行主题系统的一个或多个操作或功能。在一些实施方案中，系统包括处理器和计算机可读介质，其可包括存储器和/或存储介质。在计算机可读存储器上实现为计算机可读指令的应用程序和/或操作系统可以由处理器执行以提供本说明书中描述的一些或全部功能。
在一些实施方案中，系统包括用户界面，例如图形用户界面(GUI)，其适于或配置成从用户接收输入，并执行如本说明书中所述的一种或多种方法。在一些实施方案中，GUI被配置为向用户显示数据或信息。
现在涉及图5A，其描绘了显微镜装置的实施方案。所描绘的显微镜装置包括第一和第二照射光束路径，其中每个照射光束路径包括准直器，快门，照明滤光轮，光束扩展器，2d检流计扫描器，扫描透镜(或f-θ透镜)，管透镜，反光镜和照明物镜。所描绘的显微镜装置还包括检测光束路径，其包括sCMOS照相机，管透镜，发射滤光轮和探测物镜，其定位于光均匀的样品操作部件内。
现在涉及图5B，其描绘了光均匀样品操作部件的各种部件。图5B a组显示了可以用作内部样品室的石英比色皿。图5B b组显示了位于样品室底部的xyz-θ样品安装台。还示出了检测光束路径的检测目标和两个照明光束路径的透镜。图5B c组显示放置在样品室内的比色皿以形成内部样品室。图5B d组显示了填充有RI 1.454液体的样品室。
现在涉及图6，其显示了控制电子器件框架和COLM(CLARITY优化的光学显微镜)部件的示意性概括。如图所示，控制计算机或处理器与系统的各种部件通信，包括例如检测光束路径中的sCMOS照相机，照明光束路径中的激光控制器，以及各种附加部件。
现在涉及图7a组，其显示了多平面COLM系统的实施方案。如图所示，该系统包括两个照射光束路径和两个检测光束路径。照明光束路径被配置为从相对侧照射样品，并且检测光束路径被配置为从相对侧对样品成像。通过在逐行读出方向上操作两个彼此适度移位的检测臂(如图7c组所示，约100微米足够)来实现多个平面的同时成像。
现在涉及图8，其显示了多平面COLM系统的照明光束路径的实施方案。如图所示，照明光束路径包括配置成产生多个独立光片的各种部件。所描绘的实施方案被配置为生成四个独立的光片。
现在涉及图9，通过使用电动倒置镜将照明光束重定向到允许通过相应的检测臂对成像的两种不同配置，两个检测路径可以扩展到四个检测路径。
本发明的方面包括可用于成像大组织样品(例如，肿瘤组织样品)的方法，通过本说明书中所述的方法使其基本上透明。在一些实施方案中，主题方法涉及将样品放置在光均匀的样品操作部件的样品室中，执行校准程序以将光学片和显微镜装置的检测聚焦平面对准在样品内的多个位置处，以获取每个位置的比对参数，执行成像过程以从样品内的多个位置中的每个位置采集图像，并使用来自每个位置的图像构建样品的三维图像。现在将在下文更详细地进一步描述方法的各方面。
该方法的方面涉及将样品置于光均匀的样品操作部件中。在一些实施方案中，将样品置于样品安装台上，例如xyz-θ样品安装台，其配置成在任何方向上移动样品。在一些实施方案中，所述的方法包括将样品置于光均匀的样品操作部件的样品室中，并用具有与样品的折光率(RI)匹配的折光率(RI)的溶液填充样品室。在一些实施方案中，在进行本说明书中所述的成像分析之前，可以制备样品用于显微镜分析。在一些实施方案中，通过在水凝胶亚单位的存在下固定样品，聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品，并清洁水凝胶包埋的样品来制备样品。制备方法在国际专利申请号PCT/US2013/031066中进一步描述，通过引用将其公开内容全部并入本说明书。
该方法的方面涉及执行校准程序，该校准程序用于将显微镜装置的检测聚焦平面与用一个光片照射的样品的照明平面对准。在一些实施方案中，校准过程涉及在z方向上指定样品的开始位置和结束位置。
在某些实施方案中，校准过程涉及指定z-阶值，该z-阶值用于将样品划分为z-方向上的多个平面，其中每个平面表示样品的二维片段或部分。在一些实施方案中，z-阶值的范围为0.1微米至1毫米，例如1至5微米。
在一些实施例中，校准过程涉及将样品数字划分为多个图块。图块可以是样品的离散部分的图像。当显微镜物镜的视场小于样品本身时，可能需要在拼贴布置中收集多套图像，然后将拼接在一起以生成完整图像。在一些实施方案中，所述的方法包括定义将定义图片数量的区域的两个相对角落的坐标，以及设置将用于收集图片图像堆叠的期望z-阶值。在一些实施方案中，将区域选择为彼此重叠的图片，其具有范围为10至50％，例如15至20％的彼此重叠。
校准过程的各方面涉及获取样品内多个位置中的每一个的比对参数。为了获得每个位置处的比对参数，通过在一个维度上移动光束产生的光片用于照射样品的平面。由光片照射的样品的平面在说明书中称为“样品照明平面”或“照明平面”。通过在对应于样品照明平面和检测聚焦平面之间的最佳对准的指定邻域中找到最大图像质量测量，来实现显微镜的检测聚焦平面与样品照明平面之间的对准。在一些实施方案中，图像质量测量是光学聚焦质量测量，其包括傅立叶空间中的高频和低频信号之比。
校准过程的结果是多个比对参数，其对应于样品内的不同位置。通过在样品内的给定位置处应用比对参数，在该位置处实现显微镜装置的检测聚焦平面与光片之间的最佳对准。在一些实施方案中，使用1mm的z-阶值来执行校准过程，并且使用样品内的两个相邻位置之间的线性内插来确定两个相邻位置之间的位置处的比对参数。以这种方式，可以使用1mm的z-阶值执行校准过程，然后可以将结果应用于整个样品以确定任何位置处的比对参数。在一些实施方案中，校准过程是自动化的。在一些实施方案中，处理器执行使控制器执行校准过程并获取样品的多个比对参数的指令。
方法的方面包括执行成像过程，该成像过程利用比对参数来将显微镜装置的检测聚焦平面与样品的照明平面对准。在一些实施方案中，成像过程包括将显微镜装置的检测聚焦平面与样品的照明平面对准，用来自光源的光束照射照明平面的线性部分，并捕获多个发射的光来自照明平面的照明线性部分的信号与照相机。在某些实施方案中，显微镜装置的检测聚焦平面与样品的照明平面的对准是同步的，使得在检测聚焦平面与照明平面对准的同时执行照明平面的照射。以这种方式，仅照射主动成像的样品部分，从而减少可能由过度照射导致的样品中信号的光漂白。
在一些实施方案中，成像过程包括引导来自光源的光束扫过照明平面，从而照射照明平面的多个线性部分。在一些实施方案中，当光束扫过照明平面时，来自照明平面的每个不同线性部分的多个发射光信号被照相机捕获，导致样品的二维图像与照明平面一致。在一些实施方案中，照射样品的照明平面的时间段的范围从1毫秒(ms)到1秒，例如5到100ms。
在一些实施方案中，所述的方法涉及引导多个独立的光片以照射样品的不同部分。例如，在一些实施方案中，使用两个或以上光片来从样品的相对侧照射样品。在一些实施方案中，使用多个光片来照射样品，例如两个或以上，三个或以上，四个或以上，五个或以上，六个或以上，七个或以上，或多达八个或以上光片。在一些实施方案中，单个光片用于通过快速移动或将光片从一个位置“切换”到另一个位置来照射样品的两个或以上不同部分。
在一些实施方案中，成像过程还涉及在z方向上移动样品，使得光片将照射新的照明平面，并且重复成像过程以生成与新照明平面重合的样品的另一个二维图像。在一些实施方案中，样品保持静止，同时移动光片和检测物镜以对新的照明平面成像。在一些实施方案中，成像过程包括同步移动光学器件(例如，照明光束路径中的物镜)和用于照射样品的光片。在一些实施方案中，成像过程涉及以限定的速率连续移动样品与样品操作部件，使得检测光束路径中的相机可以在照射时连续成像样品的各个平面。可以关于任何给定的光片实现任何上述方法。照此，利用COLM系统中的多个光片可以用于增加特定样品的成像过程的总速度，以及增加可以使用主题系统和方法成像的样品的尺寸。
在一些实施方案中，照射程序的结果是样品的多个二维图像，每个图像相当于样品的不同照明平面。在一些实施方案中，成像过程是自动化的。在一些实施方案中，处理器执行使得控制器执行成像过程并获取样品的多个二维图像的指令，每个二维图像相当于样品的不同照明平面。
在一些实施方案中，成像过程还涉及二维图像的数据处理以形成样品的三维图像。在一些实施方案中，样品的两个或以上不同的二维图像可以组合或“缝合”在一起以形成样品平面的单个二维图像。例如，如上所述，当使用两个或以上不同的独立光片对样品成像时，可以组合从每个光片获得的图像以形成相当于样品的给定平面的单个二维图像。
三维重建软件是商业上可获得的，并且可以用于将平铺图像拼接在一起和/或将多个二维图像重建为三维图像。商业上可用的软件程序包括来自Imaris，Bitplane和Amira的软件程序，以及开源软件，例如Fiji，XuvTools，Vaa3D插件和TeraStitcher中的缝合插件。在一些实施方案中，可以使用商业软件(例如，Imaris和Amira)中的特定模块或使用例如Neuromantic的开源工具来执行包含神经元组织的样品中的神经元形态的手动或半自动追踪。
在一些实施方案中，显微分析成像包括：将样品放置在光均匀的样品操作部件中的样品室中；执行校准程序以在样品内的多个位置处对准显微镜装置的一个或多个光片和一个或多个检测聚焦平面，以获取每个位置的比对参数；执行成像过程以从样品内的多个位置中的每个位置采集图像；将对齐参数应用于每个位置，同时用光片照亮位置并捕获位置的图像；使用来自每个位置的图像构建样品的三维图像。
现在涉及图10，其显示了方法的一个实施方案的方框流程图。在所描绘的实施方案中，所述的方法包括将样品放置在光均匀的样品操作部件中，对样品执行校准过程以获取多个比对参数，使用比对参数对样品执行成像过程，以及构建使用在成像过程期间捕获的图像的整个样品的三维图像。
现在涉及图7，b组，其显示了得到高质量深度图像或大的完整样品的方法的实施方案。如图所示，将用两个对齐的光片照射(每个侧面的一个光束照射两个不同的平面，或者每个侧面两个，每个平面侧的一个照亮同一平面，其余照亮另一个平面)的两个独立的平面从相对的检测臂同时或顺序地成像。从每个光片生成样品的二维图像。b组展示了从两个相对的检测臂成像的同一平面的图像。检测臂可以精确对准(例如，具有亚微米精度)。图7，b组展示来自略微未对准的臂的图像，并且可以叠加在X或Y方向上的小校正。使用该方法，可以对较大的样品进行成像，因为通过在第二检测光束路径中添加第二物镜，两个物镜的组合的总工作距离增加了两倍。
现在涉及图7，c组，其显示增加成像速度的各种方法。如图所示，光片的快速切换可以照亮两个独立的平面，用于增加整体成像速度。类似地，同时多平面成像也可用于增加成像过程的整体速度。不间断样品成像，其中多个光片连续移动通过样品或样品连续移动通过多个光片，同时连续获取图像，也可用于增加成像过程的总体速度。另外，逐步光学z-扫描可以与多个光片一起使用，以顺序地成像样品的不同光学平面。单向和双向同步照明和检测也可用于提高成像过程的整体速度。在双向同步照射和检测中，使用两个或以上独立的光片来照射和成像样品的不同部分，如图7，c组所示。使用沿不同方向移动的多个光片增加了成像过程的整体速度。
现在涉及图9，其显示了增加轴向(z-分辨率)的方法。通过对来自四个独立的，正交排列的信号检测臂的样品进行成像，从四个正交视图获取3D图像。通过融合这四个视图，实现了轴向分辨率(z-分辨率)的改进。图9显示了两种可自动切换的配置，其中样品是一组两个检测臂的第一图像，然后是检测臂的正交排列的部分。这种切换使用快速，精确的后视镜进行，后者既可以反射激发光，也可以不受阻碍地通过激发光。
在一些实施方案中，本发明的方面涉及使用多个平行光片成像组织样品(例如，如上所述制备的肿瘤活组织检查样品)的方法、装置和系统，例如2014年10月8日提交的标题为“MULTIVIEW LIGHT-SHEET MICROSCOPY”的美国专利申请号2015/0098126中所一般公开的，通过引用将其全部公开内容并入本说明书。
现在涉及图11A，其描述涉及显微镜系统100和用于复杂生物样品(或样品)101(例如，发育中的胚胎或组织活检样品)的整体活体成像的相应过程。显微镜系统100使用光片显微镜技术，其提供同时多视图成像，其消除或减少可由较慢的顺序多视图成像引起的时空伪影。另外，因为样品101仅一次用扫描的激光片照射薄的部分(例如，沿z轴取得的微米(μm)量级)，同时检测器记录部分在被照射的样品101中，样品101的损坏减少。不需要样品101的机械旋转来执行同时多视图成像。
通常，光学显微镜110由沿着各个光片轴从不同方向照射样品101的光片(例如，光片102，104)和多个检测子系统(例如，检测子系统116，118)组成，其沿多个检测视图采集所产生的荧光。在下面的实例中，在相应的照明子系统112，114中产生两个光片102，104，它们从相反的方向或光片轴照射样品101；并且各个检测子系统116，118沿两个检测视图采集所得荧光。在该特定举例说明中，光板轴与照明轴(y轴)平行，并且检测视图与检测轴(z轴)平行，检测轴垂直于y轴。
因此，在该实例中，显微镜系统100提供接近完全的覆盖，获得四个互补的光学视图；第一视图来自检测系统116，检测由于光片102与样品101的相互作用而发出的荧光；第二视图来自检测系统116，其检测由于光片104与样品101的相互作用而发出的荧光；第三视图来自检测系统118，其检测由于光片102与样品101的相互作用而发出的荧光；第四视图来自检测系统118，其检测由于光片104与样品101的相互作用而发出的荧光。
现在涉及图11B，其强化为更清楚地示出光片102，104和样品101之间的相互作用，光片102，104在样品101内彼此沿着沿着图像体积IV在空间上重叠并在时间上沿y-x平面彼此重叠，并与图像体积IV内的样品101发生光学相互作用。时间重叠在时间偏移或差异内，该时间偏移或差异小于对应于显微镜110的空间分辨率极限的分辨率时间。具体地，这意味着光片102，104在生物体的图像体积IV内在空间上重叠。样品101同时或在时间上错开时间差，该时间差太小以至于在时间差期间生物样品101内的跟踪细胞C的任何位移明显小于(例如，低于一个数量级)显微镜110的分辨率极限，其中分辨率极限是相当于显微镜110的空间分辨率极限的时间。
每个光片102，104可以用激光扫描仪产生，该激光扫描仪沿着垂直于它们和z轴的照射轴(x轴)快速移动薄的(例如，μm厚的)激光束，形成通常沿平面或平行于平面延伸的光束以形成片102，104。在一些实施方案中，光片102，104形式的激光束沿着它们的轴在样品101相对侧上照射样品101。快速扫描薄体积并以直角(在该实例中，沿z轴)到照射轴的荧光检测提供光学切片图像。光片102，104将样品101内的荧光团激发成更高的能级，然后导致随后发射荧光光子P，并且荧光光子P由检测子系统116，118内的检测器检测(沿着z轴)。如下面详细讨论的，在一些实施方式中，激发是单光子激发，或者是多光子(例如，双光子)激发。
在样品中激发的荧光团可以是附着于细胞的标记，例如遗传编码的荧光蛋白如GFP或染料如Alexa-488。然而，在使用二次谐波产生或三次谐波产生的一些实施方案中，荧光团可以是细胞内的实际或天然蛋白质，其在暴露于光片102，104光时发射特定波长的光。
如图11B所图示的，光片102，104穿过样品101并激发荧光团。然而，光片102，104沿着它们各自通过样品101的路径经受光散射和光吸收。此外，非常大(与图像体积IV或视野(FOV)相比较大)或相当不透明样品可以吸收来自光片102，104的能量。
此外，如果光片102，104以双光子激发方案实现，则只有重叠光片102，104的中心区域103可以具有足够高的功率密度以有效地触发双光子过程，并且可能的是，仅响应于暴露于双光子光片102，104，样品101的一半(接近)发射荧光光子P。
光片的术语“空间重叠”可以意味着光片102，104在样品101内几何上重叠。术语“空间重叠”还可以包括使光片以几何方式到达检测子系统116，118的FOV内(如图11B所示)和样品101内。例如，为了有效地触发双光子激发，每个光片102，104可以仅覆盖检测子系统116，118的视野的一部分(例如，一半)(使得每个光片在视野的相应一半中居中)，使得两个光片102，104的使用导致全视野可见。
因此，如果光片102，104仅需要覆盖视野的一半，则每个双光子光片102，104可以做得更薄(如沿z轴测量的)。然而，如果光片102，104更薄(并且激光功率不变)，则相同数量的光子穿过样品101的较小横截面，即，激光功率密度更高，这导致更高效双光子激发(与激光功率密度的平方成正比)。同时，因为光片更薄，所以与每个光片102，104覆盖整个视野的情况相比，分辨率增加。
作为一个实施方案，如果光片102，104以单光子激发方案实现，则光片102，104还可以在中心区域103外部但在图像体积内的样品101的区域上激发荧光团，这部分在合成图像中会显得模糊。在后一种情况下，可以用两个光片102，104中的每一个顺序记录两个图像，并且计算系统190可以使用计算来调整图像以获得更高的质量。例如，可以裁剪两个图像，使得消除低对比度区域(并且在该步骤之后保留补充图像部分)，然后可以将用两个光片记录的图像缝合在一起以获得覆盖高质量的整个视野的最终图像。
光片102，104被配置成使得其最小厚度或宽度(沿z轴截取)在图像体积IV和FOV内。当两个光片102，104指向样品101时，相应光片102，104的最小厚度应该与图像体积IV重叠。如上所述，可以将其设置成使得光片102的最小厚度偏离光片104的最小厚度，如图11B中所图示的。这种设置提供了改进的或优越的空间分辨率(对于单光子和双光子激发方案)和改进的或优越的信号速率(对于双光子激发方案)。
例如，对于作为果蝇属(Drosophila)胚胎的样品101，其厚度为约200μm(沿z轴截取)，可以将光片102配置成从左边缘到达其最小厚度约50μm(测量为左边)样品101在其进入样品101之后的页面的一侧)，而光片104可被配置为从样品101的右边缘(在页面的右侧测量)达到其约50μm的最小厚度在它穿过样品101之后。
在光片102，104的最小厚度与光片102，104的整体的均匀性之间存在权衡，跨越图像体积IV。因此，如果最小厚度减小，则光片102，104在图像体积IV的边缘处变厚。光片102，104的厚度与相应的照明子系统112,114的数值孔径成比例；并且光片102，104的可用长度，即厚度足够均匀的长度，与数值孔径的平方成反比。可以使用任何合适的度量来估计光片102，104的厚度，例如沿z轴的光片102，104的全宽度取其最大强度的一半(FWHM)。
例如，具有4μm的最小厚度的光片102，104(使用例如FWHM的合适度量)是具有250μm的FOV的图像体积IV的良好匹配(这意味着其为250μm)长(沿y轴截取))。良好的匹配意味着它在整个视野范围内提供了良好的平均分辨率。较薄的光片将改善中心的分辨率(沿着它们的轴线)，但是可能在样品101的边缘处显著且不可接受地降低分辨率，并且可能导致整个视场的平均分辨率更差。较厚的光片将使得光片在整个图像体积IV上更均匀，但是它会降低整个图像体积IV的分辨率。作为另一个实例，具有7μm的最小厚度的光片102，104(使用例如FWHM的合适度量)是具有700μm的FOV(且因此其为700μm长(沿它们的y轴截取)))的图像体积IV的良好匹配。
