WO2015147432A1 - 장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단 - Google Patents

장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단 Download PDF

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WO2015147432A1
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    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Definitions

  • the present invention relates to biomarkers and their use for predicting or diagnosing the risk of metabolic and inflammatory diseases.
  • Metabolic and inflammatory diseases include obesity, high blood pressure, type 2 diabetes, inflammatory bowel disease, as well as serious diseases that threaten human health and life, including cardiovascular diseases such as stroke and arteriosclerosis, and various cancers, allergic diseases, and atopy. .
  • the intestinal bacterial community is known to be influenced by environmental factors such as host genetic factors and food intake.
  • human intestinal bacterial imbalance is known to be found in patients with obesity, diabetes, inflammatory bowel disease and the like.
  • most existing studies have focused on the discovery of disease-related microorganisms by comparing intestinal microorganisms in people with specific diseases and healthy individuals. .
  • An object of the present invention is Akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., Eubacterium spp., Roseburia spp., Metanobrebacter smimi ( One or more microorganisms selected from the group consisting of Methanobrevibacter smithii, Methanosphaera stadtmanae, Ruminococcus obeum, and Pascolactobacterium can be detected. It is to provide a composition for predicting or diagnosing the risk of metabolic and inflammatory diseases, including the agent present.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for predicting or diagnosing risk of metabolic and inflammatory diseases, comprising the composition.
  • Another object of the present invention is to provide information necessary for predicting or diagnosing the risk of metabolic and inflammatory diseases, from Akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., Eubacterium spp., Roseburia spp., Metanobrevibacter smithii, Metanosphaera stadtmanae, Ruminococcus obeum And Pascolactobacterium (Phascolarctobacterium) to provide a method for detecting one or more microorganisms selected from the group consisting of.
  • Another object of the present invention is to provide Akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., Eubacterium spp., Roseburia spp. To measure the levels of intestinal microorganisms consisting of, Metanobrevibacter smithii, Metanosphaera stadtmanae, Ruminococcus obeum and Pascolactobacterium.
  • Figure 1 shows the results of examining the association between clinical medical indicators (BMI, HOMA index, blood pressure, etc.) and intestinal microorganisms using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • Figure 2 shows the results of examining the relationship between the body mass index (BMI) and Akkermansia muciniphila using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • Figure 3 shows the results of the correlation between the insulin resistance index (HOMA index) and Akkermansia muciniphila using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • Figure 4 shows the results of examining the association between triglyceride and Akkermansia muciniphila using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 5 shows the results of investigating the correlation between body mass index (BMI) and Eubacterium eligens using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • Figure 6 shows the results of examining the relationship between the body mass index (BMI) and Eubacterium siraeum using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 7 shows the results of investigating the association between body mass index (BMI) and Parabaceroides merdae using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 8 shows the results of examining the association between diastolic blood pressure (DBP) and Methanosphaera stadtmanae using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 9 shows the results of investigating the association between diastolic blood pressure (DBP) and Metanobrevibacter smithii using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 10 shows the results of investigating the association between triglyceride and Ruminococcus obeum using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 11 shows the results of investigating the association between triglyceride and Pascolactobacterium using MaAsLin, a multivariate linear regression analysis tool.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 13 shows that HOMA index and BMI correlated significantly with methane metabolism and folic acid biosynthetic metabolic pathway.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 14 shows the results of analyzing the difference between the intestinal Streptococcus sanguinis populations in the sample (P) in which IL-17A was detected and in the sample (N).
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • FIG. 15 shows the results of analyzing the difference between the intestinal Bacteroides vulgatus community in the sample P where IL-21 was detected and the sample N which was not detected.
  • the vertical axis represents arcsine square root transformed abundances.
  • the present invention has newly established the association between intestinal bacteria and clinical medical indicators of metabolic and inflammatory diseases in healthy Korean twins, and provides an early diagnosis technology for metabolic and inflammatory diseases.
  • DNA obtained from fecal samples of healthy Korean twins is used to secure the entire genetic information of intestinal bacteria using next-generation sequencing, and from these genetic information, what kind of intestinal bacteria are composed and which genes are many To determine the existence, various bioinformatics tools were used.
  • the structure and function of the intestinal bacteria which have a significant correlation with the clinical medical indicators of the analytes, were checked after adjusting for age, sex, and genetic factors.
  • the colony and function of intestinal bacteria were analyzed.
  • the intestinal bacteria related to clinical medical indicators related to metabolic and inflammatory diseases were identified.
  • the intestinal bacteria identified in the present invention can be used as a biomarker for the early diagnosis of metabolic and inflammatory diseases, and the intestinal bacteria, which are found in the gut of healthy people, can be used for the early diagnosis, prevention and treatment of metabolic and inflammatory diseases.
  • BMI body mass index
  • HOMA index insulin resistance index
  • BMI levels and intestinal Eubacterium, Eubacterium eligens, Eubacterium siraeum, and Parabaceroides merdae are statistically significant negative.
  • BMI levels and intestinal Bacteroides frequency were statistically significant. It is important that this association occurs in normal people, not diseases.
  • Roseburia had a positive correlation with blood pressure
  • Methanobrevibacter smithii and Metanosphaera stadtmanae which are two types of archaea in the intestine
  • Higher levels were found to be strongly associated with the prevention of hypertension.
  • the more Luminococcus obeum and Pascolactobacterium exist in the intestine the lower the level of triglyceride.
  • the higher the body mass index and triglyceride the higher the intestinal microorganisms responding to oxidative stress (riboflavin, glutathione metabolism, etc.).
  • the intestinal microorganisms associated with early diagnosis, prevention and treatment of metabolic and inflammatory diseases have been found, and it is believed that they will serve as targets for diagnosis and treatment.
  • the present invention is directed to Akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., Eubacterium spp., Roseburia spp., Metanobre Detects one or more microorganisms selected from the group consisting of Methanobrevibacter smithii, Metanosphaera stadtmanae, Ruminococcus obeum, and Pascolactobacterium. It relates to a composition for predicting or diagnosing the risk of metabolic and inflammatory diseases, which may include agents.
  • Bacteroides spp. May include Bacteroides eggerthii, Bacteroides vulgatus, Bacteroides plebeius, but are not limited thereto. It is not.
  • the Eubacterium (Eubacterium spp.) May include, but is not limited to, Eubacterium eligens (Eubacterium eligens), Eubacterium siraium (Eubacterium siraeum).
  • composition may further include an agent capable of detecting Parabacteroides merdae, Streptococcus sanguinis, and the like, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a kit for predicting or diagnosing a risk of metabolic and inflammatory diseases, comprising the composition.
  • the present invention provides Akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., From a subject's sample to provide information necessary for predicting or diagnosing the risk of metabolic and inflammatory diseases.
