KR102237960B1 - 위암 진단용 microrna 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

위암을 지니거나 위암으로 진행될 대상체의 가능성을 측정하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 대상체로부터 수득된 비-세포성 생체액 샘플 중에서 본원에 기술된 바와 같은 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성을 지닌 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정함을 포함하며, 여기서 대상체로부터 수득한 샘플 중의 miRNA의 차등적인 발현은, 대조군과 비교하여, 위암을 지닌 대상체의 지표일 수 있고, 여기서 miRNA는 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 또는 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA일 수 있다. 또한 위암을 지니거나 위암의 단계로 진행될 대상체의 가능성을 측정하는 방법이 개시되어 있다.

Description

위암 진단용 MICRORNA 바이오마커{MICRORNA BIOMARKER FOR THE DIAGNOSIS OF GASTRIC CANCER}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2014년 8월 7일자로 출원된, 싱가포르 특허원 제10201404742W호의 우선권의 이익을 청구하며, 이의 내용은 모든 목적을 위해 이의 전문이 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 생화학, 특히 바이오마커(biomarker)에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암과 관련된 바이오마커 및 바이오마커를 사용하여 환자가 위암과 같은 암으로 고생할 가능성(likelihood)을 측정하는 방법에 관한 것이다.
위암은 4번째로 가장 흔한 암(매년 일백만명 초과의 경우들)이며 세계적으로 암 사망의 2번째로 가장 흔한 원인이다. 5년 생존률이 10% 미만인, 위암의 진단은 매우 불량한데, 그 이유는 상기 상태가 질병의 진전된 상태에서 일반적으로 나타나기 때문이다. 따라서, 임상 결과를 증진시키기 위해, 상기 질병의 조기 검출 및 정확한 모니터링이 필수적이다. 현재, 내시경이 조기 진단을 위한 유일한 신뢰할 수 있는 방법이지만 고 비용 및 고 위험으로 인하여 스크리닝 시험(screening test)으로서 제한된다. 위암에 대해 침습성이 적은 스크리닝 시험이 매우 바람직하며 불필요한 내시경은 감소되어야 한다.
따라서, 본 발명은 위암을 검출하기 위한 대체 방법을 제공한다.
일 국면에서, 대상체에서 위암을 검출 또는 진단하거나 대상체가 위암으로 진행될 가능성을 측정하는 방법이 제공되며, 당해 방법은 대상체로부터 수득된 비-세포 생체액(biofluid) 샘플 중에서 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 대조군과 비교하여, miRNA 발현의 차등적 발현은 위암을 지닌 대상체의 지표이고, 여기서 miRNA는 hsa-miR-142-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-128, hsa-miR-1280, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-15b-3p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-197-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-21-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-25-3p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29b-2-5p, hsa-miR-29c-5p, hsa-miR-338-5p, hsa-miR-425-3p, hsa-miR-4306, hsa-miR-450a-5p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-500a-3p, hsa-miR-501-5p, hsa-miR-532-3p, hsa-miR-550a-5p, hsa-miR-579, hsa-miR-589-5p, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-598, hsa-miR-616-5p, hsa-miR-627, hsa-miR-629-3p, hsa-miR-629-5p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-18a-3p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-181a-2-3p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-501-3p, hsa-miR-23a-3p, hsa-miR-339-3p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR-320b, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-650, hsa-miR-1290, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-320c, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-320e, hsa-miR-378a-3p, hsa-miR-9-5p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-191-5p, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-484, hsa-miR-425-5p로 이루어진 그룹으로부터 선택된 "상향-조절된(up-regulated)" miRNA; 또는 hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-99b-5p, hsa-miR-339-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-139-5p, hsa-miR-146a-5p, hsa-miR-154-5p, hsa-miR-193b-3p, hsa-miR-23c, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-337-5p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-409-3p, hsa-miR-411-5p, hsa-miR-485-3p, hsa-miR-487b, hsa-miR-495, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-671-3p, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-328, hsa-miR-320a, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-134, 및 hsa-miR-150-5p로 이루어진 그룹으로부터 선택된 "하향-조절된" miRNA이다
다른 국면에서, 대상체에서 위암 단계를 검출 또는 진단하거나 대상체가 소정의 위암의 단계를 지닐 가능성을 측정하는 방법이 제공되며, 당해 방법은 대상체로부터 수득된 비-세포 생체액 샘플 중에서 표 8, 표 15, 표 16, 및 표 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표 중의 적어도 하나에 나열된 바와 같은 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성을 지닌 적어도 하나의 microRNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 여기서 대조군과 비교한 것으로서, 샘플 중의 miRNA 발현의 차등적인 발현은 상기 대상체가 위암의 1기, 2기, 3기 또는 4기 중의 어느 하나를 가진 것으로 진단한다.
여전히 다른 국면에서, (a) 비-세포성 생체액 샘플 중에서 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계(여기서, miRNA는 hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-107, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-140-5p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-126-3p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-616-5p, hsa-miR-484, hsa-miR-4306, hsa-miR-590-5p, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR-200b-3p, hsa-miR-197-3p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-99a-5p, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-598, hsa-miR-454-3p, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-532-3p, hsa-miR-23a-5p, hsa-miR-21-3p, hsa-miR-136-5p, hsa-miR-1280, 및 hsa-miR-16-5p로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다); (b) 단계 (a)에서 측정된 miRNA의 발현 수준을 기준으로 하여 점수를 생성시키는 단계; 및 (c) 상기 점수를 사용하여 대상체가 위암을 지닐 가능성을 예측하는 단계(여기서, 상기 점수는 대상체의 발현 수준을 양성 대조군(위암 대상체로부터의 샘플) 또는 음성 대조군(위암이 없는 대조군으로부터의 샘플)의 발현 수준과 비교하는 분류 알고리즘에 의해 계산되고; 여기서 상기 점수는, 대상체의 가능성을 i. 상기 점수가 양성 대조군의 점수내에 속하는 경우, 위암을 지니거나, ii. 점수가 음성 대조군의 점수 내에 속하는 경우, 위암을 지니지 않은(위암이 없는) 것으로 확인한다.
본 발명은 비-제한적인 실시예 및 첨부되는 도면과 함께 고려하는 경우 상세한 설명에 대한 참고와 함께 보다 잘 이해될 것이며, 여기서:
도 1은 위암을 지닌 환자에서 검출된 miRNA의 분할의 개략적인 도해를 나타낸다.
도 2는 임상 샘플에서 검출된 miRNA의 고속-처리 miRNA RT-qPCR 측정의 워크플로우 도해(workflow diagram)의 예를 나타낸다. 도 2는 임상 샘플로부터 총 miRNA의 분리로부터 최종적인 데이터 프로세싱 및 통계적 분석까지의 공정에서 발생된 단계들을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 임상 샘플은 우선 "분리"의 단계에 적용되며, 이는 환자의 혈청과 같이, 샘플로부터 miRNA의 분리 및 정제를 말한다. 다음에, 샘플을 비-천연의 합성 miRNA 모사체(mimic)(즉, 길이가 22 내지 24개 염기 범위인 작은 단일-가닥(single-stranded) RNA)인 스파이크-인(spike-in) miRNA와 함께 가한다. 이들 스파이크-인 miRNA를 샘플에 가하여 분리, 역 전사, 증강(argumentation) 및 qPCR을 포함하는 다양한 단계에서 효율을 모니터한다. 다음에, miRNA는 다수의 다중 그룹으로 분리된다. 당해 단계는 "멀티플렉스 설계(multiplex disign)"로 언급되며, 여기서 miRNA 검정은 인 실리코(in silico)로 다수의 멀티플렉스 그룹(그룹 당 45 내지 65개 miRNA)으로 의도적으로 분리되어 RT 및 증강 공정 동안 비-특이적인 증폭 및 프라이머-프라이머 상호작용을 최소화시킨다. 다음에, 샘플을 "멀티플렉스 역 전사" 공정을 통과시키며, 여기서 역 전사 프라이머의 다양한 풀(pool)을 합하여 상이한 멀티플렉스 그룹에 가함으로써 cDNA를 생성시켰다. cDNA의 생성시, PCR 프라이머의 풀은 생성된(특정의 멀티플렉스 그룹) 각각과 합해지고 최적화된 터치 다운 PCR이 수행되어 그룹 속의 총 cDNA의 양을 동시에 향상시킨다. 총(모든) cDNA의 양의 당해 향상 단계는 "증강" 단계로 언급된다. 증강 후 및 데이터 프로세싱 및 통계적 분적 전에, 증강된 cDNA는 단일-플렉스(single-plex) qPCR을 겪으며, 이는, 증강된 cDNA 풀이 384개 플레이트(plate) 속의 다양한 웰(well)에 분배되고 단일-플렉스 qPCR 반응이 이후에 수행된다. 임상 샘플 중의 miRNA의 측정과 동시에, 합성 miRNA 표준 곡선이 함께 측정되어 모든 측정에서 절대적인 카피 수의 내삽(interpolation)을 수득한다. 따라서, 도 2는 하기 실험 단락에서 발생된 miRNA 샘플 프로세싱의 단계별 워크플로우에 의한 세부 단계를 제공한다.
도 3은 대상체로부터 수득된 샘플 중에서 지속적으로 검출된 miRNA의 열-지도(heat-map)를 나타낸다. 도 3은 모든 신뢰가능하게 검출된 miRNA(표 4에 나열된 바와 같음)의 열-지도 표시를 나타내고; miRNA의 발현 수준(카피/ml)은 log2 규모로 나타내며 제로 평균(zero mean)으로 표준화되었다. 점의 색상은 농도를 나타내었다. 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)을 유클리드 거리를 기준으로 치수(miRNA 및 샘플) 둘 다에 대해 수행하였다. 수평 치수의 경우: 검정색은 위암 대상체를 나타내고 흰색은 정상/대조군 대상체를 나타낸다.
도 4는 조절된 miRNA의 열-지도를 나타낸다. 특히, 도 4에 나타낸 열-지도는 조절된 miRNA 모두를 나타내며, 이는 위암에서 표 6에 나열되어 있다. miRNA의 발현 수준(카피/ml)은 log2 규모로 나타내었으며 제로 평균으로 표준화되었다. 회색-규모는 miRNA의 농도를 나타내었다. 계층적 클러스터링은 유클리드 거리를 기준으로 면적(miRNA 및 샘플) 둘 다에 대해 수행되었다. 수평 치수의 경우; 검정색은 위암 대상체를 나타내고 흰색은 정상/대조군 대상체를 나타낸다.
도 5는 정상/대조군 대상체와 비교하여 모든 위암 대상체(아류형 및 단계에 상관없이)에서 상위 등급의 상향-조절된(hsa-miR-142-5p) 및 하향-조절된 miRNA(hsa-miR-99b-5p)의 발현 수준을 나타내는 박스플롯 도해(boxplot diagram)를 나타낸다. 발현 수준(카피/ml)은 log2 규모로 나타낸다. 박스플롯은 발현 수준의 분포에 있어서 25번째, 50번째, 및 75번째 퍼센트(percentile)에 속하는 대상체에서 miRNA 발현 수준을 나타내었다. AUC는 수용자 작동 특성 곡선 하부의 영역을 말한다.
도 6은 모든 신뢰가능하게 검출된 miRNA 사이에서 상관 분석의 결과를 나타내는 도트 플롯을 나타낸다. log2 규모 발현 수준(카피/mL)을 기준으로 하여, 피어슨 선형 상관 계수(Pearson's linear correlation efficiency)를 모든 191개의 신뢰가능한 검출된 miRNA 표적 사이에서 계산하였으며, 이는 표 4에 나열되어 있다. 각각의 도트는 miRNA의 쌍을 나타내며, 여기서 상관 계수는 0.5보다 높거나(좌측 그래프, 양으로 관련됨) -0.5보다 낮고(우측 그래프, 음으로 관련됨), 여기서 0과 다른 상관을 갖는 p-값은 0.01보다 낮다.
도 7은 상관 분석 위암 바이오마커의 결과를 나타내는 도트 플롯을 나타낸다. log2 규모 발현 수준(카피/mL)을 기준으로 하여, 피어슨 선형 상관계수를 위암 대상체에서 변경된 모든 75개의 miRNA 사이에서 계산하였으며, 이는 표 6에 나열되어 있다. 각각의 도트는 miRNA의 쌍을 나타내며, 여기서 상관 계수는 0.5보다 높거나(좌측 그래프, 양으로 관련됨) -0.5보다 낮고(우측 그래프, 음으로 관련됨) 0과 다른 상관을 지닌 p-값은 0.01 미만이다. 따라서, 이와 함께, 도 6 및 도 7은 암과 관련된 및 관련되지 않은 miRNA의 많은 수가 양으로 관련된 것으로 밝혀져 있음을 나타내며, 이는 위암 진단 과제 수행(challenging)을 위한 가장 우수한 miRNA 조합의 선택을 가능하도록 한다.
도 8은 정상/대조군과 비교하여 다양한 단계의 위암에서 다양한 상위 등급의 miRNA의 민감성 및 특이성을 플롯팅한 그래프를 나타낸다. 보다 구체적으로, 도 8은 정상/대조군 대상체에서 miRNA와 비교하여 다양한 단계의 위암 대상체에서 상부(수용자 작동 특성 곡선하 영역인, AUC를 기준으로 한다) 상향-조절된(열 1) 및 하향-조절된(열 2) miRNA를 나타낸다.
도 9는 다양한 단계의 위암에 대한 바이오마커 사이의 오버랩을 나타내는 벤다이어그램을 나타낸다. 이들 벤 다이어그램은 표 8, 9, 10 및 11을 기준으로 생성된다. 따라서, 도 9는, 다양한 단계의 위암을 측정하는데 사용된 miRNA가 이들이 관련된 단계에 대해 특이적인 것으로 여겨짐을 나타내며, 단계 3 및 단계 4 둘 다에서 관찰된 큰 오버랩은 예외이고, 이는 이들 2개 단계가 임상적으로 밀접하게 관련되어 있는 것으로 예측된다.
