KR102288359B1 - 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험 예측용 다중 유전자 마커 및 이를 이용한 질병의 발병 위험 예측 방법 - Google Patents

면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험 예측용 다중 유전자 마커 및 이를 이용한 질병의 발병 위험 예측 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 여러 종류의 암을 포함하는 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험을 예측하기 위한 다중 유전자 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 다중 유전자 마커 조성물 및 상기 다중 유전자 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 조성물 등을 제공함으로써, 질병의 예방 및 관리에 매우 효과적으로 활용될 수 있다.

Description

면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험 예측용 다중 유전자 마커 및 이를 이용한 질병의 발병 위험 예측 방법 {Multi-Genetic Marker for Predicting Risk of Disease by Reduced Immunity and Methods of Predicting Risk of Disease Using the Same}
본 발명은 면역력 저하 또는 노화에 따른 질병의 발병에 대한 증가된 위험을 예측하는 것에 관한 것이다.
우리 몸은 질병에 대한 방어 기작으로서 면역 시스템을 가지고 있으며, 이의 핵심은 자신(self)과 비자신(non-self)을 정확히 식별해서 이물질을 제거하는 것이다. 이러한 면역 시스템은 단순히 우리 몸의 파수꾼 역할만 하는 것이 아니라 체내 세포를 건강하게 유지하고, 신진대사를 활발하게 하여 신체의 기능 저하 및 세포 조직의 노화를 막아주는 역할 또한 수행한다. 즉, 면역 체계가 건강하면 스트레스에도 강해지고 질병도 걸리지 않는다.
면역의 종류를 구분하자면 크게 '선천 면역'과 '획득(후천) 면역'으로 나눌 수 있다. 선천 면역은 말 그대로 선천적으로 가지고 있는 면역으로서 세균이나 암 세포와 같은 비정상적인 이물질을 공격하여 제거하는 면역 시스템이다. NK 세포(Natural killer cell)라 불리는 면역세포가 선천 면역의 대표적인 면역세포이다. 획득 면역은 선천 면역의 다음 면역 시스템으로 특별한 이물질을 인식하고 제거하는 면역이며, 선천 면역이 무작위적인 이물질 제거라면(non-specific immune response) 획득 면역은 항원이라는 특별한 이물의 획득을 통해 인식력을 기른 후 이물을 제거하는(specific immune response) 면역이라 할 수 있다.
다양한 면역 반응 가운데, 염증 반응(inflammation)은 비특이적 면역 반응의 일종으로, 만성 염증은 신체 이상을 부추기며 다양한 질병의 원인이 된다. 이러한 질병의 예로는 암, 자가면역질환, 대사성질환, 노화 등이 있으며, 이들은 염증반응과 깊은 관련성이 있다. 염증이 오랫동안 지속되는 만성 염증은, 암을 비롯한 다양한 질병을 야기시킬 가능성이 높으며, 염증 반응이 초기에 제어되지 못하면 생체 내부의 기능 손실 및 항상성 불균형에 의해 만성 감염과 자가면역질환, 대사성질환 등으로 발전될 수 있다. 특히, 만성 염증부위에서 종양이 발생한다는 사실이 19세기에 제기된 이후, 만성 염증이 암 발생률을 증가시킨다는 최근의 연구결과들은 염증과 암은 악순환의 연결고리를 통하여 공통된 신호전달이 이루어지는 것으로 알려져 있으며, 염증반응은 암의 발생(initiation), 악성으로의 전환(progression), 침윤(invasion), 전이(metastasis) 등 여러 단계로 이루어진 종양의 진행 과정에 있어서 매우 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.
면역학적 관점에서 바라본다면 질병은 면역 시스템 항상성의 불균형에 의해 나타나는 결과물로, 면역 시스템이 저하되는 경우 다양한 질병을 유발하게 된다. 구체적으로, 면역 시스템이 억제되면 전염성 질병이나 암에 대한 감수성이 증가하게 되며, 면역 시스템의 과잉 반응은 알레르기나 자가면역질환을 일으킬 수 있다. 따라서, 균형 있는 면역 활성화는 건강의 기본이자 필수적인 조건이며 개인의 면역 활성화 정도는 질병 발생 가능성의 지표가 될 수 있다.