  • Eubacterium spp., Roseburia spp., Metanobrevibacter smithii, Metanosphaera stadtmanae, Ruminococcus obeum And Pascolactobacterium (Phascolarctobacterium) relates to a method for detecting one or more microorganisms selected from the group consisting of.
  • the present invention provides an akkermansia muciniphila, Bacteroides spp., Eubacterium spp., Roseburia spp. To measure the levels of intestinal microorganisms consisting of, Metanobrevibacter smithii, Metanosphaera stadtmanae, Ruminococcus obeum and Pascolactobacterium.
  • risk prediction refers to determining whether a subject is likely to develop metabolic and inflammatory diseases, and delays or develops the onset through special and appropriate management of individuals at high risk of developing metabolic and inflammatory diseases. Can be used clinically to make treatment decisions or by selecting the most appropriate treatment regime.
  • diagnosis refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and for the purposes of the present invention, diagnosis may mean confirming the development of metabolic and inflammatory diseases.
  • Metabolic and inflammatory diseases in the present invention may be obesity, hypertension, diabetes, insulin resistance syndrome, hyperlipidemia, cancer, cardiovascular disease, inflammatory bowel disease, atopy, allergic disease or metabolic syndrome.
  • preparations capable of detecting microorganisms or measuring microbial levels include proteins, nucleic acids, lipids, glycolipids, glycoproteins or sugars (monosaccharides, disaccharides) specifically present in the microorganisms in the sample.
  • the agent capable of detecting the microorganism or measuring the microbial level may be a primer capable of detecting the microorganism.
  • the primer preferably detects the genomic sequence of the microorganisms (eg, 16S rRNA) and does not specifically bind to the genomic sequence of other microorganisms.
  • primer refers to seven to fifty nucleic acid sequences that can form base pairs complementary to the template strand and serve as a starting point for template strand copying. Primers are usually synthesized but can also be used in naturally occurring nucleic acids. The sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but only if it is sufficiently complementary to hybridize with the template. Additional features may be incorporated that do not change the basic properties of the primer. Examples of additional features that may be incorporated include, but are not limited to, methylation, capping, substitution of one or more nucleic acids with homologues, and modifications between nucleic acids.
  • 16s rRNA refers to an rRNA constituting the 30S subunit of prokaryotic ribosomes, with most of the sequence preserved significantly while some regions exhibit high sequence diversity. In particular, since there is little diversity among homogeneous species, while diversity appears among other species, prokaryotes can be usefully identified by comparing sequences of 16S rRNA.
  • the primer can be used to amplify the 16S rRNA sequence stored in the primer microorganism in the present invention, the presence of the microorganism can be detected or the microbial level can be measured through the generation of the desired product as a result of sequence amplification.
  • Sequence amplification method using a primer can be used a variety of methods known in the art.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • multiplex PCR touchdown PCR
  • hot start PCR hot start PCR
  • Booster PCR real-time PCR
  • DD-PCR differential display PCR
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • inverse polymerase chain reaction Vectorette PCR
  • TAIL-PCR thermo asymmetric interlaced PCR
  • ligase chain reaction repair chain reaction
  • transcription-mediated amplification self-sustained sequence replication
  • selective amplification of target sequences can be used, The scope of the invention is not limited thereto.
  • the agent for detecting a microorganism or measuring the level of the microorganism in the present invention may be an antibody, it can detect the microorganism or measure the microorganism level using an immunological method based on the antigen-antibody response.
  • Analytical methods for this purpose include Western blot, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, and rocket immunoelectric Electrophoresis, tissue immunity staining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, Fluorescence activated cell sorter (FACS), protein chips, and the like, but are not limited thereto.
  • molecular and immunological methods widely used in the art can be used to detect microorganisms or measure microbial levels of the present invention.
  • composition comprising an agent for detecting the microorganism or measuring the level of the microorganism of the present invention
  • kits of the present invention not only include agents such as primers, probes, antisense oligonucleotides, aptamers, antibodies, etc. for detecting the microorganisms, but also include one or more other component compositions, solutions, or devices suitable for analytical methods. Can be.
  • the kit comprising a primer specific for the microorganism in the present invention may be a kit containing the essential elements for performing the PCR and the amplification reaction.
  • the kit for PCR may be a test tube or other suitable container, reaction buffer, deoxynucleotides (dNTPs), enzymes such as Taq-polymerase reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water , Sterile water and the like.
  • dNTPs deoxynucleotides
  • enzymes such as Taq-polymerase reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitors, DEPC-water , Sterile water and the like.
  • the sample of the individual may be a fecal sample.
  • control sample may be a fecal sample of a healthy person. More specifically, the control group may be a person who did not develop metabolic and inflammatory diseases at the time of sampling and has not developed metabolic and inflammatory diseases at least 3, 6, 9 or 10 years after sampling.
  • amplification techniques known in the art, such as polymerase chain reaction, reverse transcriptase-polymerase chain reaction, multiplex PCR, touchdown PCR, hot start PCR , Nested PCR, booster PCR, real-time PCR, fractional display PCR, rapid amplification of cDNA ends, inverse PCR, Becttoret PCR, TAIL-PCR, ligase chain reaction, repair chain reaction, transcription-mediated amplification, self-maintaining sequences
  • replication and selective amplification of target sequences can be used, the scope of the present invention is not limited thereto.
  • immunological methods based on common antigen-antibody responses known in the art, such as Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, locate immunoelectrophoresis, Tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, FACS, protein chips and the like can be used, but the scope of the present invention is not limited thereto.
  • the previous study was aimed at patients with certain diseases, but this study was aimed at healthy people.
  • this study corrected genetic factors, gender, and age in analyzing the relationship between clinical medical indicators and the structure and function of intestinal bacteria. Judging from the clinical indices, it was confirmed that even in normal conditions, changes in the structure and function of the intestinal bacteria related to the disease may be observed. In other words, the analysis of intestinal bacteria can predict the risk of metabolic and inflammatory diseases in advance, and show that the intestinal bacteria, which are expected to play a beneficial role in health, can be used for the treatment and prevention of diseases.
  • fecal samples obtained from a total of 15 pairs of twins with a difference in waist circumference were used to analyze the colony structure of the intestinal microorganisms, and their serum samples were used for cytokine concentration measurement.
  • Fecal samples were mainly generated on the morning of the health examination and stored at -25 ° C, and stored at -80 ° C after transfer to the hospital. During the medical examination, questions were asked about lifestyle, drug history, and dietary habits. Body measurements (height, weight, waist circumference, etc.) and blood tests (glucose, hsCRP, total cholesterol, HDL-C, LDL-C, triglyceride, etc.) ) was also done.
  • Total DNA was extracted from each fecal sample using the Mobio Power Soil DNA isolation kit and stored at -80 ° C until analysis.
  • Samples used for the correlation analysis of intestinal microorganisms and clinical medical indicators were subjected to metaphysical shotgun sequencing using Illumina HiSeq2000 101 Cycle Paired End Sequencing according to the manufacturer's instructions. Generated.