通常，光片102，104的厚度(沿z轴截取)应小于样品101的尺寸(和厚度)，以保持图像对比度并减少焦点背景光。特别地，光片102，104的厚度应该基本上小于样品101的尺寸，以便相对于照射整个样品101的传统照明方法改善图像对比度。仅在该方案中(光片厚度显著小于样品厚度)，光片显微镜提供了优于传统照明方法的显著优点。
例如，光片102，104的厚度可以小于沿z轴截取的样品101的宽度的十分之一。在一些实施方案中，如果每个光片仅用于覆盖视野的一部分(例如，一半)，则光片102，104的厚度约为样品101的宽度或尺寸的百分之一，即，如上所述，每个光片的最小厚度点位于视野的两个半部之一的中心。
设定光片102，104的最小厚度或用于定义真实图像体积IV的一个考虑因素是样品101内需要由显微镜系统100分辨的结构的尺寸。例如，如果显微镜将系统100设置成成像细胞核，其大小约为2-10μmin(沿着穿过细胞核的直线截取；在人成纤维细胞中约10μm)。为了实现相当好的空间采样和分辨率，光片102，104应当具有最小厚度，该厚度不比这些核的横截面尺寸或长度的一半厚，例如约5μm。此外，样品101的图像应该以沿z轴的步骤记录(通过沿z轴平移样品101，光束102，104或样品101和光束102，104两者)；并且阶梯的尺寸应当是这个最小厚度的大小。
显微镜系统100还包括电子框架，该电子框架包括电子控制器180和计算系统190.电子控制器180在长时间内以毫秒精度提供显微镜110内的所有光机械部件的同步控制。计算系统190在实况样品101上快速执行复杂的光学对准，并且以若干持续数据速率提供用于与检测子系统116,118内的多个检测器(或相机)同时高速图像获取的稳健流水线。每秒数百兆字节和高流通量计算策略，用于高效的自动图像处理，以记录和重建每次实验产生的TB级原始多视图图像数据。
虽然说明书提供的实例描述了使用两个用于照明的光片和用于采集荧光的两个检测器的四视图系统，但是通过添加附加的检测器和/或照明系统可以获得更多的视图。在该实例中，照明子系统112，114彼此面对，使得样品101可以用来自两侧的光片照射，如图11B的示意图中更清楚地示出的。除了一组检测光学装置之外，每个检测子系统116，118还包括相应的检测器或照相机106，108，检测光学装置被设置成采集和记录从样品101发射的荧光。每个检测子系统116，118还包括一组致动器，在一端耦合到检测器106，108和检测光学装置中的一个或多个，并且在另一端与电子控制器180交界。
照明和检测的每种组合提供不同的视图或透视。通过同时捕获四个视图(在该实例中)，减少或消除了由样品101重复旋转到新位置(如在过去的顺序成像技术中)所引起的延迟。因此，显微镜系统100被设计用于在不旋转样品101的情况下同时获取多个互补视图。
现在涉及图12，过程700由显微镜系统100执行以对复杂的生物样品101成像。首先，制备生物样品101(702)。通过如上所述化学和生物学方式将样品以物理方式转移或安装到保持器166，并将保持器166放置在隔室168内来制备生物样品101。
例如，通过调节光片102，104的特性(例如，对准)来准备(704)显微镜110。一旦准备好显微镜110，就产生光片102，104(706)。将光板102，104引导通过生物样品101，使得样品101内存在空间和时间重叠(708)。荧光的照射和记录的开始可以在受精卵形成的时刻开始，以使生物样品101在其从受精卵到复杂系统的发育中成像。
从生物样品101发射的荧光由相机106，108记录，直到捕获整个生物样品101(710)。然后确定生物样品101的成像是否应当继续(712)。例如，成像通常可以持续到发育中胚胎强烈肌肉收缩的开始；此时，可以停止成像，因为样品101变得更加物理活动并且可能更难以成像。然而，成像可能会继续超过这个发展点。
如果要继续成像(712)，则重置光片和生物样品101之间的相对对准(714)并再次记录荧光(710)。创建生物样品101的图像(716)并且可以执行另外的后处理(718)。
本发明的方面涉及用于测定生物样品(例如，肿瘤活组织检查样品)中的荧光的方法、系统和装置。在一些实施方案中，本发明的方面涉及用于定量生物样品(例如，肿瘤活组织检查样品)中的荧光的方法、系统和装置。可以采用任何适合的定量方法，包括但不限于荧光强度，双波长荧光比率法，荧光寿命成像显微镜检查术(FLIM)，荧光原位杂交(FISH)，荧光阈值，光漂白后的共振能量转移(FRET)荧光恢复(FRAP)，光漂白中的荧光损失(FLIP)，光漂白后的荧光定位(FLAP)，它们的组合(例如，FRET-FLIM)等。根据某些实施方案，使用或适用于本方法用于荧光的2-D捕获和定量的图像分析软件。这种图像分析软件可以包括例如InForm和Mantra自动定量病理成像系统(Perkin-Elmer)。例如，3自动定量病理成像系统准确地检测和测定单个H&E，IHC或IF完整FFPE组织切片或TMA内的弱表达和重叠生物标记物，并且可以适用于本发明。和软件分析结合了多重生物标记物成像和定量分析的强大功能。在某些实施方案中，组织样品或TMA可以用免疫荧光(IF)或免疫组织化学(IHC)染色剂标记，或用常规染色剂如H&E和三色染色体标记。当使用IF或IHC染色时，可以在每个组织样品，每个细胞或每个细胞区室(例如，核，胞质)的基础上测定多种蛋白质-即使信号在光谱上相似，位于相同的细胞区室或被自发荧光遮挡。具有图像分析软件的MantraTM定量病理学工作站能够在完整的FFPE组织切片中同时对多种类型的免疫细胞进行简单的可视化，定量和表型分析，用于癌症免疫学研究，并且可以适用于根据本发明的较大组织样品。MantraTM是一种紧凑型工作站，可用于使用多重生物标记物在实体肿瘤中原位表达免疫细胞。与现有的流式细胞仪和下一代测序方法不同，后者可以对均质样品中的免疫细胞进行表型分析和定量分析，MantraTM设计用于使用FFPE组织切片的图像，同时保持组织结构和形态。MantraTM是一个集成了多光谱成像技术，新颖图像采集和inForm分析软件的工作站。它可以与各种染色剂一起使用，包括PerkinElmer的Opal TM试剂盒，其中任何一种都可以用于本发明的方法中。
分析方法的某些实施方案描述于PCT申请号PCT/US2015/032951和Tomer，R.T等人，Nature Protocols，第9卷，第7期，1682-1697(2014年6月)中，通过引用将其全部内容并入本说明书。
IV.生物样品和疾病状态的表征
本发明的方法包括确定生物样品(例如，肿瘤组织样品)的一种或多种特性，例如，以诊断疾病(例如，癌症)的存在，确定疾病的预后(例如，癌症)，监测疾病随时间的进展(例如，癌症)，确定疾病(例如，癌症)对治疗性处理的反应，确定疾病变得对疗法具有抗性的可能性(例如，癌症治疗))，或检测或监测对疗法的抗性。此外，本发明的方法可用于测试候选治疗剂，例如，通过测定受试者或疾病对候选药剂治疗的反应。可以对从患者或疾病的动物模型获得的生物样品实施本发明的方法。
检查的特性或特征可包括表型特性和/或遗传特性或特征。可以确定或测量生物样品的各种不同特征，包括但不限于：(i)特定细胞或胞外结构的存在，不存在，定位或分布；(ii)特定细胞或胞外结构的形状，大小，复杂性，位置或分布，例如血管，淋巴管或胞外基质成分；(iii)特定细胞类型(例如，免疫细胞或干细胞)的存在，不存在，位置，分布或数量；以及(iv)特定疾病标记物的存在或不存在，位置或分布，或量，例如与疾病相关的蛋白质的表达水平，例如肿瘤标记物。在某些实施方案中，出于本发明方法的目的，多个这样的特征的空间分布和/或数量可能比每个个体特征更重要。
有多种试剂和方法可用于检查组织细胞结构和疾病标记物表达水平，包括特异性结合细胞表面和指示特定细胞类型的细胞内标记物的大分子(例如，抗体或其片段和适配体)，特异性结合多肽的具有指示疾病的表达水平的核酸探针的大分子，和具有指特异性结合核酸例如mRNA的示疾病的表达水平的核酸探针，特异性结合与疾病相关的突变多肽的大分子，和特异性结合核酸例如基因或mRNA的包含与疾病相关的突变例如易位、插入、缺失或密码子取代多核苷酸。在特定的实施方案中，大分子，即可检测的标记物，包括抗体或其片段，或适配体。在特定的实施方案中，与检测到的靶多核苷酸生物标记物相比，核酸探针，即可检测标记物包含反义序列。在某些实施方案中，核酸引物的长度为8至40个核苷酸。在特定的实施方案中，它们将5'和3'结合到基因易位位点。适合于将多肽(例如，抗体或适配体)和核酸(例如，引物)与靶分子结合的条件是本领域中已知的。在标记期间，组织样品可以在适合的条件下与可检测的探针接触，并且时间足以使可检测标记物选择性地结合或与组织样品中的靶生物标记物杂交。在某些实施方案中，可以使用荧光原位杂交(FISH)检测核酸生物标记物。使用FISH检测和定位特定DNA序列，定位组织样品中的特定mRNA或鉴定染色体异常的方法描述于Shaffer D R等人，Clin Cancer Res.2007年4月1日；13(7)：2023-9，Cappuzo F等人，Journal of Thoracic Oncology，第2卷，第5期，2007年5月，Moroni M等人，Lancet Oncol.2005年5月；6(5)：279-86中，通过引用将它们各自的全部内容并入本说明书。
使用本说明书中所述的方法，检查生物样品(例如，肿瘤组织样品)的一种或多种性状或特征，基于该检查的结果可以诊断、检测或确认疾病，例如癌症。在特定的实施方案中，将生物样品的一种或多种特征与正常对照样品中的那些特征进行比较，例如，从相同组织或器官获得的无病样品。这可以通过并排分析，或通过将生物样品的一种或多种特征与此前从一种或多种正常对照样品或具有相同癌症但表型或基因型不同的样品获得的预定值或参数进行比较来进行。
使用本说明书中所述的方法，检查生物样品(例如，肿瘤组织样品)的一种或多种性状或特征，基于该检查的结果可以确定疾病(例如，癌症)的预后。在特定的实施方案中，将生物样品的一种或多种特征与鉴定为具有“良好”或“差”预后的相同类型疾病的生物样品中的那些特征进行比较。在某些情况下，一种或多种性状的存在或不存在可能与疾病的侵袭性形式或死亡率增加有关，而一种或多种其它特性的存在或不存在可能与轻度形式的疾病或低死亡。该预后分析可以通过对已知与预后良好或不良相关的生物样品进行生物样品的并排分析，或者通过将生物样品的一个或多个特征与预定值或参数进行比较来进行。已知与预后良好或不良相关的特征，例如，先前基于多个患病生物样品中这些特征的分析确定的值或参数，每个与疾病预后良好或不良相关。
使用本说明书中描述的方法，在一个或多个不同时间点，检查生物样品(例如，肿瘤组织样品)的一个或多个性状或特征，基于该检查的结果可以确定疾病(例如，受试者中的癌症)对特定治疗或治疗的预测响应。在某些实施方案中，在治疗之前从受试者获得生物样品。在特定的实施方案中，将生物样品的一种或多种特征与鉴定为对特定疗法或治疗具有良好反应或不良反应的相同类型疾病的生物样品中的那些特征进行比较。该分析可以通过生物样品的并排分析与已知与特定疗法或治疗的良好或不良反应相关联的生物样品，或通过比较生物样品的一个或多个特征来进行。已知与特定治疗的良好或不良反应相关的特征的确定值或参数，例如，基于对多个患病生物样品中的这些特征的分析预先确定的值或参数，每个与对特定疗法或治疗反应良好或差。在某些实施方案中，对治疗或治疗的响应是公认的临床终点，例如总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)。在其它实施方案中，所述一种或多种特征包括对特定治疗的抗性标记的不存在、存在或量，并且可以基于治疗抗性标记物存在或不存在来确定疾病对治疗的预测响应。在特定的实施方案中，治疗抗性标记物或大量治疗抗性标记物的存在预示着对治疗的不良反应，而不存在治疗抗性标记物或少量的治疗抗性标记物是预测对治疗的良好反应。
在特定的实施方案中，可以实施本发明的方法以基于确定受试者疾病对一种或多种的预测响应来确定向被诊断患有特定疾病(例如，癌性肿瘤)的受试者提供何种特定治疗或疗法，对疾病的不同治疗或疗法，例如，如上所述。
使用本说明书中描述的方法，在两个或更多个不同时间点，检查生物样品(例如，肿瘤组织样品)的一个或多个特性或特征，基于该检查的结果可以确定受试者中的疾病(例如，癌症)对特定疗法或治疗的实际响应。在特定实施方案中，测定在第一时间点(例如，在初始诊断时或在治疗之前)获得的生物样品的一个或多个特征，然后在第二个、更晚的时间点，例如，在治疗期间或治疗后确定所述的一个或多个特征。可以将在第一时间点确定的一个或多个特征与在第二个或更后时间点确定的一个或多个特征以及在所识别的时间点之间发生的任何变化进行比较。在第二个或更后时间点确定的一个或多个特征比在第一个时间点所确定的特征更类似于正常对照的情况下，表明该疗法正在治疗或抑制疾病的进展。在第二时间点确定的一种或多种特征与已知疾病样品的特征更相似的情况下，表明该疗法不治疗或抑制疾病的进展。可以基于对获得的正常或患病组织的生物样品的预先检查来预先确定与正常或非疾病或与疾病相关的特征。在某些实施方案中，评估例如癌症的后期阶段，包括评估肿瘤进展的RESIST标准，其描述于例如Eisenhauer，E.A.等人，EuropeanJournal of Cancer，第45卷，pp.228-247(2009)。在其它实施方案中，所述一种或多种特征包括对特定治疗的抗性标记的不存在、存在或量，并且可以基于两个不同时间点抗性标记物的不存在、存在或量的变化确定疾病对治疗的响应。例如，在第一时间点(例如，治疗前)初始不存在治疗抗性标记可以表明治疗是有效的，但是在随后的时间点存在治疗抗性标记物可以表示治疗不再有效。本发明的方法可以用于筛选候选治疗剂在治疗疾病例如肿瘤中的有效性。
在说明书所述任何方法的某些实施方案中，所述的方法还包括使一种或多种对照生物样品成像，例如阳性或阴性对照，例如，以确认组织处理和/或标记是成功的。在特定的实施方案中，例如，包含确定可检测标记物的量的实施方案，在相同条件下为对照样品确定的可检测标记物的量用于标准化测试生物样品中检测的量。在特定的实施方案中，所述的方法还包括标记对照生物样品并对标记的样品成像。在特定的实施方案中，它包括固定，聚合，清洁和标记一种或多种对照生物样品。在特定的实施方案中，对照生物样品是细胞粒状沉淀，例如培养的细胞系。在某些实施方案中，对照是冷冻的或先前冷冻的细胞粒状沉淀。在特定的实施方案中，对照是先前固定和清洁的生物样品，例如，先前固定和清洁的培养细胞的细胞。在包括确定测试样品的可检测标记物的量的方法的某些实施方案中，将测定的量与在对照样品的相同条件下测定的可检测标记物的量和测试样品的测定量进行比较。
A.生物结构
在特定的实施方案中，根据本发明的方法检查生物结构内的3维结构或细胞位置和图案。另外，可以检查组织或肿瘤微环境。在某些实施方案中，本发明包括检查生物结构是组织样品，例如肿瘤组织样品的方法，该方法包括通过以下方式处理从受试者获得的组织样品：(i)在水凝胶存在下固定组织样品亚基；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；(iv)对处理过的样品成像，以产生处理过的样品的至少一个图像。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(v)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品。在特定的实施方案中，组织样品是肿瘤组织样品。在特定的实施方案中，可检测标记物结合生物结构，其特征指示疾病的存在或不存在，例如癌症或肿瘤。在某些实施方案中，本说明书中描述的任何可检测标记物用于检测相关疾病或肿瘤。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(vi)将图像与一个或多个对照图像或从正常组织，疾病组织，肿瘤组织，与良好预后相关的肿瘤组织或与不良预后相关的肿瘤组织获得的预定图像进行比较，从而确定肿瘤的存在或肿瘤的预后。
随着肿瘤的生长和转移，它们可以影响它们生长的周围组织，这被称为肿瘤微环境(TME)。TME包括多种非恶性细胞，包括血液内皮细胞和淋巴管内皮细胞，以及胞外基质和它们分泌的炎症介质。基底层通常将薄壁组织与组织的基质区域分开，但在实体瘤中通常不完整。可以根据本发明的方法分析TME的变化，以便鉴定指示肿瘤，转移，预后或对治疗的响应的变化。可以检查的特定TME特征的实例包括但不限于：(i)血管形成，因为肿瘤由无组织和渗漏的血管异常血管化；(ii)先天性和适应性免疫细胞对肿瘤的浸润，这些细胞可以发挥肿瘤或抗肿瘤功能之一或两者；(iii)非造血细胞类型中存在的非造血细胞类型，包括血液内皮细胞和淋巴管内皮细胞，以及间充质来源的细胞，包括间充质干细胞及其分化的子代，癌症相关的成纤维细胞和周细胞。与正常健康组织相比，肿瘤微环境的特征可以是各种细胞和结构变化，例如血管渗漏，血管紊乱，间质压力增加，募集的免疫细胞重新进入肿瘤床，以及增加胶原蛋白和胞外基质沉积。在Turley，S.J.等人，Nature ReviewsImmunology，第15卷，pp.669-682(2015年11月)中进一步详细描述了这些和其它变化(其中任何一种都可以根据本发明进行评估)。
在某些实施方案中，检查生物样品内的血管或微脉管系统。血管生成或新血管形成与肿瘤生长和转移相关。肿瘤血管网络的新增长是重要的，因为癌细胞的增殖和转移扩散取决于充足的氧气和营养物供应以及废物的去除。淋巴管生成或新的淋巴管形成也在肿瘤生长和转移中起作用。此外，增加的微血管密度和解体可指示肿瘤发生，肿瘤生长和/或转移性癌症。本发明的方法允许检查整个肿瘤样品中的微脉管系统，例如，以确定微血管密度和组织。另外，可以确定肿瘤内微血管的位置，例如，与肿瘤边缘相比的血管位置，这可以指示肿瘤已经或将要转移的可能性。在特定的实施方案中，突出超出肿瘤边缘的血管的存在是肿瘤转移的预示或指示。
在某些实施方案中，通过使用特异性结合血管或其细胞的试剂染色样品来检查微脉管系统。在特定的实施方案中，使用结合血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)(内皮细胞标记物)和/或神经/神经胶质细胞抗原2(NG2)(周细胞标记物)的试剂进行免疫染色以研究程度。血管化PECAM-1用于证明组织学组织切片中存在内皮细胞。这可以帮助评估肿瘤血管生成的程度，这可能意味着快速生长的肿瘤。恶性内皮细胞通常也保留抗原，因此PECAM-1的存在也可用于鉴定血管瘤和血管肉瘤。NG2存在于中枢神经系统(CNS)和外周组织中。在中枢神经系统中，NG2存在于周细胞，各种肿瘤(包括胶质母细胞瘤)和一群称为多聚多糖细胞或少突胶质细胞前体细胞(OPCs)的祖细胞中。在外周，NG2存在于成软骨细胞，心肌细胞，主动脉平滑肌细胞，成肌细胞和几种不同的人类肿瘤中，包括黑素瘤。血管生成因子的表达水平反映了肿瘤细胞的侵袭性。表皮生长因子结构域样蛋白7(EGFL7)是一种胞外基质蛋白，支持内皮细胞粘附，促进细胞在压力下的存活，并形成调节血管形成的血管周围轨道。EGFL7在肿瘤和其它增殖组织中的新生血管中选择性表达，但在健康静止血管中不存在或以低水平表达。临床前研究还报道EGFL7可能促进肿瘤逃避免疫。增加的肿瘤或TME血管形成的特征在于可溶性因子水平增加，例如血管内皮生长因子A(VEGFA)，VEGFC和VEGFD。
