WO2017026691A1 - 비만의 진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2017026691A1
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최명숙
정운주
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경북대학교 산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a composition for diagnosing obesity and its use, and more particularly, to a composition for diagnosing obesity, a method for diagnosing obesity, and a method for treating obesity, including an agent for measuring the mRNA or protein level of a gene whose expression is changed in obese people compared to normal people A method for screening materials.
  • Obesity occurs when the body has excessive fat tissue, and the calorie consumed by various causes such as mental and social factors, heredity, disease, and drugs is higher than the calories consumed.
  • WHO World Health Organization
  • the world's overweight adult population is estimated at 1.6 billion people worldwide and 400 million people who are obese, with 2.6 million people reportedly dying from obesity and overweight each year.
  • the adult obesity rate is steadily increasing, and as of 2010, it was 30.8% (male 36.3%, female 24.8%).
  • the obese population continues to increase worldwide and the burden of medical expenses is also increasing.
  • Obesity can be measured by height and weight and diagnosed by measuring the thickness of skin wrinkles using a caliper.
  • the modified broca's method and the body mass index (BMI) are used as a method of quantifying the degree of obesity.
  • Body mass index is the weight divided by the square of height. In the West, more than 30, considering the differences between races in Korea, diagnosed as over 25.
  • Obesity can be treated with diet, regular exercise, lifestyle improvements such as behavioral therapy, and medications such as appetite suppressants and fat absorption inhibitors.
  • Obesity is a chronic disease that requires long-term use when attempting medication.
  • products approved for long-term use in Korea for more than three months include sibutramine, an appetite suppressant, and orlistat, an lipase inhibitor. There is).
  • most of these obesity drugs act on the central nervous system to control the appetite, psychological drugs that may cause side effects and abuse, so use caution when using.
  • Obesity is more serious than its own risk because of the many complications that can be caused by obesity.
  • Obesity is known to increase the risk of developing metabolic syndrome such as hypertension, hyperlipidemia, diabetes, fatty liver, joint abnormalities, and cancer.
  • metabolic syndrome such as hypertension, hyperlipidemia, diabetes, fatty liver, joint abnormalities, and cancer.
  • the World Health Organization reported that people who are obese compared to those of normal weight are more than twice as likely to have high blood pressure, diabetes, dyslipidemia (2.5 times hypertension, 2 times diabetes, 2.3 times hypercholesterolemia) Hypertriglyceridemia 2.4 times).
  • excess body fat in women may cause a breakdown of sex hormones, which may lead to infertility in severe cases, and an increased risk of endometrial and breast cancer.
  • obesity can cause not only physical diseases but also mental illnesses such as social isolation, alienation, lack of confidence, and depression, the need for the prevention and treatment of obesity is very important.
  • the present inventors completed the present invention by discovering genetic markers whose expression changes specifically in obese people for the diagnosis and treatment of obesity.
  • the present invention was devised to discover genetic markers for the diagnosis of obesity and related complications, and classified into normal control group, mild obesity group and moderate obesity group according to body mass index of Korean adult males.
  • the present invention was completed by analyzing a transcript profile and discovering genes whose expression changes only in the mild obese group or genes whose expression changes in common in both obese groups.
  • the present invention is an mRNA or at least one gene selected from the group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B. It is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing obesity and a use thereof, comprising an agent for measuring protein levels.
  • Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing obesity, including measuring the level of expression of mRNA or protein of the gene.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a substance for treating obesity using the gene.
  • the present invention consists of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B It provides a composition for diagnosing obesity, comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of one or more genes selected from.
  • At least one gene selected from the group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, and RPRM may be to diagnose mild obesity.
  • At least one gene selected from the group consisting of CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B is used to diagnose mild obesity or moderate obesity. It may be.
  • the agent for measuring mRNA level may be a sense and antisense primer, or probe that complementarily binds to the mRNA of the gene.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to the protein encoded by the gene.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing obesity, comprising the composition.
  • the invention also comprises a group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B in a biological sample from a subject. It provides a method for diagnosing obesity, comprising measuring the expression level of one or more genes mRNA or protein encoded by the gene.
  • At least one gene selected from the group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, and RPRM may be to diagnose mild obesity.
  • At least one gene selected from the group consisting of CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B is used to diagnose mild obesity or moderate obesity. It may be.
  • the expression level of the mRNA is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay ( RNase protection assay (RPA), microarray, and northern blotting can be measured by one or more methods selected from the group consisting of.
  • the protein expression level is Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation) ), Flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and protein chip. It can be measured through.
  • the present invention also provides a method for screening an obesity therapeutic substance, comprising the following steps.