  • PCR reaction solution consisted of 0.5 ⁇ M forward, reverse primer, approximately 50 ng / ⁇ L template DNA, 1 X PCR reaction buffer, 400 ⁇ M dNTP mix, 2.5U G-Taq polymerase (Cosmo, Seoul, Korea) The reaction consisted of 5 minutes denaturation at 94 ° C., 45 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 55 ° C., and 90 seconds at 72 ° C., 35 times, and a final extension step of 10 minutes at 72 ° C.
  • PCR amplification products were purified using QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, Calif., USA) and sequenced using 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX Titanium machine (Roche).
  • the colony composition of intestinal microorganisms was determined by using the ABC pipeline developed by Broad Institute of MIT and Harvard.
  • cytokine secretion patterns in serum samples were analyzed using MILLIPLEX MAP Human Magnetic Bead TH17-20 Plex (Millipore Corp., St. Charles, USA) (HTH17MAG-14K-20).
  • the 20 cytokines analyzed were IFN- ⁇ , IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17A, IL-1 ⁇ , IL-2, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-28A, IL-31, IL-33, IL-4, IL-5, IL-6, MIP-3 ⁇ , TNF- ⁇ , TNF- ⁇ .
  • the analysis process was performed in compliance with the protocol of the kit used.
  • the plate was washed twice with a magnetic plate washer according to the instructions provided in the kit, and then reacted with shaking at 20-25 ° C. for 1 hour by adding 25 ⁇ L of Detection Antibodies. After 25 ⁇ L Streptavidin-Phycoerythrin solution was added and the reaction was performed for 20 minutes at 20-25 °C again washed twice. After the reaction, 150 ⁇ L of Sheath Fluid was added to all wells, shaken for 5 minutes, and the fluorescence signal was detected using a Luminex device.
  • the analyzer used MAGPIX (Luminex, Austin, TX, USA) and MFI (Median Fluorescence Intensity) value was used for quantitative analysis. Calculation of standard concentration response (MFI) s / w Standard curve was calculated by the best fit method in 'MasterPlex QT 2010 (MiraiBio, Hitachi, CA, USA)'. In addition, when adjusting the standard curve, the concentration values of the samples were taken into consideration in consideration of the data distribution of the samples.
  • MaAsLin An analysis tool called MaAsLin was used to analyze the correlation between clinical medical indicators and intestinal microorganisms.
  • MaAsLin uses boosting to select metadata that is potentially associated with intestinal microorganisms and then performs multivariate analysis using the metadata as an independent variable and arcsin-square root transformed abundance of intestinal microorganisms as dependent variables. The significant metadata and intestinal microflora were identified.
  • Serum cytokine concentration analysis showed that most cytokines except CCL20, IL-27, and TNF ⁇ were not detected in most samples. Therefore, the cytokines were analyzed into categories of detected and undetected samples.
  • MaAsLin was used to analyze the relationship between intestinal microorganisms and serum cytokines, and the analysis was performed by setting the age and waist circumference as fixed factors and the twin relationship as random factors.
  • Metaphoric shotgun sequencing was performed on a total of 36 fecal samples consisting of 20 fecal samples collected up to two times.
  • body mass index BMI
  • fasting blood sugar FBS
  • cholesterol levels LDL, HDL
  • fasting blood insulin FBI
  • insulin resistance index HOMA index
  • triglycerides Data on clinical medical indicators such as triglycerides, liver and kidney function were also collected.
  • MetaPhlAn was used to determine the intestinal microbial community composition at the level of DNA, and metabolic pathway composition of the intestinal microorganism was determined using HUMAnN.
  • 16S rRNA gene sequencing was performed on fecal samples of 15 pairs of twins with different waist circumferences to analyze the association between cytokines in the intestine and intestinal microorganisms.
  • MaAsLin a multivariate analysis tool to remove the effects of confounding variables, was used to identify the intestinal microbiome populations that are statistically correlated with clinical medical indicators and cytokine levels in serum.
  • MaAsLin a multivariate linear regression analysis tool, was used to investigate the association between clinical markers and intestinal microorganisms.
  • MaAsLin analyzed the association between metadata and intestinal microbial community composition by calibrating variables such as sex, age and smoking status. Through this analysis, we found a correlation between BMI, HOMA index, blood pressure, and certain intestinal microorganisms and metabolic pathways.
  • Akkermansia muciniphila is a clinical medical indicator of metabolic and inflammatory diseases: body mass index (BMI), insulin resistance index (HOMA index), and triglyceride levels. The higher the was, the less the frequency in the intestine was shown (FIGS. 1-4).
  • the bacterium is an enteric microorganism that breaks down mucin, and this is the first time this study has been reported in people with normal ranges of BMI and FBS levels.
  • Eubacterium, Eubacterium eligens, Eubacterium siraeum, and Parabaceroides merdae have a statistically significant negative correlation with BMI.
  • BMI levels and intestinal Bacteroides (Bacteroides) frequency showed a significant positive correlation (Fig. 1). It is important that this association occurs in normal people, not diseases.
  • Roseburia showed a positive correlation with blood pressure (FIG. 1), and Metanobrevibacter smithii and Metanospaera Stazmane (a type of archaea that exist in the intestine). The higher the Methanosphaera stadtmanae) was found to be strongly associated with the prevention of hypertension (Figs. 8 and 9).
  • BMI was shown to be strongly associated with riboflavin and NAD biosynthesis-related modules, and showed a statistically significant positive correlation with folic acid biosynthesis metabolic pathways (FIGS. 12 and 13). These functions can be seen to reflect the response to oxidative stress in the intestine. It is not yet known why this feature is present in healthy people and how this change is related to future changes in health, but is related to changes in the metabolic function of gut microorganisms and inflammation in the gut. This is in agreement with the study.
  • cytokine CCL20 (unit: pg / mL)
  • IL-27 (unit: ng / mL)
  • TNF- ⁇ in pg / mL mean ⁇ SD 10.23 ⁇ 7.51 0.36 ⁇ 0.33 5.11 ⁇ 2.03
  • MaAsLin An analysis tool called MaAsLin was used to analyze the association between cytokines in the serum and the community composition of the intestinal microorganisms. After setting the age and waist circumference as fixed factors and twin relationship as random factors, we analyzed the statistically significant cluster composition of cytokines and intestinal microorganisms. As a result, the samples detected with IL-17A, a cytokine involved in the innate immune response to infection, had significantly higher levels of Streptococcus sanguinis than the samples without IL-17A detected. Appeared (FIG. 14). In addition, IL-21-detected samples known to be associated with autoimmune diseases, inflammatory diseases, and cancers showed significantly lower levels of Bacteroides vulgatus than those without IL-21 detection. (FIG. 15).