与肿瘤和/或异常血管生成相关的异常或增加的微脉管系统可以通过改变或增加的生物标记物水平(例如，PECAM-1，NG2和EGLF7)和/或微血管密度，结构，分支模式的改变来表征或确定。与正常组织样品相比。或者，或另外，可以基于与相同类型肿瘤中的预定模式或表达水平的比较来确定与肿瘤和/或异常血管发生相关的异常或增加的微脉管系统。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过比较肿瘤组织样品微脉管系统的一个或多个特征与在具有已知临床结果的相同类型的肿瘤中观察到的特征来确定，其例如，通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR))进行测量，并且将具有与被测试的肿瘤组织样品最相似的特征的那些的预测临床结果相关联。生物标记物的表达水平可以通过测量生物标记物的表达量来确定，并且可以通过将这些与对照或预定值或两个或以上时间点进行比较来观察改变。微脉管系统结构可以通过测量特征来确定，例如，微管血管分支的数量，连接较大血管的毛细血管的数量，以及微血管的长度，例如通过视觉评估，并且可以通过将这些与对照或者在两个或以上时间点的预定值进行比较来观察改变。
在某些实施方案中，可以通过测量以下任何标记基因在肿瘤组织样品中的表达水平来确定肿瘤对用抗血管生成药物治疗的预测响应：VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VEGFA，VEGFB，VEGFC，VEGFD，PDGFRA和PDGFRB，因为这些已被认为是对抗血管生成药物的反应的潜在标记物。例如，可以将肿瘤组织样品中任何这些标记物的表达水平与其在已知对抗血管生成有反应或已知对抗血管生成药物无反应的相同类型的肿瘤中的表达水平进行比较，并且相关基于鉴定与肿瘤组织样品中最相似的表达水平的预测结果。
在其它实施方案中，检查生物样品中的胞外基质。癌细胞的局部微环境在癌症发展中起重要作用。局部微环境的主要组成部分是胞外基质(ECM)，一种复杂的大分子胞外网络。ECM提供许多功能，例如提供支持，将组织彼此分离以及调节细胞间通信。胞外基质调节细胞的动态行为。此外，它还能隔离各种细胞生长因子，并作为当地商店。ECM通常在例如癌症的疾病中失调和紊乱。异常ECM通过直接促进细胞转化和转移来影响癌症进展。ECM异常还使基质细胞失调，促进肿瘤相关的血管生成和炎症，从而导致致瘤微环境的产生。
ECM的成分由驻留细胞在细胞内产生，并通过胞吐作用分泌到ECM中。一旦分泌，它们就会与现有的矩阵聚合在一起。ECM由纤维蛋白和糖胺聚糖GAG的互锁网组成。ECM的成分包括但不限于蛋白聚糖，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素，硫酸角质素，非蛋白聚糖多糖，透明质酸，纤维蛋白，弹性蛋白，胶原蛋白和其它蛋白质，例如纤连蛋白，层粘连蛋白和血小板反应蛋白。血小板反应蛋白的表达增加与肿瘤生长和/或转移相关。原位和侵袭性或转移性癌症之间的临床预后的一个显著差异主要来自周围胞外基质膜(BM)的存在或不存在。正常或侵入前的肿瘤上皮通常缺乏淋巴管和血管，并且还通过BM与基质内的血管结构物理隔离。BM主要由IV型胶原蛋白，层粘连蛋白和其它分子组成，这些分子形成围绕上皮细胞的连续片(更常称为肿瘤囊)。
可以通过与正常组织样品相比胞外基质成分的改变水平来表征或确定与胞外基质相关的改变。或者，或另外，可以对相同类型肿瘤中的预定表达水平进行比较。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过比较肿瘤组织样品的一种或多种胞外基质成分的表达水平与具有已知临床结果的相同类型肿瘤中观察到的表达水平来确定，其例如，通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)进行测量，并且将具有与被测试的肿瘤组织样品最相似的特征的那些的预测临床结果相关联。可以通过测量生物标记物的表达量来确定生物标记物的表达水平或水平的变化。
组织功能结构的改变与分期和治疗决策高度相关。仅举一个实例，导管结构的完整性和连续性是格里森(Gleason)系统中前列腺癌分期不可或缺的部分，其中3D导管结构可视化在诊断，预后和治疗决策中具有很高的价值(因为它带有关于去分化，化生，瘤形成，转移潜能和组织破坏的程度。这个概念可以扩展到任何其它具有导管结构的组织(乳腺，胰腺，胆囊，肾等)以及其中的任何组织。功能结构涉及瘤形成的诊断、预后或治疗。
与正常组织相比，与正常组织样品相比，与胞外基质相关的改变也可以通过胞外基质的改变的结构或胞外基质成分的改变的位置或模式来表征或确定。或者，或另外，可以对相同类型肿瘤中的预定结构或蛋白质表达模式进行比较。
B.细胞类型
在其它实施方案中，检查生物样品中特定细胞类型的存在和/或量，和/或特定细胞类型的3D排列和位置。在特定的实施方案中，细胞类型包括干细胞和/或免疫细胞，例如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。在某些实施方案中，本发明包括检查细胞类型的方法是组织样品，例如肿瘤组织样品，包括通过以下方式处理从受试者获得的组织样品：(i)在水凝胶亚单位存在下固定组织样品；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；(iv)对处理过的样品成像，以产生处理过的样品的至少一个图像。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(v)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品。在特定的实施方案中，组织样品是肿瘤组织样品。在具体的实施方案中，可检测标记物结合细胞类型，其存在或量指示疾病的存在或不存在，例如癌症或肿瘤，肿瘤转移或肿瘤对治疗的抗性，例如癌症干细胞。在某些实施方案中，本说明书中描述的任何可检测标记物用于检测相关疾病或肿瘤。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(vi)将图像与一个或多对照图像或从正常组织，疾病组织，肿瘤组织，与良好预后相关的肿瘤组织或与预后差或转移或预测治疗反应相关的肿瘤组织获得的预定图像进行比较，从而确定肿瘤的存在，转移的可能性或肿瘤的预后。
白细胞及其可溶性介体在实体肿瘤发展的所有方面发挥重要的调节作用。适应性和先天性免疫应答在肿瘤免疫监视中起重要作用，它们可能限制肿瘤的发展和生长。推定肿瘤微环境免疫平衡在预后和对治疗的响应中起作用。此外，化疗可能引发免疫反应，这有助于治疗反应。TIL是对抗癌细胞的主要参与者，因此它们构成宿主和肿瘤之间免疫平衡的替代标记物。TILS被认为是杀死肿瘤细胞的原因，它们的存在通常与更好的临床结果相关。例如，在乳腺癌中，解决肿瘤免疫细胞浸润问题的研究已经证明，高淋巴细胞浸润预示着更好的预后和对新辅助化疗(NCT)更好的反应，尽管这种益处可能仅限于某些肿瘤亚型。类似地，一些研究支持TIL的某些亚型与乳腺癌存活率之间的关系。
各种类型的TIL包括表达CD3，CD4，CD8，CD20，CD68或Foxp3的那些。CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)直接能够杀死肿瘤细胞。CD4+T辅助淋巴细胞(Th)是分泌异质细胞因子的T淋巴细胞。辅助1型淋巴细胞(Th1)在激活CTL中起关键作用。T辅助2型淋巴细胞刺激体液免疫并激活嗜酸性粒细胞。就抗肿瘤免疫而言，Th2活化不如Th1活化有效。除Th1和Th2亚群外，CD4+调节性T淋巴细胞(Treg)亚群抑制效应T淋巴细胞。FoxP3+是相对选择性的Treg标记。在癌症中，由于肿瘤细胞和微环境巨噬细胞产生趋化因子，Treg优先转运至肿瘤。近年来，不同亚群之间比率最能预测预后的假设引起了人们的广泛关注。经常使用的比例是CD8+/FoxP3+(效应子：调节性)之比和CD8+/CD4+(效应子：辅助细胞)之比。
特定免疫细胞(例如，TIL)的存在或数量、类型和/或3D布置和位置以及生物样品中不同TIL子集的比例可以使用特异于细胞表面标记物特异性的探针来确定。不同的免疫细胞和不同类型的TILs。可以将生物样品(例如，肿瘤组织)内的不同免疫细胞的量，位置和比例，和/或特定免疫细胞的3D排列和位置与正常对照或预定水平进行比较。已知与正常或患病细胞相关。或者，或另外，可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的不同免疫细胞的量，位置和比例，和/或特定免疫细胞的3D布置和位置进行比较。相同类型肿瘤中不同免疫细胞的确定量，位置和比例。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过下列步骤来确定：比较不同免疫细胞的量，位置和比例，和/或特定免疫细胞的3D排列和位置与在已知的临床结果的具有相同类型的肿瘤中观察到的那些，其例如，通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)所测量的，并将所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果与具有已知临床结果的那些肿瘤的预测临床结果相关联，其具有最类似于被测试的肿瘤组织样品的不同免疫细胞的量、位置和比率，和/或特定免疫细胞的3D排列和位置。
癌症干细胞是具有与正常细胞相关的特征的癌细胞，特别是产生特定癌症样品中发现的所有细胞类型的能力。CSC是致肿瘤性的并且可以通过自我更新和分化成多种细胞类型的干细胞过程产生肿瘤。假设CSC作为一个小的，不同的群体在肿瘤中持续存在并引起复发和转移。在癌症治疗期间检测CSC和监测CSC的破坏对于癌症诊断，预后和监测治疗的有效性可能是重要的。本发明提供了鉴定CSC的优点，因为它允许比传统方法更彻底地研究整个肿瘤组织样品。
生物样品中CSC的存在或量可以使用对CSC特有的细胞表面标记物特异的探针来确定，例如但不限于CD90，Sca1，CS133和Oct3/4。对CSC特异的其它探针和与之相关的举例说明性癌症类型包括：CD24(热稳定抗原)，乳腺CSC；A1DH1，乳腺CDC；CD44，乳腺和前列腺CSC；ALDH1，广泛组织中的正常和癌症干细胞；EpCAM(上皮特异性抗原(ESA))，乳腺癌和胰腺癌；CD133(prominin-1)，胶质瘤和结肠直肠癌；4-Oct(POU5F1)，CSC广泛的组织；CD34，肠，肝和胰腺CSCs；c-Kit(CD117)，肠道，肝脏和胰腺CSC；以及CD10(CALLA)，头颈部鳞状细胞癌。可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的CSC的量与正常对照或已知与正常或患病细胞相关的预定水平进行比较。或者，或另外，可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的CSC的量与相同类型肿瘤中CSC的预定量，位置和比例进行比较。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过比较肿瘤组织样品中的CSC的量与在具有已知临床结果的相同类型的肿瘤中观察到的量来确定，其例如，通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)所测量，并且将所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果与具有已知临床结果的那些肿瘤的预测临床结果相关联，所述临床结果具有与所测试的肿瘤组织样品最相似的CSC量。
癌症相关成纤维细胞(CAF)是多种来源的异质细胞群，并且它们在肿瘤微环境中的积累通常与许多肿瘤中的不良预后相关。癌症相关的成纤维细胞支持癌细胞生长和转移，并可能阻碍抗肿瘤免疫反应。癌症相关的成纤维细胞可以通过量表达例如波形蛋白，α-平滑肌肌动蛋白和成纤维细胞活化蛋白的标记物来鉴定，并且其特征在于活化的，高度收缩的肌纤维母细胞表型。可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的CAF的量与正常对照或已知与正常或患病细胞相关的预定水平进行比较。或者，或另外，可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的CAF的量与相同类型肿瘤中CAF的预定量，位置和比例进行比较。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过比较肿瘤组织样品中CAF的量与具有已知临床结果的相同类型肿瘤中观察到的量来确定，其例如，通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)进行测量，并且将所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果与具有已知临床结果的那些肿瘤的预测临床结果相关联，所述临床结果具有与所测试的肿瘤组织样品最相似的CAF的量或位置。
通过血小板衍生的生长因子-β(PDGF-β)梯度将周细胞募集到肿瘤中，并且它们具有特征性细胞标记物，包括3G5神经节苷脂和硫酸软骨素蛋白聚糖4，也称为NG2。此外，G蛋白信号传导5(RGS5)的调节因子在肿瘤周细胞中过量表达。肿瘤细胞的Periyte覆盖率异常。在TME中，周细胞与血液内皮细胞和基底膜松散地相关，导致肿瘤脉管系统的渗漏增加，可能是由于VEGFA增加。生物样品(例如，肿瘤组织样品)中周细胞的位置和数量可能与正常对照或已知与正常或患病细胞相关的预定水平进行比较。或者/另外，可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)中周细胞的位置或量与相同类型肿瘤中预定量的周细胞或位置进行比较。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过比较肿瘤组织样品中周细胞的量与具有已知临床结果的相同类型的肿瘤中观察到的量来确定，其例如，通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)进行测量，并且将所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果与具有已知临床结果的那些肿瘤的预测临床结果相关联，所述临床结果具有与所测试的肿瘤组织样品最相似的周细胞的量或位置。
肿瘤微环境中的基质细胞表达许多表面和分泌的分子，这些分子影响肿瘤生长和对肿瘤的免疫应答。根据本发明的方法，这些分子可用作肿瘤的标记物。例如，血液内皮细胞在其表面表达程序性细胞死亡配体1、T细胞免疫球蛋白和含粘蛋白的结构域分子3和CD95L，并且它们分泌吲哚胺2,3-二氧化酶，白细胞介素-6，前列腺素E2和转化生长因子β。它们还表达可溶形式的CD137。周细胞分泌白细胞介素6，一氧化氮，前列腺素E2和转化生长因子b。间充质干细胞分泌堆积细胞生长因子，白细胞介素10，IDO，一氧化氮，前列腺素E2和转化生长因子β；癌相关成纤维细胞分泌转化生长因子β胸腺基质lymphopoetin和炎性细胞因子，包括CXC趋化因子配体8，白介素4和白介素6，M2巨噬细胞分泌分泌因子如表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，血小板衍生的生长因子β和转化生长因子β，支持CAF的存活和激活。肿瘤相关巨噬细胞和其它免疫细胞分泌的基质金属蛋白酶9，和可溶性介质，如环加氧酶2，成纤维细胞生长因子2，血小板衍生生长因子β和血管内皮生长因子，如血管内皮生长因子C和血管内皮生长因子D。这些都可以用作检测、预后和对癌症疗法反应后的标记物。
C.基因或蛋白质表达水平和突变
本发明的各种方法包括将疾病细胞(例如，肿瘤细胞)中具有改变的表达水平的一种或多种标记物的组织样品(例如，肿瘤组织样品)中的表达水平或表达模式与表达水平或表达模式进行比较。控制正常细胞或控制疾病细胞，包括具有已知临床结果的对照疾病细胞，例如，其通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)进行测量，或已知对一种或多种特定疗法有应答或无应答的对照疾病细胞。
与正常对照或患病组织中的表达模式相比，这些方法可包括测量一种或多种标记物的表达量和/或测量整个生物样品中的表达模式。在某些实施方案中，标记物在患病组织或细胞中具有增加的表达水平，而在其它实施方案中，标记物在患病组织或细胞中具有降低的表达水平。特别地，在实施方案中，标记是多肽或核酸，例如mRNA。所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果可以基于与具有与被测试的肿瘤组织样品最相似的表达水平的已知临床结果的那些肿瘤的相关性来确定。
在某些实施方案中，本发明包括检查组织样品(例如，肿瘤组织样品)中的基因表达水平(例如，表达的mRNA或编码的多肽)的方法，包括通过以下方式处理从受试者获得的组织样品：(i)在水凝胶亚单位存在下固定组织样品；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；(iv)对处理过的样品成像，以产生处理过的样品的至少一个图像。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(v)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋样品。在特定的实施方案中，组织样品是肿瘤组织样品。在特定的实施方案中，可检测标记物结合具有指示疾病存在或不存在的特征(例如，表达水平或表达模式)的基因表达产物(例如，mRNA或编码的多肽)，例如癌症或肿瘤。在某些实施方案中，本说明书中描述的任何可检测标记物用于检测相关疾病或肿瘤。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(vi)将图像与一个或多个对照图像或从正常组织，疾病组织，肿瘤组织，与良好预后相关的肿瘤组织或与不良预后相关的肿瘤组织，在治疗之前和之后或期间预后或肿瘤组织获得的预定图像进行比较，从而确定肿瘤的存在或肿瘤的预后。在本说明书中所述的本发明任何方面的具体实施方案中，成像包括定量一种或多种可检测标记物的量。