  • the present invention provides CCL4L1 (NCBI accession number: NT_187661.1), CPT1B (NM_152247.1), CACNA1I (NM_021096.3), CD19 (NM_001770.4), RPRM (NM_019845.2), CXCR5 (NM_032966 .1), CX3CR1 (NM_001337.3), TNFAIP3 (NM_006290.2), NLRC4 (NM_021209.3), DDIT3 (NM_004083.4), HSPA1A (NM_005345.4), BIRC3 (NM_182962.1), NFKBIA (NM_020529. 1), CACNA2D3 (NM_018398.2), APAF1 (NM_181869.1), and one or more genes selected from the group consisting of PDE4B (NM_002600.3) provide diagnostic purposes for obesity.
  • the present invention is classified into normal group, mild obese group, and moderate obese group according to the body mass index of Korean males, and by comparing and analyzing the profile of gene transcripts in peripheral blood mononuclear cells.
  • the gene whose expression is changed in the mild obesity group may be used as an important biomarker for early diagnosis and drug response diagnosis for the prevention and treatment of obesity and related complications. It may be usefully used as a biomarker for the development of targets and therapeutic materials for the prevention or treatment of related complication diseases.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a schematic experimental design for classifying Korean male volunteers according to body mass index (BMI) and discovering genes whose expression changes in peripheral blood mononuclear cells.
  • BMI body mass index
  • Figure 2 shows a step-by-step experimental process to compare the gene transcript profile by separating peripheral blood mononuclear cells from volunteers classified according to body mass index.
  • Figure 3 is a graphical representation of the number of genes in the expression changes, respectively, or in mild obesity group (Obese A) and moderate obesity group (Obese B) compared to the normal control group.
  • the present invention provides CCL4L1 (NCBI accession number: NT_187661.1), CPT1B (NM_152247.1), CACNA1I (NM_021096.3), CD19 (NM_001770.4), RPRM (NM_019845.2), CXCR5 (NM_032966.1 ), CX3CR1 (NM_001337.3), TNFAIP3 (NM_006290.2), NLRC4 (NM_021209.3), DDIT3 (NM_004083.4), HSPA1A (NM_005345.4), BIRC3 (NM_182962.1), NFKBIA (NM_020529.1) Obesity comprising an agent for measuring mRNA or protein levels of one or more genes selected from the group consisting of CACNA2D3 (NM_018398.2), APAF1 (NM_181869.1), and PDE4B (NM_002600.3) It provides a diagnostic composition.
  • the obesity refers to a state in which fat cells proliferate and differentiate due to metabolic disorders, and thus fat is accumulated in excess, and is accompanied by hypertension, diabetes, and dyslipidemia. This can lead to related complications, including metabolic syndrome.
  • obesity in the present invention means a body mass index (BMI) 25 kg / m 2 or more.
  • diagnosis in the broad sense means to determine the actual condition of the patient's disease in all aspects. The content of the judgment is the name of the disease, the etiology, the type of disease, the seriousness, the detailed mode of the condition, the presence or absence of complications, and the prognosis. Diagnosis in the present invention is to determine the onset of obesity and the level of obesity.
  • Korean adult male volunteers were classified into normal, mild obese, and moderate obese groups according to their body mass index, and RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from their blood. Gene transcript profiles were compared and analyzed. As a result, genes whose expression was changed only in the mild obesity group or in common in the mild obesity group and the moderate obesity group were found compared to the normal group (see Examples 1 and 2).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the gene whose expression is changed was analyzed through the KEGG pathway.
  • five genes whose expression was changed only in the mild obese group were identified. More specifically, the expression of CCL4L1 was decreased compared to the normal group, and the expression of CPT1B, CACNA1I, CD19, and RPRM was significantly increased.
  • 11 genes with altered expression were identified in mild and moderate obesity groups. More specifically, CX3CR1, NLRC4, HSPA1A, CACNA2D3, and APAF1 showed reduced expression compared to normal group, and CXCR5, TNFAIP3, DDIT3, The NFKBIA, BIRC3, and PDE4B genes were found to have significantly increased expression (see Example 3).
  • At least one gene selected from the group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, and RPRM may be used to diagnose only mild ratio.
  • the at least one gene selected from the group consisting of CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B may be used to diagnose mild or moderate obesity.
  • the agent for measuring the mRNA level may be, but is not limited to, sense and antisense primers or probes that bind complementarily to mRNA.
  • primer refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing and the like as a short gene sequence that is a starting point for DNA synthesis.
  • the primers can be synthesized in a conventional length of 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, or the like by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA of several to several hundred bases in length, which has been produced through enzymatic chemical separation or purification. The presence of mRNA can be confirmed by labeling radioisotopes or enzymes, and can be designed and modified by known methods.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by a gene, but is not limited thereto.