  • blood cytokine levels are associated with inflammatory diseases, immune diseases, obesity, etc., by measuring the increase or decrease of certain intestinal microorganisms mentioned above, it is possible to predict the level of specific blood cytokines (IL-17A, IL-21), This can predict the immune status of the body, as well as metabolic and inflammatory diseases.
  • the present invention provides a novel biomarker of metabolic and inflammatory diseases, and by using this, it is possible to predict the risk of metabolic and inflammatory diseases through simple sampling, and a quick diagnosis kit for the prevention and diagnosis of various metabolic and inflammatory diseases. Development is possible.
  • the biomarker may be used as a target for the development and control of new drugs for the prevention or treatment of various metabolic and inflammatory diseases.

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Abstract

본 발명은 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단을 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다.

Description

장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단
본 발명은 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단을 위한 바이오마커 및 이의 이용에 관한 것이다.
최근 현대인들은 고열량의 식사가 주를 이루는 식생활로의 변화 및 운동 부족, 스트레스의 증가에 의해 인체의 항상성이 교란되고 있으며, 이에 따라 각종 대사성 및 염증성 질환이 급증하고 있다. 대사성 및 염증성 질환은 비만, 고혈압, 2형 당뇨병, 염증성 장질환 뿐 아니라, 뇌졸중, 동맥경화 등 심혈관 질환과 각종 암, 알러지 질환, 아토피 등에 이르기까지 인류의 건강 및 생명을 위협하는 심각한 질환을 포함한다.
한편, 장내 세균의 군집은 호스트의 유전학적인 요인과 음식 섭취 등 환경적인 요인에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 또한, 인간의 장내 세균 불균형은 비만, 당뇨, 염증성 장질환 환자 등에서 발견되는 것으로 알려져 있다. 이에, 장내 세균 군집과 이들 질환과의 관련성을 연구한 종래 보고가 존재하지만, 대부분의 기존 연구는 특정 질환을 가진 사람과 건강한 사람의 장내 미생물을 비교하여 질환 관련 미생물을 발견하는 데 초점을 맞추었다.
그러나, 종래의 연구들은 건강한 성인을 대상으로 한 일부 연구의 경우 혈당, 중성지방과 같은 다양한 임상 의학적 지표들에 대한 정보의 부족으로, 장내에 존재하는 특정 미생물과 건강 지표와의 상관관계에 대한 정보는 부족한 실정이었다. 또한, 개인 간의 유전적 차이에 대한 고려가 부족했다는 점에서 한계가 있다.
본 발명의 목적은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 군으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은, 개체의 시료로부터 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 장내 미생물의 수준을 측정하는 단계 상기 장내 미생물 수준을 대조군 시료의 장내 미생물의 수준과 비교하는 단계 및 상기 대조군 시료와 비교시 개체의 시료에서 아커만시아 뮤시니필라, 유박테리움, 메타노브레비박터 스미시, 메타노스파에라 스타츠마네, 루미노코커스 오베움 및 파스코락토박테리움의 수준이 감소하고, 박테로이데스 및 로세부리아의 수준이 증가하는 경우 대사성 및 염증성 질환의 위험도가 높다고 예측하는 단계를 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도를 예측하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 임상 의학적 지표들(BMI, HOMA index, 혈압 등)과 장내 미생물 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 2는 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 체질량지수(BMI)와 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 3은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 인슐린저항성지수(HOMA index)와 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 4는 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 혈중중성지방(triglyceride)과 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 5는 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 체질량지수(BMI)와 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 6은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 체질량지수(BMI)와 유박테리움 시라이움(Eubacterium siraeum) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 7은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 체질량지수(BMI)와 파라박테로이데스 메르대(Parabacteroides merdae) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 8은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 이완기 혈압(diastolic blood pressure, DBP)과 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 9은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 이완기 혈압(diastolic blood pressure, DBP)과 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 10은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 혈중중성지방(triglyceride)과 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 11은 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하여, 혈중중성지방(triglyceride)과 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium) 간의 연관성을 조사한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 12는 BMI가 리보플라빈 및 NAD 생합성 관련 모듈과 강한 연관성이 있음을 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 13은 HOMA 지수 및 BMI가 메탄 대사 및 엽산 생합성 대사 경로와 유의적인 상관관계가 있음을 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 14는 IL-17A가 검출된 시료(P)와 검출되지 않은 시료(N)에서 장내 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis) 군집의 차이를 분석한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
도 15는 IL-21이 검출된 시료(P)와 검출되지 않은 시료(N)에서 장내 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus) 군집의 차이를 분석한 결과를 나타낸다. 세로축은 arcsine square root transformed abundances 를 나타낸다.
본 발명은 건강한 한국인 쌍둥이를 대상으로 하여 장내 세균과 대사성 및 염증성 질환의 임상 의학적 지표들의 관련성을 새로이 규명하였으며, 이를 토대로 대사성 및 염증성 질환의 조기진단 기술을 제공한다.
본 발명에서는 건강한 한국인 쌍둥이의 분변 시료로부터 추출된 DNA에서, 차세대염기서열 분석법을 이용하여 장내 세균의 전체 유전정보를 확보하고, 이들 유전정보로부터 장내 세균이 어떠한 종류로 구성되어 있으며, 어떠한 유전자가 많이 존재하는지를 파악하기 위하여, 다양한 생물정보학적 도구들을 이용하였다. 또한, 분석대상자의 임상 의학적 지표와 유의한 상관관계가 있는 장내 세균의 구조와 기능을 나이, 성별, 유전적 요인 등을 보정한 후 확인하였다. 그 결과 장내 세균의 군집과 기능을 분석하였으며, 그 결과 정상 범위 내의 대사성 및 염증성 질환 관련 임상 의학적 지표와 관련된 장내 세균들을 확인하였다.
본 발명을 통해서 정상 범위의 임상 의학적 지표를 갖는 사람이라 할지라도 그 수치가 높아질수록 장내 세균의 군집과 구조에 변화가 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 관련성이 규명된 장내 세균을 대사성 및 염증성 질환의 조기 진단을 위한 바이오마커로 사용할 수 있으며, 건강한 사람의 장내에서 많이 발견되는 장내 세균을 대사성 및 염증성 질환의 조기진단, 예방 및 치료를 위한 목적으로 사용할 수 있다.