许多表现出改变的表达水平的基因，例如mRNA或编码的蛋白质表达，是本领域中已知的。描述这些基因及其癌症相关表达模式的许多数据库是本领域中已知的并且是可获得的。其中包括GENT，一个可通过网络访问的数据库，提供跨多样人类癌症和正常组织的基因表达模式，以及癌症基因组图谱(TCGA)，它提供了大量不同肿瘤类型中各种基因表达水平以及肿瘤相关突变的信息。
可以使用的许多癌症或肿瘤相关生物标记物包括US2015/0301055中描述的那些，以及与如下文献中公开的癌症诊断、预后和治疗相关的那些：美国专利号6,692,916、6,960,439、6,964,850、7,074,586；美国专利申请顺序号11/159,376、11/804,175、12/594,128、12/514,686、12/514,775、12/594,675、12/594,911、12/594,679、12/741,787、12/312,390；以及国际PCT专利申请号PCT/US2009/049935、PCT/US2009/063138、PCT/US2010/000037；通过引用将每个专利或专利申请整体并入本说明书。图19中提供了疾病的生物标记物的进一步实例，例如癌症，以及可用于检测它们的药剂，以及与癌症相关的易位。可以根据本发明的方法检测和/或定量这些生物标记物中的任何一种。另外，可以使用的某些标记物描述于实施例1中。在某些实施方案中，乳腺癌是浸润性ducal癌，其为乳腺的非浸润性乳腺粉刺癌。这些类型的乳腺癌的标记物可包括ER，PR和/或HER2/neu。在某些实施方案中，样品可以是被诊断患有癌症(例如，乳腺癌)的患者的淋巴结，并且在一些实施方案中，标记物是CD-31。
乳腺癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何组合。在乳腺癌中过量表达的miR生物标记物包括但不限于miR-21，miR-155，miR-206，miR-122a，miR-210，miR-21，miR-155，miR-206，miR-122a，miR-210，或miR-21，或其任意的组合。在乳腺癌中表达不足的miR生物标记物包括但不限于let-7，miR-10b，miR-125a，miR-125b，miR-145，miR-143，miR-145，miR-16或其任意的组合。。可以分析的乳腺癌的mRN生物标记物可以包括但不限于ER，PR，HER2，MUC1或EGFR，或其任意的组合。突变包括但不限于与KRAS，B-Raf或CYP2D6相关的突变或其任意的组合也可用作乳腺癌的特异性生物标记物。此外，乳腺癌特异性蛋白质，配体或肽生物标记物可包括但不限于hsp70，MART-1，TRP，HER2，hsp70，MART1，TRP，HER2，雌激素受体(ER)，孕酮受体。(PR)，III类b-微管蛋白，或VEGFA，或其任意的组合。此外，可用作乳腺癌生物标记物的snoRNA包括但不限于GASS。基因融合蛋白ETV6-NTRK3也可用作乳腺癌的生物标记物。另一种乳腺癌特异性生物标记物是ETV6-NTRK3。
用于评估乳腺癌的本发明方法的生物标记物包括但不限于BCA-225，hsp70，MART1，ER，VEGFA，III类b-微管蛋白，HER2/neu(例如，用于Her2+乳腺癌)，GPR30，ErbB4(JM)同种型，MPR8，MISIIR，CD9，EphA2，EGFR，B7H3，PSM，PCSA，CD63，STEAP，CD81，ICAM1，A33，DR3，CD66e，MFG-E8，TROP-2，乳房珠蛋白，Hepsin，NPGP/NPFF2，PSCA，5T4，NGAL，EpCam，神经激肽受体-1(NK-1或NK-1R)，NK-2，Pai-1，CD45，CD10，HER2/ERBB2，AGTR1，NPY1R，MUC1，ESA，CD133，GPR30，BCA225，CD24，CA15.3(分泌MUC1)，CA27.29(分泌MUC1)，NMDAR1，NMDAR2，MAGEA，CTAG1B，NY-ESO-1，SPB，SPC，NSE，PGP9.5，孕酮受体(PR)或其同种型(PR(A)或PR(B))，P2RX7，NDUFB7，NSE，GAL3，骨桥蛋白，CHI3L1，IC3b，间皮素，SPA，AQP5，GPCR，hCEA-CAM，PTP IA-2，CABYR，TMEM211，ADAM28，UNC93A，MUC17，MUC2，IL10R-β，BCMA，HVEM/TNFRSF14，Trappin-2，Elafin，ST2/IL1R4，TNFRF14，CEACAM1，TPA1，LAMP，WF，WH1000，PECAM，BSA，TNFR或任何组合它们。一种或多种抗原CD9，MIS Rii，ER，CD63，MUC1，HER3，STAT3，VEGFA，BCA，CA125，CD24，EPCAM和ERB B4可用于评估源自乳腺癌细胞的囊泡。在特定的实施方案中，标记物是雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)或HER2/neu。结合标记物的抗体可商购获得或可使用本领域实践的常规方法产生。举例说明性抗体描述于表3中。
卵巢癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何组合。例如，本发明的方法可用于检测一种或多种卵巢癌过量表达的miR，例如但不限于miR-200a，miR-141，miR-200c，miR-200b，miR-21，miR。-141，miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-203，miR-205，miR-214，miR-1 99*或miR-215，或其任意的组合。生物印记还可以包含一种或多种卵巢癌表达不足的miR，例如但不限于miR-199a，miR-140，miR-145，miR-100，miR-let-7簇或miR-125b-1，或其任意的组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于ERCC1，ER，TOPO1，TOP2A，AR，PTEN，HER2/neu，CD24或EGFR，或其任意的组合。
可以使用的卵巢癌的其它生物标记物包括但不限于KRAS突变，B-Raf突变，BRCA1和BRCA2，或卵巢癌特异性突变的任何组合。可以评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于VEGFA，VEGFR2或HER2，或其任意的组合。另一种卵巢癌特异性生物标记物是CD24。
肺癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何组合。标记物可包含一种或多种肺癌过量表达的miR，例如但不限于miR-21，miR-205，miR-221(保护性)，let-7a(保护性)，miR-137(有风险的)，miR-372(风险)，或miR-122a(风险)，或其任意的组合。它们可包含一种或多种肺癌增量调节或过量表达的miRNA，例如miR-17-92，miR-19a，miR-21，miR-92，miR-155，miR-191，miR-205或miR-210；一种或多种肺癌减量调节或表达不足的miRNA，例如miR-let-7，或其任意的组合。一种或多种生物标记物可以是miR-92a-2*，miR-147，miR-574-5p，例如用于小细胞肺癌。可以分析的一种或多种肺癌mRNA生物标记物包括但不限于EGFR，PTEN，RRM1，RRM2，ABCB1，ABCG2，LRP，VEGFR2，VEGFR3，III类b-微管蛋白，或其任意的组合。在某些实施方案中，肺癌是肺腺癌，并且标记物可以是CD-31。
可以评估的肺癌的生物标记物突变包括但不限于EGFR，KRAS，B-Raf，UGT1A1的突变，或ALK，ROS或RET基因的重排，或肺癌特异性突变的任何组合。可以评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于KRAS，hENT1或其任意的组合。肺癌生物标记物也可以是中期因子(MK或MDK)。在一些实施方案中，肺癌生物标记物包含SPB，SPC，PSP9.5，NDUFB7，gal3-b2c10，iC3b，MUC1，TS，ERCC1，GPCR，CABYR和muc17中的一种或多种，与正常相比其可在肺癌样品中过量表达。可以使用其它肺癌特异性生物标记物，例如RLF-MYCL1，TGF-ALK或CD74-ROS1。
结肠癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或它们的任何组合，例如图6中所列的，并且可用于制造结肠癌特异性生物标记。例如，它们可包含一种或多种结肠癌过量表达的miR，例如但不限于miR-24-1、miR-29b-2、miR-20a，miR-10a、miR-32、miR-203、miR-106a、miR-17-5p、miR-30c、miR-223、miR-126、miR-128b、miR-21、miR-24-2、miR-99b、miR-155、miR-213、miR-150、miR-107、miR-191、miR-221、miR-20a、miR-510、miR-92、miR-513、miR-19a、miR-21、miR-20、miR-183、miR-96、miR-135b、miR-31、miR-21、miR-92、miR-222、miR-181b、miR-210、miR-20a、miR-106a、miR-93、miR-335、miR-338,miR-133b、miR-346、miR-106b、miR-153a、miR-219、miR-34a、miR-99b、miR-185、miR-223、miR-211、miR-135a、miR-127、miR-203、miR-212、miR-95或miR-17-5p或其任意的组合。所述生物标记还可以包含一种或多种结肠癌过量表达的miR，例如miR-143、miR-145、miR-143、miR-126、miR-34b、miR-34c，let-7、miR-9-3、miR-34a、miR-145、miR-455、miR-484、miR-101、miR-145、miR-133b、miR-129、miR-124a、miR-30-3p、miR-328、miR-106a、miR-17-5p、miR-342、miR-192、miR-1、miR-34b、miR-215、miR-192、miR-301,miR-324-5p、miR-30a-3p、miR-34c、miR-331、miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a或miR-148b或其任意的组合。一种或多种结肠癌生物标记物可以是增量调节或过量表达的miRNA，例如miR-20a、miR-21、miR-106a、miR-181b或miR-203，例如，用于表征结肠腺癌。一种或多种生物标记物可用于表征结肠直肠癌，例如选自如下的增量调节或过量表达的miRNA：miR-19a、miR-21、miR-127、miR-31、miR-96、miR-135b和miR-183；减量调节或低表达的miRNA，例如miR-30c、miR-133a，mir143、miR-133b或miR-145或其任意的组合。一种或多种生物标记物可以用于表征结肠直肠癌，例如增量调节或过量表达的miRNA，其选自：miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a和miR-200b或其任意的组合。
可被分析的一种或多种结肠癌mRNA可以包括但不限于EFNB1，ERCC1，HER2，VEGF或EGFR，或其任意的组合。可被评估的结肠癌的生物标记物突变包括但不限于EGFR，KRAS，VEGFA，B-Raf，APC或p53的突变，或结肠癌特异性突变的任何组合。可被评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于AFR，Rab，ADAM10，CD44，NG2，肝配蛋白B1，MIF，b-连环蛋白，连接物，斑珠蛋白，glalectin-4，RACK1，tetrspanin-8，FasL，TRAIL，A33，CEA，EGFR，二肽酶1，hsc-70，四跨膜蛋白，ESCRT，TS，PTEN或TOPO1，或其任意的组合。
根据本发明的方法，膀胱癌的生物标记物可用于评估膀胱癌。生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。膀胱癌的生物标记物包括但不限于miR-223，miR-26b，miR-221，miR-103-1，miR-185，miR-23b，miR-203，miR-17-5p，miR-23a，miR-205中的一种或多种或其任意的组合。膀胱癌的其它生物标记物包括FGFR3，EGFR，pRB(视网膜母细胞瘤蛋白)，5T4，p53，Ki-67，VEGF，CK20，COX2，p21，细胞周期蛋白D1，p14，p15，p16，Her-2，MAPK(分裂原活化蛋白激酶)，Bax/Bcl-2，PI3K(磷酸肌醇-3-激酶)，CDKs(细胞周期蛋白依赖性激酶)，CD40，TSP-1，HA-ase，端粒酶，存活素，NMP22，TNF，细胞周期蛋白E1，p27，半胱天冬酶，存活蛋白，NMP22(核基质蛋白22)，BCLA-4，细胞角蛋白(8，18，19和20)，CYFRA 21-1，IL-2和补体因子H相关蛋白。在一个实施方案中，非受体酪氨酸激酶ETK/BMX和/或碳酸酐酶IX用作膀胱癌的标记物，用于诊断，预后和治疗目的。
来自囊泡的前列腺癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，前列腺癌的生物标记物可包含miR-9、miR-21、miR-141、miR-370、miR-200b、miR-210、miR-155或miR-196a。在一些实施方案中，生物标记物是一种或多种前列腺癌过量表达的miR，例如但不限于miR-202、miR-210、miR-296、miR-320、miR-370、miR-373、miR-498、miR-503、miR-184、miR-198、miR-302c、miR-345、miR-491、miR-513、miR-32、miR-182、miR-31、miR-26a-1/2、miR-200c、miR-375、miR-196a-1/2、miR-370、miR-425、miR-425、miR-194-1/2、miR-18la-1/2、miR-34b、let-7i、miR-188、miR-25、miR-106b、miR-449、miR-99b、miR-93、miR-92-1/2、miR-125a、miR-141、miR-29a、miR-145或其任意的组合。在一些实施方案中，生物标记物包含在前列腺癌中过量表达的一种或多种miRs，包括miR-29a和/或miR-145。在一些实施方案中，生物标记物包含在前列腺癌中过量表达的一种或多种miR，包括hsa-miR-1974、hsa-miR-27b、hsa-miR-103、hsa-miR-146a、hsa-miR-22、hsa-miR-382、hsa-miR-23a、hsa-miR-376c、hsa-miR-335、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-221、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-151-3p和hsa-miR-21或miR-141或其任意的组合。前列腺癌生物标记物还可包含一种或多种表达不足的miR，例如但不限于let-7a，let-7b，let-7c，let-7d，let-7g、miR-16、miR-23a、miR-23b、miR-26a、miR-92、miR-99a、miR-103、miR-125a、miR-125b、miR-143、miR-145、miR-195、miR-199、miR-221、miR-222、miR-497，let-7f、miR-19b,miR-22、miR-26b、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-29b、miR-305p、miR-30c、miR-100、miR-141、miR-148a、miR-205、miR-520h、miR-494、miR-490、miR-133a-1、miR-1-2、miR-218-2、miR-220、miR-128a、miR-221、miR-499、miR-329、miR-340、miR-345、miR-410、miR-126、miR-205、miR-7-1/2、miR-145、miR-34a、miR-487或let-7b或其任意的组合。前列腺癌生物标记物可包含增量调节或过量表达的miR-21，甲减量调节或表达不足的miR-15a，miR-16-1，miR-143或miR-145，或其任意的组合。
可以分析的一种或多种前列腺癌生物标记物mRNA可以包括但不限于AR，PCA3或其任意的组合，并且可以用作前列腺癌的特异性生物标记物。
可以作为前列腺癌生物标记物评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于FASLG或HSP60，PSMA，PCSA，雄激素受体(AR)，TNFSF10或其任意的组合。此外，可用作前列腺癌的生物标记物的snoRNA可包括但不限于U50。
另外的前列腺癌特异性生物标记物包括ACSL3-ETV1、C15ORF21-ETV1、F1135294-ETV1、HERV-ETV1、TMPRSS2-ERG、TMPRSS2-ETV1/4/5、TMPRSS2-ETV4/5、SLC5A3-ERG、SLC5A3-ETV1、SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV。
黑素瘤特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何其组合，如图19所示，并且可用于产生黑素瘤特异性生物标记。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-19a、miR-144、miR-200c、miR-211、miR-324-5p、miR-331或miR-374或其任意的组合。所述生物标记物还可以包含一种或多种过量表达的miRs，例如，但不限于miR-9、miR-15a、miR-17-3p、miR-23b、miR-27a、miR-28、miR-29b、miR-30b、miR-31、miR-34b、miR-34c、miR-95、miR-96、miR-100、miR-104、miR-105、miR-106a、miR-107、miR-122a、miR-124a、miR-125b、miR-127、miR-128a、miR-128b、miR-129、miR-135a、miR-135b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-145、miR-149、miR-154、miR-154#3、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-184、miR-185、miR-189、miR-190、miR-199、miR-199b、miR-200a、miR-200b、miR-204、miR-213、miR-215、miR-216、miR-219、miR-222、miR-224、miR-299、miR-302a、miR-302b、miR-302c、miR-302d、miR-323、miR-325，let-7a、let-7b、let-7d、let-7e或let-7g或其任意的组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于MUM-1，β-连环蛋白或Nop/5/Sik，或其任意的组合，并且可以用作黑素瘤的特异性生物标记物。