한편, 암 세포는 사람의 몸에서 매일 수 백 내지 수 천 개가 발생되고 있다. 1 개의 암세포가 1cm의 크기(약 10억 개의 암 세포)가 되는데는 약 10년 걸린다. 이 때, 암세포의 증식이나 전이를 억제하는 대표적인 면역세포로 T 세포와 NK 세포가 있으며, T 세포는 암세포를 공격, 파괴하는 면역 반응의 중심적인 역할을, NK 세포는 림프계의 세포로서 몸 속에서 발생한 이상 세포를 직접 공격, 파괴하는 역할을 한다. 즉, 암은 이러한 면역 작용(면역 활성도)이 저하되는 경우 발생하는 것이다. 이와 비교하여 대식세포(macrophage; Mq)의 경우 종양미세환경에서 가장 풍부한 정상 세포로 암의 생성 및 진행을 촉진시키는 역할을 한다고 알려져 있다.
즉, 다양한 면역세포(T 세포, NK 세포, 대식 세포)의 상호 작용에 대한 종합적인 분석을 기반으로 하는 면역 활성도 분석은 정확한 질병 발생 가능성의 지표가 될 수 있다.
Gonzalez H, Hagerling C, Werb Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes Dev. 2018;32(19-20):1267-1284. doi:10.1101/gad.314617.118
본 발명자들은 면역 반응, 특히 사이토카인(cytokine)의 발현을 조절하는데 관여하는 miRNA를 선별하고, 상기 miRNA의 발현 수준이 증가 또는 감소하는 경우 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험이 증가된다는 사실을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 다중 유전자 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 피검체의 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 다중 유전자 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제제는 하나 이상의 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 피검체의 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측 방법 또는 위험을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 miRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(d) 상기 miRNA 중 적어도 하나 이상의 발현 수준에 변화가 있는 경우 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험도가 증가된 것으로 예측하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시료는 피검체로부터 유래한 혈액, 혈청, 혈장, 타액(saliva), 생검(biopsy), 종양 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 miRNA의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅 또는 유전자 칩을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 면역력 감소에 의한 질병은 암, 자가면역질환, 대사성 질환 및 감염성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 식도암, 대장암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 유방암, 전립선암, 방광암, 갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 피부암, 혈액암, 림프종, 신경교종, 결장암 및 골육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 다중 유전자 마커를 이용하면, 면역에 관여하는 다양한 종류의 면역세포 활성 변화를 감지할 수 있고, 따라서 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험을 예측할 수 있다. 따라서, 본 발명은 질병의 예방 및 관리에 매우 효과적으로 활용될 수 있으며, 이는 개인뿐만 아니라 국가적 차원에서 의료비 절감에 매우 큰 기여를 할 것으로 기대된다.
도 1은 정상인과 6대 암 환자의 검체를 대상으로 본 발명에 따른 다중 유전자 마커의 상대적 발현을 비교한 도이다. (BC, 유방암; CC, 대장암; HCC, 간암; PC, 전립선암; LC, 폐암; SC, 위암)
도 2a는 정상인과 1기 및 2기 암 환자의 검체를 대상으로 본 발명에 따른 다중 유전자 마커의 상대적 발현을 비교한 도이다.
도 2b는 정상인과 6대 암 환자의 검체를 대상으로 IFN-γ의 생산량 변화를 비교한 도이다.
도 3은 말초 혈액 단핵세포에서 면역세포의 증식을 유도한 뒤 miR-146a, miR-155 및 miR-454의 발현 변화를 비교한 도이다.