임상 의학적 지표와 장내 미생물 간의 연관성을 조사한 결과, 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)는 대사성 및 염증성 질환 관련 임상 의학적 지표인 체질량지수(body mass index, BMI), 인슐린저항성지수(HOMA index), 혈중중성지방(triglyceride)의 수치가 높아질수록 그 장내에서의 빈도가 감소하는 것으로 나타났다. 또한, BMI 수치와 장내의 유박테리움(Eubacterium), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 유박테리움 시라이움(Eubacterium siraeum), 파라박테로이데스 메르대(Parabacteroides merdae)는 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 보인 반면, BMI 수치와 장내의 박테로이데스(Bacteroides)의 빈도는 통계학적으로 의미 있는 양의 상관관계를 보였다. 이러한 연관성이 질환이 아닌 정상인들에게서 나타났다는 점이 중요하다. 또한, 로세부리아(Roseburia)는 혈압과 양의 상관관계를 나타냈고, 장내에 존재하는 고세균의 일종인 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii) 및 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae)가 높을수록 고혈압의 예방과 강한 연관성이 있음을 발견하였다. 그리고 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium) 이 장내에 많이 존재할수록 혈중중성지방의 수치가 낮은 것으로 나타났다. 아울러, 체질량지수, 혈중중성지방 등의 수치가 높을수록 산화적 스트레스에 반응하는 장내 미생물의 기능(riboflavin, glutathione metabolism 등)이 높은 것으로 나타났다.
또한, 혈청 중 사이토카인의 농도와 연관성이 있는 장내 미생물의 군집 구성을 확인한 결과, 감염에 대한 선천성 면역 반응에 관여하는 IL-17A가 검출된 시료는 IL-17A가 검출되지 않은 시료에 비해서, 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis)가 유의하게 높은 수준으로 존재하는 것으로 나타났다. 또한, 자가면역질환, 염증성질환, 암과 관련이 있는 것으로 알려진 IL-21이 검출된 시료는 IL-21이 검출되지 않은 시료에 비해서 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus)가 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것으로 나타났다. 따라서, 이들 장내 미생물의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 특정 혈중 사이토카인(IL-17A, IL-21)의 수준을 예측하고, 이를 통해 체내 면역 상태, 나아가 대사성 및 염증성 질환을 예측할 수 있음을 확인하였다.
이와 같이 대사성 및 염증성 질환의 조기 진단, 예방 및 치료와 관련된 장내 미생물을 발견하였고, 진단 및 치료제의 타겟으로서 역할이 있을 것으로 판단된다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스(Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물에 관한 것이다.
상기 박테로이데스(Bacteroides spp.)는 박테로이데스 에게르티(Bacteroides eggerthii), 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus), 박테로이데스 플레베이우스(Bacteroides plebeius) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유박테리움(Eubacterium spp.)은 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 유박테리움 시라이움(Eubacterium siraeum) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이 외에, 상기 조성물은 파라박테로이데스 메르대(Parabacteroides merdae), 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis) 등을 검출할 수 있는 제제를 더욱 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 개체의 시료로부터 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스(Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 군으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 미생물을 검출하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 개체의 시료로부터 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스(Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 장내 미생물의 수준을 측정하는 단계 상기 장내 미생물 수준을 대조군 시료의 장내 미생물의 수준과 비교하는 단계 및 상기 대조군 시료와 비교시 개체의 시료에서 아커만시아 뮤시니필라, 유박테리움, 메타노브레비박터 스미시, 메타노스파에라 스타츠마네, 루미노코커스 오베움 및 파스코락토박테리움의 수준이 감소하고, 박테로이데스 및 로세부리아의 수준이 증가하는 경우 대사성 및 염증성 질환의 위험도가 높다고 예측하는 단계를 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도를 예측하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본원에서 용어,"위험도 예측" 이란 개체가 대사성 및 염증성 질환이 발병할 가능성이 있는지를 판별하는 것을 말하고, 대사성 및 염증성 질환의 발병 위험성이 높은 개체를 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하거나, 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다. 또한, "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상, 진단은 대사성 및 염증성 질환의 발병 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 대사성 및 염증성 질환은 비만, 고혈압, 당뇨, 인슐린 내성 증후군, 고지혈증, 암, 심혈관질환, 염증성 장질환, 아토피, 알러지 질환 또는 대사 증후군일 수 있다.
본 발명에서 바이오마커로 제공하는 미생물들을 검출하거나 미생물 수준을 측정할 수 있는 제제로는, 시료 내 해당 미생물들에 특이적으로 존재하는 단백질, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등을 사용할 수 있다.
일예로, 본 발명에서 상기 미생물들을 검출하거나 미생물 수준을 측정할 수 있는 제제는 해당 미생물을 검출할 수 있는 프라이머 일 수 있다. 상기 프라이머는 해당 미생물들의 게놈 서열(예컨대, 16S rRNA)을 특이적으로 검출하고 다른 미생물의 게놈 서열에는 특이적 결합을 하지 않는 것이 바람직하다.
본원에서 용어, "프라이머"란, 주형 가닥에 상보적인 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 7개 내지 50개의 핵산서열을 의미한다. 프라이머는 보통 합성하지만 자연적으로 생성된 핵산에서 이용할 수도 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 혼입할 수 있는 추가의 특징의 예로 메틸화, 캡화, 하나 이상의 핵산을 동족체로의 치환 및 핵산 간의 변형 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 용어, "16s rRNA "란, 원핵생물 리보솜의 30S 소단위체를 구성하고 있는 rRNA로, 염기서열이 대부분 상당히 보존되어 있는 한편 일부 구간에서는 높은 염기서열 다양성이 나타난다. 특히 동종 간에는 다양성이 거의 없는 반면에 타종 간에는 다양성이 나타나므로 16S rRNA의 서열을 비교하여 원핵생물을 유용하게 동정할 수 있다.
일구현예로, 본 발명에서 상기 프라이머 해당 미생물에 보존된 16S rRNA 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있으며, 서열 증폭 결과 원하는 생성물의 생성 여부를 통하여 해당 미생물의 존재를 검출하거나 미생물 수준을 측정할 수 있다. 프라이머를 이용한 서열 증폭 방법은 당업계에 알려진 다양한 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 멀티플렉스 PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR, 부스터(booster) PCR, 실시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스(inverse) 중합효소 연쇄반응, 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR), 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에서 미생물을 검출하거나 미생물 수준을 측정하는 제제는, 항체일 수 있으며, 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법을 사용하여 해당 미생물을 검출하거나 미생물 수준을 측정할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion),오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법(Complement Fixation Assay), FACS(Fluorescence activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
그 외, 당업계에 널리 사용되는 분자 및 면역학적 방법이 본 발명의 미생물을 검출하거나 미생물 수준을 측정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 미생물을 검출하거나 미생물 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물은, 진단 키트 형태로 구현되어 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 해당 미생물들을 검출하기 위한 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머, 항체 등의 제제를 포함할 뿐만 아니라, 분석 방법에 적합한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 일례로, 본 발명에서 해당 미생물에 특이적인 프라이머를 포함하는 키트는, PCR 및 등의 증폭 반응을 수행하기 위한 필수 요소들을 포함하는 키트 일 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 용 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 개체의 시료란, 바람직하게는 분변 시료일 수 있다.