可被评估的黑素瘤的生物标记物突变包括但不限于CDK4的突变或黑素瘤特异性突变的任意组合。
可被评估的黑素瘤的蛋白质，配体或肽生物标记物可以包括但不限于DUSP-1，Alix，hsp70，Gib2，Gia，膜突蛋白，GAPDH，苹果酸脱氢酶，p120连环蛋白，PGRL，突触融合蛋白结合蛋白1和2，氯苄乙胺-2或含有WD-重复的蛋白质1，或其任意的组合。可用作黑素瘤的生物标记物的snoRNA包括但不限于H/ACA(U107f)，SNORA11D或其任意的组合。
与黑素瘤相关的生物标记物还包括HSPA8、CD63、ACTB、GAPDH、ANXA2、CD81、ENO1、PDCD6IP、SDCBP、EZR、MSN、YWHAE、ACTG1、ANXA6、LAMP2、TPI1、ANXA5、GDI2、GSTP1、HSPA1A、HSPA1B、LDHB、LAMP1、EEF2、RAB5B、RDX、GNB1、KRT10、MDH1、STXBP2、RAN、ACLY、CAPZB、GNA11、IGSF8、WDR1、CAV1、CTNND1、PGAM1、AKR1B1、EGFR、MLANA、MCAM、PPP1CA、STXBP1、TGFB1、SEPT2和TSNAXIP1。可以评估这些标记物的一种或多种以表征黑素瘤。
胰腺癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-221、miR-181a、miR-155、miR-210、miR-213、miR-181b、miR-222、miR-181b-2、miR-21、miR-181b-l、miR-220、miR-181d、miR-223、miR-100-1/2、miR-125a、miR-143、miR-10a、miR-146、miR-99、miR-100、miR-199.alpha.-1、miR-10b、miR-199a-2、miR-221、miR-181a、miR-155、miR-210、miR-213、miR-181b、miR-222、miR-181b-2、miR-21、miR-181b-1、miR-181c、miR-220、miR-181d、miR-223、miR-100-1/2、miR-125a、miR-143、miR-10a、miR-146、miR-99、miR-100、miR-199.alpha.-1、miR-10b、miR-199a-2、miR-107、miR-103、miR-103-2、miR-125b-1、miR-205、miR-23a、miR-221、miR-424、miR-301、miR-100、miR-376a、miR-125b-1、miR-21、miR-16-1、miR-181a、miR-181c、miR-92、miR-15、miR-155，let-7f-1、miR-212、miR-107、miR-024-1/2、miR-18a、miR-31、miR-93、miR-224或let-7d或其任意的组合。
生物标记物还可包含一种或多种表达不足的miR，例如但不限于miR-148a，miR-148b，miR-375，miR-345，miR-142，miR-133a，miR-216，miR-217或miR-139或其任意的组合。可被分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于PSCA，间皮素或骨桥蛋白，或其任意的组合，并且可以用作胰腺癌的特异性生物标记物。
可被评估的胰腺癌的生物标记物突变包括但不限于KRAS，CTNNLB1，AKT，NCOA3，B-RAF或EGFR的突变，或胰腺癌特异性突变的任意组合。生物标记物也可以是BRCA2，PALB2或p16A。
脑癌(包括但不限于神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，脑膜瘤，听神经瘤/神经鞘瘤，髓母细胞瘤)特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种))过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-21、miR-10b、miR-130a、miR-221、miR-125b-1、miR-125b-2、miR-9-2、miR-21、miR-25或miR-123或其任意的组合。生物标记物还可以包含一种或多种表达不足的miRs，例如，但不限于miR-128a、miR-181c、miR-181a或miR-181b或其任意的组合。
可被分析的一种或多种mRNA包括但不限于MGMT，其可以用作脑癌的特异性生物标记物。可以在囊泡中评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于EGFR。
肝细胞癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-2、let-fg、miR-122a、miR-124a-2、miR-130a、miR-132、miR-136、miR-141、miR-142、miR-143、miR-145、miR-146、miR-150、miR-155(BIC)、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181c、miR-195、miR-199a-1-5p、miR-199a-2-5p、miR-199b、miR-200b、miR-214、miR-223或前-miR-594或其任意的组合。可以分析的一种或多种mRNA可以包括，但不限于FAT10。
一种或多种生物标记物也可用于表征丙型肝炎病毒相关的肝细胞癌。一种或多种生物标记物可以是miRNA，例如过量表达或表达不足的miRNA。例如，增量调节或过量表达的miRNA可以是miR-122，miR-100或miR-10a，并且减量调节的miRNA可以是miR-198或miR-145。
宫颈癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或以上过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何组合。例如，可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于HPV E6，HPV E7或p53，或其任意的合，并且可以用作宫颈癌囊泡的特异性生物标记物。
子宫内膜癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-185、miR-106a、miR-181a、miR-210、miR-423、miR-103、miR-107或let-7c或其任意的组合。生物标记物还可包含一种或多种表达不足的miR，例如但不限于miR-7i，miR-221，miR-193，miR-152或miR-30c，或其任意的组合。
可以评估的子宫内膜癌的生物标记物突变包括但不限于PTEN，K-RAS，B-连环蛋白，p53，Her2/neu的突变，或子宫内膜癌特异性突变的任何组合。可以评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于NLRP7，AlphaVβ6整联蛋白或其任意的组合。
头和颈癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-21，let-7，miR-18，miR-29c，miR-142-3p，miR-155，miR-146b，miR-205或miR-21，或其任意的组合。生物标记还可以包含一种或多种表达不足的miR，例如但不限于miR-494。可以分析的一种或多种mRNA包括，但不限于HPVE6、HPVE7、p53、IL-8、SAT、H3FA3或EGFR或其任意的组合，其可以用作来自头颈癌囊泡的特异性生物标记物。
可被评估的头颈癌的生物标记物突变包括但不限于GSTM1，GSTT1，GSTP1，OGG1，XRCC1，XPD，RAD51，EGFR，p53的突变，或头颈癌特异性突变的任意组合。可以评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于EGFR，EphB4或EphB2，或其任意的组合。可以使用其它头颈癌特异性生物标记物，例如CHCHD7-PLAG1，CTNNB1-PLAG1，FHIT-HMGA2，HMGA2-NFIB，LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1。
GIST特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或任何其组合。例如，可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于DOG-1，PKC-θ，KIT，GPR20，PRKCQ，KCNK3，KCNH2，SCG2，TNFRSF6B或CD34，或其任意的组合，并可用作GIST的特异性生物标记物。
GIST的生物标记物突变，可以评估，但不限于PKC-theta的突变或GIST特异性突变的任意组合。可以评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于PDGFRA，c-kit或其任意的组合。
肾细胞癌(RC)特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，生物标记物还可包含一种或多种表达不足的miR，例如但不限于miR-141，miR-200c或其任意的组合。一种或多种增量调节或过量表达的miRNA可以是miR-28，miR-185，miR-27，miR-let-7f-2或其任意的组合。
可以分析的一种或多种mRNA可以包括但不限于层粘连蛋白受体1，betaig-h3，半乳糖凝集素-1，α-2巨球蛋白，亲脂蛋白，血管生成素2，Caldesmon 1，II类MHC相关恒定链(CD74)，胶原IV-a1，补体成分，补体成分3，细胞色素P450，亚家族III多肽2，δ睡眠诱导肽，Fc g受体Ma(CD16)，HLA-B，HLA-DRa，HLA-DRb，HLA-SB，IFN诱导的跨膜蛋白3，IFN诱导的跨膜蛋白1或赖氨酰氧化酶，或其任意的组合，可用作肾细胞癌的特异性生物标记物。
可被评估的肾细胞癌的生物标记物突变包括但不限于VHL突变或突变特异性肾细胞癌的任意组合。
可被评估的肾细胞癌的蛋白质，配体或肽生物标记物可包括但不限于IF1α，VEGF，PDGFRA或其任意的组合。其它RCC特异性生物标记物包括ALPHA-TFEB，NONO-TFE3，PRCC-TFE3，SFPQ-TFE3，CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB。
食道癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-192、miR-194、miR-21、miR-200c、miR-93、miR-342、miR-152、miR-93、miR-25、miR-424或miR-151或其任意的组合。生物标记还可以包含一种或多种表达不足的miR，例如，但不限于miR-27b、miR-205、miR-203、miR-342，let-7c、miR-125b、miR-100、miR-152、miR-192、miR-194、miR-27b、miR-205、miR-203、miR-200c、miR-99a、miR-29c、miR-140、miR-103或miR-107或其任意的组合。可以分析的一种或多种mRNA包括，但不限于MTHFR并且可以用作食道癌的特异性生物标记物。
胃癌特异性生物标记物可包括一种或多种(例如，2、3、4、5、6、7、8或更多种)过量表达的miR，表达不足的miR，mRNA，遗传突变，蛋白质，配体，肽，snoRNA或其任意的组合。例如，生物标记物可包含一种或多种过量表达的miR，例如但不限于miR-106a、miR-21、miR-191、miR-223、miR-24-1、miR-24-2、miR-107、miR-92-2、miR-214、miR-25或miR-221或其任意的组合。生物标记还可以包含一种或多种表达不足的miR，人，但不限于let-7a。
可以分析的一种或多种mRNA包括但不限于RRM2，EphA4或存活蛋白，或其任意的组合，并且可以用作来自用于胃癌的囊泡的特异性生物标记物。可以评估的胃癌的生物标记物突变包括但不限于APC的突变或胃癌特异性突变的任意组合。可以评估的蛋白质，配体或肽可以包括但不限于EphA4。
甲状腺癌特异性生物标记物包括但不限于AKAP9-BRAF，CCDC6-RET，ERC1-RETM，GOLGA5-RET，HOOK3-RET，HRH4-RET，KTN1-RET，NCOA4-RET，PCM1-RET，PRKARA1A-RET，RFG-RET，RFG9-RET，Ria-RET，TGF-NTRK1，TPM3-NTRK1，TPM3-TPR，TPR-MET，TPR-NTRK1，TRIM24-RET，TRIM27-RET或TRIM33-RET，其特征在于甲状腺乳头状；或PAX8-PPARy，其特征在于滤泡性甲状腺癌。
在某些方法中，确定与疾病(例如，肿瘤)相关的基因中存在突变。在特定的实施方案中，突变是易位，重排或基因扩增。在其它实施方案中，突变产生剪接突变体，或截短或修饰的编码多肽基因产物。在特定的实施方案中，突变包含至少一个核苷酸插入，缺失或取代。在特定的实施方案中，编码的多肽基因产物包含氨基酸插入，缺失或取代。可以确定的突变包括但不限于本说明书中描述的任何突变。可以根据本发明的方法检测的与实体瘤相关的突变或基因组改变的其它实例包括但不限于ABL1、AKT1、AKT2、AKT3、ALK、APC、AR、ARAF、BAP1、BCL2L11、BRAF、BRCA1、BRCA2、BTK、CBL、CCND1、CCNE1、CDH1、CDK2、CDK4、CDK6、DKN1B、CDKN2A、CSF1R、CTCF、CTNNB1、DDR2、DDX3X、EGFR、EPHA2、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、ETV6、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT1(VEGFR1)、FLT3、FOXO1、GATA3、GNA11、GNAQ、GNAS、HIF1A、HNF1A、HRAS、IDH1、IDH2、IGF1R、JAK1、JAK2、JAK3、KDR、KEAP1、KIT、KMT2A/MLL、KRAS、MAP2K1、MAP2K2、MAP2K4、MAP3K1、MAP3K9、MAPK1、MCL1、MDM2、ED12、MET、MITF、MTOR、MYC、NF1、NKX2-l、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NTRK1、PALB2、PBRM1、PDGFRa、PDGFRb、PIK3CA、PIK3CD、PIK3R1、PTCH1、PTEN、PTPN11、RB1、RET、RHEB、RHOA、RICTOR、RIT1、ROS1、RUNX1、SMAD4、SMARCB1、SMO、SPEN、SPOP、SRC、STK11、SYK、TP53、TSC1、TSC2和VHL中的突变。与黑素瘤相关的突变基因包括，但不限于BRAF、CTNNB1、GNA11、GNAQ、KIT、MEK1、NF1和NRAS。与非小细胞肺癌相关的突变或改变(例如，重排或扩增)基因包括但不限于AKT1(突变)，ALK(重排)，BRAF(突变)，DDR2(突变)，EGFR(突变)，FGFR1(扩增)，HER2(突变)，KRAS(突变)，MEK1(突变)，METa(扩增)，NRAS(突变)，PIK3CA(突变)，PTEN(突变)，RET(重排)和ROS1a(重排)。与卵巢癌相关的突变或改变(例如，重排或扩增)基因包括但不限于BRAF，KRAS，PIK3CA和PTEN。与结肠直肠癌相关的突变或改变(例如，重排或扩增)基因包括但不限于AKT1，BRAF，KRAS，NRAS，PIK3CA，PTEN和SMAD4。
在某些实施方案中，本发明包括通过以下方法确定来自受试者的组织样品中基因或等位基因中突变的存在的方法：(i)在水凝胶亚单位存在下固定组织样品；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；(iv)对处理过的样品成像，以产生处理过的样品的至少一个图像。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(v)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品。在特定的实施方案中，组织样品是肿瘤组织样品。在特定的实施方案中，可检测标记物结合基因突变，其存在或量指示疾病的存在或不存在，例如癌症或肿瘤，肿瘤转移或肿瘤对治疗的抗性，例如癌症干细胞。在某些实施方案中，检测本说明书中所述的任何突变以鉴定相关的疾病或肿瘤。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(vi)将图像与一个或多个对照图像或预定图像进行比较，或者从正常组织，疾病组织，肿瘤组织，预后良好的肿瘤组织或与预后或转移不良相关的肿瘤组织，或预测治疗反应获得的基因突变的存在或不存在，从而确定肿瘤的存在，转移的可能性或肿瘤的预后。
本发明的方面可用于检测可能与疾病相关的任何一个或多个感兴趣的基因座中遗传异常的存在。例如，可以根据本发明的方法测定与肿瘤，癌症，癌前病变或任何其它疾病或病况相关的一个或多个不同基因座。靶核酸的实例包括但不限于一种或多种癌基因，肿瘤抑制基因，含有核酸重复的基因组区域(例如，不同形式的卫星DNA，例如微卫星DNA或微卫星DNA)，其它遗传基因座(编码)或非编码遗传基因座)，或其组合。图19中提供了显示差异表达，易位，重排等的基因、miRNA等的实例。
