CN112941185B - miR-29a作为标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用 - Google Patents

miR-29a作为标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR‑29a作为生物标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用，属于生物医学技术领域。所述miR‑29a核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，本发明首次公开miR‑29a与恶性间皮瘤的发病相关，以miR‑29a作为鉴别诊断恶性间皮瘤的生物标志物，将其应用到恶性间皮瘤的诊断试剂盒中具有重要的临床应用价值。

Description

miR-29a作为标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及miR-29a作为生物标志物在制备恶性间皮瘤诊断试剂盒中的应用。
背景技术
恶性间皮瘤(MM)是一种发生于胸膜壁层或腹膜的职业性侵袭性恶性肿瘤，在石棉暴露后有长达20-40年的潜伏期。恶性间皮瘤是高度致死的，恶性间皮瘤受试者的总生存期非常低，中位生存期只有12个月，早期诊断比较困难并且对常规化疗和放疗反应不敏感。由于没有强制要求做组织学和影像学检查，许多病例可能简单地被误诊为其他癌症。因此，该病症的低发病率可能是报告率降低或诊断准确性限制的反映。
众所周知，由microRNA(miRNA，小RNA)介导的转录后修饰调控的多个基因参与了癌症的进展。因此，单个基因的表达可能并不能可靠地用于预测肿瘤的生物学过程。microRNA表达试验扩大了与关键的靶分子相关的多个靶向干扰的肿瘤生物学的研究范围，这可能是一个更好的恶性间皮瘤的研究策略，因为基因突变的多样性和通路失调是它侵袭性和耐药性的基础。因此，了解参与基因调控的miRNAs和下游信号转导的效应将为这些miRNAs开发成疾病的生物标志物提供机会，也将为调控靶向基因的生物学效应提供方法。建立基于每个病人特有的一系列miRNAs上调(致癌)和下调(抑癌)的特征将根据风险对新诊断的受试者进行分层，并为个性化治疗提供宝贵的工具。
研究证据支持miRNAs在恶性间皮瘤的分子生物学中发挥着越来越多的作用。例如，已有研究表明，miR-31具有抑制恶性间皮瘤细胞增殖、迁移、侵袭和生长的能力。另一研究发现在MeT-5A(恶性间皮瘤间皮细胞系)，H2452(恶性间皮瘤上皮细胞系)和MSTO-211H(恶性间皮瘤双向细胞系)中miR-205的异位表达导致ZEB1和ZEB2(间充质标记物)的表达显著减少和E-cadherin(上皮标志物)基因表达结果增加，同时也抑制了迁移和侵袭。miR-205的下调调控上皮细胞向间充质转化(EMT)与间充质表型和更强的侵袭行为显著相关。
因此，通过研究发现更多与恶性间皮瘤发病相关的miRNAs，作为恶性间皮瘤疾病诊断、治疗和预后评估的生物标志物，为疾病治疗提供有价值的信息，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供能够高灵敏度、特异性鉴别石棉相关疾病特别是恶性间皮瘤的生物标志物，将其应用于恶性间皮瘤疾病的诊断、治疗和预后评估。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明利用恶性间皮瘤组织样本构建小RNA文库进行测序，根据测序结果分析出癌组织与相邻正常组织之间的表达水平有显著差异的miRNA，发现miR-29a显著上调，进而在大样本量的组织和血浆样本中验证了miR-29a作为恶性间皮瘤诊断生物标志物的可行性。
本发明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的miR-29a作为生物标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用。
所述检测试剂盒通过测定样本中miR-29a的表达水平来诊断恶性间皮瘤。miR-29a在恶性间皮瘤患者中高表达。
进一步的，所述检测试剂盒包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测miR-29a表达的变化。
当测定样本为病理组织时，所述检测试剂盒中包含测定病理组织中miR-29a表达水平的试剂。
优选的，采用荧光原位杂交技术对病理组织中的miR-29a表达水平进行检测。所述试剂为miRNA探针，miRNA探针的核苷酸序列为：5'-TAACCGATTTCAGATGGTGCTA-3'。更为优选，miRNA探针带有地高辛标记。
当测定样本为血浆时，所述检测试剂盒中包含测定血浆中miR-29a表达水平的试剂。
优选的，采用实时荧光定量PCR法检测血浆中miR-29a表达水平。从血浆样本中分离出miRNA，逆转录生成cDNA，再进行定量PCR。所述试剂包括miR-29a反转录引物和定量PCR引物对。具体的，miR-29a反转录引物为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’；定量PCR引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为5’-CGCGTAGCACCATCTGAAAT-3’，下游引物的核苷酸序列为：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。
本发明的有益效果是：
本发明首次公开miR-29a与恶性间皮瘤的发病相关，以miR-29a作为鉴别诊断恶性间皮瘤的生物标志物，具有重要的临床应用价值。
附图说明
图1为MM和相应的正常间皮组织的荧光原位杂交(FISH)分析。在肿瘤细胞中，基于蓝色细胞质染色的评分强度从0到3级。A：0分；B：1分；C：2分；D：3分。E：miR-29a在MM组织及相邻组织中的表达N：正常组织，T：MM组织；*P<0.05，**P<0.01。