  • antibody includes immunoglobulin molecules that are immunologically reactive with specific antigens, and include both monoclonal and polyclonal antibodies.
  • antibodies include forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • Monoclonal antibodies can be prepared using methods using hybridoma cells or phage antibody library techniques, and the techniques required for the above procedures are well known in the art and can be easily carried out.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.
  • the present invention also provides a kit for diagnosing obesity comprising the composition.
  • the diagnostic kit of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
  • the kit of the present invention may be used to perform genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising.
  • the PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 .
  • the components necessary for performing electrophoresis to confirm amplification of PCR products may be further included in the kit of the present invention.
  • kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, as well as individual primer pairs specific for the marker gene, DNase, RNase inhibitors, DEPC - May include DEPC-water, sterile water, and the like. It may also include primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for carrying out the DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative gene or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the kit of the present invention may be a kit comprising the necessary elements necessary to perform an ELISA.
  • ELISA kits include antibodies specific for the marker protein and include agents that measure the protein level.
  • the ELISA kit may comprise reagents capable of detecting antibodies that have formed an “antigen-antibody complex”, such as labeled secondary antibodies, chromopores, enzymes, and substrates thereof. It may also include antibodies specific for quantitative control proteins.
  • antigen-antibody complex means a combination of a protein encoded by a gene and an antibody specific thereto.
  • the amount of antigen-antibody complex formed can be measured quantitatively through the magnitude of the signal of the detection label.
  • detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not limited thereto.
  • the invention also comprises a group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B in a biological sample from a subject. It provides a method for diagnosing obesity, comprising measuring the expression level of one or more genes mRNA or protein encoded by the gene.
  • the biological sample derived from the subject may include tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid and urine, more preferably blood, and more preferably peripheral blood mononuclear cells in blood. May be, but is not limited to this.
  • the expression level of the mRNA is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase) by conventional methods known in the art protection assay (RPA), microarray, or northern blotting, or one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase RNase protection assay
  • microarray microarray
  • northern blotting or one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the protein expression level is Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation) by conventional methods known in the art
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation immunoprecipitation
  • the term "information providing method for diagnosing obesity" used in the present invention is to provide objective basic information necessary for diagnosing obesity as a preliminary step for diagnosis and excludes the clinical judgment or findings of the doctor.
  • the invention is selected from the group consisting of CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, and PDE4B.
  • the candidate may be selected from the group consisting of compounds, microbial cultures or extracts, natural product extracts, nucleic acids, and peptides, but is not limited thereto.
  • the gene includes all of the genes whose expression changes only in the mild obese group and the genes in which the expression changes in common in the mild obesity group and the moderate obesity group through one embodiment of the present invention.
  • a test substance that increases the expression of a gene whose expression is decreased in an obese group or decreases the expression of a gene whose expression is increased in an obese group may be selected as a therapeutic agent for obesity.
  • the cell may be appropriately selected and used by those skilled in the art without any limitation as long as it is a cell capable of expressing the gene.
  • BMI body mass index
  • PBMC gene transcript analysis was performed by performing microarray using RNA extracted from PBMC of each group volunteers.
  • RNA was amplified and purified using Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion) to obtain a biotinylated cRNA.
  • 750 ng of biotinylated cRNA per volunteer (sample) was hybridized to Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChips at 58 ° C. for 16-18 hours.
  • Array signals were detected using Amersham Cy3-streptavidin (GE Healthcare), and BeadChips were scanned using an Illumina BeadArray Reader.
  • Example 1-2 In order to detect genes whose expression was changed in the obese group (Obese A and Obese B) compared to the normal control group (Normal), the method of Example 1-2 in each group of volunteers classified according to the method of Example 1-1 RNA was extracted from the PBMCs separated from each other, and microarrays were performed according to the method of Example 1-3, and then the standardized data were analyzed and analyzed.
  • the CCL4L1 gene is involved in cytokine-cytokine receptor interaction; CPT1B, a fatty acid oxidation related gene; CACNA1I, a gene related to the MAPK signaling pathway; CD19, a gene associated with PI3K-AKT signaling pathway, and RPRM, a gene associated with p53 signaling pathway, changed expression only in the Obese A group.
  • the expression of CCL4L1 was decreased compared to the normal group, while the other four genes were markedly increased compared to the normal group.