在本发明的某些实施方案中，突变的存在或不存在可以指示与发展癌症，癌症的早期检测以及最终癌症的预后和治疗相关的风险。这些突变包括但不限于以下基因：MSH2，MSH6，MLH1，PMS2，BUB1，BUBR1，MRE11，CDC4，APC，β-连环蛋白，TGFbeta，SMAD4，p21Waft，14-3-3sigma，PUMA，BAX，PRL-3和PIK3CA。应理解，这些基因参与肿瘤过程的不同阶段，因此可选择性地用于检测或监测肿瘤起源，进展或复发。例如，APC/β-连环蛋白途径中的突变引发肿瘤过程。检测这些基因中的突变对于癌症风险评估非常有用。在APC/β-连环蛋白基因中发现突变的患者发生肿瘤的风险升高。最常见的是，APC/β-连环蛋白基因突变导致腺瘤(小的良性肿瘤)。随着其它生长控制途径基因的突变积累，这些肿瘤进展，变得更大，更危险。生长控制途径基因包括K-Ras，B-RAF，PIK3CA或p53。检测这些基因中的突变可以导致早期检测肿瘤的发展。如果未检测到和未治疗(在某些情况下)，肿瘤过程可以通过稳定基因的突变加速，例如PIKSCA/PTEN，PUMA，p53/BAX，p21Waf1，14-3-3σ或PRL-3。许多这些基因产物起到阻断细胞分娩，细胞周期和/或激活细胞死亡和凋亡的作用。其它如PRL-3和PIK3CA参与调节转移。检测这些基因中的突变对于确定特定癌症的临床预后，特定癌症治疗的治疗功效和监测给定肿瘤的进展或复发是重要的。
可根据本发明的方法检测的乳腺癌特异性融合的实例包括但不限于ETV6-NTRK3。肺癌特异性融合的实例包括但不限于RLF-MYCL1，TGF-ALK或CD74-ROS1。前列腺癌特异性融合的实例包括但不限于ACSL3-ETV1，C150RF21-ETV1，F1135294-ETV1，HERV-ETV1，TMPRSS2-ERG，TMPRSS2-ETV1/4/5，TMPRSS2-ETV4/5，SLC5A3-ERG，SLC5A3-ETV1，SLC5A3-ETV5或KLK2-ETV4。脑癌特异性融合的实例包括但不限于GOPC-ROS 1.头颈癌特异性融合的实例包括但不限于CHCHD7-PLAG1，CTNNB1PLAG1，FHIT-HMGA2，HMGA2-NFIB。，LIFR-PLAG1或TCEA1-PLAG1。RCC特异性融合体的实例包括但不限于ALPHA-TFEB，NONO-TFE3，PRCC-TFE3，SFPQ-TFE3，CLTC-TFE3或MALAT1-TFEB。甲状腺癌特异性融合的实例包括但不限于AKAP9-BRAF，CCDC6-RET，ERC1-RETM，GOLGA5-RET，HOOK3-RET，HRH4-RET，KTN1-RET，NCOA4-RET，PCM1-RET，PRKARA1A-RET，RFGRET，RFG9-RET，Ria-RET，TGF-NTRK1，TPM3-NTRK1，TPM3-TPR，TPR-MET，TPRNTRK1，TRIM24-RET，TRIM27-RET或TRIM33-RET，甲状腺乳头状癌的特征；或PAX8-PPARy，是滤泡性甲状腺癌的特征。
D.细胞死亡或细胞凋亡
在癌症中，凋亡过程自发地发生并且通过抗肿瘤疗法诱导。细胞死亡和细胞增殖之间的平衡也在恶性肿瘤的进展中起作用。当确定细胞经历凋亡时，几种促凋亡蛋白被激活，包括Bcl-2/BAX家族基因，其中包括BAX，BAK，BOKk，Bcl-XS等。截短形式的BAX，例如仅BH3成员也已知是促凋亡的，这些包括BID，BAD，BIK，BIM，NOXA，PUMA(p53增量调节细胞凋亡调节剂)等。这些mRNA都与一种或多种肿瘤类型中的细胞凋亡反应有关。已显示GADD153(生长停滞和DNA损伤诱导基因)介导细胞凋亡。Apaf-1蛋白与线粒体和dATP释放的细胞色素C相互作用形成凋亡体复合物，可激活半胱天冬酶9并导致细胞凋亡。Apaf-1沉默或减量调节与黑素瘤和胶质母细胞瘤有关。SUMO-1(小泛素相关修饰物)在结构上与遍在蛋白相关，但当蛋白质被SUMO修饰(苏素化)时，它们被保护免于泛素介导的降解。Bfl-1是抑制p53介导的细胞凋亡的Bcl-2家族的成员。在癌症中发现Bfl-1水平升高。BCLW是Bcl-2家族的另一成员，具有抗细胞凋亡作用。Bcl-2基因具有抗细胞凋亡作用。它与半胱天冬酶-9和Apaf-1形成复合物，阻止这些蛋白质形成凋亡小体并启动蛋白酶级联反应导致细胞凋亡。它涉及多种癌症。PUMA(p53-增量调节的细胞凋亡调节剂，也称为BBC3)通过线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。已经发现NOXA(也称为PMAIP1或ARP)在成人T细胞白血病中高度表达，并且响应细胞损伤具有促凋亡功能，参与胱天蛋白酶-9的激活和随后的细胞凋亡。Hrk是与Bcl-2相互作用的细胞凋亡的激活剂。它与星形细胞肿瘤和中枢神经系统淋巴瘤有关。Bim与大多数Bcl-2同源物共享短BH3基元；它引发细胞凋亡。它与套细胞淋巴瘤的发展有关。BINP3是一种促凋亡的Bcl-2家族蛋白，与恶性胶质瘤有关。Bik(Bcl-2相互作用杀伤者)蛋白是另一种促凋亡Bcl-2家族成员；它与B细胞淋巴瘤和乳腺癌有关，并且在上皮细胞和肺细胞中也观察到了表达。Bid(BH3相互作用结构域死亡激动剂)是一种与骨肉瘤和胃癌有关的促凋亡蛋白。坏是另一个与B细胞淋巴瘤和结肠癌有关的Bcl-2促凋亡家族成员。Bcl-XS是该家族的另一种促凋亡成员，其与肝细胞癌，乳腺癌和卵巢癌有关。Bok(Bcl-2相关卵巢杀伤者)是另一种与卵巢癌有关的Bcl-2促凋亡家族成员。Bak是另一种Bcl-2同源物，是细胞凋亡的强有力的促进剂，并且已经涉及胃癌和结肠直肠癌。Bax(Bcl-2相关X蛋白)是促凋亡蛋白，其涉及许多癌症，包括急性和慢性淋巴细胞白血病，胃癌和结肠直肠癌，乳腺癌和胰腺癌。已经在人纤维肉瘤，肝细胞癌和急性髓性白血病中发现了LRP(肺阻力蛋白)的表达。已显示MRP基因在肝细胞癌和结肠直肠癌中表达。
在某些实施方案中，本发明包括检查组织样品(例如，肿瘤组织样品)中细胞凋亡或细胞死亡或其标记物的方法，包括通过以下方式处理从受试者获得的组织样品：(i)固定组织在水凝胶亚基存在下的样品；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；(iv)对处理过的样品成像，以产生处理过的样品的至少一个图像。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(v)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品。在特定的实施方案中，组织样品是肿瘤组织样品。在特定的实施方案中，可检测标记物结合凋亡标记物或细胞死亡，其特征可指示疾病的存在或不存在，例如癌症或肿瘤。在某些实施方案中，本说明书中所述的任何可检测的细胞凋亡或细胞死亡标记物用于检测相关疾病或肿瘤。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(vi)将图像与一个或多个对照图像或从正常组织，疾病组织，肿瘤组织，与良好预后相关的肿瘤组织或与不良预后相关的肿瘤组织获得的预定图像进行比较，从而确定肿瘤的存在或肿瘤的预后，或凋亡或细胞死亡的存在或量。
可以根据本发明确定这些和其它凋亡标记物的表达水平、活性和模式。在特定的实施方案中，p21，GADD，Apaf-1，SUMO，Bfl-1，BCL-W，BCL-2，PUMA，NOXA，Hrk，Bim，BINP3，Bik，Bid，Bad，Bcl-XS，Bok，Bak，Bax，LRP和MRP是根据本发明的方法检测的标记物。在特定的实施方案中，可用于表征增加或减少的细胞凋亡水平的标记物包括但不限于bad，bax，bcl-2，bcl-w，BID，BIM，半胱天冬酶3，半胱天冬酶8，CD40，CD40配体，cIAP-2，细胞色素-C，DR6，Fas，Fas配体，HSP27，HSP60，HSP70，HTRA，IGF-1，IGF-2，IGFBP-1，IGFBP-2，IGFBP-3，IGFBP-4，IGFBP-5，IGFBP-6，IGF-1sR，livin，p21，p27，p53，SMAC，存活蛋白，sTNFRI，sTNFRII，TNFα，TNFβ，TRAIL R1，TRAIL R2，TRAIL R3，TRAIL R4和XIAP。
可以确定参与凋亡途径的各种多肽(或多核苷酸)的表达水平。通常，增加量的促凋亡标记物与肿瘤死亡或有效治疗相关，而增加量的抗凋亡标记物与肿瘤生长相关。可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的蛋白质或核苷酸表达水平或蛋白质活性水平与正常对照或已知与正常或患病细胞相关的预定水平进行比较。或者/另外，可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的凋亡标记物的量与相同类型肿瘤中凋亡标记物的预定量，位置和比例进行比较。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过比较肿瘤组织样品中的凋亡标记物的量与具有已知临床结果的相同类型的肿瘤中观察到的量来确定，例如，其通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)进行测量，并且将所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果与具有已知临床结果的那些肿瘤的预测临床结果相关联，所述临床结果具有与所测试的肿瘤组织样品最相似的凋亡标记物的量或位置。
E.肿瘤中信号传导途径的激活
异常的信号转导途径激活是癌症的标志。调节正常细胞过程的这些信号传导途径也可能导致恶性细胞增殖。涉及生长和增殖的关键途径包括但不限于PI3K/Akt/mTor，Ras/Raf/MEK和Wnt/β-连环蛋白，或Hedgehog/patched信号传导途径。除了共同调节癌症增殖和生长之外，这些途径还调节多种生理过程，包括细胞凋亡，细胞周期调节，DNA维持，基因转录，存活，代谢，血管生成，愈合，细胞迁移和分化。这些途径的刺激可以通过细胞因子，存活因子，趋化因子，死亡因子，激素递质，生长因子，胞外基质，WNT或Hedgehog。这些途径的激活可以通过细胞因子受体，受体酪氨酸激酶，G蛋白偶联受体和整联蛋白。这些途径的激活可以通过间接测量各种上游和下游蛋白质的表达和/或磷酸化来确定，包括IL-6，IL2，IGF1，TGFα，EGF，调蛋白，EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4，cMET，IGF1R，FGFR。，ER，PR，整联蛋白β，Frizzled，Patched，WNT，Hedgehog，FASR，PI3K，AKT，PKC，PLC，NFkB，JAK，STAT3&5，BCL-XL，半胱天冬酶9，半胱天冬酶8，FADD，RAS，RAF，MEK，MEKK，MAPK，MKK，FAK，APC，β-连环蛋白，ARF，ERK，JNK，JUN，FOS，CDK2，p53，p21，p27，p15，p16，SMAD，CDC42。此外，HER家族受体的潜在同二聚体/异二聚体(例如，HER2同二聚体，HER2/HER3异二聚体，HER1/HER2异二聚体)的测定和活化可以是对患有各种癌症的患者的诊断、预后或治疗预测。
在某些实施方案中，本发明包括确定组织样品(例如，肿瘤组织样品)中异常信号转导途径的预先存在的方法，包括通过以下方式处理从受试者获得的组织样品：(i)固定组织样品在水凝胶亚基存在下；(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；(iii)清洁水凝胶包埋的样品；(iv)对处理过的样品成像，以产生处理过的样品的至少一个图像。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(v)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品。在特定的实施方案中，组织样品是肿瘤组织样品。在特定的实施方案中，可检测标记物结合PI3K/Akt/mTor，Ras/Raf/MEK和Wnt/β-连环蛋白或Hedgehog/patched信号传导途径的成分。在特定的实施方案中，可检测标记物结合IL-6，IL2，IGF1，TGFα，EGF，神经生长因子，EGFR，ERBB2，ERBB3，ERBB4，cMET，IGF1R，FGFR，ER，PR，整联蛋白β，Frizzled，Patched，WNT，Hedgehog，FASR，PI3K，AKT，PKC，PLC，NFkB，JAK，STAT3&5，BCL-XL，半胱天冬酶9，半胱天冬酶8，FADD，RAS，RAF，MEK，MEKK，MAPK，MKK，FAK，APC，β连环蛋白，ARF，ERK，JNK，JUN，FOS，CDK2，p53，p21，p27，p15，p16，SMAD或CDC42。在某些实施方案中，可检测标记物结合HER家族受体的同二聚体/异二聚体，例如HER2同源二聚体，HER2/HER3异二聚体，HER1/HER2异二聚体，其可以是对患有各种癌症的患者的治疗的诊断，预后或预测，可以指示存在或不存在疾病，例如癌症或肿瘤。在某些实施方案中，本说明书中描述的任何信号转导转导途径或标记物用于检测相关疾病或肿瘤。在特定的实施方案中，所述的方法还包括：(vi)将图像与一个或多个对照图像或从正常组织，疾病组织，肿瘤组织，与良好预后相关的肿瘤组织或与不良预后相关的肿瘤组织获得的预定图像进行比较，从而确定肿瘤的存在或肿瘤的预后或凋亡或细胞死亡的存在或量。可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的蛋白质或核苷酸表达水平或蛋白质活性水平与正常对照或已知与正常或患病细胞相关的预定水平进行比较。或者，或另外，可以将生物样品(例如，肿瘤组织样品)内的信号转导标记物的量与相同类型肿瘤中的信号转导诱导标记物的预定量，位置和比例进行比较。在某些实施方案中，预测的临床结果可以通过下列步骤来确定：比较肿瘤组织样品中的信号转导诱导标记物的量与具有已知临床结果的相同类型的肿瘤中观察到的量，例如，其通过总存活(OS)，无进展存活(PFS)，进展时间(TTP)，治疗失败时间(TTF)，无事件存活(EPS)，至下一次治疗的时间(TTNT)，总响应率(ORR)或响应持续时间(DofR)进行测量，并且将所测试的肿瘤组织样品的预测临床结果与具有已知临床结果的那些肿瘤的预测临床结果相关联，所述临床结果具有与所测试的肿瘤组织样品最相似的信号转到标记物的量或位置。
F.乳腺癌中响应靶向疗法的生物标记物的评估
在一个实施方案中，本发明提供评估乳腺癌对疗法(例如，目前FDA批准的靶向疗法)的响应的方法。在使用福尔马林固定石蜡包埋组织上的单蛋白/DNA测量的当前方法中，测量药物反应和抗性的关键生物标记物的共表达以及固有的主观性存在显著限制。曲妥珠单抗在乳腺癌治疗中的临床成功表明，肿瘤评估对于正确鉴定可作为靶向治疗候选者的患者至关重要。常规用于选择曲妥珠单抗治疗患者的两种测定是通过免疫组织化学(IHC)的HER2蛋白表达和通过荧光原位杂交(FISH)的基因扩增。不幸的是，两种测定仅部分地预测了对药物的反应。在表皮生长因子受体(EGFR)的情况下，尽管该蛋白质的高水平表达，但不能建立响应和EGFR酪氨酸激酶抑制剂之间的联系。虽然这些测试已经成为将肿瘤定义为HER-2阳性的基准，但是关于这些方法的准确性和可重复性存在相当大的争议。据估计，由于这些研究的主观性质，在针对中心实验室检测进行验证时，社区中高达20％的HER-2检测可能是不准确的。此外，研究表明，其它途径的表达和激活，例如涉及HER3表达和截短形式的HER2(p95HER2)的途径，可以促成对标准曲妥珠单抗疗法的抗性。这些问题可以通过分解或均质化组织的方法或在福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)上使用常规单染色IHC的方法以有限的方式回答。本发明提供了制备和成像组织样品的替代方法，以便能够重建真实的生物学和抗性途径的潜在激活。
本发明提供了一种预测患有乳腺癌的受试者是否对曲妥珠单抗治疗有响应的方法。在特定的实施方案中，如本说明书中所述处理从受试者获得的乳腺癌组织样品以形成固定的交联样品，清洁脂质，然后用HER2蛋白表达的一种或多种可检测标记物HER2基因扩增染色，和/或p95HER2表达。在其它实施方案中，样品用一种或多种可检测标记物染色，所述标记物结合HER2，雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)，HER1，HER3，调蛋白或ki67蛋白或mRNA。使用本说明书中所述的显微镜技术测定标记物(蛋白质或核酸)的存在和/或量，并将结果与对照标准物比较，例如先前表征为HER2和ER/PR的乳腺肿瘤样品。表达状态并且已知对曲妥珠单抗治疗有利或不响应。如果被测试的样品与先前表征的样品具有共同特征，这些样品的反应良好，则表明用曲妥珠单抗治疗受试者，但当被测试的样品与先前表征的反应差的样品具有更多共同特征时，表明不用曲妥珠单抗治疗受试者。
G.免疫细胞和限制点蛋白的评估
本发明的方法还可以用于与免疫限制点抑制剂治疗相关的肿瘤类型，因为它允许理解癌症模型中潜在免疫调节剂的生物学景观，例如晚期黑素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)。使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织测量PD-L1蛋白表达的现有方法不稳健且可重复。通过免疫组织化学缺乏PD-L1表达的患者对PD-1抑制剂有反应，表明肿瘤，微环境以及宿主之间的潜在相互作用是至关重要的，并且表明PD-L1的单个分析物测量不是确定临床疗效的最佳方法。
据报道，阻断程序性细胞死亡(PD)-1蛋白与其配体之一PD-L1之间的相互作用在许多肿瘤类型中具有令人印象深刻的抗肿瘤反应，包括晚期黑素瘤和NSCLC。PD-L1的肿瘤表达目前是预示性的，但是不足以预测对免疫限制点抑制剂的反应的生物标记物。肿瘤异质性是许多肿瘤中的重要问题，使得较小的活组织检查样品对于基于组织的生物标记物(例如，PD-L1肿瘤表达)不太可靠。宿主细胞，入侵的肿瘤细胞和免疫系统之间的相互作用非常复杂，单个蛋白质在组织切片上的测量或通过流式细胞术测量具有显著的局限性。免疫限制点疗法，其靶向T细胞中的调节途径以增强抗肿瘤免疫应答，已导致癌症治疗领域的重要临床进展。这些疗法已经证明了持久的临床反应，并且在一小部分患者中，长期结果是患者多年未表现出癌症的临床症状。完全理解这类新药的机制和预测生物标记物在于能够在肿瘤微环境中理解人体免疫应答。这将提供有关免疫反应和其它途径调节的有价值的从头和动态信息，这些信息需要通过联合疗法进行定位，以便为更多患者提供存活益处。与对免疫限制点疗法的响应相关的生物标记物包括但不限于表6中所示的那些。
表6.