도 10은 인 실리코에서 4개의 배수 교차 검증(cross fold validation) 동안의 발견 및 검증 상(phase)에서 다변량 바이오마커 패널의 진단력(AUC)(miRNA의 수는 3 내지 10이다)의 박스플롯을 나타낸다. 3 내지 10개의 miRNA를 사용한 바이오마커 패널은 샘플의 발견 세트를 기준으로 모델로서 선형 지지 벡터 머신을 사용한 유동 조사 상부(forward) 서열을 사용하여 확인되었고 샘플의 다른 독립적인 세트에서 입증되었다. 4개의 배수 교차 검증을 다수 회 수행하였다. 박스플롯은 정상/대조군 및 위암 대상체의 분류를 위한 AUC에서 miRNA 세트의 25번째, 50번째, 및 75번째 퍼센트를 나타내었다. 도 10은 다양한 다변량 바이오마커 패널로부터 수득된 데이터의 확고함(robustness)을 나타낸다.
도 11은 교차 검증 공정 동안의 발견 세트(검정색 막대) 및 검증 세트(회색 막대)에서 다양한 다변량 바이오마커 패널의 AUC의 평균을 나타내는 막대 그래프(bar graph)를 나타낸다. 오차 막대는 AUC의 표준 편차를 나타낸다. 보다 많은 miRNA를 패널에 포함시킨 경우 검증 세트에서 AUC 증진의 유의성을 시험하기 위하여, 우측-테일 t-시험(right-tailed t-test)을 수행하여 모든 인접한 회색 막대를 비교하였다. *: p-값 < 0.05; **: p-값 < 0.01; ***: p-값 < 0.001. 따라서, 도 11은 다가의 바이오마커 패널 세트에서 다양한 수의 miRNA 사이의 AUC에 있어서의 차이를 나타낸다.
도 12는 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하는데 사용하는 경우 본원에 기술된 바와 같은 방법의 단계를 요약하는 개략적인 도해를 나타낸다.
도 13은 위암의 단계들 중 하나를 지닌 대상체의 가능성을 측정하는데 사용하는 경우 본원에 기술된 바와 같은 방법의 단계들을 요약하는 개략적인 도해를 나타낸다.
도 14는 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하는데 있어서 본원에 기술된 바와 같은 다변량 방법의 단계를 요약하는 개략적인 도해를 나타낸다.
도 15는 (A) 당해 연구에서 대조군 및 위암 대상체에 대한 암 위험 점수의 박스플롯 묘사; (B) 당해 연구에서 대조군 및 위암 대상체에 대한 로지스틱 분포(logistic distribution)로 핏팅한 암 위험 점수의 가능성 분포, (C) 위암을 지닌 알려지지 않은 대상체(고 위험 집단에 속함)의 가능성은 암 위험 점수의 값(고 위험 집단에서 위암의 유병률은 국립대학 병원으로부터의 데이터를 기준으로 0.0067이었다)에 의존한다; (D) 고 위험 집단에서 위암의 유병률과 비교하여 다양한 암 위험 점수 수준에서 위암을 지닌 알려지지 않은 대상체의 가능성(위험)의 배수 증가를 나타낸다. 파선은 대상체를 높은 암 위험(H), 중간 암 위험(M) 또는 낮은 암 위험(L) 그룹으로 분리하는 한계 점수(threshold score)를 정의한다.
표의 간단할 설명
본 발명은 비-제한적인 실시예 및 첨부된 표와 함께 고려하는 경우 상세한 설명에 대한 참고로 보다 잘 이해될 것이며, 여기서:
표 1은 위암에 대한 혈청/혈장 microRNA 바이오마커 연구의 요약을 나타낸다. 표 1은 세포-유리된 혈청/혈장 샘플에서 miRNA의 수준을 측정하는 다양한 연구를 요약한다. RT-qPCR로 입증된 결과만이 당해 표에 나열되어 있다. "GC"는 위암 대상체를 말하고 "C"는 대조군 대상체를 말한다.
표 2는 본 개시내용의 실험 단락에서 분석된 위암 대상체의 임상 정보를 나타낸다. 모든 혈청을 어떠한 처리 전에 236명의 위암 대상체로부터 수집하여 사용 전에 -80℃에서 저장하였다. 에이치. 파일로리(H. Pylori) 감염의 상태는 또한 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)를 지칭하는 "H. Pylori"로 표지된 컬럼에 나타나 있다.
표 3은 정상 대상체(대조군)의 임상 정보를 나타낸다. 모든 정상/대조군 대상체(237명의 대상체)는 샘플을 수집하는 시점에 내시경에 의해 위암이 없는 것으로 확인되었다. 대상체를 2년마다 내시경 스크리닝으로 3 내지 5년 동안 수행하여 대상체가 당해 기간내에 위암으로 진행되지 않았음을 보증하였다. 모든 혈청을 사용 전에 -80℃에 저장하였다. 에이치. 파일로리 감염의 상태는 또한 헬리코박터 파일로리를 지칭하는 "H Pylori"로 표지된 컬럼에서 나타나 있다.
표 4는 위암 대상체 및 정상 대상체(대조군) 둘 다의 혈청 샘플에서 신뢰가능하게 검출된 191개의 miRNA의 서열을 나타낸다. miRNA는 혈청 샘플의 적어도 90%가 ml당 500개 초과의 카피의 농도를 갖는 경우 "신뢰가능하게 검출된"으로 고려된다. miRNA는 miRBase V18 방출에 따라 명명되었다.
표 5는 위암 대상체 및 건강한 대조군(정상 대상체/대조군) 둘 다의 특성의 요약을 나타낸다.
표 6은 정상 대상체(대조군) 및 위암 대상체에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열한다. 정상/대조군과 모든 위암 대상체 사이의 비교의 경우(아류형 및 단계와 상관없이), 75개의 miRNA는 거짓 발견율 보정(false discovery rate correction)(본페로니 방법(Bonferroni method)) 후 0.01 미만이었다. AUC - 수용자 작동 특성 곡선하 영역; 배수 변화 - 정상/대조군 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml)으로 나눈 암 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준.
표 7은 현재의 연구와 다른 문헌 보고 사이의 비교를 나타낸다. 표 4에 나열되지 않은 MiRNA(즉, 발현 수준이 ≥500개 카피/ml인 miRNA)를 연구의 검출 한계 이하(측정되지 않음)인 것으로 고려하였다. 따라서, 표 7은 본 개시내용의 예시적인 miRNA와 상이한 당해 분야의 주장된 차등적으로 조절된 miRNA 대부분을 나타낸다.
표 8은 정상 대상체(대조군)와 1기 위암 대상체 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열한다. 정상/대조군과 1기 위암 대상체 사이의 비교를 위해, 20개의 miRNA는 거짓 발견율 보정(본페로니 방법) 후 0.01 미만의 p-값을 가졌다. AUC - 수용자 작동 특성 곡선 하 영역; 배수 변화 - 정상/대조군 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml)으로 나눈 암 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml).
표 9는 정상 대상체(대조군)와 2기 위암 대상체 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열한다. 정상/대조군과 2기 위암 대상체 사이의 비교를 위해, 62개의 miRNA는 거짓 발견율 보정(본페로니 방법) 후 0.01 미만의 p-값을 가졌다. AUC - 수용자 작동 특성 곡선 하 영역; 배수 변화 - 정상/대조군 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml)로 나눈 암 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml).
표 10은 정상 대상체(대조군)와 3기 위암 대상체 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열한다. 정상/대조군과 3기 위암 대상체 사이의 비교를 위해, 43개의 miRNA는 거짓 발견율 보정(본페로니 방법) 후 0.01 미만의 p-값을 가졌다. AUC - 수용자 작동 특성 곡선 하 영역; 배수 변화 - 정상/대조군 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml)로 나눈 암 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml).
표 11은 정상 대상체(대조군)와 4기 위암 대상체 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열한다. 정상/대조군과 4기 위암 대상체 사이의 비교를 위해, 74개의 miRNA는 거짓 발견율 보정(본페로니 방법) 후 0.01 미만의 p-값을 가졌다. AUC - 수용자 작동 특성 곡선 하 영역; 배수 변화-정상/대조군 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml)로 나눈 암 집단에서 miRNA의 평균 발현 수준(카피/ml).
표 12는 다변량 바이오마커 패널 확인 공정에서 확인되는 miRNA를 나열한다. 6, 7, 8, 9 및 10번 miRNA를 사용한 바이오마커 패널의 조립을 위해 선택한 miRNA의 실체(identity)를 요약하였다. 유병률은 패널의 총 수로 나눈 모든 패널내 miRNA의 수로 정의하였다. 상위 10% 및 하위 10% AUC를 지닌 패널을 배제하여 교차-검증 분석에서 무작위 공정에 의해 생성된 소집단으로부터의 부정확한 데이터의 핏팅으로 인한 거짓 발견된 바이오마커의 수를 피하였다. 4 이상의 수를 지닌 miRNA만을 나열하였다. 다양한 단계의 위암에서 miRNA의 변화는 표 6 및 8 내지 11을 기준으로 정의하였다.
표 13은 다변량 바이오마커 패널 선택 공정에서 빈번하게 선택된 miRNA의 발생의 통계학을 나타낸다. 2개의 miRNA 그룹으로부터 miRNA의 상이한 수를 사용한 miRNA 패널의 퍼센트: hsa-miR-134, hsa-miR-1280, hsa-miR-27a-5p 그룹 및 hsa-miR-425-5p, hsa-660-5p 그룹. 검증 세트(도 10)에서 AUC로 정의한 6, 7, 8, 9, 10번 miRNA 바이오마커 패널의 상위 10% 및 하위 10%는 계수를 위해 배제하였다.
표 14는 정상/대조군과 위암(단계는 무시한다) 사이에 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열하며, 이는 당해 분야에서 이미 보고되지 않은 것이었다(이는 표 1에 나열되어 있다).
표 15는 정상/대조군과 2기 위암 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열하며, 이는 당해 분야에 이미 보고되지 않은 것이었다.
표 16은 정상/대조군과 3기 위암 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열하며, 이는 당해 분야에 이미 보고되지 않은 것이었다.
표 17은 정상/대조군과 4기 위암 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열하며, 이는 당해 분야에 이미 보고되지 않은 것이었다.
표 18은 정상/대조군과 1기, 2기, 3기 4기 또는 모든 단계의 위암 사이에서 차등적으로 발현되는 miRNA를 나열하며, 이는 당해 분야에 이미 보고되지 않은 것이었다. 표 18은 표 14, 표 8, 표 15, 표 16 및 표 17의 조합이다.
표 19는 다가의 바이오마커 패널에서 사용하기 위해 빈번하게 선택된 miRNA를 나열하며, 여기서 miRNA의 발현 수준은 위암 대상체(표 12로부터 유의적인 그룹)에서 변경되었고, 이는 당해 분야에 이미 보고되지 않은 것이었다.
표 20은 다변량 바이오마커 패널에서 사용하기 위해 빈번하게 선택된 miRNA를 나열하며, 여기서 miRNA의 발현 수준은 위암 대상체에서 변경되지 않았고(즉, 표 12로부터 유의적이지 않다), 이는 당해 분야에 이미 보고되지 않은 것이었다.
표 21은 도 15에서 암 위험 점수를 계산하기 위해(식 1) 결합된 유병률이 >20%인 다변량 바이오마커 패널 확인 공정에서 빈번하게 선택된 12개의 miRNA(이들의
Figure 112017012869895-pct00001
계수 값)를 나열한다.
microRNA(miRNA)는 유전자-발현 조절에서 중요한 역할을 하는 작은 암호화되지 않은 RNA이며 비정상적인 발현은 위암을 포함하는 다양한 암의 발병과 연류되어 있다. microRNA를 사용하여 암으로 진행되는 대상체의 가능성을 측정할 수 있다.
따라서, 일 국면에서, 위암으로 진행되거나 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하는 방법이 제공된다. 일 예에서, 도 12는 대상체의 위암으로 진행되거나 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하는 방법의 단계를 요약한다. 일 예에서, 상기 방법은 또한 대상체에서 위암을 검출하거나 진단하기 위한 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 시험관내(in vitro) 방법이다. 일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 대상체로부터 수득한 비-세포 생체액 샘플 중에서 표 18에 나열된 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 microRNA(miRNA)의 발현 수준을 측정하거나 결정함을 포함할 수 있으며, 여기서 대조군과 비교한 것으로서, miRNA의 차등적인 발현은 위암을 지닌 대상체의 지표이며, 여기서 miRNA는 표 18에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 또는 표 18에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA이다.