본 발명에서 대조군 시료란, 건강한 사람의 분변 시료일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 대조군은, 시료 채취 당시 대사성 및 염증성 질환이 발병하지 않았으며 시료 채취 후 최소한 3, 6, 9 또는 10년 이상 대사성 및 염증성 질환이 발병하지 않은 사람일 수 있다.
또한, 본 발명에서 개체의 시료로부터 미생물을 검출하기 위하여, 당업계에 알려진 일반적인 증폭 기술들, 예를 들어 중합효소 연쇄반응, 역전사-중합효소 연쇄반응, 멀티플렉스 PCR, 터치다운 PCR, 핫 스타트 PCR, 네스티드 PCR, 부스터 PCR, 실시간 PCR, 분별 디스플레이 PCR, cDNA 말단의 신속 증폭, 인버스 PCR, 벡토레트 PCR, TAIL-PCR, 리가아제 연쇄 반응, 복구 연쇄 반응, 전사-중재 증폭, 자가 유지 염기서열 복제, 타깃 염기서열의 선택적 증폭 반응을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지는 않는다.
또한, 당업계에 알려진 일반적인 항원-항체 반응을 기반으로 한 면역학적 방법들, 예를 들어, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법,오우크테로니 면역 확산법, 로케이트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체고정분석법, FACS, 단백질 칩 등을 이용할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
그 외, 당업계에 널리 사용되는 분자 및 면역학적 방법이 본 발명의 미생물을 검출하는 데 사용될 수 있다.
기존의 연구들에서 대사성 및 염증성 질환과 장내 세균의 군집 변화에 대한 보고는 있었으나, 본 발명에서와 같이 정상 범주의 건강 상태를 보이는 사람에게서도 이러한 질환 관련 장내 세균의 군집과 기능에 변화가 있음은 대사성 및 염증성 질환의 조기 진단에 해당 세균을 이용할 수 있음을 나타낸다. 그리고 본 발명에서는 장내 미생물을 species 수준까지 분석함으로써, 진단 및 치료제로서의 정확한 미생물 타겟을 제시하였다.
기존의 연구가 특정 질환이 있는 환자를 대상으로 한 연구였다면, 본 연구는 건강한 사람을 대상으로 했다는 점이 차이점이다. 또한 본 연구에서는 임상의학적 지표와 장내 세균의 구조와 기능의 관계를 분석함에 있어서 유전학적인 요인과 성별, 나이 등을 보정해 줌으로써, 기존의 연구에 비해 보다 정확한 결과를 얻을 수 있었다. 임상의학적 지표들로 판단했을 경우 정상정인 상태라 할지라도, 질병과 관련이 있는 장내 세균의 구조와 기능의 변화가 나타날 수 있음을 확인하였다. 즉, 장내 세균의 분석을 통해 대사성 및 염증성 질환의 위험을 사전에 예측할 수 있으며, 건강에 이로운 역할을 할 것으로 예측되는 장내 세균들을 질병의 치료와 예방의 목적으로 사용할 수 있음을 보여준다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 연구대상 및 시료 수집
본 연구는 한국의 쌍둥이 연구(Healthy Twin Study)에 참여한 일란성 쌍둥이를 대상으로 수행되었다. 쌍둥이의 일란성 여부는 AmpFlSTR Indentifier Kit (15개의 상염색체 short tandem repeat 마커와 1개의 성-결정 마커)와 90% 이상의 정확도를 보이는 설문지 조사를 통하여 확인하였으며, 본 쌍둥이 코호트에 대한 자세한 방법론은 이전의 논문에 기술되어 있다 (Sung, J., et al., Twin Research and Human Genetics, 2006. 9(6): p. 844-848.). 두 쌍의 쌍둥이로부터는 1회, 여덟 쌍의 쌍둥이로부터는 2회에 걸친 분변 시료를 수집하여, 총 36개의 분변 시료를 메타지노믹 샷건 시퀀싱 분석에 포함시켰다. 한편, 허리둘레에 차이가 있는 총 15쌍의 쌍둥이로부터 획득된 분변 시료를 장내 미생물의 군집 구조를 분석하기 위하여 사용하였고, 그들의 혈청 시료를 사이토카인 농도 측정을 위하여 사용하였다. 분변 시료는 주로 건강 검진 당일 아침에 생성하여 -25℃에 보관하였다가, 병원에 옮긴 이후에는 -80℃에서 보관하였다. 건강 검진 시에는 생활 방식, 약물력, 식습관에 대한 설문이 이루어 졌으며, 신체계측 (키, 몸무게, 허리둘레 등)과 혈액검사 (glucose, hsCRP, total cholesterol, HDL-C, LDL-C, triglyceride 등) 도 함께 이루어졌다.
실시예 2. DNA 추출
Mobio Power Soil DNA isolation kit를 이용하여 각 분변 시료로부터 전체 DNA를 추출하였고, 분석 전까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3. 메타지노믹 샷건 시퀀싱
장내 미생물과 임상 의학적 지표와의 상관관계 분석에 사용된 시료는 Illumina HiSeq2000 101 Cycle Paired End Sequencing을 이용하여 제조사의 설명에 따라 메타지노믹 샷건 시퀀싱을 수행하였으며, 각 시료 당 평균 3.5 gigabase의 염기 서열을 생성하였다.
실시예 4. 16S rRNA 유전자 시퀀싱
장내 미생물과 혈청 사이토카인의 상관관계 분석에 사용된 시료에 대해서는, 454 Life Sciences (Roche) Titanium 호환의 어댑터 서열(5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-3'), 4-염기 링커 서열(TCAG) 및 보존된 박테리아 프라이머 8F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')를 포함하는 정방향 프라이머와 454 Life Sciences(Roche) Titanium 티타늄 호환의 어댑터 시퀀스(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-3'), 4-염기 링커 서열(TCAG), 9- 또는 10-염기 다중 확인자 (MID) 및 박테리아 프라이머 534R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')을 포함하는 역방향 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 반응액은 0.5μM의 정방향, 역방향 프라이머, 약 50 ng/μL의 template DNA, 1 X PCR 반응 버퍼, 400μM의 dNTP mix, 2.5U G-Taq polymerase (Cosmo, Seoul, Korea)로 구성되었으며, PCR 반응은 94℃에서 5분간 변성, 94℃에서 45초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 90초 35 회 반복, 72℃에서 10분간의 최종 연장 단계로 이루어졌다. PCR 증폭 산물은 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 를 이용하여 정제되었으며, 454 Life Sciences Genome Sequencer FLX Titanium machine (Roche) 를 이용하여 시퀀싱하였다.
실시예 5. 메타지노믹 샷건 시퀀스 분석
메타지노믹 샷건 시퀀싱을 통해서 확보된 염기 서열로부터, MetaPhlAn (Segata, N., et al., Nature methods, 2012. 9(8): p. 811-814)이라는 분석 도구를 이용하여 장내 미생물의 군집 구성을 파악하였으며, HUMAnN (Abubucker, S., et al., PLoS computational biology, 2012. 8(6))이라는 도구를 이용하여 장내 미생물의 대사 경로 구성을 파악하였다.