4-1BB CD80
B7H4 VISTA
CD70 CD40
CTLA-4 GITR
HVEM LAG-3
OX40配体 PD-L1
SIRPα TIM-3
B7-H2 CD160
4-1BB配体 CD86
BTLA CD27
CD28 CD40配体
DNAM-1 GITR配体
ICOS OX40
PD-1 PD-L2
TIGIT 2B4
CD155 CD47
在具体的实施方案中，本发明提供了预测患有癌症如晚期黑素瘤或NSCLC的受试者是否对用抑制PD-1蛋白或其配体，PD-L1或阻断其相互作用的药剂治疗有响应的方法。彼此。在特定的实施方案中，如本说明书中所述处理从受试者获得的癌组织样品以形成固定的交联样品，清洁脂质，然后用一种或多种PD-L1蛋白表达的可检测标记物染色。在其它实施方案中，样品用一种或多种可检测的免疫标记物染色，例如CD4，CD8，CD20，细胞角蛋白或PD-L1，或表6中所示的任何一种。标记物的存在和/或量。使用本说明书中所述的显微术技术测定检测到的(蛋白质或核酸)，并将结果与对照标准进行比较，例如先前表征任何这些标记物的表达状态的肿瘤样品，并且已知对治疗有利或不响应。用PD-1抑制剂。如果被测试的样品与先前表征的样品具有共同特征，这些样品有利地反应，则表明用PD-1抑制剂治疗受试者，但是当测试的样品与先前表征的样品相比具有更多共同的特征，这些样品的反应很差，表明不用PD-1抑制剂治疗受试者。
H.癌症干细胞
确定并准确量化完整生物系统中癌症干细胞的存在和临床意义对于预测癌症治疗耐药性非常重要。例如，乳腺癌是一种异质性疾病，并且存在几种记录良好的乳腺癌亚型，其预后和预测特征不同。近年来，基础科学和转化研究已经证明癌症干细胞有助于乳腺癌的异质组织学和功能特征。甚至最近，乳腺上皮细胞经历上皮至间充质(EMT)转变的能力与获得干细胞特性，增强肿瘤侵袭，转移和对可用治疗的抗性有关。因此，干细胞和经历EMT的细胞是潜在治疗的有吸引力的靶标。它们在乳腺组织样品中的鉴定将为确定乳腺癌预后和治疗提供重要信息，并且还使病理学家能够发现和验证预后和预测标记物，以及鉴定乳腺癌风险增加的标记物。从临床角度来看，鉴定和靶向干细胞的重要性是基于他们报告的化学和放射抗性，这可能是目前治疗乳腺癌治疗模式失败的原因。此外，许多研究表明，组织样品中乳腺癌干细胞的存在和丰度具有预后意义。近年来，基础科学研究提供了强有力的证据表明EMT和干细胞计划密切相关，并且是乳腺癌异质性的原因。
本发明提供了鉴定肿瘤组织样品(例如，三阴性乳腺癌模型)中的癌症干细胞(CSC)和上皮至间质转化(EMT)的方法。在特定的实施方案中，如本说明书中所述处理从受试者获得的癌组织样品以形成固定的交联样品，清洁脂质，然后用一种或多种可检测的免疫标记物染色，例如ALDH1，CD24，CD44，CD133，钙黏着糖蛋白和波形蛋白。另外，可以确定HER2和/或ER/PR状态。使用本说明书中所述的显微术技术测定检测到的标记物(或蛋白质或核酸)的存在和/或量，并将结果与对照标准品进行比较，例如先前表征任何这些的表达状态的肿瘤样品。已知的标记物是否产生抗性。如果被测试的样品与以前表征的对治疗产生抗性的样品具有共同的特征，则预测受试者也会对疗法产生抗性，但是当被测试的样品与先前表征的样品具有更多共同特征时未发生抗性，表明受试者不会产生抗性。
I.具有异质性肿瘤灶的实体瘤的完整可视化
尽管存在均一的临床风险参数(基于类似TNM分期的相同NCCN(国家综合癌症网络)风险类别，Gleason评分和预处理PSA(前列腺特异性抗原)，但局部治疗在高达30-40％的前列腺癌患者中失败抗原)值)。基于原发性肿瘤或血液样品中mRNA丰度的生物标记物尚未达到完全的临床效用，导致进一步缺乏对固有的腺体内和多焦点异质性的理解。尽管大多数前列腺癌被诊断为器官局限性疾病，但具有相似Gleason评分的癌症(例如，Gleason评分为7-10)显示出大量的患者间异质性和不同的前列腺癌特异性死亡率。进一步的复杂性在于个体癌症病灶之间的腺体内生物异质性，因为80％的前列腺癌包含>1个疾病焦点。单个前列腺癌病灶被认为是克隆性的，但在Boutras等2015年最近出版之前，其在特定患者中的分子性质在全基因成分辨率上基本上没有表征。总体而言，Boutros等报道的研究结果突出了依赖的局限性。在一个肿瘤切片或活组织检查中确定用于临床决策的前列腺癌的分子状态。该研究为未来的试验提供了生物学基础，致力于了解这些问题在多大程度上影响患者的存活结果。这可能需要对患有致死性疾病的患者进行广泛表征匹配的原发性和转移性肿瘤。
本发明提供了捕获分子异质性的新技术，包括涉及液体活组织检查和/或分子成像的技术，这些技术在将这些研究的发现转化为临床中是重要的，并且与分子相比，使用完整成像提供对前列腺癌异质性的复杂性的理解。如Boutros等人所述，描述肿瘤组织。在特定的实施方案中，如本说明书中所述处理从受试者获得的癌组织样品以形成固定的交联样品，清洁脂质，然后用一种或多种可检测标记物染色，包括本说明书中所述的任何标记物。使用本说明书中所述的显微术技术测定检测到的标记物(或蛋白质或核酸)的存在和/或量，并将结果与对照标准品进行比较，例如先前表征任何这些的表达状态的肿瘤样品。已知的标记物是否产生抗性。如果被测试的样品与以前表征的对疗法产生抗性的样品具有共同的特征，则预测受试者也会对治疗产生抗性，但是当被测试的样品与先前表征的样品具有更多共同特征时未发生抗性，表明受试者不会产生抗性。
J.微环境和实体肿瘤中对癌症疗法的响应
认为目前可用于胰腺癌的大多数药物的失败是由于缺乏对肿瘤微环境的生物学的理解以及许多癌症药物不能穿透胰腺癌的复杂基质成分。胰腺癌是美国癌症死亡的第四大主要原因，并且通常在治愈率非常低时在疾病的后期诊断。胰腺癌的微环境(肿瘤体积的80-90％)似乎是完全适合支持癌症生长的环境的最佳实例之一。它是非常不均匀的并且含有许多细胞和无细胞成分，例如成纤维细胞，肌成纤维细胞，胰腺星状细胞，免疫细胞，血管，胞外基质(ECM)和可溶性蛋白质如细胞因子和生长因子。由此产生的微环境支持肿瘤的发生，进展，侵袭和转移。此外，基质细胞表达与治疗抗性相关的多种蛋白质和生长因子。最近的努力旨在修饰或靶向微环境中的结构蛋白，包括透明质酸(HA)(在原发性和转移性中)，胶原蛋白和SPARC(分泌蛋白，酸性和富含半胱氨酸)。成功靶向癌症的这一方面已经产生了改善晚期胰腺癌(nab-紫杉醇+吉西他滨)患者存活率的方案，然而，需要更好的治疗和对该癌症的生物学的理解。为此，在临床前试验(细胞系和异种移植模型)中报道的一些疗法的有效性与人类临床试验中随后的失败之间存在很大差异。
本发明的方法可用于检查和理解各种癌症(例如，胰腺癌)中肿瘤微环境的复杂性，例如用于确定癌症预后，预测或监测对治疗的响应，以及预测或确定对治疗的抗性。在特定的实施方案中，如本说明书中所述处理从受试者获得的癌组织样品(例如，胰腺肿瘤组织样品)以形成固定的交联样品，清洁脂质，然后用一种或多种可检测的免疫标记物染色。肿瘤微环境，例如，特异性结合微环境成分的标记物，例如肿瘤微环境的细胞或胞外基质成分，包括本说明书中所述的任何成分，例如SPARC，透明质酸和/或胶原。使用本说明书中所述的显微术技术测定检测到的标记物(或蛋白质或核酸)的存在和/或量，并将结果与对照标准品进行比较，例如先前表征任何这些的表达状态的肿瘤样品。已知的标记物是否产生抗性。如果被测试的样品与以前表征的对治疗产生抗性的样品具有共同的特征，则预测受试者也会对治疗产生抗性，但是当被测试的样品与先前表征的样品具有更多共同特征时发展抵抗力，表明受试者不会产生抗性。如果被测试的样品与对疗法反应良好的先前表征的样品具有共同的特征，则预测该受试者也对疗法反应良好，而当测试样品与在先对疗法反应差的表征样品共有更多特征时，表示该受试者对所述疗法反应差。
V.筛选药物的方法
本发明的方法可以容易地适用于筛选候选治疗剂以确定它们在治疗包括癌症在内的疾病和病况中的有效性。在特定的实施方案中，使用疾病的动物模型进行这些方法。各种癌症和肿瘤发生的动物模型是本领域中已知的并且是可获得的。例如，小鼠癌症模型是众所周知的，并且异种移植物和化学或遗传诱导的小鼠癌症是常用的啮齿动物癌症模型。在某些实施方案中，这些方法使用例如从用候选药物治疗的患者获得的人组织样品，例如肿瘤组织样品来实施。
在一些实施方案中，第一疾病组织样品(例如，肿瘤组织样品)在第一时间点(例如，在用候选药物治疗之前)从受试者(例如，疾病的动物模型(例如，癌症))获得，并根据本发明的方法检查。然后用候选药物治疗受试者，并在治疗期间或之后的第二时间点从受试者获得第二种疾病组织样品。如本说明书中所述处理和分析第一和第二疾病组织样品，任选地在用允许可视化组织结构和/或成分(例如，细胞，蛋白质，核酸)(例如，肿瘤标记物)的试剂染色之后，它们与疾病或病况相关，所述疾病例如肿瘤。如果第二疾病组织样品具有比第一疾病组织样品减少量的结构或疾病标记物，则表明候选药物有效治疗疾病或病况。如果第二疾病组织样品具有比第一疾病组织样品更多的结构或疾病标记物，则表明候选药物在治疗疾病或病况方面无效。
在特定的实施方案中，可以使用本说明书中描述的任何方法和生物标记物或结构来实施这些方法。
VI.治疗方法
本发明还提供了治疗疾病和障碍的方法。本说明书中描述的方法可用于确定用于治疗疾病或障碍的治疗剂，或者它们可用于监测受试者对治疗的响应。在特定的实施方案中，这些方法包括从诊断患有或怀疑患有疾病或障碍的受试者获得疾病组织样品，如本说明书中所述处理和成像疾病组织样品，确定与之相关的存在，数量或特征。疾病或障碍，然后用已知有效治疗疾病或障碍的治疗剂治疗受试者，所述疾病或障碍具有在疾病组织样品中测定的相似量或特征。在特定的实施方案中，这些方法还包括在如本说明书中所述的治疗，处理和成像第二疾病组织样品之后从受试者获得第二疾病组织样品，并确定与疾病或障碍相关的存在、量或特征，以确定治疗是否有效治疗疾病或障碍。在特定的实施方案中，疾病或障碍是肿瘤。
在特定的实施方案中，指示使用特定药物治疗癌症，其中肿瘤显示预测对药物反应的生物标记物特征。在某些实施方案中，本发明的方法可用于确定肿瘤中一种或多种生物标记物的状态，以确定用于治疗获得肿瘤组织样品的受试者的药物。在具体的实施方案中，根据本发明的方法确定表1中所示的生物标记物和参比亚组的状态，并且当确定相应的表型时用所示药物治疗受试者。
表1.
实施例
实施例1
肿瘤细胞、小鼠异种移植肿瘤和人肿瘤的CLARITY分析
根据本说明书中所述的方法处理和分析肿瘤细胞系、异种移植物和肿瘤组织。这些研究证实，所要求保护的方法可用于使用各种探针成功地交联、清洁和标记肿瘤样品，以检查样品内的肿瘤标记物的结构特征和表达。
方法
用于小鼠异种移植物接种的细胞的细胞培养、冷冻粒状沉淀生成、制备
表2中显示了本组实验中所利用的试剂和化学品。
表2.所使用的试剂和化学品
将SKBR3维持在McCoys 5A培养基中，MCF-7细胞维持在最小必需培养基α(MEMa)培养基中，MDA-MB-231细胞维持在Dulbecco改进Eagle培养基(DMEM)，HUVEC维持在EGM-2Bulletkit中，SKOV3-HER2-GFP、EGFR-RFP维持在McCoy’s 5A中。SUPT1、SU-DHL-1、NCI-H1703、NCI-H2087、NCI-H647均维持在RPMI-1640中。全部培养基均补充有10％胎牛血清(BSA)、10mM青霉素-链霉素和10mM Glutamax。将全部细胞系在37℃在包含95％空气和5％CO2的加湿气氛中培养，并根据制造商的建议进行分离和补充培养基。在培养物达到适当的汇合后，将细胞用PBS洗涤1次，然后在1X胰蛋白酶/EDTA中移出，将所得溶液离心并用PBS洗涤2次。将最终的离心沉淀物在液氮中快速冷冻～1-5分钟，并储存在-80℃直至水凝胶单体(HM)包埋。
对于异种移植物接种，培养MCF-7细胞，然后收获，同时仍处于生长的线性阶段。在接种之前，通过从150cm2组织培养皿中刮取细胞，在不含钙或镁的1x PBS中收获细胞。细胞计数后，用0.5mL1x胰蛋白酶(在HEPES平衡盐溶液中)处理细胞粒状沉淀5分钟以破坏细胞并产生单细胞悬浮液。然后计数收获的群体并将其调节至MEMa中每100微升107个细胞的浓度。
冷冻细胞粒状沉淀/人肿瘤/小鼠新鲜组织HM包埋和脂质清洁
HM包埋。HM包埋是根据先前公布的方法(Chung 2013)进行的，并进行了一些修改。简而言之，将冷冻细胞系沉淀或冷冻人肿瘤组织或新鲜收获的小鼠组织在5-50mL HM溶液(4％丙烯酰胺，0.05％BIS-丙烯酰胺，0.25％VA-044引发剂，4％多聚甲醛，1x)中温育。PBS，pH 7.4)在4℃下保持约24-72小时，然后在真空下脱气10-30分钟，并在37℃下聚合3小时直至HM溶液固化。小心地从过量聚合的凝胶中取出，将沉淀在PBST(1X PBS，pH7.4，0.1％triton x-100)中洗涤2次，然后置于25mL清洁溶液(200mm硼酸盐缓冲液，pH8.5和8％SDS)中。组织或细胞系在37℃-55℃的温度范围内以100rpm的速度振荡并且每3-7天更换一次缓冲液，直到沉淀在视觉上清晰，从几天到2天-2个月的任何地方都被清洁。
苏木精和曙红(H&E)染色。HM-包埋的样品经历了缩短的染色方案，其消除了下述的Histochoice清洁和脱水分级乙醇系列。简言之，使用3次Histochoice交换清洁组织切片各5分钟。然后将样品在梯度乙醇系列(2×100％，2×95％，1×80％，1×70％，每种3分钟)中脱水。然后将切片在蒸馏水中漂洗3分钟。将苏木精加入每个切片1分钟，在自来水中快速冲洗，然后分液溶液--3分钟，斯科特自来水--30-45秒，蒸馏水-1分钟，并用曙红染色1分钟。除去过量的曙红并通过分级乙醇系列(2×70％，2×80％，2×95％，2×100％，每次2分钟)再水化，每次2分钟用3次Histochoice交换清洁，并且安装有HistoChoice封固剂，使用Leica Galen III显微镜，配有4x 0.1物镜计划和Aptina CMOS传感器数码相机(5.1MP1/2.5”色彩USB 2.0)和Toupview 3.7数码相机软件。
免疫组织化学。双石蜡和HM包埋的样品经历经典的免疫荧光染色。使用3次交替的Histochoice将组织切片清洁5分钟。然后将样品在梯度乙醇系列中脱水(2×100％，2×95％，1×80％，1×70％，每次3分钟)。将连续切片在ddH 2O中冲洗两次，每次5分钟，然后暴露于Histo/zyme，在室温下取出抗原15分钟。在PBS洗涤5分钟后，用Protein Block Serum-Free(Dako)覆盖切片，并使其在室温下温育1小时。然后将样品在加湿室中用一抗(1μg/ml或1：50)在室温下从1小时染色至4℃过夜，用TBST洗涤3次，然后用二次山羊染色-抗-兔(或小鼠)抗体在室温下一小时。除去二抗，用TBST洗涤切片3次，每次5分钟。最后，在室温下用核染色剂DAPI(1μg/ml，5分钟)或Sytox Blue(1μM，15分钟)对样品进行复染，然后在使用Leica Galen成像之前用Fluoroshield和盖玻片安装组织载玻片。III显微镜配有4x0.1物镜和Aptina CMOS传感器数码相机(5.1MP1/2. 5“色彩USB 2.0)和Toupview 3.7数码相机软件。
免疫组织化学：HM包埋的细胞系和组织。使用PBS中的10％正常山羊血清，3％BSA和0.1％Triton X-100(封闭缓冲液)封闭HM包埋的样品。根据样品厚度，将样品置于封闭缓冲液中1-3小时。将样品转移到在封闭缓冲液中稀释的适当的一抗溶液(10μg/ml或1：50)中，并根据样品厚度在4℃下温育12-144小时。将样品在PBST(1X PBS加0.1％Triton X-100)中在室温下洗涤至少4-72小时。在封闭缓冲液中制备适当的物种特异性二抗(10μg/ml或1：200)，并在室温下在样品上温育3-144小时，然后在室温下最终1-2PBST洗涤至至少4-48小时。然后将样品用在试剂级水(1μg/ml，5分钟)中稀释的DAPI或在试剂级水中稀释的Sytox Blue(1μM，15'-24小时)在室温下复染，然后将组织切片置于RapiClear中CS(SunJinLab Co.)封固剂中平衡组织样品的折光率以进行成像。
HM染色的细胞系和组织的成像和3D图像处理。使用3种不同成像模态中的一种来获取染色的HM包埋组织的荧光图像。第一种方法主要用于薄切片组织(>100μM)，并涉及使用具有LED滤光片立方体的IRIS数字图像分析系统。iRiSTM数字细胞成像系统是一种多色荧光成像系统，集成了图像分析软件和车载计算机(Logos Biosystems)。使用以下物镜和LED滤光片立方体(TC planFluor 10x，20x，Plan Apochromat氟油40x，TC plan acro 4x Ph，DAPI DAPI(Ex375/28，Em460/50)，mCherry(Ex580/25，Em645/75)，Cy5(Ex620/60，Em700/75)用于成像)。第二种方法主要用于100-250μM范围内的切片，这是一个倒置的LSM780多光子激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss)，使用以下目标(EC Plan Neo 40x oil，Plan Apo 20x，Zeiss)，第三种方法Ultramicroscope II光学显微镜(LaVision Biotec)用于尺寸范围为500μM-10mm的组织，使用0.63-6.3x的标准放大率和2x物镜(Mv PLAPO2VC，Olympus)。使用IMARIS科学3D/4D处理和分析软件8.2版对所有图像进行分析和处理。
肿瘤异种移植物的生成。在第0天，将6只动物中的每一只原位用细胞悬液(1x 107个细胞/100毫升)皮下注射到右侧第二乳头下的乳房脂肪垫中，进入雌性Rag-2ga mma小鼠(6-8周龄，20-25g)。动物皮下植入囊内60天缓释17B-雌二醇粒状沉淀，无麻醉。肿瘤生长至至少250cm3且不超过500cm3(用卡尺测量)。一般动物情况每日控制每周2次评估肿瘤体积和体重，所有实验均经分子医学研究所(MMRI)IACUC委员会批准，方案16-002。
从PDX小鼠、ND4小鼠和MCF-7异种移植小鼠中收获器官。将4只PDX肿瘤模型或ND4，Swiss Webster模型小鼠(表x)安乐死并用20mL冰冷的1X PBS以10mL/分钟的速率进行心脏灌流。然后以10mL/分钟的速率用20mL冰冷的4％水凝胶单体(HM)溶液灌流动物。灌流后，切下PDX肿瘤组织并置于含有HM溶液的50mL锥形管中。
结果
总体实验概括：正常小鼠组织、小鼠细胞系和患者衍生的异种移植物、人癌细胞系和人切除活检样品
表3中提供了被鉴定为适用于HM包埋样品的抗体。通过使用表4中列出的细胞系对照初步测试抗原结合来确定在HM包埋组织中起作用的抗体。表4还包括小鼠(正常的)和癌症异种移植组织)和这些研究中使用的人类癌症组织。使用细胞系单层作为目标抗原的阳性对照测试2-3种不同的抗体。典型地，根据文献，目标抗原以相当高的浓度表达，并且是使用特定模型细胞系的基本原理。如果单层培养物中的染色对于同种型对照是特异性的并且显示出良好的信噪比，则抗体在HM包埋细胞系对照中进行测试。