본 발명자들은 면역 반응을 조절하는데 관여하는 miRNA를 선별하고, 상기 miRNA의 발현 수준이 증가 또는 감소하는 경우 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험이 증가된다는 사실을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 면역 활성도를 측정함으로써 면역력 저하에 의한 질병의 발병 위험을 예측하기 위한 다중 유전자 마커를 선별하고, 최종 선별된 miR-146a, miR-155 및 miR-454에 대하여, 정상인과 6대 암 환자 검체를 대상으로 상기 유전자의 발현 정도를 분석한 결과 상기 3개 유전자 가운데 1개 이상의 유전자가 통계적으로 유의한 수준의 발현 변화 패턴을 나타내고 있음을 확인하였다(실시예 1 및 2 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 기존의 면역활성도 측정 방법인 IFN-γ 생산량 분석과의 비교 실험을 통해 본 발명에 따른 다중 유전자 마커의 발현 변화가 더 넓은 범위의 질병이 발생될 수 있는 위험 예측이 가능함을 증명하였다(실시예 3 참조).
뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에서는, 말초 혈액 단핵세포의 면역반응 유도 실험을 통해 다중 유전자 마커 miR-146a, miR-155 및 miR-454는 면역 반응 조절과 직접적인 관련이 있는 조절자임을 확인하였으며, 따라서 상기 다중 유전자 마커의 발현 변화를 측정함으로써 향후 질병이 발생될 증가된 위험을 예측할 수 있다는 것을 증명하였다(실시예 4 참조).
따라서, 본 발명은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 다중 유전자 마커 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어, “miR-146a”는 성숙한 서열(Mature sequence)의 hsa-miR-146a-5p (miR base Accession number: MIMAT0000449) 를 의미하며, 하기의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
hsa-miR-146a-5p, UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU (서열번호 1)
본 발명에서 사용된 용어, “miR-155”는 성숙한 서열의 hsa-miR-155-5p (miR base Accession number: MIMAT0000646) 를 의미하며, 하기의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
hsa-miR-155-5p, UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGUU (서열번호 2)
본 발명에서 사용된 용어, “miR-454”는 성숙한 서열의 hsa-miR-454-3p (miR base Accession number: MIMAT0003885) 를 의미하며, 하기의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
hsa-miR-454-3p, UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU (서열번호 3)
본 발명에서 사용된 용어, “발병 위험”은 면역력 감소에 의한 질병이 발병할 수 있는 상대적인 위험일 수 있다. 예를 들면, 상기 위험은 발병의 확률이 건강한 정상인 군에 비하여 증가되어 있는지, 또는 감소되어 있는지를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 하나 이상의 상기 miRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 상기 miRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 목적이라면 그 형태에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화등으로 변형시킬 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 RNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 피검체의 면역력 감소에 의한 질병의 발병에 대한 증가된 위험 예측 방법 또는 위험을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
(b) 상기 시료로부터 miR-146a, miR-155 및 miR-454로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
(c) 상기 miRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
(d) 상기 miRNA 중 적어도 하나 이상의 발현 수준에 변화가 있는 경우 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험도가 증가된 것으로 예측하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 피검체는 면역력 감소에 의한 질병의 발병 위험을 예측하고자 하는 동물, 바람직하게는 포유류, 예를 들어, 인간, 마우스, 쥐, 소, 양, 개, 고양이, 원숭이, 유인원 등이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 시료는 피검체로부터 자연적으로 분리되거나 인위적으로 분리한 것일 수 있고, 그 예로 혈액, 혈청, 혈장, 타액(saliva), 생검(biopsy), 종양 조직, 액체 배양물, 분변, 소변 등일 수 있으며, 바람직하게는 혈장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 시료는 공지의 방법에 따라 피검체에서 적절하게 채취될 수 있으며, 검출 방법에 따라 필요한 전처리 과정을 거칠 수 있다. 또한, 시료를 피검체로부터 채취하는 시점은 질병의 발병 전 또는 발병 후일 수 있으나, 바람직하게는 발병 전 시료를 채취하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅 또는 유전자 칩을 이용하여 측정할 수 있으나, miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 것이라면 상기 열거한 방법으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 면역력 감소에 의한 질병은 암, 자가면역질환, 대사성 질환, 감염성 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 간암, 위암, 식도암, 대장암, 췌장암, 담낭암, 담도암, 유방암, 전립선암, 방광암, 갑상선암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 피부암, 혈액암, 림프종, 신경교종, 결장암, 골육종 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 대사성 질환은 당뇨병, 저혈당, 고콜레스테롤혈증, 혈색소증, 유전분증, 포르피린증 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스 또는 병원균의 감염에 의해 발생하는 질환으로, 호흡기 및 혈액, 피부접촉 등을 통해 전염되어 감염될 수 있는 질환을 모두 포함하는 개념이다. 이러한 감염성 질환의 비제한적인 예로서는 B형 및 C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 인플루엔자 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험예 1: 정상인과 암 환자 검체 분양 및 준비
본 연구는 한국인체자원은행 사업의 일원인 충북대학교병원 인체자원은행에서 제공한 인체 자원과 데이터를 이용하여 수행되었다. 먼저, 질병관리본부 인체자원은행에서 분양 받은 암환자 샘플(혈장; plasma)을 200ul씩 분주하여 -80℃에 보관하였다. 모든 샘플은 동일하게 1 번의 냉동(freezing)과 해동(thawing)을 거치는 것을 원칙으로 하여 분석에 사용하였다.