실시예 6. 16S rRNA 유전자 시퀀스 분석
16S rRNA 유전자 시퀀싱을 통해서 확보된 염기 서열로부터, Broad Institute of MIT and Harvard에서 개발된 ABC pipeline을 이용하여, 장내 미생물의 군집 구성을 파악하였다.
실시예 7. 혈청 중 사이토카인 패턴 분석
혈청 시료 중 20가지의 사이토카인 분비 패턴은 MILLIPLEX MAP Human Magnetic Bead TH17 - 20 Plex (Millipore Corp., St. Charles, USA) (HTH17MAG-14K-20)를 이용해 분석하였다. 분석 대상인 20개의 사이토카인은 IFN-γ, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17A, IL-1β, IL-2, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-28A, IL-31, IL-33, IL-4, IL-5, IL-6, MIP-3α, TNF-α, TNF-β 이다. 분석 과정은 사용한 키트의 protocol을 준수하여 수행하였고 그 과정은 다음과 같다.
200μL의 assay buffer를 96-well의 각 well에 첨가한 후 plate를 sealing하여 20-25℃에서 10분간 plate shaker에서 잘 섞었다. Assay buffer를 버리고 plate를 tapping 하여 남은 버퍼를 제거한 후 25μL의 standard와 control을 해당 well에, 25μL의 assay buffer를 background 와 sample well에 첨가하였다. 25μL의 혈청용 matrix solution을 background, standards, control well에 첨가하고, sample well에는 25μL 혈청 시료를 첨가하였다. 모든 well에 25μL의 Mixed/Premixed Bead를 첨가한 후 plate shaker를 이용해 4℃에서 16-18시간 동안 반응하였다. 반응이 끝난 plate는 키트에 제공된 instruction에 따라 magnetic plate washer를 이용해 두 번 washing한 후, 25μL의 Detection Antibodies를 첨가하여 20-25℃에서 1시간 shaking 하며 반응하였다. 이후 25μL Streptavidin-Phycoerythrin 용액을 넣고 20-25℃에서 30분간 반응 후 다시 2회 washing을 실시하였다. 반응이 끝나면 모든 well에 150μL의 Sheath Fluid를 넣고 5분간 진탕한 후 Luminex기기를 이용해 형광 신호를 검출하였다.
분석기기는 MAGPIX (Luminex, Austin, TX, USA)를 이용하였으며 MFI(Median Fluorescence Intensity)값을 정량 분석에 사용하였다. Standard 농도 별 반응 측정값(MFI)을 계산 s/w 'MasterPlex QT 2010 (MiraiBio, Hitachi, CA, USA)'에서 best fit 방법으로 standard curve를 구하였으며, 이 curve를 기준으로 각 시료 결과 농도 값들이 계산되었으며 또한 standard curve 조정할 때 시료들의 data 분포를 고려하여 시료들의 농도 값이 최대한 계산될 수 있도록 반영하였다.
실시예 8. 장내 미생물과 임상 의학적 지표와의 상관관계 분석
임상 의학적 지표와 장내 미생물의 상관관계를 분석하기 위하여 MaAsLin 이라는 분석 도구를 이용하였다. MaAsLin은 boosting을 이용하여 장내 미생물과 잠재적인 연관성을 보이는 메타데이터를 선택하고, 이 후 그 메타데이터를 독립변수, 장내 미생물의 arcsin-square root transformed abundance를 종속변수로 하여 다변량분석을 실시함으로써, 통계적으로 유의한 메타데이터와 장내 미생물의 군집 구성을 파악하였다.
실시예 9. 장내 미생물과 혈청 사이토카인의 상관관계 분석
혈청 사이토카인의 농도 분석 결과, CCL20, IL-27, TNFα를 제외한 나머지 사이토카인의 경우 대부분의 시료에서 검출되지 않는 것으로 나타났다. 따라서 해당 사이토카인들에 대해서는 검출된 시료와 검출되지 않은 시료의 카테고리로 나누어 분석을 진행하였다.
장내 미생물과 혈청 사이토카인의 상관관계를 분석하기 위하여 MaAsLin을 이용하였으며, 분석 대상자의 나이와 허리둘레를 고정 요인으로, 쌍둥이 관계를 임의 요인으로 설정하고, 분석을 진행하였다.
실험 결과
최대 2회에 걸쳐 모아진 20명의 분변 시료로 구성된 총 36개의 분변 시료에 대해 메타지노믹 샷건 시퀀싱을 실시하였다. 또한 체질량지수(body mass index, BMI), 공복 혈당(fasting blood sugar, FBS), 콜레스테롤 수치(LDL, HDL), 공복 인슐린(fasting blood insulin, FBI), 인슐린저항성지수(HOMA index), 중성지방(triglyceride), 간, 신장 기능 등 임상 의학적 지표에 대한 데이터도 수집하였다. 염기 서열이 분석된 DNA read로부터 MetaPhlAn을 이용하여species 수준의 장내 미생물 군집 구성을 파악하였으며, HUMAnN을 이용하여 장내 미생물의 대사 경로 구성을 파악하였다. 또한 혈청 내 사이토카인과 장내 미생물의 연관성을 분석하기 위하여, 허리둘레에 차이를 보이는 15쌍의 쌍둥이의 분변 시료에 대해 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 실시하였으며, 그들의 혈청 시료로부터 총 20종의 사이토카인의 농도를 측정하였다. 임상 의학적 지표 및 혈청 중 사이토카인의 수치와 통계적으로 유의한 연관성이 있는 장내 미생물의 군집 구성을 확인하기 위하여, 혼란변수의 영향을 제거할 수 있는 다변량분석 도구인 MaAsLin을 이용하였다.
임상 의학적 지표와 장내 미생물 간의 연관성을 조사하기 위하여, 다변량 선형 회기 분석 도구인 MaAsLin을 이용하였다. MaAsLin은 성별, 나이, 흡연여부 등의 변수들을 보정하면서, 메타데이터와 장내 미생물의 군집 구성의 연관성을 분석하였다. 이 분석을 통해 BMI, HOMA index, 혈압 등과 특정 장내 미생물 및 대사 경로의 연관성을 발견하였다. 예를 들어, 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)는 대사성 및 염증성 질환 관련 임상 의학적 지표인 체질량지수(body mass index, BMI), 인슐린저항성지수(HOMA index), 혈중중성지방(triglyceride)의 수치가 높아질수록 그 장내에서의 빈도가 감소하는 것으로 나타났다(도 1 내지 도 4). 이 박테리아는 mucin을 분해하는 장내 미생물로, 정상 범위의 BMI와 FBS 수준을 갖는 사람에게서 이러한 경향을 보이는 것은 본 연구를 통해 처음으로 보고되는 것이다.