  • the genes whose expression is changed in Obese A and Obese B in common compared to the normal group are CXCR5 and CX3CR1 genes involved in cytokine-cytokine receptor interaction; TNFAIP3, NLRC4 genes involved in NOD-like receptor signaling pathways; DDIT3, a gene associated with nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD); HSPA1A, a gene associated with the estrogen signaling pathway; Cancer signaling pathway related genes, NFKBIA, BIRC3; CACNA2D3, a gene associated with the MAPK signaling pathway; APAF1, a gene associated with p53 signaling pathway, and PDE4B, a gene associated with cAMP signaling pathway.
  • CX3CR1, NLRC4, HSPA1A, CACNA2D3, and APAF1 decreased expression compared to the normal group, while the other genes significantly increased expression in both obesity groups. It was. The 11 genes were thought to be involved in the maintenance of obesity as the expression change was maintained until moderate obesity.

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Abstract

본 발명은 비만 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 정상인과 비교하여 비만인들에게서 발현이 변화된 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물, 진단을 위한 정보제공방법, 및 비만 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 경도비만군에서 발현이 변화한 유전자는 비만 및 관련 합병증의 예방 및 치료를 위한 조기진단 및 약물반응 진단에 중요한 바이오마커로써 활용될 수 있을 것이며, 이에 더하여 비만군에서 공통적으로 발현이 변화한 유전자들은 비만 및 관련 합병증 질환의 예방 또는 치료용 물질의 타겟 및 개발을 위한 바이오 마커로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

비만의 진단용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 비만 진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 정상인과 비교하여 비만인들에게서 발현이 변화된 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물, 진단방법, 및 비만 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
비만은 체내에 지방조직이 과다한 상태로 정신 및 사회적 요인, 유전, 질병, 약물 등의 다양한 원인으로 섭취하는 열량이 소비하는 열량보다 많을 경우 발생한다. 2010년 세계 보건기구(WHO)에 따르면, 과체중 성인 인구는 전 세계적으로 약 16억 명, 비만인은 약 4억 명으로 집계되었으며, 매년 260만 명이 비만과 과체중으로 사망한다고 보고되었다. 우리나라의 경우에도 보건복지부와 질병관리본부에 의한 보고에 따르면 성인 비만율은 계속적으로 증가하고 있는 추세이며, 2010년을 기준으로 30.8%(남자 36.3%, 여자 24.8%)로 나타났다. 이처럼 비만 인구는 전 세계적으로 계속 증가하고 있으며, 이에 따른 의료비 부담도 증가하고 있는 추세이다.
비만은 키와 체중을 통해 측정할 수 있고, 캘리퍼를 이용해 피부주름의 두께를 측정함으로써 진단할 수 있다. 비만의 정도를 수치화하여 진단하는 방법으로는 이상체중법(Modified Broca's method)과 체질량지수(Body mass index; BMI)가 이용되고 있다. 체질량지수는 체중을 신장의 제곱으로 나눈 것으로, 서양의 경우 30 이상, 인종간의 차이를 고려하여 우리나라의 경우에는 25 이상을 비만으로 진단한다.
비만은 식이요법, 규칙적인 운동과 더불어 행동요법과 같은 생활습관 개선, 및 식욕억제제와 지방 흡수 억제제와 같은 약물을 통해 치료할 수 있다. 비만은 만성 질환이기 때문에 약물치료를 시도하는 경우 장기간의 사용이 필요하며, 현재 국내에서 3개월 이상 장기간 사용이 허가된 제품으로는 식욕억제제인 시부트라민(sibutramine)과 지방분해효소 억제제인 올리스타트(orlistat)가 있다. 그러나 이러한 비만 약물들은 대부분 중추신경계에 작용하여 식욕을 조절하고, 부작용과 남용의 우려가 있는 향정신성의약품들이므로, 사용 시 주의가 필요하다.
비만은 그 자체의 위험성보다 비만으로 인해 유발될 수 있는 여러 합병증 때문에 그 심각성이 더욱 크게 인식되고 있다. 비만은 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 대사증후군, 지방간, 관절 이상, 및 암 발병 위험을 증가시킨다고 알려져있다. 2010년 세계보건기구에서 발표한 바에 따르면, 정상 체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상(고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배) 높게 나타났다. 상기 질환들 이외에도 여성의 경우 체지방이 과다하면 성호르몬의 균형이 깨져 심한 경우 불임증을 초래할 수 있고, 자궁내막암과 유방암의 위험성이 높아진다고 알려져있다. 더불어 비만은 신체적인 질환뿐 만 아니라 사회적 고립감이나 소외, 자신감 결여, 및 우울감과 같은 정신적 질환을 유발할 수 있으므로 비만의 예방 및 치료에 대한 필요성은 매우 중요하게 인식되고 있다.