[표 18]
Figure 112017012869895-pct00002
Figure 112017012869895-pct00003
본원에 사용된 것으로서, 용어 "miRNA" 또는 "microRNA" 또는 "miR"은 이의 전구체 RNA 전사체가 작은 줄기-루프(stem-loop)를 형성할 수 있고 이로부터 성숙한 "miRNA"가 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의해 절단되는 내인성의, 비-암호화된 유전자의 생성물을 포함하는 RNA(또는 RNA 유사체)를 말한다. MiRNA는, 이들이 이의 발현을 조절하는 mRNA와는 구분되는 유전자내에서 암호화된다. 일 예에서, 용어 "miRNA" 또는 "microRNA"는 함께 공유결합된 적어도 10개의 뉴클레오타이드 및 35개 이하의 뉴클레오타이드의 단일가닥 RNA 분자를 말한다. 일 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 길이가 10 내지 33개 뉴클레오타이드 또는 15 내지 30개 뉴클레오타이드, 또는 길이가 17 내지 27개 뉴클레오타이드 또는 18 내지 26개 뉴클레오타이드, 즉, 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 뉴클레오타이드이며, 임의로 표지 및/또는 연장된 서열(예를 들면, 바이오틴 스트레치)를 포함하지 않는 분자이다. 본원에 기술된 바와 같은 miRNA의 서열은 본원에 제공된 표 4에 제공되며, 표 4는 서열 번호 1 내지 서열 번호 191의 miRNA를 포함한다. 당해 분야의 숙련가에게 인식될 수 있는 바와 같이, miRNA는 "ATGC"와 같은 문자를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 유형이다. 뉴클레오타이드는 좌측으로부터 우측으로 5'→3' 순서이며 달리 나타내지 않는 한 "A"는 데옥시아데노시드, "C"는 데옥시사이티딘, "G"는 독시구아노시드, 및 "T"는 데옥시티미딘을 나타낸다. 문자 A, C, G 및 T는 당해 분야에서 표준인 것으로서, 염기 자체, 뉴클레오사이드, 또는 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 언급하는데 사용될 수 있다. 당해 용어는 천연적으로 존재하는 핵염기, 당, 및 뉴클레오타이드간(골격) 연결로 구성된 올리고뉴클레오타이드 및 또한 유사하게 작용하거나 특이적으로 개선된 작용을 지닌 비-천연적으로 존재하는 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드에서, 뉴클레오사이드간 연결은 전형적으로 포스포디에스테르 결합이며, 소 단위는 "뉴클레오타이드"로 언급된다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 염기 및/또는 당과 같은 완전히 또는 부분적으로 변형되거나 치환된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 분야에서 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 방법 중 어느 것에서도, miRNA는 표 4에 나열된 miRNA의 서열과 100% 서열 동일성을 갖지 않을 수 있다. 따라서, 일 예에서, 측정된 miRNA는 표 8, 표 15, 표 16, 표 17, 표 18, 표 19 또는 표 20(표 4 참고)중 어느 것에 나열된 바와 같은 miRNA에 대해 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 85%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95%, 또는 적어도 97.5%, 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99%, 또는 적어도 99.9%의 서열 동일성을 가질 수 있다. 일 예에서, 측정된 miRNA는 1, 2, 3, 또는 4개의 뉴클레오타이드 치환을 가질 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 사용된 바와 같은 miRNA는 표 8, 표 15, 표 16, 표 17, 표 18, 표 19 또는 표 20(표 4에 제공된 서열 참고)에 나열된 바와 같은 서열에 하이브리드화하거나 특이적으로 결합할 수 있는 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "에 하이브리드화하는" 및 "하이브리드화"는 용어 "에 대해 특이적인" 및 "특이적으로 결합하는"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며 상보성 핵산과 서열 특이적인 비-공유 결합 상호작용, 예를 들면, 표적 핵산 서열과 표적 특이적인 핵산 프라이머 또는 프로브(probe) 사이의 상호작용을 말한다. 일 예에서, 하이브리드화하는 핵산 프로브는 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과 또는 100%(즉, 본원에 기술된 바와 같은 miRNA 중 하나와의 교차 하이브리드화는 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만)의 선택성으로 하이브리드화하는 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 이해될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 miRNA에 "하이브리드화"하는 핵산 프로브는 길이 및 조성을 고려하여 측정할 수 있다. 일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 miRNA 중 어느 것과 하이브리드화하는 핵산 프로브는 1개, 또는 2개, 또는 3개의 미스매치된 염기 쌍을 가질 수 있다. 일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 용어 "miRNA"는 miRNA를 포함할 수 있으며, 생산 동안, miRNA의 3'-말단 및/또는 5' 말단은 변형되고/되거나 분해될 수 있다. 일 예에서, 생산 동안 3'-말단 및/또는 5' 말단에서 변형되고/되거나 분해된 miRNA는 본 발명의 검정에 의해 선택된다. 일 예에서, 본원에 개시된 바와 같은 miRNA는 3, 또는 4, 또는 5개의 뉴클레오타이드에 의해 표 4에 나열된 바와 같은 서열과는 상이할 수 있는 miRNA들은 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "암"은 조절되지 않은 증식, 불멸성, 전이 잠재성, 신속한 성장 및 증식 속도, 및 당해 분야에 공지된 특정의 특징적인 형태학적 특성과 같은 암-유발 세포의 대표적인 특징을 지니는 세포의 존재를 말한다. 일 예에서, "암"은 위암 또는 위장 암일 수 있다. 일 예에서, "암"은 악성 암뿐만 아니라 전-악성 암도 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "위암"은 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 기술된 바와 같은 위암의 모든 단계를 포함한다.
일 예에서, 당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 방법은 의사/주치의에 의해 수행된 단계를 포함하지 않는다. 따라서, 본원에 기술된 방법으로부터 수득된 결과는 임상 데이터와 결합될 필요가 있을 수 있으며 주치의에 의해 수행된 최종적인 진단 전에 다른 임상적인 표시를 대상체에게 제공할 수 있다. 대상체가 위암을 지니고 있는지에 대한 최종적인 진단은 주치의의 영역이며 본 개시내용의 일부분인 것으로 고려되지 않는다. 따라서, 본원에 사용된 것으로서, 용어 "측정하는", "검출하는" 및 "진단하는"은 이의 발달의 어느 단계에서 질병(위암과 같은)을 가진 대상체의 변화 또는 가능성의 확인, 또는 질병으로 진행될 대상체의 예후의 측정을 말한다. 일 예에서, "진단", "측정", "검출"은 증상의 만연 전에 일어난다. 일 예에서, "진단", "측정", "검출"은 임상의/주치의(다른 임상 표시와 함께)가 위암을 지닌 것으로 의심되는 대상체에서 위암을 확인하도록 한다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "차등적 발현"은 제2의 샘플 중에서 또는 예비측정된 참고값 또는 대조군과 관련하여 동일한 하나 이상의 miRNA의 발현의 수준과 비교하여 하나의 샘플에서, miRNA의 양으로 측정된 바와 같은, 하나 이상의 miRNA의 발현의 수준에 있어서의 차이를 말한다. 차등적 발현은 배열 하이브리드화, 차세대 서열분석, RT-PCR 및 당해 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있는 다른 방법에 의해서와 같이, 당해 분야에 공지된 방법으로 측정될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 방법의 목적에 따라서, 차등적 발현이 관찰될 수 있는지를 측정하는데 사용된 대조군 그룹은 상이할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 본원에 기술된 바와 같은 어떠한 제공된 방법에서도 대조군 그룹은 당해 분야의 숙련가에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 일 예에서, 대조군 그룹은 어떠한 위암 관련된 질병이 없는 대상체일 수 있다. 일 예에서, 대조군 그룹은 어떠한 존재하는 질병이 없는 건강한 대상체일 수 있다. 일 예에서, 대조군 그룹은 위염, 장상피화생(intestinal metaplasia), 장 위축증 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 비-장 암 관련 질병을 가진 것으로 공지된 대상체일 수 있다. 일 예에서, 대조군은 샘플의 특성 및 또한 훈련하는 데이터 세트가 수득되는 것들을 기준으로 대상체의 성별, 연령, 대상체의 인종(ethnicity)과 같은 다른 인자들에 따라 변할 수 있다. 일 실시예에서, 대조군 대상체는 아시아계 인종 또는 혈통, 예를 들면, 중국계 인종 또는 인종적 중국계 혈통일 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은, 대조군과 비교하는 경우, 표 18에서 "상향-조절된"으로 나열된 miRNA가 위암을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된 샘플에서 상향-조절되는 것으로 발견되는 경우 관찰된다. 따라서, 일 예에서, 대조군과 비교하여, 표 18에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA의 상향 조절은 위암을 갖는 대상체를 진단하거나 위암을 갖는 대상체의 지표일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본원에 기술된 실시예 또는 방법중 어느 것에서, 용어 "상향-조절된"은 대조군과 비교하여 miRNA의 발현의 수준 또는 miRNA의 보다 많은 카피의 검출에 있어서의 증가를 말한다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군과 비교하여 적어도 약 1.01배 이상인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05보다 낮을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적 시험을 사용하여 계산될 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용한 잘목된 발견률(false discovery rate: FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 <0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 적어도 대조군에 대해 약 1.02배수 변화 내지 약 2.5배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 6에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.05배수 변화 내지 약 1.53배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 약 1.10배, 또는 약 1.15배, 또는 약 1.20배, 또는 약 1.25배, 또는 약 1.30배, 또는 약 1.35배, 또는 약 1.40배, 또는 약 1.45배, 또는 약 1.50배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 대조군은 위암이 없는 대상체일 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은, 대조군과 비교하는 경우, 표 18에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA가 위암을 지닌 것으로 의심된 대상체로부터 수득된 샘플 중에서 하향-조절된 것으로 발견된 경우 관찰된다. 따라서, 일 예에서, 대조군과 비교하여, 표 18에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA의 하향-조절은 위암을 지닌 대상체의 지표이거나 대상체가 위암을 가진 것으로 진단될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 본원에 기술된 바와 같은 예들 또는 방법들 중 어느 것에서, 용어 "하향-조절된"은 대조군과 비교하여 miRNA 발현의 수준에 있어서의 감소 또는 miRNA의 카피 미만의 검출을 말한다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.99배수 변화 이하인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05보다 더 낮을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용한 잘못된 발견률(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 <0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 적어도 대조군에 대해 약 0.98배수 변화 내지 약 0.3배수 변화인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 6에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.5배수 변화 내지 약 0.92배수 변화인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, miRNA 발현은 발현 수준이 대조군에 대해 약 0.95배, 또는 약 0.90배, 또는 약 0.85배, 또는 약 0.80배, 또는 약 0.75배, 또는 약 0.70배, 또는 약 0.65배, 또는 약 0.60배, 또는 약 0.55배수 변화인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 대조군은 위암이 없는 대상체일 수 있다.
용어 "약"은, 값이 당해 분야에 공지된 바와 같은 고유의 오차 변화를 포함함을 나타내기 위해 본원에서 사용되며, 상기 오차 변화는 값을 측정하는데 사용되는 장치, 방법의 사용, 또는 연구 대상체 중에 존재하는 변화로부터 발생할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 본원에 기술된 것으로서 본 개시내용 전체에서 사용된 것으로서, 표현에서 배수 변화의 내용에서 용어 "약"은 기술된 값의 평균 +/- 5%, 또는 기술된 값의 +/- 4%, 또는 기술된 값의 +/- 3%, 또는 기술된 값의 +/- 2%, 또는 기술된 값의 +/- 1%, 또는 기술된 값의 +/- 0.5%를 의미할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 18에 나열된 바와 같은 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 18에 나열된 바와 같이 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 55개, 또는 적어도 60개, 또는 적어도 65개, 또는 적어도 70개, 또는 적어도 75개, 또는 적어도 80개, 또는 적어도 85개, 또는 적어도 90개, 또는 적어도 95개, 또는 적어도 100개, 또는 적어도 105개, 또는 적어도 107개 또는 모든 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 18에 나열된 1 내지 108개의 miRNA, 또는 표 18에 나열된 바와 같은 2 내지 10개, 또는 11 내지 30개, 또는 31 내지 50개, 또는 50 내지 70개, 또는 71 내지 90개, 또는 91 내지 108개의 miRNA를 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 18에 나열된 모든 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 표 18에서 "상향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA 및 표 18에서 "하향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 18에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 55개, 또는 적어도 60개, 또는 적어도 65개, 또는 70개; 표 18에 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 38개의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 대상체로부터 수득된 비-세포 생체액 샘플 중에서 표 14에 나열된 바와 같은 적어도 하나의 microRNA(miRNA)의 발현 수준을 측정함을 포함할 수 있다.
[표 14]
Figure 112017012869895-pct00004
Figure 112017012869895-pct00005
당해 분야에 공지된 바와 같이, 증식성 질병이 진행(치료하에 또는 치료없이)하는 경우, 당해 질병의 임상적 표시는 진행 단계들 사이에서 변할 것이다. 따라서, 위암/위장암이 진행되는 방법을 측정하는데 있어서 기술자를 보조하기 위하여, 국립 보건원에서의 국립 암 센터는 위암/위장암에서 관찰된 단계의 일반화된 임상적 표시를 발표하였다. 위암의 단계는 이의 정의 내에서 다음과 같이 기술된 하기 단계를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:
I 기: I 기, 암이 위장 벽의 점막의 내벽(최내부 층)에 형성된다. I 기는 암이 확산되는 곳에 따라서 IA 기 및 IB 기로 나누어진다.
IA 기: 암이 위장 벽의 점막하(점막 다음의 조직 층)으로 확산될 수 있다.
IB 기: 암이 위장 벽의 점막하(점막 다음의 조직 층)로 확산될 수 있고 종양 근처에 1 또는 2개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 근육 층으로 확산된다.
II 기: II 기 위암은 암이 확산되는 곳에 따라서 IIA 기 및 IIB 기로 나누어진다.
IIA 기: 암이 위장 벽의 장막하(장막의 다음 조직의 층)으로 확산되거나; 위장 벽의 근육 층으로 확산되어 종양 근처에 1 또는 2개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 점막하(점막 다음의 조직 층)으로 확산되어 종양 근처에 3 내지 6개의 림프절에서 발견된다.
IIB 기: 암이 위장 벽의 장막(최외각 층)으로 확산되거나; 위장 벽의 장막하(장막 다음의 조직 층)으로 확산되어 종양 근처에 1 또는 2개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 근육 층으로 확산되어 종양 근처의 3 내지 6개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 점막하(점막 다음의 조직 층)로 확산되어 종양 근처에 7개 이상의 림프절에서 발견된다.
III 기: III 기 위암은 암이 확산되는 곳에 따라서 IIIA 기, IIIB 기, 및 IIIC 기로 나누어진다.
IIIA 기: 암이 위장 벽의 장막(최외각) 층으로 확산되어 종양 근처의 1 또는 2개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 장막하(장막 다음의 조직 층)로 확산되어 종양 근처의 3 내지 6개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 근육 층으로 확산되어 종양 근처의 7개 이상의 림프절에서 발견된다.