실험예 2: 유전자 발현 분석
1.1. 엑소좀 내의 RNA 추출
정상인과 암 환자 혈장에서 엑소좀 내의 RNA를 추출은 시약(㈜제놀루션, 대한민국)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 혈장에서 엑소좀 내 RNA의 추출은 혈장 내 엑소좀을 분해(lysis)시킨 후 엑소좀에서 흘러나온 단백질, DNA, RNA(mRNA, miRNA, rRNA 등)에서 RNA만을 분리하였다. 이 때, 단백질과 DNA가 오염되지 않도록 최적화하여 순도를 높이고 RNAs 추출 농도(RNA prep yield)를 극대화 할 수 있는 추출 과정(protocol)을 확립하였다.
1.2. 엑소좀으로부터 추출한 RNA 정량
혈장에서 추출한 엑소좀 내 RNA 농도를 정량하기 위해 나노드롭(nano-drop, 260nm 파장에서의 흡광도)을 사용하여 농도를 측정하였다. 260/280 ratio와 260/230 ratio를 통해 RNA 순도 및 오염도를 확인하여 정상 범위 내에 속하는 RNA를 실험에 사용하였다.
1.3. qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)
혈장에서 추출한 exo RNA 10ng을 템플릿(template)으로 하여 two-step qRT-PCR을 진행하였다. PCR 장비는 StepOne plus(ABI, 미국)를 사용하였으며, 모든 샘플은 결과의 신뢰도를 높이기 위해 duplicate으로 진행하였다.
실험예 3: IFN-γ 농도의 측정
검체의 혈장 내 IFN-γ 농도는 인간 IFN-γ면역측정(Immunoassay) 키트(R&D, 미국)를 이용하여 측정하였다. 먼저, 포획 항체(Capture antibody)가 코팅된 플레이트를 샘플 항원과 특이적 결합을 위해 다른 표면을 블로킹(blocking) 하였다. 이어서, 항원(antigen)이 존재하는 샘플을 처리한 후, 비오틴(Biotin)으로 표지된 검출 항체(Detection antibody)를 결합시켰다. 그 후 HRP(Horseradish peroxidase)가 컨주게이션 된 아비딘(Avidin) 또는 스트렙트아비딘(streptavidin)을 처리하고, 효소와 반응하는 기질(TMB)을 처리한 다음, ELISA 리더 기기를 이용해 O.D 값을 측정하였다.
실험예 4: 혈액에서 말초 혈액 단핵세포(Peripheral Blood Mononuclear Cells; PBMC)의 분리 및 배양
건강한 정상인으로부터 말초 혈액을 비중 1.077 g/mL의 히스토파크(Histopaque®, Sigma, 미국)에 중첩시킨 후 400 xg에서 30분간 원심분리하여 단핵구를 분리하였다. 분리한 단핵구에 면역세포 증식유도제로서 PMA(50 ng/ml, 4.5 시간)와 이오노마이신(Ionomycin, 1 ug/ml, 4.5 시간)을 처리하여 배양 후 miRNA 발현 분석에 사용하였다.