따라서 비만과 관련 합병증을 예방하기 위해서 비만을 조기에 진단하고 관리하는 것이 매우 중요하다. 이에, 본 발명자들은 비만의 진단 및 치료를 위해 비만인들에게서 특이적으로 발현이 변화하는 유전자 마커들을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 비만과 관련 합병증의 진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 안출된 것으로, 한국 성인남성들을 대상으로 체질량지수에 따라 정상대조군, 경도비만군, 중등도비만군으로 분류한 후 이들의 말초혈액단핵세포의 전사체 프로파일을 분석하여 경도비만군에서만 발현이 변화하는 유전자 또는 두 비만군에서 공통적으로 발현이 변화하는 유전자들을 발굴함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 이용하여 비만 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, 및 RPRM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만 또는 중등도비만을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 비만 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, 및 RPRM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만 또는 중등도비만을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 비만 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현수준을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 CCL4L1(NCBI 접근(accession) 번호: NT_187661.1), CPT1B(NM_152247.1), CACNA1I(NM_021096.3), CD19(NM_001770.4), RPRM(NM_019845.2), CXCR5(NM_032966.1), CX3CR1(NM_001337.3), TNFAIP3(NM_006290.2), NLRC4(NM_021209.3), DDIT3(NM_004083.4), HSPA1A(NM_005345.4), BIRC3(NM_182962.1), NFKBIA(NM_020529.1), CACNA2D3(NM_018398.2), APAF1(NM_181869.1), 및 PDE4B(NM_002600.3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의, 비만 진단용도를 제공한다.
본 발명은 한국 남성들의 체질량지수에 따라 정상군, 경도비만군, 및 중등도비만군으로 분류하고 이들의 말초혈액단핵세포 내 유전자 전사체의 프로파일을 비교 분석함으로써 경도비만군에서만 발현이 변화하는 유전자 및 경도비만군과 중등도비만군에서 공통적으로 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하였다. 상기 경도비만군에서 발현이 변화된 유전자는 비만 및 관련 합병증의 예방 및 치료를 위한 조기진단 및 약물반응 진단에 중요한 바이오마커로써 활용될 수 있을 것이며, 이에 더하여 두 비만군에서 공통적으로 발현이 변화된 유전자들은 비만 및 관련 합병증 질환의 예방 또는 치료용 물질의 타겟 및 치료 물질 개발을 위한 바이오마커로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 한국 남성 지원자들을 체질량지수(BMI)에 따라 분류하고 말초혈액단핵세포에서 발현이 변화하는 유전자를 발굴하기 위한 개략적인 실험디자인을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 체질량지수에 따라 분류된 지원자들로부터 말초혈액단핵세포를 분리하여 유전자 전사체 프로파일을 비교 분석하는 실험과정을 단계별로 나타낸 것이다.
도 3은 정상대조군과 비교하여 경도비만군(Obese A)과 중등도비만군(Obese B)에서 각각 또는 공통적으로 발현이 변화한 유전자 개수를 그림으로 나타낸 것이다.
본 발명은 CCL4L1(NCBI 접근(accession) 번호: NT_187661.1), CPT1B(NM_152247.1), CACNA1I(NM_021096.3), CD19(NM_001770.4), RPRM(NM_019845.2), CXCR5(NM_032966.1), CX3CR1(NM_001337.3), TNFAIP3(NM_006290.2), NLRC4(NM_021209.3), DDIT3(NM_004083.4), HSPA1A(NM_005345.4), BIRC3(NM_182962.1), NFKBIA(NM_020529.1), CACNA2D3(NM_018398.2), APAF1(NM_181869.1), 및 PDE4B(NM_002600.3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 진단 대상 질병인 “비만(obesity)”은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 고혈압, 당뇨, 및 이상지질혈증 등을 동반하는 대사증후군을 포함하여 관련 합병증을 유발할 수 있다. 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다. 본 발명에서 비만은 체질량지수(BMI) 25 ㎏/m2 이상을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “진단”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 비만의 발병 여부 및 비만 수준 등을 판단하는 것이다.
본 발명의 일실시예에서는, 한국인 성인남성 지원자들을 체질량지수에 따라 정상군, 경도비만군, 및 중등도비만군으로 분류하고 이들의 혈액에서 분리한 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 RNA를 추출하여 마이크로어레이를 통해 유전자 전사체 프로파일을 비교 분석하였다. 그 결과, 정상군에 비하여 경도비만군에서만 발현이 변화하거나 또는 경도비만군과 중등도비만군에서 공통적으로 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하였다(실시예 1 및 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 발현이 변화된 유전자를 KEGG pathway를 통해 분석하였다. 그 결과, 경도비만군에서만 발현이 변화하는 5개 유전자를 발굴하였으며, 보다 구체적으로 CCL4L1은 정상군에 비해 발현이 감소하였고, CPT1B, CACNA1I, CD19, 및 RPRM은 발현이 유의하게 증가한 것을 확인하였다. 또한, 경도비만군과 중등도비만군에서 공통적으로 발현이 변화한 11개 유전자를 발굴하였으며, 보다 구체적으로 CX3CR1, NLRC4, HSPA1A, CACNA2D3, 및 APAF1은 정상군에 비해 발현이 감소하였고, CXCR5, TNFAIP3, DDIT3, NFKBIA, BIRC3, 및 PDE4B 유전자는 발현이 현저히 증가한 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
따라서 상기 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, 및 RPRM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만을 진단하는 것일 수 있다.