图2为miR-29a及与之相关的癌症信号通路基因靶点网络图。红色矩形表示miR-29a，蓝色圆形表示与其相关的基因靶点。
图3为LC、PP、AE试验组、健康对照组和MM试验组血浆中miR-29a的qRT-PCR分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图4为LC、PP、AE试验组、健康对照组与MM试验组的miR-29a曲线图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本专利的技术方案作进一步详细地说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供测定恶性间皮瘤病理组织中miR-29a含量的试剂方法，并且本实施例中对筛选得到的差异小RNA进行了进一步的鉴定和验证分析，以判定所筛选得到的差异小RNA作为恶性间皮瘤诊断生物标志物的可行性。本实施例的具体方案内容如下：
一、材料与方法
1.研究对象和样本收集
1998年到2017年之间的85例FFPE恶性间皮瘤组织样本是从中国浙江的医院回顾性收集的。临床信息是从各医院的入院记录中获得的。组织切片具有三种组织病理学类型的代表性：诊断时收集的57种上皮型样本、4种双相型样本、6种肉瘤型样本和18种未知的组织病理类型(受试者既往未接受过治疗)。间皮瘤的组织学被两个病理学家独立审查。
利用49-52岁不吸烟但暴露于石棉环境女性的两份双相和一份上皮样FFPE样本构建小RNA文库进行测序。其余82份FFPE标本用于组织微阵列(TMAs)和FISH。
本研究是根据赫尔辛基宣言开展和浙江省医学科学院伦理委员会批准的。研究方案已向所有研究人员解释，并得到了所有研究人员的知情同意。
2.组织芯片(TMA)的构建
从恶性间皮瘤组织中分离出82个FFPE恶性间皮瘤组织样本，并从同一受试者获得相应的正常间皮瘤组织。TMAs(Superchip Biotech，Shanghai)使用组织扫描仪器(BeecherInstruments，Silver Springs，Md)组装。所有的组织样本制作成四个组织芯片板。使用微米切片机(HM355S)切割成多个4μm的部分染色后进行FISH分析。
3.荧光原位杂交(FISH)
利用特异性digoxin标记的miRNA探针5'-TAACCGATTTCAGATGGTGCTA-3'，通过FISH在TMAs上评估miR-29a-3p在组织中的表达水平。miRNAs在细胞质和细胞核中被染色。评价miRNA染色和表达的定量方法是Leica公司的Aperio ImageScope V11，阳性值乘以100表示miRNA的表达。用光学显微镜对有代表性的有效组织切片进行半定量评分。TMA芯片由一位经验丰富的病理科医师和一位肿瘤学家匿名独立评分。计算每个样本重复芯片的平均分数。然后我们将染色分为高表达和低表达。miRNA表达评分标准如下：1，无染色评分为0分；2，<20％评1分；3，20-40％评2分；4，40-60％评3分；5，60-80％评4分；6，肿瘤组织染色>80％的评5分。肿瘤细胞蓝浆染色评分强度从0–3分(0、无；1、弱、2、中级；3、强)。总评分按如下公式计算：染色指数＝强度×阳性率。在本研究中，染色指数≤8为低表达，染色指数>8为高表达。
4.miRNAs靶基因预测
为了预测miRNA差异表达靶向的基因，我们使用TargetScan 5.0(http://www.targetscan.org)和miRanda 3.3a(http://www.microrna.org/microrna/home.do)两种计算靶标预测算法来识别miRNA的结合位点。选择两种算法预测的一致靶标进行富集分析。Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes(KEGG)富集分析在David6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp)进行。超几何检验分析的GO种类和KEGG信号通路种类保留148个小于0.01的p值。
二、结果
1、利用3例恶性间皮瘤受试者的3份FFPE样本构建小RNA文库进行测序。根据miRNA测序结果，配对t检验显示，miR-29a在癌组织与相邻组织之间的表达水平有显著差异(P<0.05)。miR-29a序列为：5’-UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA-3’。
2、在TMA中有49对有效的MM肿瘤标本和相邻组织切片。在肿瘤细胞中，基于蓝色细胞质染色的miRNA染色评分强度从0到3分级(图1A-1D)。在MM样本中观察到阳性表达的miRNA比在相邻组织中多。其中，细胞质miR-29a在MM组织中与相邻组织相比显著上调(图1E)。
3、使用CytoScape绘制筛选出的miR-29a及由KEGG癌症通路导出的预测的基因靶点网络图(图2)。上调表达的miR-29a对通路中28个基因产生调控作用。
实施例2
本实施例提供测定恶性间皮瘤血浆中miR-29a含量的试剂方法，并且本实施例中对筛选得到的差异小RNA进行了进一步的鉴定和验证分析，以判定所筛选得到的差异小RNA作为恶性间皮瘤诊断生物标志物的可行性。本实施例的具体方案内容如下：
一、材料与方法
1.研究对象和样本收集
总共的196份血浆样品收集于中国东南部。受试者被分为5组：(1)健康对照组50人没有接触任何类型的石棉和胸部X光片结果正常，(2)一组21例受试者诊断为间皮瘤(MM)，(3)一组50例患肺癌(LC)受试者，(4)一组25例受试者诊断为胸膜斑(PP)，(5)一组职业暴露于石棉(AE)的50个受试者还没有任何成像变化。