IIIB 기: 암이 비장, 횡행 결장, 간, 횡격막, 췌장, 신장, 부신, 또는 소장과 같은 근처 기관으로 확산되어, 종양 근처의 1 또는 2개의 림프절에서 발견될 수 있거나; 위장 벽의 장막(최외각 층)으로 확산되어 종양 근처의 3 내지 6개의 림프절에서 발견되거나; 위장 벽의 장막하(장막 다음의 조직 층)으로 확산되어 종양 근처의 7개 이상의 림프절에서 발견된다.
IIIC 기: 암이 비장, 횡행 결장, 간, 횡격막, 췌장, 신장, 부신, 또는 소장과 같은 근처 기관으로 확산되어 종양 근처의 3개 이상의 림프절에서 발견될 수 있거나; 위장 벽의 장막(최외각 층)으로 확산되어 종양 근처의 7개 이상의 림프절에서 발견된다.
IV 기: IV 기에서, 암은 신체의 먼 부분으로 확산된다.
당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 대상체가 특수한 단계에 있는지에 대한 측정은 어떠한 치료 또는 고통 완화 처치를 가장 잘 시도하는 방법에 대한 명백한 안내를 임상의에게 제공하는데 있어서 유용할 수 있다. 따라서, 일 국면에서, 본 개시내용은 대상체에서 위장 암 단계를 검출하거나 진단하는 방법을 제공한다. 일 예에서, 당해 방법은 위암의 단계를 가진 대상체의 가능성을 측정한다. 당해 국면에서, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 비-세포성 생체액 샘플 중에서, 표 8; 표 9 또는 표 15; 표 10 또는 표 16; 및 표 11 또는 표 17로 이루어진 그룹으로부터 선택된 표 중의 적어도 하나에서 나열된 바와 같은 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성을 가진 적어도 하나의 microRNA(miRNA)의 발현 수준을 측정함을 포함하며, 여기서 대조군과 비교하여, 대상체로부터 수득된 샘플 중에서 miRNA 발현의 차등적 발현은 1기, 2기, 3기 또는 4기 위암 중의 어느 하나를 갖는 대상체의 가능성의 지표일 수 있거나, 1기, 2기, 3기 또는 4기 위암 중의 어느 하나를 갖는 것으로 대상체를 진단할 수 있다. 본원에 사용된 것으로서, 대조군은 위암이 없는 대상체일 수 있다. 일 예에서, 도 13은 위암의 단계들로 진전되거나 이들 중 하나를 갖는 대상체의 가능성을 측정하는 방법의 단계를 요약한다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 8에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA가 1기 위암을 가진 대상체의 지표일 수 있거나 대상체를 1기 위암으로 진단할 수 있는 경우, 및 miRNA가 표 8에서 "상향-조절된" 것으로서 나열된 miRNA의 적어도 하나를 포함할 수 있는 경우 관찰된다. 표 8은 실험 단락에서 추가로 상세히 제공된다. 일 예에서, miRNA는, 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.01배수 변화 내지 약 2.5배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05보다 더 낮을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 것으로서 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용한 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 약 1.10배, 또는 약 1.15배, 또는 약 1.20배, 또는 약 1.25배, 또는 약 1.30배, 또는 약 1.35배, 또는 약 1.40배, 또는 약 1.45배, 또는 약 1.50배수 변화를 가질 수 있는 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 8에 예시된 것으로서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.11배수 변화 내지 약 1.57배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 8에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 것으로서 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일예에서, 상기 방법은 표 8에서 "상향-조절된" 것으로서 나열된 것으로서 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 8개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 8에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA가 1기 위암을 가지는 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 1기 위암을 가지는 것으로 진단될 수 있는 경우 관측된다. 일 예에서, miRNA는 표 8에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.9배수 변화 이하인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05 미만일 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적인 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용하여 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA 발현은 발현 수준이 대조군에 대해 약 0.95배, 또는 약 0.90배, 또는 약 0.85배, 또는 약 0.80배, 또는 약 0.75배, 또는 약 0.70배, 또는 약 0.65배, 또는 약 0.60배, 또는 약 0.55배수 변화를 가질 수 있는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 8에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.68배수 변화 내지 약 0.84배수 변화를 가지는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 8에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 8에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개 또는 12개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 8에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 적어도 하나의 miRNA 및 표 8에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 적어도 하나의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 8에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 8개; 표 8에 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 12개의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 9 또는 표 15에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA가 2기 위암을 가진 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 2기 위암을 가진 것으로 진단될 수 있는 경우 관측된다. 표 9는 실험 단락에서 추가로 상세히 기술된다. 일 예에서, miRNA는 표 15에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
[표 15]
Figure 112017012869895-pct00006
Figure 112017012869895-pct00007
일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.01배수 변화 내지 약 2.5배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05보다 더 낮을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)와 같이 당해 분야에 공지된 통계적 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 것으로서 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용한 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 약 1.10배, 또는 약 1.15배, 또는 약 1.20배, 또는 약 1.25배, 또는 약 1.30배, 또는 약 1.35배, 또는 약 1.40배, 또는 약 1.45배, 또는 약 1.50배수 변화를 가질 수 있는 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 9에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.13배수 변화 내지 약 2.13배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 9 또는 표 15에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 9 또는 표 15에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개, 또는 적어도 50개, 또는 적어도 54개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 9 또는 표 15에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA가 2기 위암을 가지는 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 2기 위암을 가지는 것으로 진단될 수 있는 경우 관측된다. 일 예에서, miRNA는 표 15에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 비해 적어도 약 0.9배수 변화 이하인 경우 "하향-조절된" 것으로 간주될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적인 시험에서 p-값은 0.05 보다 낮을 수 있다. 일 예에서 p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적인 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용하여 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용된다. 일 예에서, miRNA 발현은 발현 수준이 대조군에 대해 약 0.95배, 또는 약 0.90배, 또는 약 0.85배, 또는 약 0.80배, 또는 약 0.75배, 또는 약 0.70배, 또는 약 0.65배, 또는 약 0.60배, 또는 약 0.55배수 변화를 가질 수 있는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 9에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.56배수 변화 내지 약 0.87배수 변화를 가지는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 9 또는 표 15에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 9 또는 표 15에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 표 9 또는 표 15에서 "상향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA 및 표 9 또는 표 15에서 "하향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 9 또는 표 15에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개, 또는 적어도 50개, 또는 54개의 miRNA; 및 표 9 또는 표 15에 "하향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 대상체가 2기 위암을 가질 수 있는지에 대한 진단 또는 지표를 제공할 수 있는 본원에 기술된 방법이 표 15를 사용하는 경우, 당해 방법은 miR-20a-5p, miR-223-3p, miR-17-5p, miR-106b-5p, miR-423-5p, 및 miR-21-5p를 포함하나, 이에 한정되지 않는 miRNA의 어느 하나 이상의 발현 수준을 비교함을 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 10 또는 표 16에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 miRNA가 3기 위암을 가진 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 3기 위암을 가진 것으로 진단될 수 있는 경우 관측된다. 표 10은 실험 단락에서 추가로 상세히 기술된다. 일 예에서, miRNA는 표 16에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
[표 16]
Figure 112017012869895-pct00008
일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.01배수 변화 내지 약 2.5배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05보다 더 낮을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)와 같이 당해 분야에 공지된 통계적 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 것으로서 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용한 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 약 1.10배, 또는 약 1.15배, 또는 약 1.20배, 또는 약 1.25배, 또는 약 1.30배, 또는 약 1.35배, 또는 약 1.40배, 또는 약 1.45배, 또는 약 1.50배수 변화를 가질 수 있는 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 10에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.20배수 변화 내지 약 1.93배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 10 또는 표 16에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 10 또는 표 16에서 "상향-조절된" 것으로서 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 37개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 10 또는 표 16에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 경우 나열된 miRNA가 3기 위암을 가지는 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 3기 위암을 가지는 것으로 진단될 수 있는 경우 관측된다. 일 예에서, miRNA는 표 16에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.9배수 변화 이하인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05 미만일 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적인 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용하여 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용된다. 일 예에서, miRNA 발현은 발현 수준이 대조군에 대해 약 0.95배, 또는 약 0.90배, 또는 약 0.85배, 또는 약 0.80배, 또는 약 0.75배, 또는 약 0.70배, 또는 약 0.65배, 또는 약 0.60배, 또는 약 0.55배수 변화를 가지는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 10에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.72배수 변화 내지 약 0.88배수 변화를 가지는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 10 또는 표 16에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 10 또는 표 16에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 6개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 표 10 또는 표 16에서 "상향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA 및 표 10 또는 표 16에서 "하향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 10 또는 표 16에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 37개의 miRNA; 및 표 10 또는 표 16에 "하향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 6개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 대상체가 3기 위암을 가질 수 있는지에 대한 진단 또는 지표를 제공할 수 있는 본원에 기술된 방법이 표 16을 사용하는 경우, 당해 방법은 miR-21-5pm, miR-223-3p 및 miR-423-5p를 포함하나, 이에 한정되지 않는 miRNA 중의 어느 하나 이상의 발현 수준을 비교함을 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 11 또는 표 17에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 miRNA가 4기 위암을 가진 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 4기 위암을 가진 것으로 진단될 수 있는 경우 관측된다. 표 10은 실험 단락에서 추가로 상세히 기술된다. 일 예에서, miRNA는 표 17에서 "상향-조절된" 것으로서 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
[표 17]
Figure 112017012869895-pct00009
Figure 112017012869895-pct00010
일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.01배수 변화 내지 약 2.5배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화에 대한 통계적 시험에서 p-값은 0.05보다 더 낮을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용한 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용되었다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 약 1.10배, 또는 약 1.15배, 또는 약 1.20배, 또는 약 1.25배, 또는 약 1.30배, 또는 약 1.35배, 또는 약 1.40배, 또는 약 1.45배, 또는 약 1.50배수 변화를 가질 수 있는 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 11에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 1.12배수 변화 내지 약 1.86배수 변화인 경우 "상향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 11 또는 표 17에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 11 또는 표 17에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개 또는 46개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 차등적 발현은 대조군과 비교하여, 표 11 또는 표 17에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA가 4기 위암을 가지는 대상체의 지표일 수 있거나 대상체가 4기 위암을 가지는 것으로 진단될 수 있는 경우 관찰된다. 일 예에서, miRNA는 표 17에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예에서, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.9배수 변화 이하인 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 변화를 위한 통계적인 시험에서 p-값은 0.05보다 작을 수 있다. 일 예에서, p-값은 t-시험(p-값 < 0.01)과 같이 당해 분야에 공지된 통계적인 시험을 사용하여 계산할 수 있다. 다른 예에서, 통계적 시험은 당해 분야에 공지된 바와 같은 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용하여 잘못된 발견율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)이다. 이는 하기 실시예에서 예시적으로 사용된다. 일 예에서, miRNA 발현은 발현 수준이 대조군에 대해 약 0.95배, 또는 약 0.90배, 또는 약 0.85배, 또는 약 0.80배, 또는 약 0.75배, 또는 약 0.70배, 또는 약 0.65배, 또는 약 0.60배, 또는 약 0.55배수 변화를 가질 수 있는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다. 일 예에서, 표 11에 예시된 바와 같이, miRNA는 발현 수준이 대조군에 대해 적어도 약 0.48배수 변화 내지 약 0.90배수 변화를 가지는 경우 "하향-조절된" 것으로 고려될 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 표 11 또는 표 17에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 하나 이상의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 상기 방법은 표 11 또는 표 17에서 "하향-조절된" 것으로 나열된 바와 같은 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 28개의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 표 11 또는 표 17에서 "상향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA 및 표 11 또는 표 17에서 "하향-조절된" 바와 같이 나열된 적어도 하나의 miRNA의 차등적 발현을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 11 또는 표 17에서 "상향-조절된" 것으로 나열된 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 적어도 40개, 또는 적어도 45개 또는 46개의 miRNA; 및 표 11 또는 표 17에 "하향-조절된" 것으로 나열된 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 28개의 차등적 발현을 측정할 수 있다.
일 예에서, 대상체가 4기 위암을 가질 수 있는지에 대한 진단 또는 지표를 제공할 수 있는 본원에 기술된 방법이 표 17을 사용하는 경우, 당해 방법은 miR-21-5pm, miR-223-3pm, miR-20a-5pm, miR-106b-5p, 및 miR-17-5p를 포함하나, 이에 한정되지 않는 miRNA 중의 어느 하나 이상의 발현 수준을 비교함을 추가로 포함할 수 있다.
여전히 다른 국면에서, (a) 비-세포성 생체액 샘플 중에서 표 12 또는 표 19에 나열된 miRNA와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 단계 (a)에서 측정된 miRNA의 발현 수준을 기준으로 점수를 생성시키는 단계, 및 (c) 상기 점수를 사용하여 위암을 지닌 대상체의 가능성을 예측하는 단계를 포함하여, 대상체에서 위암을 검출하거나 진단하거나 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 점수는 양성 대조군(위암 대상체로부터의 샘플) 또는 음성 대조군(위암이 없는 대상체로부터의 샘플)의 발현 수준과 대상체의 발현 수준을 비교하는 분류 알고리즘으로 계산되며, 상기 점수는 (i) 점수가 양성 대조군의 점수내에 속하는 위암을 가지거나, (ii) 점수가 음성 대조군의 점수내에 속할 수 있는 위암을 가지지 않은(즉, 위암이 없는) 대상체의 가능성을 확인한다. 일 예에서, miRNA는 표 19에 나열된 것으로서 miRNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 일 예에서, 대상체에서 위암을 검출하거나 진단하거나 당해 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하는 당해 방법은 다변량 방법으로 언급될 수 있다. 일 예에서, 다변량 방법은 소-집단 또는 그룹을 나타내는 임상 데이터로 측정된 miRNA를 사용할 수 있다. 일 예에서, 다변량 바이오마커 패널은 표 12에 나열된 바이오마커를 포함할 수 있으며, 이는 위암과 관련된 것으로 밝혀진 miRNA 및 위암과 관련되지 않은 것으로 밝혀진 miRNA 둘 다를 포함한다. 일 예에서, 위암과 관련된 다변량 방법에서 사용될 수 있는 miRNA는 표 19에서 포함될 수 있다. 표 12는 실시예 단락에서 추가로 상세히 기술된다. 일 예에서, 도 14는 위암으로 진행되는(또는 위암을 지닌) 대상체의 가능성을 측정하는 다변량 방법의 단계를 요약한다.