상기 CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만 또는 중등도비만을 진단하는 것일 수 있다.
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 단클론항체는 하이브리도마 세포를 이용한 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 상기 과정에 필요한 기술은 당업계에 잘 알려져있어 용이하게 실시할 수 있다. 다클론항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비만 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단방법을 제공한다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 혈액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액 내 말초혈액단핵세포일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비만의 진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 비만의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, RPRM, CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현수준을 비교하는 단계를 포함하는 비만 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 유전자는 본 발명의 일실시예를 통해 경도비만군에서만 발현이 변화하는 유전자 및 경도비만군과 중등도비만군에서 공통적으로 발현이 변화한 유전자를 모두 포함하며, 상기 시험물질 처리 후 유전자의 발현수준을 대조군과 비교하여 비만군에서 발현이 감소되어 있는 유전자의 발현을 증가시키거나, 비만군에서 발현이 증가되어 있는 유전자의 발현을 감소시키는 시험물질을 비만 치료 물질로 선정할 수 있다.
상기 세포는 상기 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 그 종류에 제한 없이 당업자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 준비 및 실험방법
1-1. 실험 디자인
한국인 성인 남성을 대상으로 말초혈액단핵세포의 유전자 전사체를 비교 분석함으로써 비만도에 따라 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하기 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이 지원자를 모집하여 실험을 디자인하고 진행하였다. 지원자 선정 시 암, 심장질환, 신장질환, 간질환 또는 감염질환을 앓고 있거나, 인슐린 치료, 혈당 조절, 혈중 지질 조절 또는 체중 조절용 약물을 섭취하고 있거나, 위장 수술을 받은 적이 있거나, 기능성 식품 또는 약물을 섭취하고 있는 지원자는 본 실험 대상자에서 제외되었다.
구체적으로, 20~59세 연령대의 남성 지원자들을 대상으로 1차 스크리닝을 통해 총 37명의 대상자를 선정하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 체질량지수(body mass index; BMI)를 기준으로 3그룹 즉, 체질량지수가 18.5 이상 23 미만(18.5≤BMI<23 kg/m2, n=11)인 지원자를 정상대조군(Normal), 체질량지수가 25 이상 27.5 미만(25≤BMI<27.5 kg/m2, n=14)인 지원자를 경도비만군(Obese A), 체질량지수가 27.5 이상 30 미만(27.5≤BMI<30 kg/m2, n=12)인 지원자를 중증도비만군(Obese B)으로 분류하였다.
1-2. PBMCs 분리 및 RNA 추출
상기 실시예 1-1에서 분류한 정상대조군(Normal), 경도비만군(Obese A), 및 중등도비만군(Obese B)의 지원자들 중 18명(Normal=4, Obese A=7, 및 Obese B= 7)을 무작위로 선정하고 이들로부터 혈액을 채취하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담은 후 Ficoll-Paque 시약(GE Healthcare)을 이용한 밀도구배 침전법(density gradient sedimentation)을 통해 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMCs)를 분리하였다. 이후 분리된 PBMC에 TRIzol(Invitrogen)을 처리하고 제조사의 프로토콜에 준하여 PBMC로부터 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 순도와 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 측정하였다.