5组受试者的年龄、性别、吸烟比例分布差异无统计学意义(表1)。数据收集按照上述程序进行。所有受试者都进行了胸部X光检查。在浙江医学科学院，非恶性石棉相关疾病(ARDs)的诊断遵循美国胸科学会(ATS)标准。确诊为恶性胸膜间皮瘤(MPM)受试者的血浆样本收集于2014-2016年。入选标准如下：(1)恶性间皮瘤均由两位以上独立的病理科医师根据国际间皮瘤兴趣小组提出的《国际恶性胸膜间皮瘤病理诊断指南》建议进行确诊，(2)没有化疗前血浆样本，(3)恶性胸膜间皮瘤病人或其直系亲属签署知情同意。被诊断为其他恶性肿瘤的受试者被排除在我们的研究之外。
在接受任何治疗之前，所有受试者在诊断时采集静脉血样本。从每个受试者收集5ml外周血到含有乙二胺四乙酸(EDTA)的试管中。室温下3000rpm/min离心10min，将上层清液转移至1.5ml离心管(Axygen，USA)，-80℃保存。
表1研究受试者的一般特征
Figure BDA0002995134810000061
Figure BDA0002995134810000071
MM：恶性间皮瘤；LC：肺癌；PP：胸膜斑；AE：石棉暴露
本研究是根据赫尔辛基宣言开展和浙江省医学科学院伦理委员会批准的。研究方案已向所有研究人员解释，并得到了所有研究人员的知情同意。
2.miRNA实时荧光定量PCR
来自MM、LC、PP、AE和对照组的196份血浆样本被用于miRNA定量表达。
使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen，CA)按照制造商的方案从200μl混合的血浆样本中分离出用于实时定量PCR(qRT-PCR)miRNA，并在14μL不含Rnase的水中洗脱。结合miR-29a RT引物(5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3’)和miRNA逆转录试剂盒(TaKaRa Technologies)，使用每个反应2.5μl的RNA生成cDNA。
使用SYBR Green qPCR master mix(TaKaRa)进行定量PCR(qPCR)。qPCR上游引物：5’-CGCGTAGCACCATCTGAAAT-3’，下游引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。
候选miRNA的表达水平被标准化为U6(ΔCt)。之后，计算对照组miRNAsΔCt值的平均值和减去每个样本的ΔCt值(ΔΔCt)，表达水平计算使用2-ΔΔCt方法。
3.受试者工作特性(ROC)曲线
根据每个miRNA的能力预测表现的评估来区分MM组，LC组，PP组，AE组和对照组。ROC曲线是用来评估y轴阳性率(灵敏度)和x轴上的假阳性率(特异度)。ROC曲线下的面积为1.0，表示具有良好的区分能力，置信区间为0.5，表示该测试的区分能力并不优于随机测试。双侧P<0.05被认为有统计学意义。使用GraphPad Prism 8.0和SPSS Statistics 17.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)进行分析。
二、结果
为了研究上述miR-29a在MM受试者血浆中的表达是否升高，我们比较了5组受试者血浆中上述miR-29a的表达水平。如图3所示，MM组和LC组与对照组、PP组和AE组相比，miR-29a表达显著上调。MM组与LC组相比，miR-29a表达上调。
为了进一步评价miR-29a在区分MM受试者与LC受试者、PP受试者、AE受试者和健康对照中的诊断意义，我们计算了miR-29a的灵敏度和特异度。区分健康对照组和MM受试者的miR-29a曲线下的面积(AUC)为0.92(95％置信区间：0.86-0.98)(图4)。区分MM和LC受试者的miR-29a AUC为0.68(95％置信区间：0.54-0.82)。区分MM和PP受试者的miR-29a AUC为0.96(95％置信区间：0.91-1.00)。
序列表
<110> 杭州医学院
<120> miR-29a作为标志物在制备恶性间皮瘤检测试剂盒中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 22
<212> RNA
<213> 人(Homo sapiens)
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uagcaccauc ugaaaucggu ua 22
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gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgactaaccg 50
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<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagtgcaggg tccgaggtat t 21

Claims (1)

1.血浆中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的miR-29a作为生物标志物在制备用于区分恶性间皮瘤与胸膜斑、职业暴露于石棉还没有成像变化的鉴别诊断试剂盒中的应用,其特征在于，所述检测试剂盒中包含测定血浆中miR-29a 表达水平的试剂；
所述测定血浆中miR-29a表达水平的试剂包括miR-29a反转录引物和定量 PCR引物对,miR-29a反转录引物为：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTAACCG-3',定量PCR引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列为：5’-CGCGTAGCACCATCTGAAAT-3',下游引物的核苷酸序列为：5' -CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3'。
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