실시예 1: 후보 유전자의 선별
본 발명자들은 면역 활성도를 측정함으로써 면역력 저하에 의한 질병의 발병 위험을 예측하기 위한 후보 유전자 마커를 선별하기 위해, 면역 활성과 관련된 miR에 초점을 맞추어 스크리닝을 진행하였다. 먼저 질병의 발생에 관여하는 대표적인 면역세포인 T 세포, NK 세포, 대식세포의 활성에 관여하는 사이토카인(Cytokine), IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6, IL-8 등의 발현 조절에 관여하는 miRNA를 스크리닝하여 후보 miRNA를 1차로 선정하였다. 사이토카인의 mRNA 발현 조절에 관여하는 miRNA는 표적 예측 데이터베이스인 microRNA.org, TargetScan을 이용하여 mRNA UTR(Untranslated region) 지역의 결합 부위를 확인하였다.
상기 과정으로부터 스크리닝된 miRNA 가운데 암 세포의 생성 및 진행에 관여하는 기능이 알려져 있는 조건의 miRNA를 2차 후보로서 6개의 유전자를 선정하였다. 상기 유전자의 선정에는 암 유발에 관여하는 onco-miR 유전자와 암 억제에 관여하는 tumor suppressor miR 유전자를 함께 고려하였다. 그 결과 miR-146a, miR-155, miR-186, miR-454, miR-301a/b 및 miR-181a가 후보 유전자로 선정되었다.
상기 2차 후보로 선정된 6개의 유전자를 건강인과 6대 암 환자의 검체를 대상으로 하여 독립적으로 3회 반복 분석한 결과, 정상인과 암환자에서 통계적으로 의미 있는 차이를 보이는 3개의 유전자 - miR-146a, miR-155 및 miR-454 - 가 최종 선정되었다. 이 때, 검체는 10명의 암 환자의 검체를 섞어서 만든 풀링(pooling) 검체를 사용하였다.
실시예 2: 정상인과 6대 암 환자 검체를 대상으로 한 다중 유전자 마커 발현 분석
면역 활성도 측정을 위해 최종 선정된 다중 유전자 마커 miR-146a, miR-155 및 miR-454에 대하여, 정상인과 6대 암 - 유방암(BC), 대장암(CC), 간암(HCC), 전립선암(PC), 폐암(LC) 및 위암(SC) - 환자 검체를 대상으로 상기 유전자의 발현 정도를 분석하였다. 이 때, 암의 발생 및 초기 단계의 변화를 중심으로 다중 유전자 마커의 임상적 유효성을 검증하고자 암 환자 검체는 1기 및 2기에 해당하는 검체를 사용하였다.
그 결과, 6 가지의 모든 암에서 3개 유전자 가운데 1개 이상의 유전자가 통계적으로 유의한 수준의 발현 변화(증가 또는 감소) 패턴을 나타내고 있음을 확인하였다(도 1). 이러한 결과는 여러 종류의 암이 발생하는 데 있어서 면역세포의 활성을 조절하는 microRNA의 발현 변화가 필수적으로 수반됨을 시사하는 것이다. 즉, 본 발명에 따른 miR-146a, miR-155 및 miR-454는 암 발생 및 초기 단계의 변화를 매우 잘 반영하는 다중 유전자 마커라고 판단된다.
실시예 3: 다중 유전자 마커의 발현과 IFN-γ 발현의 비교 분석
본 발명자들은 기존의 면역활성도 측정 방법으로서 다양한 면역세포 중 NK 세포의 활성만을 측정하는 방법인 IFN-γ 생산량 분석과 비교하여, 본 발명에 따른 다중 유전자 마커, miR-146a, miR-155 및 miR-454의 임상적 가치가 더 우수함을 증명하기 위해 동일한 암 환자의 검체를 대상으로 비교 분석 실험을 진행하였다.