[표 19]
Figure 112017012869895-pct00011
위에서 언급된 바와 같이, 다변량 방법은 표 12에 나열된 바이오마커의 측정을 포함할 수 있으며, 당해 표는 위암과 관련된 것으로 밝혀진 miRNA 및 위암과 관련되지 않은 것으로 밝혀진 miRNA 둘 다를 포함한다. 따라서, 일 예에서, 다변량 방법이 표 19에 나열된 바와 같은 miRNA를 사용하는 경우, 상기 방법은 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있으며, 당해 miRNA는 이후에 음성 대조군과 비교하는 경우, 발현 수준이 대상체 내에서 변경되지 않는다. 일 예에서, 음성 대조군과 비교하는 경우 발현 수준이 대상체 내에서 변경되지 않는 miRNA는 표 20에 나열된 miRNA 중의 어느 하나일 수 있다.
[표 20]
Figure 112017012869895-pct00012
일 예에서, 당해 분야에 공지된 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 다변량 방법에서, 상기 점수는 분류 알로리즘을 사용하여 계산할 수 있다. 일 예에서, 분류 알고리즘은 지지체 벡터 머신 알고리즘, 로지스틱 회귀 알고리즘(logistic regression algorithm), 다항 로지스틱 회귀 알고리즘(multinomial logistic regression algorithm), 피셔 선형 판별 알고리즘(Fisher's linear discriminant algorithm), 이차 분류기 알고리즘(quadratic classifier algorithm), 퍼셉트론 알고리즘(perceptron algorithm), k-최단 근접 알고리즘(k-nearest neighbors algorithm), 인공 신경망 알고리즘(artificial neural network algorithm), 무작위 숲 알고리즘(random forests algorithm), 의사결정 트리 알고리즘(decision tree algorithm), 나이브 베이스 알고리즘(naive Bayes algorithm), 조정 베이스 네트워크 알고리즘(adaptive Bayes network algorithm), 및 앙상블 학습 방법 조합 다중 학습 알고리즘(ensemble learning method combining multiple learning algorithm)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 당해 분야의 기술자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 분류 알고리즘은 양성 대조군 및 음성 대조군의 발현 수준을 사용하여 예비-훈련될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 다변량 방법의 특수한 국면에서, 양성 대조군은 위암을 지닌 대상체로부터 수득된 샘플일 수 있으며 음성 대조군은 위암이 없는 대조군으로부터 수득된 샘플이다. 일 예에서, 위암이 없는 대조군은 위에 기술된 바와 같을 수 있다. 즉, 일 예에서, 위암이 없는 대조군은 어떠한 위암 관련 질병도 없는 대상체일 수 있다. 일 예에서, 위암이 없는 대조군은 어떠한 존재하는 질병도 없는 건강한 대상체일 수 있다. 일 예에서, 위암이 없는 대조군은 위장염, 장 상피화생, 장 위축증 등과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 비-위암 관련 질병을 가진 것으로 공지된 대상체일 수 있다. 일 예에서, 대조군은 샘플의 특성 및 또한 훈련 데이터 세트가 수득되었는 것들을 기준으로 대상체의 성별, 연령, 인종과 같은 다른 인자에 따라 변할 수 있다. 일 예에서, 대조군 대상체는 중국 인종 또는 인종적 중국 혈통일 수 있다.
당해 분야의 숙련가에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, miRNA의 발현 수준은 농도, log(농도), Ct/Cq 수, Ct/Cq 수의 파워(power)에 대해 2 중 어느 것일 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정할 수 있는 데이터-훈련된 식을 사용할 수 있다. 일 예에서, 알고리즘은 다수의 miRNA의 측정과 결합하여 위암을 지닌 대상체의 위험을 예측하기 위한 점수를 제공한다. 이는 다수의 유전적 표적의 정보와 결합하여 단일의 miRNA 바이오마커를 사용하는 것보다 더 우수한 예측 정확도를 제공한다. 일 예에서, 유용한 패널을 구축하기 위한 miRNA 바이오마커의 최소 수는 4이다. 예를 들면, 4개의 miRNA를 지닌 바이오마커 패널은 유용한 바이오마커 패널로 간주되는 검증 세트에서 평균 AUC > 0.8을 갖는다는 것이 도 11에 도시되어 있다. 바이오마커 패널(AUC 값의 측면에서)의 수행능에 있어서의 개선은, miRNA가 7 초과인 경우 유의적으로 증가하지 않는다. 따라서, 일 예에서, 최대화된 수행능을 지닌 최적의 패널을 구축하기 위한 miRNA의 최소의 수는 7개의 miRNA이다. 일 예에서, 위암을 가진 대상체의 가능성을 측정하기 위한 점수를 계산하는데 사용될 수 있는 식은 다음과 같을 수 있다:
A x miRNA1 + B x miRNA2 + C x miRNA3 + D,
여기서, miRNA1, miRNA2, miRNA3는 카피 수, log(카피 수), Ct/Cq 수 또는 다른 수일 수 있는 miRNA의 발현 수준과 관련된 값이었고; A, B, C, D는 양성 또는 음성일 수 있는 계수였다. 예를 들면, 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하기 위한 점수(즉, 암 위험 점수)는 하기 실시예 및 도 15에 기술된 바와 같이, 우세(prevalence)가 20%를 초과하는 다변량 바이오마커 패널 확인 공정에서 빈번하게 선택된 12개의 miRNA(표 21)를 합하여 계산할 수 있다. 일 예에서, 점수가 식으로부터 수득된 경우, 점수가 더 높을/낮을수록, 위암을 지닌 대상체의 변화는 더 높다. 일 예에서, 상기 범위는 계수가 환산될 수 있으므로 명확히 정의되지 않을 수 있다. 예를 들면, 모든 계수(즉, A, B, 또는 C)는 상기 양의 1/2일 수 있거나, D의 값은 훈련 데이터 세트에 의한 훈련에 따라 변할 수 있다. 일 예에서, 상기 점수의 값은 위암을 지닐 위험과 양으로 또는 음으로 관련될 수 있다. 실제 관련성은 훈련 데이터 세트에 의존할 수 있으며 당해 분야의 숙련가는 훈련 데이터 세트의 확립시 요구된 필수적인 조절에 친숙할 것이다.
일 예에서, 상기 범위는 계수가 환산될 수 있으므로 명확히 정의되지 않을 수 있다. 예를 들면, 모든 계수(즉, A, B, 또는 C)는 상기 양의 2배일 수 있거나 D의 값은 훈련 데이터 세트에 의한 훈련에 따라 변할 수 있다. 일 예에서, 상기 점수의 값은 위암의 위험과 양으로 또는 음으로 관련될 수 있다. 실제 관련성은 훈련 데이터 세트에 의존할 수 있으며 당해 분야의 숙련가는 훈련 데이터 세트의 확립시 요구되는 필수적인 요건에 친숙할 수 있다.
일 예에서, 모든 계수(즉, A, B, 또는 C)는 상기 양의 1/2로 적절히 조절될 수 있고/있거나 D의 값은 0 내지 100까지의 대상체 대부분에 대한 식을 기준으로 계산된 값의 범위로 환산되도록 적절히 변화될 수 있다. 일 예에서, 상기 점수의 값은 위암을 지닐 위험과 양으로 또는 음으로 관련될 수 있다. 실제 관련성은 훈련 데이터 세트에 의존할 수 있으며 당해 분야의 기술자는 훈련 데이터 세트의 확립히 요구되는 필수적인 요건에 친숙할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 표 12에서 "유의적인" 것으로 나열된 바와 같은 또는 표 19에 나열된 바와 같은 적어도 하나의 miRNA 및 표 12에서 "비유의적인" 것으로 나열되거나 표 20에 나열된 바와 같은 적어도 하나의 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있다. 일 예에서, 상기 방법은 표 12에서 "유의적인" 것으로 나열된 바와 같은 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 42개의 miRNA 또는 표 19에 나열된 바와 같은 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 적어도 10개, 또는 적어도 11개, 또는 적어도 12개, 또는 적어도 13개, 또는 적어도 14개, 또는 적어도 15개, 또는 적어도 20개, 또는 적어도 25개, 또는 적어도 30개, 또는 적어도 35개, 또는 38개; 및 표 12에 "비유의적인" 것으로 나열된 바와 같은 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 12개, 또는 표 20에 나열된 것으로서 miRNA의 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 적어도 8개, 또는 적어도 9개, 또는 10개의 발현 수준을 측정할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 다변량의 방법이 표 19에 나열된 바와 같은 위암과 관련된 miRNA를 사용하는 경우, 상기 방법은 miR-21-5p, miR-20a-5pm, miR-17-5p, miR-423-5p 및 miR-223-3p로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miRNA의 어떠한 하나 이상의 발현 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 다변량의 방법이 표 20에 나열된 바와 같은 관련되지 않은 miRNA를 사용하는 경우, 본원에 기술된 상기 방법은 miR-34a-5p 및 miR-27b-3p로 이루어진 그룹으로부터 선택된 miRNA 중 어떠한 하나 이상의 발현 수준을 측정함을 추가로 포함할 수 있다.
위암과 관련된 miRNA 세트에 도달하기 위한 예시적인 시도는 하기 요약된다. 또한, 일반적인 워크플로우는 도 1, 2 및 14에 나타낸다.
단계 1: 총 RNA(또는 이의 소분획)을 적합한 키트 및/또는 정제 방법을 사용하여 대상체 또는 위암을 지닌 대상체의 샘플(예를 들면, 혈장, 혈청, 또는 다른 혈액 분획)로부터 추출한다.
단계 2: 각각의 샘플로부터, 하나의 miRNA의 양(발현 수준) 또는 서열 번호 1 내지 서열 번호 191로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 miRNA의 세트를 실험 기술을 사용하여 측정한다. 일 예에서, 적어도 하나의 miRNA가 표 12, 19 및 20에서 나열된 바와 같은 그룹으로부터 선택될 수 있다. 이들 기술은 당해 분야에 공지된 기술이며, 이는 배열계 시도, 증폭 방법(PCR, RT-PCR, 또는 qPCR), 서열분석, 차세대 서열분석, 및/또는 질량 분광법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 3: 단일의 miRNA 바이오마커 각각의 진단 값 및 풍부성에 대한 정보를 모으기 위하여, 수학적 방법이 적용된다. 이들 방법은 당해 분야에 공지된 방법이며 기본적인 수학적 접근법(예를 들면, 몫의 자승(Fold Quotients), 시그날-대-노이즈 비, 연관성), 가설 시험(예를 들면, t-시험, 윌콕슨-만-휘트니 시험(Wilcoxon-Mann-Whitney test)), 수용자 작동기 특징 곡선하 영역(Area under the Receiver operator Characteristics Curve), 정보 이론 접근법(예를 들면, 상호 정보, 교차-엔트로피), 가능성 이론(예를 들면, 고 조건부 합동 확률(joint and conditional probabilities)) 또는 앞서 언급된 방법의 조합 및 변형을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
단계 4: 단계 3)에서 수집된 정보를 사용하여 각각의 miRNA 바이오마커에 대해 진단적 성분 또는 값을 평가한다. 일반적으로, 그러나, 이들 진단적 값은 너무 작아서 80% 장벽을 초과하는 정확율, 특이성 및 민감성을 지닌 고도로 정밀한 진단을 얻을 수 없다. 위암을 진단하는데 적합한 miRNA의 진단 내용은 도 1에 나열된다. 당해 도는 표 12, 19, 및 20에 나열된 바와 같은 miRNA를 포함한다.
단계 5: 위암으로 고생하는 개인의 진단을 위한 수행능을 증가시키기 위하여, 하나 이상의 miRNA 바이오마커를 사용할 수 있다. 따라서, 통계적 학습/기계적 학습/생물정보학/컴퓨터 접근법을 세트 선택을 위해 적용하여 위암의 검출을 위해 조절된 miRNA 바이오마커(표 12 또는 표 19 및 20에 나열된 바와 같은 miRNA를 포함할 수 있다)의 세트를 선택/정의한다. 이들 기술은 래퍼 소세트 선택 기술(Wrapper subset selection technique)(예를 들면, 단계-별, 후방 단계-별, 조합 시도, 최적화 시도), 필터 소세트 방법(예를 들면, 단계 3에서 언급된 방법), 기본 성분 분석, 또는 이러한 방법의 조합 및 변형(예를 들면, 복합 접근법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단계 6: 모든 측정된 miRNA에 대해 단지 작은 수(세트에 대해 적어도 1개, 또는 적어도 2개 이상)의 범위일 수 있는, 단계 5에서 선택된/정의된 소세트를 이후에 사용하여 위암의 진단을 수행한다. 이러한 목적으로, 통계적인 학습/기계적 학습/생물정보학/컴퓨터 접근법을 적용하며 이는 어떠한 유형의 지도 분석(supervised analysis) 또는 자율 분석(unsupervised analysis): 분류 기술(예를 들면, 나이브 바이스(naive Bayes), 주 요인 분석(Linear Discriminant Analysis), 2차 판별 분석 신경 회로망(Quadratic Discriminant Analysis Neural Nets), 트리계 시도(Tree based approache), 서포트 벡터 기계(Support Vector Machine), 최단 근접 시도(Nearest Neighbor Approache), 회귀분석 기술(예를 들면, 선형 회귀분석, 다중 회귀분석, 로지스틱 회귀분석(logistic regression), 프로빗 회귀분석(probit regression), 서수 로지스틱 회귀 서수 프로빗-회귀분석(ordinal logistic regression ordinal Probit-Regression), 포아송 회귀분석(Poisson Regression), 음이항 회귀분석(negative binomial Regression), 다항 기호 논리학 회귀분석(multinomial logistic Regression), 절단 회귀분석(truncated regression)), 클러스터링 기법(Clustering technique)(예를 들면, k-평균 클러스터링(k-means clustering), 계층 클러스터링(hierarchical clustering), PCA), 어댑테이션(Adaptation), 확장(extension), 및 앞서 언급된 접근법들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
단계 7: 소세트 선택(단계 5) 및 기계 학습 접근법(단계 6)의 조합에 의해 위암을 진단하기 위한 알고리즘 또는 수학적 함수를 수득한다. 당해 알고리즘 또는 수학적 함수를 위암에 대해 진단할 개인(소세트)의 miRNA 발현 프로파일(miRNA 발현 프로파일 데이터)에 적용시킨다.