1-3. 마이크로어레이(Microarray)
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 각 그룹 지원자들의 PBMC로부터 추출한 RNA를 이용하여 마이크로어레이를 실시함으로써 PBMC 유전자 전사체 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 추출된 RNA에 대하여 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion)를 사용하여 RNA를 증폭시키고 정제하여 biotinylated cRNA를 얻었다. 지원자(샘플) 당 biotinylated cRNA 750 ng을 58℃에서 16-18시간 동안 Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChips에 혼성화시켰다. Amersham Cy3-스트렙타비딘(GE Healthcare)을 사용하여 어레이 시그널을 검출하였고, BeadChips은 Illumina BeadArray Reader를 사용하여 스캔하였다. 이후 Illumina BeadStudio software를 사용하여 raw data를 얻었으며, 표준화(normalization) 과정을 거친 후 단순선형회귀분석법을 이용하여 PBMC에서 유의하게 발현이 변화된 유전자(a false-discovery rate of <5%, p value of <0.05, 및 fold change of >1.3)를 추출하였다. 정상대조군에 비하여 비만군에서 유의하게 발현이 변화된 유전자들을 대상으로 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathways를 이용하여 유전자 사이의 상호관계를 확인하였으며, 상기 분석과정을 차례로 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 비만군에서 발현이 변화된 유전자 확인
정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese A 및 Obese B)에서 발현이 변화한 유전자를 검출하기 위하여, 실시예 1-1의 방법에 따라 분류된 각 그룹의 지원자에서 실시예 1-2의 방법으로 PBMC를 분리하여 이로부터 RNA를 추출하고, 실시예 1-3의 방법에 따라 마이크로어레이를 수행한 후 도출된 데이터를 표준화하고 분석하였다.
분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, normal군에 비하여 Obese A와 Obese B군에서 각각 84, 342개 유전자의 발현이 증가하였고, 각각 55, 533개 유전자의 발현이 감소한 것을 확인하였다. 이중 74개의 유전자가 Obese A와 Obese B군에서 공통적으로 발현이 변화하였으며, 각각 36개의 유전자에서 발현이 증가하였고, 38개 유전자의 발현이 감소한 것을 알 수 있었다.
상기 결과를 바탕으로, KEGG pathway를 이용하여 Obese A군에서만 발현이 변화된 유전자 전사체, 및 Obese A와 Obese B에서 공통으로 발현이 변화된 유전자 전사체 프로파일들을 각각 분석하였다.
실시예 3. 비만군에서 발현이 변화된 유전자 발굴
3-1. Obese A군에서만 발현이 변화된 유전자 발굴
실시예 2의 결과를 바탕으로 정상대조군(Normal)에 비하여 경도비만군(Obese A)에서만 발현이 변화된 유전자들을 분석하여 하기 표 1에 나타내었다.
KEGG pathway 발현이 증가된 유전자 발현이 감소된 유전자
Cytokine-cytokine receptor interaction CCL4L1
NOD-like receptor pathway
NAFLD
Fatty acid metabolism CPT1B
Estrogen signaling pathway
Cancer pathway
MAPK signaling pathway CACNA1I
PI3K-AKT signaling pathway CD19
p53 signaling pathway RPRM
cAMP signaling pathway
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용(cytokine-cytokine receptor interaction)에 관여하는 CCL4L1 유전자; 지방산 산화 관련 유전자인 CPT1B; MAPK 신호전달 경로 관련 유전자인 CACNA1I; PI3K-AKT 신호전달 경로 관련 유전자인 CD19, 및 p53 신호전달 경로 관련 유전자인 RPRM이 Obese A군에서만 발현이 변화하였다. 이중 CCL4L1은 Normal군에 비하여 발현이 감소된 반면, 나머지 4개 유전자들은 Normal군에 비해 발현이 현저히 증가되었다.
3-2. Obese A와 Obese B군에서 공통적으로 발현이 변화된 유전자 발굴
실시예 2의 결과를 바탕으로 정상대조군(Normal)군에 비하여 경도비만군(Obese A)과 중등도비만군(Obese B)군에서 공통적으로 발현이 변화된 유전자들을 분석하여 하기 표 2에 나타내었다.
KEGG pathway 발현이 증가된 유전자 발현이 감소된 유전자
Cytokine-cytokine receptor interaction CXCR5 CX3CR1
NOD-like receptor pathway TNFAIP3 NLRC4
NAFLD(nonalcoholic fatty liver disease) DDIT3
Fatty acid metabolism
Estrogen signaling pathway HSPA1A
Cancer pathway NFKBIA, BIRC3
MAPK signaling pathway CACNA2D3
PI3K-AKT signaling pathway
p53 signaling pathway APAF1
cAMP signaling pathway PDE4B
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, Normal군에 비해 Obese A와 Obese B에서 공통적으로 발현이 변화된 유전자로는 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용(cytokine-cytokine receptor interaction)에 관여하는 CXCR5와 CX3CR1 유전자; NOD-like 수용체 신호전달 경로에 관여하는 TNFAIP3, NLRC4 유전자; 비알콜성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease; NAFLD) 관련유전자인 DDIT3; 에스트로겐 신호전달 경로 관련 유전자인 HSPA1A; 암 신호전달 경로 관련 유전자인 NFKBIA, BIRC3; MAPK 신호전달 경로 관련 유전자인 CACNA2D3; p53 신호전달 경로 관련 유전자인 APAF1, 및 cAMP 신호전달 경로 관련 유전자인 PDE4B 였고, 이중 CX3CR1, NLRC4, HSPA1A, CACNA2D3, APAF1은 Normal군에 비해 발현이 감소되는 반면 나머지 유전자들은 두 비만군에서 발현이 현저히 증가하였다. 상기 11개 유전자들은 중등도비만까지 발현 변화가 유지되는 것으로 보아 비만을 지속시키는데 관여할 것으로 생각되었다.