表3.用于HM包埋样品的抗体
表4.细胞系和组织
使用标准测定技术产生单层细胞培养免疫荧光数据(数据未显示)。表5总结了HM包埋细胞系和小鼠异种移植物或人癌组织中抗体测试的结果，这些抗体的相对染色由以下名称表示：0＝未检测到染色，1+＝低染色，2+＝中度染色；3+＝强染色。这些发现不一定与文献中已公开的已知靶标相关，可能是由于多种原因，包括一抗或多重反应中使用的一抗或二次抗的浓度。如果没有供应商提供的浓度信息，则使用的一级抗体浓度为0.38-20mg/mL，或者为1：100。对于荧光可视化，使用两种方法并且表示为间接或直接，并且第7列中指示的二抗(间接)或荧光团缀合物(直接)的类型。二抗均以1：100稀释使用。此外，说明书列出的是包埋方法，它是专门的标准HM包埋，持续48小时，以及清洁时间/温度和组织的大小。组织大小范围为7μM-10mm3。为了说明书件的目的，任何高于5mm3的都被标记为“厚”。组织的清洁时间为5-32天，取决于组织类型(癌症与正常组织或细胞系)，清洁温度为37°-55℃。
表5.染色结果概括
这些数据表明，可以从小鼠细胞系和PDX异种移植肿瘤组织中清洁多种癌组织，以及人乳腺癌和肺癌组织和正常淋巴结组织的各种组织学亚型和阶段。它还说明HMembedded清洁已用各种市售抗体染色的组织，可以用各种成像方式成像，这取决于样品的厚度。值得注意的是，冷冻的人类肿瘤组织以及冷冻的沉淀都可以成功地进行HM包埋，脂质清洁，并成功染色而不破坏组织的形态。据我们所知，CLARITY方法尚未报道正常或患病组织，包括癌组织。此外，还没有结合CLARITY方法报道冷冻细胞系沉淀的使用。该方法为控制该过程的多个方面提供了极好的方法，并且具有用于该技术的研究和开发的可再生和可再现的试剂。此外，可以利用含有不同浓度的目的抗原的细胞系混合物来理解优先染色的敏感性和特异性。该发展策略可以应用于肿瘤学领域或具有感兴趣的核酸或蛋白质靶标的细胞系模型的任何其它疾病状态。
冷冻细胞系对照。速冷冻的细胞系对照(MCF-7)进行HM包埋(图13A)，然后在55℃下清洁5天(图13B)，然后与碘化丙锭一起温育以染色细胞核，然后成像。通过创建具有10μM步长的1mm Z-堆叠的光片显微术(图13C)。利用IMARIS科学3D/4D处理和分析软件8.2版完成图像处理。图像之前和之后(图13A与图13B)示出了冷冻HM包埋样品相对于透明粒状沉淀清洁后的不透明性质。碘化丙锭深深地渗透到组织中并允许通过1mm的样品均匀成像。
小鼠患者衍生的异种移植物(PDX)。图2中示出了小鼠PDX人样品的实例。14.该样品来自患有浸润性导管癌的患者，其先前被分类为雌激素受体(ER)阴性和孕酮受体(PR)阴性和HER2阳性。如方法部分和HM包埋的样品(图14A)中所述制备样品，在55℃下清洁7天(图2B)，并用抗盘细胞角蛋白(图14C)或抗体染色。-HER2(克隆CB11)一抗(图14D)和488二抗，用光片显微镜成像，用IMARIS 8.2版软件分析。有关抗体的详细信息，请参阅表3。图像之前和之后(图14A与图14B)示出了在55℃下清洁7天后小鼠灌流的HM包埋样品与透明粒状沉淀的不透明性质。各类细胞角蛋白成像(1.2mm Z-堆叠具有10μM步长)说明在整个组织中具有相当均匀的3+染色，具有很好的形态保持。使用CB11抗体克隆可以在该样品中检测到强烈的3+HER2染色。
人乳腺癌切除活检样本。人乳腺癌切除活组织检查样本样品的一个实例如图1所示。15.该样品来自患有先前表征的乳腺非浸润性粉腺癌的患者，在肿瘤的单独部分中为ER阴性，PR阴性和HER2阳性。该市售冷冻人乳腺癌切除标本(图15A)是HM包埋(图15B)并清洁(图15C)，如表5所示，清洁～35天。用针对HER2的抗体(ErbB 2/HER2Affibody-FITC缀合的)(图15D)，各类细胞角蛋白(图15E)或Ki-67(图15F)染色样品，并用共聚焦或光片成像显微镜并用IMARIS 8.2版软件进行分析。从用HER2染色的样品中，分析来自光片的具有10μM步长的600μMZ-堆叠，并且揭示了用5μMH&E染色的载玻片无法看到的非常有序的树状3D结构。(数据未显示，Asterand)。这证明了能够采取冷冻的人类切除标本和HM包埋，清洁和染色组织而不丧失肿瘤的关键结构。该工作表明，与新鲜切除样品相反，可以根据本说明书中所述的方法使用冷冻样本样品。用抗各类细胞角蛋白抗体观察到肿瘤上皮细胞的强烈3+染色(图15E)以及用抗Ki-67抗体对肿瘤细胞核进行3+染色(图15F)。有趣的是，Ki-67染色存在异质性，表明肿瘤可能存在差异增殖，这取决于肿瘤内的位置。这表明本说明书中所述的方法可能对治疗反应有影响，与依赖于如果使用2D薄甲醛固定的石蜡包埋切片用常规方法进行分析肿瘤的部分相比。
人转移乳腺癌淋巴结。来自患有原发性肿瘤的患者的人转移性乳腺癌淋巴结样品，其先前被诊断为浸润性导管癌，IIIA期；分化差；分析了基于薄切片2D FFPE分析的ER，PR和HER2阳性。来自患有转移性乳腺癌的患者的这种商业上可获得的冷冻人淋巴结(图16A)是HM包埋的(图16B)并被动清洁(图16C)，如表5所示。样品在多重反应中染色，使用sytox blue(nuclei)，抗647(肿瘤细胞)的细胞角蛋白8/18抗体和抗CD-31抗体，以及与568(血管)结合的二抗(图16D)。箭头表示肿瘤特征的差异染色，并说明了在多重复合中包埋冷冻的人癌组织，清洁和用3种不同标记物成像的能力。用共聚焦显微镜对100μM切片成像，并用IMARIS版本8.2软件分析(见方法部分)。有趣的是，在100μM淋巴结(5μM步长)中存在相当多的可变性，因为存在一些Z-堆叠图像仅包含细胞核且没有可见的肿瘤细胞(数据未显示)。这表明本说明书中所述的方法在患者可能在淋巴结中具有微转移并且由于进行常规2D薄切片FFPE测试而可能不适当地分期的情况下可能是有利的。
1B期人肺腺癌。通过2D薄切片FFPE分析，分析来自具有阶段1B的患者的人肺腺癌，其先前被表征为EGFR致敏突变和KRAS致敏突变。将该市售冷冻人切除肿瘤样品(图17A)包埋在HM(表5)中(图17B)，然后被动清洁(图17C)。样品在多重反应中染色，具有sytox blue(细胞核)，针对细胞角蛋白8/18的抗体，其直接与Alexa Fluor 647(肿瘤细胞)缀合，和抗CD-31抗体，具有缀合的第二抗体到568(血管)(图17D)。箭头表示肿瘤特征的差异染色，并说明了在多重复合中包埋冷冻的人癌组织，清洁和用3种不同标记物成像的能力。用共聚焦显微镜对100μM切片成像，并用IMARIS版本8.2软件分析(见方法部分)。由于缺乏与647缀合的最佳抗各类细胞角蛋白抗体，实验用针对角蛋白8/18的抗体进行。肺腺癌高表达CK 7。这代表了对该肿瘤染色的良好阴性对照。还使用与647缀合的标准各类细胞角蛋白抗体进行了实验。
HM-包埋的正常小鼠肾的H&E染色。将正常小鼠肾脏样品进行HM包埋，脂质清洁并使用振动切片机切片。对50μM切片进行H&E染色，并在方法部分中指出修改。使用LeicaGallen III显微镜拍摄明场图像，其中Aptina CMOS传感器数码相机(5.1MP1/2. 5“彩色USB2.0)连接到一个目镜并使用Toupview 3.7数码相机软件可视化。图18示出了10x和a染色后组织的40倍图像，其中HM包埋和清洁后小鼠肾脏结构的形态保持非常好。这种类型的方法与HM包埋的病变组织的成功允许检测正常组织与癌组织以及了解样品的形态。
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通过引用将本说明书中提及的所有美国专利，美国专利申请公开文本，美国专利申请，外国专利，外国专利申请和非专利出版物在与本说明书没有不一致的程度上整体并入本说明书。
从前述内容可以理解，尽管为了举例说明的目的在说明书中描述了本发明的特定实施方案，但是在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种变型。因此，除外待批权利要求，本发明不受限制。

Claims (30)

1.一种分析生物样品的方法，它包括：
(a)通过下列步骤处理生物样品：
(i)在水凝胶亚单位存在下固定样品；
(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；
(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及
(iv)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；
(b)通过显微镜检查术，任选地通过光学显微镜检查术使经处理的样品成像，以产生生物样品的至少一个第一图像和/或测定生物样品中第一可检测标记物的量，
其中所述的生物样品是肿瘤组织样品、预先冷冻的生物样品或细胞系。
2.权利要求1的方法，其中所述的生物样品具有大于20微米的长度和大于20微米的厚度。
3.一种在受试者中诊断肿瘤或确定肿瘤的预后的方法，它包括：
(a)通过下列步骤处理从受试者获得的肿瘤组织样品：
(i)在水凝胶亚单位存在下固定该肿瘤组织样品；
(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；
(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及
(iv)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；
(b)使经处理的样品成像，以产生第一可检测标记物的至少一个肿瘤图像和/或测定第一可检测标记物的量；以及
(c)将所述的肿瘤图像或量与一个或多个对照图像或量或从正常组织、肿瘤组织、与良好预后相关的肿瘤组织或与不良预后相关的肿瘤组织获得的预定图像或量比较，
由此确定肿瘤的存在或肿瘤的预后。
4.一种确定受试者的肿瘤对治疗性处理的响应的方法，它包括：
(a)通过下列步骤处理在第一时间点从受试者获得的第一肿瘤组织样品：
(i)在水凝胶亚单位存在下固定该肿瘤组织样品；
(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；
(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及
(iv)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；
(b)通过下列步骤处理在治疗性处理后在第二时间点从受试者获得的第二肿瘤组织样品：
(i)在水凝胶亚单位存在下固定该肿瘤组织样品；
(ii)聚合水凝胶亚单位以形成水凝胶包埋的样品；
(iii)清洁水凝胶包埋的样品；以及
(iv)用一种或多种第一可检测标记物标记经清洁的水凝胶包埋的样品；
(c)使(a)和(b)的处理过的样品成像，以产生(a)的经处理的样品的第一肿瘤图像和(b)的经处理的样品的第二肿瘤图像和/或测定(a)的经处理的样品中所述一种或多种第一可检测标记物的第一量和(b)的经处理的样品中所述一种或多种第一可检测标记物的第二量；以及
(d)将第一肿瘤图像与第二肿瘤图像比较，或所述一种或多种可检测标记物的第一量与第二量比较，其中如果第二肿瘤图像或第二量显示比第一肿瘤图像或第一量更少的肿瘤特征，则该肿瘤对该治疗性处理响应良好，其中如果第二肿瘤图像或第二量显示比第一肿瘤图像或第一量更多的肿瘤特征，则该肿瘤对该治疗性处理响应差。
5.权利要求3或权利要求4的方法，其中所述的受试者是哺乳动物。
6.权利要求5的方法，其中所述的受试者是人。
7.权利要求5的方法，其中所述的受试者是人类疾病的动物模型。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中所述的成像包括：
将(a)的经处理的样品置于光均匀的样品操作部件中；
在(a)的经处理的样品内多个位置上比对显微镜装置的一个或多个光片和一个或多个检测聚焦平面；
用(a)的经处理的样品进行成像操作以从所述多个位置的每个位置采集图像；以及
基于从所述多个位置的每个位置采集的图像产生第一肿瘤图像。
9.权利要求8的方法，其中所述的成像还包括：
将比对参数应用于每个位置；
同时用光片照明所述位置并且捕获该位置的图像；以及
使用来自每个位置的图像构建样品的三维图像。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中固定样品包括使样品接触多聚甲醛。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中所述的水凝胶亚单位包含丙烯酰胺。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中聚合样品包含热交联。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中清洁样品包括使样品电泳。
14.权利要求13的方法，其中使用包含离子表面活性剂，任选十二烷基硫酸钠的缓冲溶液进行电泳。
15.权利要求13或权利要求14的方法，其中：
(a)使用约10至约60伏特的电压将样品电泳；以及/或
(b)将样品电泳约15分钟至约10天的时间期限。
16.权利要求1-15任一项的方法，它还包括在封固剂中温育所述经清洁的样品，所述的封固剂具有与该经清洁的样品的折光率基本上匹配的折光率，其中该封固剂增加样品的光透明度，并且其中该封固剂任选地包含甘油。
17.权利要求1-14任一项的方法，它还包括：
(a)洗涤成像后得到的经处理的样品，以除去所述的一种或多种第一可检测标记物；
(b)用一种或多种第二可检测标记物重新标记经洗涤的样品；
(c)通过显微镜检查术，任选通过光学显微镜检查术使重新标记的样品成像，得到第二图像；以及
(d)任选地，检查权利要求3的步骤(c)或权利要求4的步骤(d)中所述的第二图像。
18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述的标记和/或重新标记包括使经清洁的水凝胶包埋的样品接触一种或多种可检测标记物，该标记物结合样品内的细胞成分或胞外成分。
19.权利要求18的方法，其中所述的细胞成分或胞外成分选自由如下各项组成的组：
(a)免疫细胞标记物；
(b)癌干细胞标记物；
(c)胞外基质蛋白质；
(d)血管标记物；
(e)凋亡标记物；以及
(f)肿瘤标记物。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中所述的可检测标记物包含多肽、核酸或小分子。
21.权利要求20的方法，其中所述的可检测标记物在使用或不用与所述可检测标记物结合的可检测第二试剂的情况下是可检测的。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中所述的肿瘤选自由如下各项组成的组：肾上腺皮质癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨转移、脑肿瘤、脑癌、乳腺癌、儿童癌、原发性起源未知的癌症、Castleman病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因家族肿瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠类癌瘤、胃肠间质瘤、妊娠滋养层细胞疾病、头或颈癌、卡波西肉瘤、肾细胞癌、喉癌和下咽癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺类癌瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、成人软组织肉瘤、基底和鳞状细胞皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、胃癌、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、Waldenstrom巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
23.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是乳腺癌肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定如下所述的一种或多种：HER2、雌激素受体、孕酮受体、各类细胞角蛋白、Ki67、CD3、CD4、CD8、CD20、CD68或Foxp3、PD-L1、PD-1、PD-L2、CTLA-4和雄激素受体。
24.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是肺肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定如下所述的一种或多种：表皮生长因子受体，包括其致敏性和抗性突变，ALK/ROS/RET重排，BRAF突变，以及PD-L1，PD-1，PD-L2，CTLA4，CD4，CD8，CD20，各类细胞角蛋白。
25.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是黑素瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定如下所述的一种或多种：BRAF、NRAS、KIT、GNA11/GNAQ、CDK4以及MEK突变或PD-L1、PD-1、CTLA-4CD4、CD8、CD20和各类细胞角蛋白的一种或多种的表达。
26.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是结肠癌，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定KRAS突变和表皮生长因子受体的一种或多种。
27.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是前列腺肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定雄激素受体。
28.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是乳腺癌肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合或鉴定HER2/neu。
29.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是乳腺癌肿瘤，并且所述的一种或多种可检测标记物结合Ki-67。
30.权利要求22的方法，其中所述的肿瘤是肺癌，并且所述的一种或多种可检测标记物结合CD-31。
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