본원에 기술된 방법중 어느 것에서도, 비-세포 생체액은 유액의 어떠한 세포 성분도 포함하지 않는 어떠한 체액도 포함할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 대상체로부터 추출시, 생체액 또는 체액은 일반적으로 대상체의 체액 또는 생체액에서 발견되었다. 그러나, 이러한 생체액 또는 체액은 당해 분야에 공지된 방법으로 프로세싱되어 생체액 또는 체액 속에 함유된 어떠한 세포 성분도 제거할 수 있다. 예를 들면, 체액 또는 생체액의 세포 성분을 제거하기 위한 원심분리 또는 정제 공정을 본 발명의 방법을 수행하기 전에 수행할 수 있다. 따라서, 일 예에서, 체액 또는 비-세포성 생체액은 양수, 모유, 기관지 세척 유액, 뇌척수액, 초유, 간질액, 복막액, 흉수, 타액, 정액, 뇨, 눈물, 혈장, 적혈구 세포, 백혈구 세포 및 혈장을 포함한 전혈을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일 예에서, 비-세포성 생체액은 혈청 또는 혈장일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, 본원에 기술된 방법 중 어느 것에서도, 용어 "대상체" 및 "환자"는 동물(예를 들면, 포유동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 곤충)을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일 예에서, 대상체는 포유동물(예를 들면, 비-사람 포유동물(예를 들면, 개, 고양이, 또는 영장류) 및 사람)일 수 있다. 일 예에서, 대상체는 영장류(예를 들면, 침팬지 및 사람)일 수 있다. 일 예에서, 대상체는 사람일 수 있다. 일 예에서, 대상체는 위암(또는 위장암)을 지니거나 지니지 않은 사람일 수 있다. 본 개시내용의 실험 단락에서, 교육용 데이터 세트는 중국 인종 또는 중국 혈통의 대상체에서 얻었다. 따라서, 일 예에서, 대상체는 아시아계 혈통일 수 있다. 일 예에서 대상체는 중국 인종 또는 인종적 중국 혈통일 수 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 방법은 키트(kit)로 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기술된 바와 같은 miRNA에 필요하거나 이를 검출하는 성분을 포함할 수 있다. 성분은 본원에 기술된 바와 같은 miRNA, 시약, 용기 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 miRNA 및 프라이머/프로브를 검출하도록 구성된 장치를 포함할 수 있다. 일 예에서, 키트내 용기는 사용 전에 방사능표지된 본원에 기술된 바와 같은 miRNA의 수준을 검출하거나 측정할 수 있는 프라이머/프로브를 함유할 수 있다. 키트는 dDNT(4개의 데옥시뉴클레오타이드 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP 각각), 완충제, 역 전사효소 및 DNA 폴리머라제를 포함하는 용기와 같은, 하나 이상의 miRNA를 역 전사시키고 증폭시키기 위한 물질의 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 양성 대조군 및/또는 음성 대조군 반응을 위한 핵산 주형(들)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 대상체로부터 수득한 샘플로부터 miRNA의 분리에 필요한 어떠한 반응 성분 또는 완충제도 포함할 수 있다.
본원에 예증적으로 기술된 발명은 본원에 특이적으로 개시되지 않은 어떠한 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 확장하여 및 제한없이 판독될 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어들 및 표현들은 설명의 용어로서 및 제한없이 사용되었으며, 나타내고 기술된 특징들 또는 이의 일부의 어떠한 등가물을 제외한 이러한 용어 및 표현들의 사용에 있어 의도는 없지만, 다양한 변형이 특허청구된 영역내에서 가능함이 인식된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 특별하게 개시되었지만, 개시된 본원에 구현된 본 발명의 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가에 의해 재분류될 수 있으며 이러한 변형 및 변화는 본 발명의 영역내에 있음이 고려된다.
본 발명은 본원에 광범위하게 및 포괄적으로 기술되어 있다. 일반적인 개시내용에 속하는 보다 협소한 종 및 아종 그룹화들 각각은 또한 본 발명의 일부를 형성한다. 이는 제외된 물질이 본원에 구체적으로 인용되는 것과 상관없이, 속(genus)으로부터 어떠한 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한과 함께 본 발명의 일반적인 기술을 포함한다.
다른 구현예는 다음의 특허청구범위 및 비-제한적 실시예내에 있다. 또한, 본 발명의 특징 또는 국면은 마르쿠식 그룹(Markush group)의 측면에서 기술되는 경우, 당해 분야의 숙련가는 그렇게 함으로써 본 발명이 마르쿠식 그룹의 어떠한 개개 구성원 또는 구성원들의 소 그룹의 측면에서 또한 기술되어 있음을 인식할 것이다.
실험 단락
방법
예비-분석(샘플 수집 및 microRNA 추출): 정상(즉, 위암이 없는 대조군) 및 위암 대조군으로부터의 혈청 샘플을 싱가포르 위암 컨소시엄(Singapore Gastric Cancer Consortium)에서 중심적으로 수집하고, 가공하여 -80℃에서 동결 저장하였다. 200μl의 혈청으로부터의 총 RNA를 잘-확립된 컬럼계 miRNeasy 키트(Qiagen, 독일 힐덴 소재)를 사용하여, 반-자동화 QiaCube 시스템 상에서 분리하였다. 혈청은 소량의 RNA를 함유한다. RNA의 손실을 감소시키고 추출 효능을 모니터링하기 위하여, 합리적으로 설계된 분리 향상인자(MS2) 및 스파이크-인 대조군(spike-in control) RNA(MiRXES)를 분리 전에 시험편에 가하였다.
RT-qPCR: 분리된 총 RNA 및 합성 RNA 표준물을 스파이크-인 대조군 RNA의 제2 세트와의 최적화된 멀티플렉스 역 전사 반응 속에서 cDNA로 전환시켜 억제제의 존재를 검출하고 RT-qPCR 효능을 모니터링하였다. Impron II(Promega®) 역 전사효소를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 역 전사를 수행하였다. 이후에, 합성된 cDNA를 멀티플렉스 증강 단계에 적용시키고 Sybr Green 계 싱글-플렉스(single-plex) qPCR 검정(MIQE compliant)(MiRXES®)을 사용하여 정량화하였다. ABI® ViiA-7 384 기계를 qPCR 반응을 위해 사용하였다. miRNA RT-qPCR 측정 워크플로우의 개관 및 세부사항은 도 2에 요약되어 있다.
데이터 프로세싱: 한계(Ct) 값까지의 미가공 순환을 진행시키고 각각의 샘플 중에서 표적 miRNA의 절대적인 카피 수를 합성 miRNA 표준 곡선의 내삽법을 통해 측정하였다. 기계적 변화를 RNA 분리 동안 도입하고 RT-qPCR의 공정을 스파이크-인 대조군 RNA로 표준화하였다. 단일 miRNA의 분석을 위해, 생물학적 변화를 모든 대조군 및 질병 샘플에 따라 안정하게 발현된 승인된 내인성 참고 miRNA의 세트에 의해 추가로 표준화하였다.
연구 설계
잘 설계된 임상 연구(사례-대조군 연구)를 수행하여 위암의 진단을 위한 바이오마커의 정밀한 확인을 보증하였다. 연령이 68.0 ± 10.9세인 위암(1 내지 4기)을 지닌 총 237명의 중국 환자를 본 연구에 사용하였으며 비교는 대조군 그룹으로 제공된, 연령 및 성별이 일치된 다른 236명의 정상(건강하고 위암이 없음) 중국인 대상체로 이루었다. 모든 암 대상체를 내시경 및 생검으로 확인하고 혈청 샘플을 어떠한 처리 전에 수집하였다. 모든 정상(건강한) 대상체는 샘플을 수집한 시기에 내시경으로 위암이 없음을 확인하였으며 2년마다 내시경 스크리닝으로 3 내지 5년 동안 추적하여 대상체가 당해 기간내에 위암으로 진행하지 않았음을 입증하였다. 대상체의 세부적인 임상 정보는 표 2 및 표 3에 나열하였다. 모든 혈청 샘플을 사용 전에 -80℃에 저장하였다. 연구된 대상체의 특징을 표 5에 요약한다. 많은 수의 대조군(정상의/건강한/위암이 없는 대상체) 대상체는 위염, 장상피화생 및 위축증(atrophy)과 같은 위장 질병을 가졌다. 따라서, 대조군 그룹은 위암에 대해 고-위험 집단을 나타내었다. 헬리코박터 파일로리를 지닌 위암 환자의 퍼센트(78.8%)는 대조군 그룹의 것(55.7%) 초과였지만, 이러한 미미한 차이는 위암에 대한 바이오마커로서 헬리코박터 파일로리 사용을 지지하기에 충분하지 않았다.
[표 2]
Figure 112017012869895-pct00013
Figure 112017012869895-pct00014
Figure 112017012869895-pct00015
Figure 112017012869895-pct00016
Figure 112017012869895-pct00017
Figure 112017012869895-pct00018
[표 3]
Figure 112017012869895-pct00019
Figure 112017012869895-pct00020
Figure 112017012869895-pct00021
Figure 112017012869895-pct00022
Figure 112017012869895-pct00023
Figure 112017012869895-pct00024
[표 5]
Figure 112017012869895-pct00025
혈액 중에서 세포-유리된 miRNA를 순환시키는 것은 상이한 조직 공급원으로부터 기원할 수 있음이 알려져 있다. 그 결과, 고형 위 종양의 존재에 의해 유발된 miRNA의 수준에 있어서의 변화는 다른 공급원으로부터 동일한 miRNA의 존재에 의해 복잡해질 수 있다. 따라서, 암 및 대조군 그룹에서 발견된 miRNA의 발현 수준에 있어서의 차이를 측정하는 것은 도전이 될 것이고 예상대로 명확하지 않을 것이다. 또한, 큰 용적의 혈액(성인에서 5L)의 희석 효과로 인하여, 대부분의 세포-유리된 miRNA는 혈액 속에서 예외적으로 풍부성이 낮음이 알려져 있다. 따라서, 제한된 용적의 혈청/혈장 샘플로부터 다수의 miRNA 표적의 정밀한 측정은 중요하며 매우 유의적인 도전을 나타낸다. 낮은 민감성 또는 반-정량적 스크리닝 방법(미세배열, 서열분석)을 사용하는 것 대신에, miRNA의 유의적으로 변경된 발현의 발견 및 위암의 진단을 위한 다변량 miRNA 바이오마커 패널의 확인을 가장 우수하게 촉진시키기 위하여, 본 실험 연구는 도 2에 요약한 바와 같은 워크플로우를 사용하는 qPCR-계 검정을 수행하였다.
본 실험 단락에서 사용된 워크플로우에서, 모든 반응은 miRNA 표적에 대해 싱글-플렉스 방식으로 적어도 2회 수행하였고 합성 RNA '스파이크-인' 대조군에 대해 적어도 4회 수행하였다. 이러한 고-배출 qPCR 연구에서 결과의 정확성을 보증하기 위하여, 많은 반복, 순환하는 바이오마커의 발견을 위한 확고한 워크플로우 후에 본 연구를 설계하고 확립하였다("방법" 단락 및 도 2 참고). 당해 워크플로우에서, 다양한 인공적으로 설계된 '스파이크-인' 대조군을 사용하여 분리, 역 전사, 증강 및 qPCR 공정에서 기술적 변화에 대해 모니터링하고 교정하였다. 모든 스파이크-인 대조군은 비-천연 합성 miRNA 모사체(길이가 22 내지 24개 염기 범위인 작은 단일가닥 RNA)이었으며, 이는 인 실리코에서 설계하여 모든 공지된 사람 miRNA에 대해 서열내 예외적으로 낮은 유사성을 갖도록 함으로써, 당해 검정에서 사용된 프라이머에 대한 교차-하이브리드화를 최소화시켰다. 또한, miRNA 검정을 인 실리코로 다수의 멀티플렉스 그룹 및 프라이머-프라이머 상호작용으로 의도적으로 분할하였다. 합성 miRNA를 사용하여 모든 측정에서 절대 카피 수의 내삽법을 위한 표준 곡선을 작제함으로써 기술적 변화를 추가로 교정하였다. 예상대로, 다수 수준의 대조군을 사용한 당해 워크플로우로, 순환시 miRNA의 낮은 수준의 발현이 신뢰가능하게 및 반복적으로 검출될 수 있었다.
MiRNA 바이오마커
바이오마커를 확인하는 것에 대한 단계는 정상(대조군) 및 질병 상태에서 각각의 miRNA의 발현 수준을 비교하는 것이다. 모든 472개의 혈청 샘플(위암 및 정상/대조군)에서 578개(miRBase Version 10 release)의 사람 miRNA의 발현 수준을 확고한 워크플로우 및 고 민감성 qPCR 검정(MiRXES, 싱가포르)을 사용하여 정량적으로 측정하였다.