상기 결과들을 통해 정상대조군에 비하여 경미한 경도비만군에서만 발현이 변화하는 5개 유전자와 경도 및 중등도 비만군에서 발현이 변화하는 11개 유전자를 발굴하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명에서는 실제 한국 남성들의 말초혈액단핵세포 내 유전자 전사체의 프로파일을 비교하여 분석함으로써 경도비만군 단독 또는 경도비만군과 중등도비만군에서 공통적으로 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하였는바, 상기 유전자들은 의료산업분야에서 비만 및 관련 합병증의 조기진단 및 약물반응 진단에 중요한 바이오마커로 이용될 수 있고, 나아가 상기 질환의 예방, 개선, 또는 치료물질 개발의 주요한 소재로 활용될 수 있을 것이다.

Claims (13)

  1. CCL4L1(NCBI 접근(accession) 번호: NT_187661.1), CPT1B(NM_152247.1), CACNA1I(NM_021096.3), CD19(NM_001770.4), RPRM(NM_019845.2), CXCR5(NM_032966.1), CX3CR1(NM_001337.3), TNFAIP3(NM_006290.2), NLRC4(NM_021209.3), DDIT3(NM_004083.4), HSPA1A(NM_005345.4), BIRC3(NM_182962.1), NFKBIA(NM_020529.1), CACNA2D3(NM_018398.2), APAF1(NM_181869.1), 및 PDE4B(NM_002600.3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, 및 RPRM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만을 진단하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만 또는 중등도비만을 진단하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제 1 항의 조성물을 포함하는, 비만 진단용 키트.
  7. 피검체 유래의 생물학적 시료에서 CCL4L1(NCBI 접근(accession) 번호: NT_187661.1), CPT1B(NM_152247.1), CACNA1I(NM_021096.3), CD19(NM_001770.4), RPRM(NM_019845.2), CXCR5(NM_032966.1), CX3CR1(NM_001337.3), TNFAIP3(NM_006290.2), NLRC4(NM_021209.3), DDIT3(NM_004083.4), HSPA1A(NM_005345.4), BIRC3(NM_182962.1), NFKBIA(NM_020529.1), CACNA2D3(NM_018398.2), APAF1(NM_181869.1), 및 PDE4B(NM_002600.3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 진단방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 CCL4L1, CPT1B, CACNA1I, CD19, 및 RPRM으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 경도비만을 진단하는 것을 특징으로 하는, 비만 진단방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 CXCR5, CX3CR1, TNFAIP3, NLRC4, DDIT3, HSPA1A, BIRC3, NFKBIA, CACNA2D3, APAF1, 및 PDE4B로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자는 중등도비만을 진단하는 것을 특징으로 하는, 비만 진단방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 비만 진단방법.
  11. 제 7 항에 있어서,
    상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 비만 진단방법.
  12. 하기의 단계를 포함하는, 비만 치료 물질의 스크리닝 방법:
    (a) CCL4L1(NCBI 접근(accession) 번호: NT_187661.1), CPT1B(NM_152247.1), CACNA1I(NM_021096.3), CD19(NM_001770.4), RPRM(NM_019845.2), CXCR5(NM_032966.1), CX3CR1(NM_001337.3), TNFAIP3(NM_006290.2), NLRC4(NM_021209.3), DDIT3(NM_004083.4), HSPA1A(NM_005345.4), BIRC3(NM_182962.1), NFKBIA(NM_020529.1), CACNA2D3(NM_018398.2), APAF1(NM_181869.1), 및 PDE4B(NM_002600.3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 유전자의 발현수준을 비교하는 단계.
  13. CCL4L1(NCBI 접근(accession) 번호: NT_187661.1), CPT1B(NM_152247.1), CACNA1I(NM_021096.3), CD19(NM_001770.4), RPRM(NM_019845.2), CXCR5(NM_032966.1), CX3CR1(NM_001337.3), TNFAIP3(NM_006290.2), NLRC4(NM_021209.3), DDIT3(NM_004083.4), HSPA1A(NM_005345.4), BIRC3(NM_182962.1), NFKBIA(NM_020529.1), CACNA2D3(NM_018398.2), APAF1(NM_181869.1), 및 PDE4B(NM_002600.3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 유전자의, 비만 진단용도.
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