그 결과, IFN-γ 생산량의 변화는 6 가지의 암 종 가운데 단 2 가지의 암 종에서만 통계적으로 유의한 수준의 차이가 나타나는 반면(도 2b), 본 발명에 따른 다중 유전자 마커는 6 가지의 모든 암 종에서 1개 이상의 유전자가 통계적으로 유의한 수준의 변화가 나타나다는 것을 확인하였다(도 2a). 상기와 같은 결과는 IFN-γ 생산량의 변화 보다 본 발명에 따른 다중 유전자 마커의 발현 변화가 더 넓은 범위의 질병이 발생될 수 있는 고위험군 선별 마커로써 더 큰 임상적 의의가 있음을 증명하는 것이다.
실시예 4: 면역세포의 억제 및 활성에 따른 다중 유전자 마커의 발현 변화 분석
질병이 없는 상태의 건강한 면역세포에서 본 발명에 따른 다중 유전자 마커, miR-146a, miR-155 및 miR-454의 발현 변화가 면역세포의 억제 및 활성과 연관되어 있는지 확인함으로써 본 발명이 질병의 발생 위험 예측에 유효함을 증명하고자 하였다.
이에 따라, 면역세포에서 면역세포의 억제 및 활성에 의해 본 발명에 따른 다중 유전자 마커의 발현 변화를 확인하기 위해 정상인의 혈액에서 분리한 말초 혈액 단핵세포를 대상으로 면역세포 증식 유도제(PMA+Ionomycin)를 처리하여 그 발현 변화를 분석하였다. 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 둥근 핵을 가진 말초 혈액 세포로서 림프구와 단핵구로 구성되는데 구체적으로 80~85 %가 T 세포, 10 %가 단핵구, 5 %가 B 세포로 구성된다. 따라서 다양한 면역세포에서의 miRNA 발현 변화를 관찰하는데 매우 적합하다고 판단되었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 T 세포의 IFN-γ의 생산 조절에 관여하는 miR-155의 발현이 면역세포 증식 유도제에 의해 통계적으로 의미 있는 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 miR-155가 T 세포의 활성화와 직접적으로 관련이 있다는 점을 증명하는 것이다.
또한, 대식세포의 염증반응과 상관관계가 있는 miR-146a와 miR-454의 경우 말초 혈액 단핵구에서 증식유도제 처리에 의해 감소하는 변화를 관찰하였는데, 이러한 결과 또한 miR-146a 및 miR-454가 면역 반응의 음성적 조절자로서 직접 관여하고 있음을 증명하는 것이다.
상기와 같은 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 다중 유전자 마커 miR-146a, miR-155 및 miR-454는 면역 조절과 직접적인 관련이 있는 조절자로 볼 수 있으며, 따라서 상기 다중 유전자 마커의 발현 변화를 측정함으로써 향후 질병이 발생될 증가된 위험을 예측할 수 있는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (13)

  1. miR-146a, miR-155 및 miR-454를 포함하는, 간암, 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 폐암을 모두 포함하는 6가지 암의 증가된 발병 위험을 동시에 예측하기 위한 다중 유전자 마커 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. miR-146a, miR-155 및 miR-454의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 간암, 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 폐암을 모두 포함하는 6가지 암의 증가된 발병 위험을 동시에 예측하기 위한 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제제는 상기 miR-146a, miR-155 및 miR-454에 각각 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제4항 또는 제5항에 따른 조성물을 포함하는, 간암, 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 폐암을 모두 포함하는 6가지 암의 증가된 발병 위험을 동시에 예측하기 위한, 키트.
  9. 하기의 단계를 포함하는, 피검체의 간암, 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 폐암을 모두 포함하는 6가지 암의 증가된 발병 위험을 동시에 예측하기 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 miR-146a, miR-155 및 miR-454의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 miRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA의 발현 수준과 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 miRNA 중 miR-146a 및 miR-454; 또는 miR-155 및 miR-454; 또는 miR-146a, miR-155 및 miR-454의 발현 수준에 변화가 감지되는 경우, 간암, 대장암, 위암, 유방암, 전립선암 및 폐암을 모두 포함하는 6가지 암의 발병 위험이 증가된 것으로 예측하는 단계.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 시료는 피검체로부터 유래한 혈액, 혈청, 혈장, 타액(saliva), 생검(biopsy), 종양 조직, 액체 배양물, 분변 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 miRNA의 발현 수준은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅 또는 유전자 칩을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
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