본 실험 설계에서, 200μL의 혈청을 추출하고 총 RNA를 역 전사시키고 터치-다운 증폭으로 증강시켜 cDNA의 양을 증가시키지만 miRNA 발현 수준의 표시는 여전히 변화시키지 않았다(도 2). 증강된 cDNA를 qPCR 측정을 위해 이후에 희석시켰다. 희석의 효과를 기준으로 한 단순한 순환은, 혈청 속에서 ≤500개 카피/ml 수준에서 발현되는, miRNA는 싱글-플렉스 qPCR 검정의 검출 한계(≤10개 카피/웰)에 근접한 수준에서 정량화될 것이다. 이러한 농도에서, 측정은 기술적 제한(피펫팅 및 qPCR에서 오차)로 인하여 유의적인 도전이 될 것이다. 따라서, ≤500개 카피/ml의 농도에서 발현된 miRNA는 분석으로부터 배제시키고 본 연구에서 검출불가능한 것으로 고려하였다.
검정된 총 miRNA의 약 33%(578개의 검정된 총 miRNA)가 고도로 발현된 것으로 밝혀졌다. 이들 191개의 miRNA는 혈청 샘플의 90% 초과에서 신뢰가능하게 검출되었으며(발현 수준 ≥500개 카피/ml; 표4) 이는 다른 기술을 사용하여 이미 보고된 것보다 많았는데, 이는 확고한 실험 설계 및 잘 조절된 워크플로우 사용의 중요성을 강조한다.
[표 4]
Figure 112017012869895-pct00026
Figure 112017012869895-pct00027
Figure 112017012869895-pct00028
Figure 112017012869895-pct00029
Figure 112017012869895-pct00030
이후에 열-지도를 구축하여 모든 검출된 혈청 miRNA(191개의 검출된 miRNA, 도 3)의 발현 수준을 나타내었다. miRNA의 다양한 소그룹이 함께 무리화(clustered)되었지만, 검출된 miRNA의 총 수를 기준으로 관리되지 않은 계층적 클러스터링에 의해 암과 대조군 그룹 사이에 명확한 구별이 되는 것으로 여겨지지 않았다. 따라서, 어떠한 특징 선택없이, 그룹 둘 다에 대한 전체 miRNA 프로파일은 유사하게 보였다.
191개의 혈청 miRNA의 발현을 이후 비교하였다.
· A] 정상/대조군과 위암(단계 또는 아형과 상관없음) 사이
· B] 질병의 다양한 단계(1 내지 4기) 사이, 및
· C] 정상/대조군과 질병의 다양한 단계 사이.
2개의 그룹 사이의 차등적 발현에 있어서 유의성을 당해 분야에 공지된 본페로니-형 다중 비교 과정을 사용하여 거짓 발견 비율(FDR)에 대해 교정된 t-시험(p-값 < 0.01)을 기준으로 계산하였다.
A] 정상/대조군 및 위암(단계 또는 아형에 상관없이)에서 차등적으로 발현된 miRNA의 확인
확산성, 위장 또는 혼합형의 위암을 가진 것으로 임상적으로 확인된 환자로부터의 샘플을 함께 그룹화하여 정상/대조군 공여자로부터의 샘플과 비교하였다. 대조군과 암 그룹 사이에 유의적인 차등적 발현을 나타낸 75개의 miRNA의 풀을 확인하였다(p-값 < 0.01; 표 6). 추정된 바이오마커의 발현의 대부분이 위암 대상체에서 더 높은 것으로 발견된 다른 보고서와는 달리(표 1), 본 연구는, 51개의 miRNA가 암 대상체에서 상향-조절된 반면 24개는 하향-조절되었음을 입증하였다(표 6). 따라서, 본 실험 설계는 보다 조절된 바이오마커를 확인하였다.
[표 1]
Figure 112017012869895-pct00031
[표 6]
Figure 112017012869895-pct00032
Figure 112017012869895-pct00033
본 연구의 결과(표 6)를 다른 보고서에 의해 혈액 속에서 차등적으로 발현되는 것으로 확인된 30개의 miRNA(표 1)를 비교시, 6개의 miRNA(hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-223-3p 및 hsa-miR-423-5p) 만이 일반적으로 상향-조절된 것으로 밝혀졌다(표 7). 따라서, 문헌에서 목적한 차등적으로 조절된 miRNA의 대부분은 본 연구에서 확인되지 않았다. 흥미롭게도, 위암에 대해 잠재적인 바이오마커였던, 69개의 신규 miRNA가 본원에서 확인되었다.
[표 7]
Figure 112017012869895-pct00034
75개의 바이오마커의 당해 세트를 사용하여, 위암과 정상/대조군 대상체 사이의 보다 명확한 클러스터링이 miRNA 프로파일의 열-지도에서 관찰되었다(도 4). 수평 치수를 볼때, 대부분의 위암 대상체(검정색)가 중심 영역으로 무리를 이루며 대부분의 정상/대조군 대상체는 지도의 나머지 공간에 남는다. 상위를 차지하는 상향-조절된(hsa-miR-142-5p) 및 하향-조절된(hsa-miR-99b-5p) miRNA에 대한 AUC 값은 각각 0.71 및 0.67이었다(도 5). 약간의 75개의 차등화된 miRNA 각각 또는 조합은 위암의 진단을 위한 바이오마커 또는 바이오마커(다변량 지수 검정)의 패널로서 제공될 수 있다.
miRNA의 발현은 열-지도에 예시된 바와 같이 소그룹으로 무리를 이루는 것으로 밝혀졌다(도 3, 4). 각각의 군집은 약 10 내지 20개의 miRNA를 갖는다(도 3, 4개의 파선). 모든 검출가능한 miRNA의 분석은 이들 다수가 양으로 관련되어 있음을 나타내었다(피어슨 상관 계수 > 0.5)(도 6). 동일한 관찰이 또한 위암 특이적인 miRNA으로 발견되었다(도 7). 상기 결과는 miRNA의 특정 그룹이 모든 대상체 중에서 유사하게 조절되었음을 입증하였다. 그 결과, miRNA의 패널은 하나 이상의 명확한 miRNA를 다른 것과 치환시켜 조립함으로써 진단 수행능을 향상시킬 수 있었으며 모든 75개의 유의적으로 변경된 miRNA는 위암에 대한 다변량 색인 진단 검정의 개발에 중요하였다.
B] 정상/대조군과 다양한 단계의 위암 사이에서 차등적으로 발현된 miRNA의 확인.
질병의 다양한 단계 사이의 miRNA의 발현을 이후에 비교하였다. 단계 및 아형을 고려하는 2-방식 아노바 시험(Anova test)을 사용하여, 36개의 miRNA(191개의 혈청 miRNA의 풀로부터)는 다양한 단계의 위암 대상체 사이에서 차등적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다(거짓 발견율 교정 후 아노바 시험의 p-값 < 0.01, 데이터는 나타내지 않음).
다양한 단계 사이의 차이를 알면, 다음 시도를 수행하여 각각의 단계의 암과 정상/대조군 사이에서 차등적으로 발현된 miRNA를 확인하였다. 당해 새로운 조사 공정에서 발견된 명백한 miRNA의 총 수는 113개였다(표 8 내지 11. 여기서 프로파일은 오버랩되었다). 이들 중에서, 20개(8개의 상향-조절된 및 12개의 하향-조절된), 62개(54개의 상향-조절된 및 8개의 하향-조절된), 43개(37개의 상향-조절된 및 6개의 하향-조절된) 또는 74개(28개의 상향-조절된 및 46개의 하향-조절된) miRNA는 정상/대조군과 각각의 상응하는 1, 2, 3 및 4기 사이에서 차등적인 발현을 나타내었다(FDR 교정 후 p-값 < 0.01, 표 8-11).
[표 8]
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[표 9]
Figure 112017012869895-pct00036
Figure 112017012869895-pct00037
[표 10]
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[표 11]
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3개의 miRNA(hsa-miR-486-5p, hsa-miR-19b-3p, hsa-miR-411-5p)를 제외하고, 모든 단계의 암을 총괄적으로 사용하는 분석으로부터 발견된 75개의 miRNA 중 나머지(표 6)는 각각의 단계의 암을 독립적으로 분석하는 경우 확인된 이들 113개의 miRNA의 소세트인 것으로 밝혀졌다. 다양한 단계의 위암 사이에서 차등적으로 조절된 것으로 밝혀진 36개의 miRNA의 대부분(1개 제외)은 또한 정상/대조군(N) 및 각각의 단계(S1-S4)의 위암과 비교하는 경우 차등적으로 발현되는 것으로 밝혀졌다(표 8-11). 이들 단계들 사이의 차이는 miRNA의 상이한 풀이 위암의 검출에 유용함을 생성하였다. 따라서, 정상/대조군에 대해 상이한 단계(기)에서 발현 수준을 비교하는 것으로부터의 결과는 유익한 miRNA의 보다 큰 풀을 생성하였다.
명확하게, 보다 적은 수의 miRNA가 후기 단계보다 조기 1기에서 확인되었다. AUC 값에서 최고로 순위가 매겨진 miRNA의 확인은 모든 단계에 대해 항상 동일하지는 않았다(도 8). 보다 큰 수의 miRNA가 조절되었으며(표 8 내지 11) 유사한 실체가 단계에 걸쳐 반복적으로 발견되었다(도 10). 단지 하나의 miRNA((hsa-miR-27a-5p)가 모든 4개의 단계 중에서 일반적인 것으로 밝혀졌다. 이들 명백한 miRNA(표 8-11)를 개별적으로 사용할 수 있으며 다수의 miRNA의 전체적인 결과는, 암의 단계가 표시 시점에서 알려지지 않은 임상 세팅에서 위암의 진단에 유용할 수 있다.
상기 연구로부터, 각각의 단계 특이적인 miRNA 목록으로부터 적어도 하나의 miRNA로 이루어진 바이오마커 패널은 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하기 위한 대안적 방법을 제공할 수 있었다.
III, 다변량 바이오마커 패널에 대한 조사
다변량 패널을 조립하기 위한 중요한 기준은 암의 각각의 단계에 대해 특이적인 목록으로부터 적어도 하나의 miRNA를 포함시켜 모든 암 소그룹이 포함되도록 하는 것이다. 그러나, 4 단계의 암을 정의하는 miRNA는 동일한 miRNA가 이들 사이에서 유사하게 발견되었기 때문에 전체적으로 명백하지 않았다(도 9). 동시에, 큰 수의 암 관련되거나 관련되지 않은 miRNA가 양으로 관련된 것으로 밝혀졌으며(도 6, 7) 이는 위암 진단 도전을 위한 가장 우수한 miRNA 조합을 선택하도록 한다.
업무의 복잡성의 측면에서, 본 연구는 서열 상향 플로팅 조사 알고리즘(sequence forward floating search algorithm)을 사용하여 최대 AUC를 지닌 miRNA의 패널을 확인하여야 하는 것으로 결정되었다. 당해 분야의 선형 지지 벡터 기계의 상태에서, 가변량의 패널의 구축을 위한 잘 활용되고 인식된 모델화 도구는 또한 당해 분야에서 사용되어 miRNA의 조합의 선택시 보조하는 것으로 알려져 있었다. 상기 모델은 각각의 구성원의 발현 수준 및 이들의 가중치에 대해 고려하여 선형 공식을 기준으로 한 점수를 수득하였다. 이들 선형 모델은 임상 실시에서 용이하게 채택되어 적용된다.
이러한 공정의 성공을 위한 중요한 요건은 고 품질 데이터의 이용능이다. 다수의 잘 정의된 임상 샘플에서 모든 검출된 miRNA의 정량적 데이터는 결과의 정밀성 및 정확성을 증진시킬 뿐 아니라 qPCR을 사용한 추가의 임상 적용을 위한 확인된 바이오마커 패널의 일관성을 보증하였다.
다수의 임상 샘플(500+)을 사용하면, 모델화시 데이터의 과-핏팅(over-fitting)의 쟁점은, 이들이 이로부터 선택된 단지 191개의 후보물 특징이므로 최소화되었다. 또한, 결과의 진실성을 보증하기 위하여, 4개의 배수 교차 확인을 다수 회 수행하여 확인 샘플의 별도의 세트(각각의 배에서 샘플의 나머지 1/4)에서 발견 세트(각각의 배에서 샘플의 3/4)를 기준으로 확인된 바이오마커 패널의 수행능을 시험하였다. 교차 확인 공정 동안, 샘플을 성별, 아형 및 단계에 대해 일치시켰다.
결과(발견 상 및 확인 상 둘 다에서 바이오마커 패널의 AUC)를 나타내는 박스플롯은 도 10에 나타내었다. 예측한 바와 같이, 각각의 조사에 대해 확인 세트를 사용하여 AUC 값에 있어서 감소되었다(0.04-0.06). 박스의 크기는 값의 확장의 지표인, 확인 상에서 데이터로 보다 크다고 해도, 차이는 ≤0.1 AUC 값이었다. 이러한 값의 확장은 분석에 포함된 다수의 바이오마커의 수가 6보다 큰 경우 휠씬 더 엄격하였다(<0.05). 이러한 관찰은, 보다 확고한 결과가 6개 이상의 miRNA로 수득되었음을 나타내었다.
상기 결과의 보다 정량적인 표시는 도 11에 나타내었으며, 여기서 AUC 값에 있어서의 증진은 분석에 포함된 다수의 바이오마커의 수가 7보다 컸던 경우 관찰되었다. 6개의 miRNA와 7개의 miRNA 바이오마커 패널 사이의 차이가 통계적으로 유의적이었지만, 이러한 증진은 AUC 값에서 단지 0.02이었다. 따라서, 6개의 miRNA 패널을 사용하는 0.855의 AUC 값은 임상 용도로 충분하다.
IV, 다변량-miRNA 바이오마커 패널의 조성
다변량 바이오마커 패널의 조성을 시험하기 위하여, 6 내지 10개의 miRNA를 함유하는 모든 패널내 miRNA의 발생을 계수하였으며, 여기서 상위 10% AUC의 패널 및 하위 10% AUC 패널은 배제하였다. 상위 10% 및 하위 10% AUC의 배제를 수행하여 교차-검증 분석에서 무작위화 과정에 의해 생성된 소집단으로부터의 부정확성의 핏팅으로 인해 거짓으로 발견된 바이오마커가 계수되는 것을 피하였다. 수 4 미만인 이들 miRNA를 배제시키고, 총 55개의 miRNA를 발견 공정에서 선택하였으며(표 12), 여기서 이들 중 43개의 발현이 또한 암에서 유의적으로 변경된 것으로 밝혀졌다. 다른 12개의 포함은, 암에서 변경되지 않았지만, AUC 값을 유의적으로 증진시키는 것으로 밝혀졌다. 모든 miRNA 표적의 직접적이고 정량적인 측정없이, 이들 miRNA는 고속 대량 스크리닝 방법(미세배열, 서열분석)에서 선택되지 않을 수 있었으며 qPCR 확인을 위해 배제될 수 있었다. 이들 miRNA는 상위 2개의 miRNA(hsa-miR-532-5p, hsa-miR-30e-5p)가 패널의 57.8% 및 48.4%에서 일관되게 발견되었으므로 무작위로 선택되지 않았다.
[표 12]
Figure 112017012869895-pct00041
Figure 112017012869895-pct00042
다변량 패널을 형성하기 위해 선택된 miRNA(표 12)는 다양한 단계의 암을 검출하는데 있어서 가변성을 나타내었다(표 8-11). 20% 초과의 발생율로 목록에서 상위 10개의 빈번하게 선택된 miRNA의 경우, 이들 중 3개만이 암의 2개 이상의 상이한 단계에서 일반적으로 조절된 반면(hsa-miR-21-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-142-5p) 나머지의 경우, hsa-miR-103a-3p는 1기에 대해서만 유의적이었고, hsa-miR-181a-5p는 4기에 대해서만 유의적이었으며, hsa-miR-26a-5p는 1 및 4기에 대해서 유의적이었고 hsa-miR-20a-5p 및 hsa-miR-17-5p는 2 및 4기에 대해서 유의적이었고 hsa-miR-616-5p 및 hsa-miR-30a-5p는 3 및 4기에 대해서 유의적이었다. 다수의 miRNA가 3개의 다른 단계에 대한 목록과 오버랩되었던, 4기를 제외하고(도 9), 1 내지 3기 각각에 대한 2개의 특이적인 miRNA가 빈번하게 선택되었다.
가변량 패널에 대해 선택된 miRNA 및 진단 마커로서 단일의 miRNA의 실체와 비교하는 경우, 이들은 필수적으로 동일하지 않았다. 예를 들면, 모든 암에 대해 상위 상향-조절된(hsa-miR-532-5p) 및 하향-조절된(hsa-miR-30e-5p) miRNA(도 5)는 상기 목록에 포함되지 않았다. 따라서, 다양한 단계에 대해 확인된 가장 우수한 바이오마커를 단순히 결합시켜 최적의 바이오마커 패널을 형성하는 것보다는 가장 우수한 결과를 제공하는 상보성 정보를 제공하는 마커의 패널을 형성하는 것이 가능하였다.
흥미롭게도, 5개의 miRNA가 다변량 패널에 대해 흔히 선택되었다(>48% 유병률, 표 12 참고). 이들 중 3개가 암 특이적이었고(hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103a-3p 및 hsa-miR-20a-5p) 2개는 다른 그룹으로부터의 것이었다(유의적이지 않은 그룹; hsa-miR-532-5p 및 hsa-miR-30e-5p). 모든 다변량 패널(표 13)에서 이들 5개의 miRNA의 동시-출현을 분석하여 상기 패널 중 85.9%가 hsa-miR-532-5p 또는 hsa-miR-30e-5p를 가졌음이 밝혀졌다. 따라서, 이들 2개의 miRNA 중 하나를 사용하는 것은 다변량 지수 패널에서 AUC 값을 증가시키는데 충분히 유용할 수 있다.
전체적으로, miRNA 바이오마커 패널의 93.8%는 각각의 그룹으로부터 적어도 하나의 miRNA를 가졌다. 따라서, 일 예에서, 위암을 지닌 대상체의 가능성을 측정하기 위한 다변량 방법은 이들 2개의 빈번하게 선택된 miRNA 그룹 각각으로부터 적어도 하나의 miRNA를 포함할 수 있다.
[표 13]
Figure 112017012869895-pct00043
암 위험 점수의 계산
MiRNA를 결합하여 바이오마커 패널을 형성시킴으로써 암 위험 점수를 계산할 수 있다(식 1). 예를 들면, >20% 유병률을 사용한 다변량 바이오마커 패널 확인 공정에서 빈번하게 선택된 12개의 miRNA를 합하여 바이오마커 패널을 형성시킴으로써 암 위험 점수를 계산하였다. 본원의 수학식은 위암 위험 예측을 위한 선형 모델의 용도를 입증하며, 여기서 암 위험 점수(각각의 대상체에 대해 독특함)는 위암을 지닌 대상체의 가능성을 나타낸다. 이는 12개의 miRNA 및 50의 상수에 대해 칭량된 측정을 요약하여 계산된다.
[수학식 1]
Figure 112017012869895-pct00044
Figure 112017012869895-pct00045
- 12개의 개개의 miRNA의 log 전환된 카피 수(카피/혈청의 ml).
Figure 112017012869895-pct00046
- 표 21에서 발견될 수 있는 다수의 miRNA 표적을 칭량하는데 사용된 계수.
Figure 112017012869895-pct00047
의 값은 지지체 벡터 기계 방법으로 최적화하고 0 내지 100의 범위로 규모화하였다. 0보다 낮은 암 위험 점수를 지닌 대상체는 0으로 고려될 것이고 100보다 높은 암 위험 점수를 지닌 대상체는 100으로 고려될 것이다.
[표 21]
Figure 112017012869895-pct00048
당해 연구에서 대조군 및 암 대상체는 수학식을 기준으로 계산된 상이한 암 위험 점수를 갖는다(도 15a). 대조군 및 암 대상체에 대한 암 위험 점수의 핏팅된 가능성 분포는 도 15b에서 찾을 수 있으며, 여기서 2개의 그룹 사이의 명확한 분리가 발견될 수 있다. 당해 연구에서, 대조군 대상체는 위암을 가지는 0.0067의 가능성을 갖는 고 위험 집단으로부터 선택된 비-암 대상체였다. 이러한 선행의 가능성 및 도 15b에서 핏팅된 가능성 분포를 기준으로 하여, 암을 지닌 알려지지 않은 대상체의 가능성(위험)을 이들의 암 위험 점수 값을 기준으로 계산할 수 있다(도 15c). 보다 높은 점수를 갖는 경우, 대상체는 위암을 지닐 위험이 더 높다. 또한, 암 위험 점수는 고 위험 집단에서 암 발생율과 비교하여 위암을 지닌 알려지지 않은 대상체의 가능성(위험)의 배수 변화를 말해줄 수 있다(도 15d). 예를 들면, 암 위험 점수가 70인 알려지지 않은 고 위험 대상체는 고 위험 잡단의 평균 위험보다 약 22배 더 높은 위암을 가질 가능성이 14.6%일 것이다.
40 및 70에서 2개의 한계 값을 추가로 적용하여, 대상체를 암 위험 점수 도 15c, d를 기준으로 3개의 범주로 정의할 수 있다. 암 위험 점수 범위가 0 내지 40인 대상체는 0.052%의 위암을 가질 기회를 가지는 저 암 위험 그룹에 속하며 이는 고 위험 집단에서 평균 암 발생율보다 13배 더 낮다. 암 위험 점수 범위가 40 내지 70의 범위인 대상체는 1.4%의 위암을 가질 기회를 가지는 중간 암 위험 그룹에 속하며 이는 고 위험 집단에서 평균 암 발생율보다 2배 더 높다. 암 위험 점수 범위가 70 내지 100인 대상체는 12.2%의 위암을 가질 기회를 갖는 고 암 위험 그룹에 속하며 이는 고 위험 집단의 평균 암 발생율보다 18배 더 높다.
SEQUENCE LISTING <110> AGENCY FOR SCIENCE, TECHNOLOGY AND RESEARCH NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL (SINGAPORE) PTE LTD <120> MICRORNA BIOMARKER FOR THE DIAGNOSIS OF GASTRIC CANCER <130> IPA170103-SG <150> SG10201404742W <151> 2014-08-07 <160> 191 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 cacccguaga accgaccuug cg 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aucacauugc cagggauuac c 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 uaccacaggg uagaaccacg g 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 5 uacaguacug ugauaacuga a 21 <210> 6 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 6 agcagcauug uacagggcua uca 23 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 7 cagugcaaug augaaagggc au 22 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 8 aauaauacau gguugaucuu u 21 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Homo 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Homo sapiens <400> 21 uucuggaauu cugugugagg ga 22 <210> 22 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 22 uaaugccccu aaaaauccuu au 22 <210> 23 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 uaauccuugc uaccugggug aga 23 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 uauugcacau uacuaaguug ca 22 <210> 25 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 uuauaaagca augagacuga uu 22 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 auauaauaca accugcuaag ug 22 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 uucacagugg cuaaguuccg c 21 <210> 28 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 gugagucucu aagaaaagag ga 22 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 ggagaaauua uccuuggugu gu 22 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 aggggugcua ucugugauug a 21 <210> 31 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 ucaggcucag uccccucccg au 22 <210> 32 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 uaacagucua cagccauggu cg 22 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 ugguagacua uggaacguag g 21 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 acaggugagg uucuugggag cc 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 uagcaccauc ugaaaucggu ua 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 aauugcacgg uauccaucug ua 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 aucauagagg aaaauccaug uu 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 ugagaaccac gucugcucug ag 22 <210> 39 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 ucuuggagua ggucauuggg ugg 23 <210> 40 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 ucccaccgcu gccaccc 17 <210> 41 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 43 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 caaagugcug uucgugcagg uag 23 <210> 44 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 45 <211> 23 <212> 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<210> 151 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 151 uguaaacauc cuugacugga ag 22 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 152 agugccugag ggaguaagag ccc 23 <210> 153 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 153 aaugacacga ucacucccgu uga 23 <210> 154 <211> 17 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 154 uggagagaaa ggcagua 17 <210> 155 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 155 caugccuuga guguaggacc gu 22 <210> 156 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 156 ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23 <210> 157 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 157 aagacgggag gaaagaaggg ag 22 <210> 158 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 158 ucaccagccc uguguucccu ag 22 <210> 159 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 159 ugucuugcag gccgucaugc a 21 <210> 160 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 160 cgcauccccu agggcauugg ugu 23 <210> 161 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 161 aaucguacag ggucauccac uu 22 <210> 162 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 162 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 163 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 163 uuguacaugg uaggcuuuca uu 22 <210> 164 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 164 acuccauuug uuuugaugau gga 23 <210> 165 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 165 aucacauugc cagugauuac cc 22 <210> 166 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 166 uucaacgggu auuuauugag ca 22 <210> 167 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 167 ugaggggcag agagcgagac uuu 23 <210> 168 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 168 aaagcugggu ugagaagg 18 <210> 169 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 169 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 170 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 170 cacuagauug ugagcuccug ga 22 <210> 171 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 171 uagcaccauu ugaaaucggu ua 22 <210> 172 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 172 ccucugggcc cuuccuccag 20 <210> 173 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 173 aagccugccc ggcuccucgg g 21 <210> 174 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 174 uccauuacac uacccugccu cu 22 <210> 175 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 175 ugagaacuga auuccauagg cu 22 <210> 176 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 176 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 177 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 177 gcaaagcaca cggccugcag aga 23 <210> 178 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 178 uagguuaucc guguugccuu cg 22 <210> 179 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 179 caacggaauc ccaaaagcag cug 23 <210> 180 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 180 aacuggcccu caaagucccg cu 22 <210> 181 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 181 cagugcaaug auauugucaa agc 23 <210> 182 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 182 cuuucagucg gauguuuaca gc 22 <210> 183 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 183 aaaagcuggg uugagagggc ga 22 <210> 184 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 184 acaguagucu gcacauuggu ua 22 <210> 185 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 185 aaugcaccug ggcaaggauu ca 22 <210> 186 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 186 uuuugcgaug uguuccuaau au 22 <210> 187 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 187 aaacaaacau ggugcacuuc uu 22 <210> 188 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 188 ucguaccgug aguaauaaug cg 22 <210> 189 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 189 uagcagcaca ucaugguuua ca 22 <210> 190 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 190 ucccuguccu ccaggagcuc acg 23 <210> 191 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 191 gaacggcuuc auacaggagu u 21

Claims (23)

  1. 대상체에서 위암을 검출 또는 진단하거나 대상체가 위암을 가질 가능성을 결정하기 위한 정보를 제공하기 위한 방법으로서, 방법은
    i) 대상체로부터 수득된 혈청 또는 혈장 샘플 중에서, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-616-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-532-5p 및 hsa-miR-30e-5p로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 6개의 microRNA (miRNA)의 발현 수준을 결정하는 단계로, 적어도 6개의 miRNA 중 적어도 하나가 hsa-miR-103a-3p인 단계, 및
    ii) 대조군과 비교하여, 샘플 내 miRNA의 차등적 발현을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대조군이 위암이 없는 대상체로부터 얻어진 샘플인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 miRNA는 다음의 모두인, 방법: hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-616-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-532-5p 및 hsa-miR-30e-5p.
  4. 대상체에서 위암을 검출 또는 진단하거나 대상체가 위암을 가질 가능성을 결정하기 위한 키트로서, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-616-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-532-5p 및 hsa-miR-30e-5p로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 6개의 microRNA (miRNA)와 혼성화할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 포함하고, 적어도 6개의 miRNA 중 적어도 하나가 hsa-miR-103a-3p인, 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 miRNA는 다음의 모두인, 키트: hsa-miR-21-5p, hsa-miR-103a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-26a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-616-5p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-532-5p 및 hsa-miR-30e-5p.
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