또한, 유박테리움(Eubacterium), 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 유박테리움 시라이움(Eubacterium siraeum), 파라박테로이데스 메르대(Parabacteroides merdae)는 BMI와 통계적으로 유의한 음의 상관관계를 보였다(도 1, 도 5 내지 도 7). 한편, BMI 수치와 장내의 박테로이데스(Bacteroides)의 빈도는 통계학적으로 의미 있는 양의 상관관계를 보였다(도 1). 이러한 연관성이 질환이 아닌 정상인들에게서 나타났다는 점이 중요하다.
또한, 로세부리아(Roseburia)는 혈압과 양의 상관관계를 나타냈고(도 1), 장내에 존재하는 고세균의 일종인 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii) 및 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae)가 높을수록 고혈압의 예방과 강한 연관성이 있음을 발견하였다(도 8 및 도 9).
또한, 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)이 장내에 많이 존재할수록 혈중중성지방의 수치가 낮은 것으로 나타났다(도 10 및 도 11).
아울러, 체질량지수, 혈중중성지방 등의 수치가 높을수록 산화적 스트레스에 반응하는 장내 미생물의 기능(riboflavin, glutathione metabolism 등)이 높은 것으로 나타났다.
본 연구에서 BMI는 리보플라빈과 NAD 생합성 관련 모듈과 강한 연관성이 있는 것으로 나타났으며, 엽산 생합성 대사 경로와도 통계적으로 유의한 양의 상관관계를 나타냈다(도 12 및 도 13). 이러한 기능들은 장내에 산화적 스트레스에 대한 반응을 반영하는 것으로 볼 수 있다. 건강한 사람을 대상으로 한 본 연구에서 왜 이러한 특징이 나타나는지, 그리고 이러한 변화가 향후 건강의 변화와 어떠한 관련이 있는지는 아직 밝혀지지 않았으나, 장내 미생물의 대사적 기능의 변화와 장내의 염증과 관련성이 있다는 최근의 연구와는 일치된 결과이다.
한편, 혈청 중 사이토카인의 농도와 연관성이 있는 장내 미생물의 군집 구성을 확인하기 위하여, 15쌍의 쌍둥이로부터 혈청 중 사이토카인의 농도를 측정한 결과, CCL20, IL-27, TNF-α의 평균 농도는 각각 10.23±7.51 pg/mL, 0.36±0.33 ng/mL, 5.11±2.03 pg/mL 인 것으로 나타났으며(표 1), 나머지 사이토카인의 경우 검출 한계 이상 측정된 샘플의 수가 적어서 검출 여부를 카테고리로 나누어 분석하였다(표 2).
표 1
cytokine CCL20(단위: pg/mL) IL-27(단위: ng/mL) TNF-α(단위: pg/mL)
mean±S.D. 10.23±7.51 0.36±0.33 5.11±2.03
표 2
cytokine IL-12 IL-21 IL-17A IL-31 IL-33 IL-5 IL-2 IFN-γ IL-4 IL-22 TNF-β
number of positive1) 16 11 5 5 5 5 4 3 2 2 1
1) 해당 사이토카인이 검출된 시료의 개수를 말함
혈청 중의 사이토카인과 장내 미생물의 군집 구성과의 연관성을 분석은 MaAsLin 이라는 분석도구를 이용하였다. 분석 대상자의 나이와 허리둘레를 고정 요인으로, 그리고 쌍둥이 관계를 임의 요인으로 설정 후, 통계적으로 유의한 혈중 사이토카인과 장내 미생물의 군집 구성 관계를 검색하였다. 그 결과, 감염에 대한 선천성 면역 반응에 관여하는 cytokine인 IL-17A가 검출된 시료는 IL-17A가 검출되지 않은 시료에 비해서, 스트렙토코커스 산구이니스(Streptococcus sanguinis)가 유의하게 높은 수준으로 존재하는 것으로 나타났다(도 14). 또한 자가면역질환, 염증성질환, 암과 관련이 있는 것으로 알려진 IL-21이 검출된 시료는 IL-21이 검출되지 않은 시료에 비해서 박테로이데스 불가투스(Bacteroides vulgatus)가 유의한 수준으로 낮게 존재하는 것으로 나타났다(도 15).
혈중 사이토카인 수준은 염증성 질환, 면역질환 및 비만 등과 연관성이 있으므로, 위에서 언급된 특정 장내 미생물의 증가 또는 감소를 측정함으로써, 특정 혈중 사이토카인(IL-17A, IL-21)의 수준을 예측하고, 이를 통해 체내 면역 상태, 나아가 대사성 및 염증성 질환을 예측할 수 있다.
본 발명은 대사성 및 염증성 질환의 신규 바이오마커를 제공하며, 이를 이용하면 간단한 시료 채취를 통하여 대사성 및 염증성 질환의 위험도를 예측하는 것이 가능하고, 각종 대사성 및 염증성 질환의 예방, 진단을 위한 신속 진단 키트의 개발이 가능하다. 또한, 각종 대사성 및 염증성 질환의 예방 또는 치료를 위한 신약 개발 및 제어의 타겟으로도 상기 바이오마커의 활용이 가능할 것으로 기대된다.

Claims (7)

  1. 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 군의 미생물을 검출할 수 있는 제제를 포함하는,
    대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물을 검출할 수 있는 제제는 미생물에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프라이머는 미생물의 16S rRNA를 증폭할 수 있는 프라이머인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 대사성 및 염증성 질환은 비만, 고혈압, 당뇨, 인슐린 내성 증후군, 고지혈증, 암, 심혈관질환, 염증성 장질환, 아토피, 알러지 질환 또는 대사 증후군인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단용 키트.
  6. 대사성 및 염증성 질환의 위험도 예측 또는 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 군의 미생물을 검출하는 방법.
  7. 개체의 시료로부터 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila), 박테로이데스 (Bacteroides spp.), 유박테리움(Eubacterium spp.), 로세부리아(Roseburia spp.), 메타노브레비박터 스미시(Methanobrevibacter smithii), 메타노스파에라 스타츠마네(Methanosphaera stadtmanae), 루미노코커스 오베움(Ruminococcus obeum) 및 파스코락토박테리움(Phascolarctobacterium)으로 이루어진 장내 미생물의 수준을 측정하는 단계;
    상기 장내 미생물 수준을 대조군 시료의 장내 미생물의 수준과 비교하는 단계; 및
    상기 대조군 시료와 비교시 개체의 시료에서 아커만시아 뮤시니필라, 유박테리움, 메타노브레비박터 스미시, 메타노스파에라 스타츠마네, 루미노코커스 오베움 및 파스코락토박테리움의 수준이 감소하고, 박테로이데스 및 로세부리아의 수준이 증가하는 경우 대사성 및 염증성 질환의 위험도가 높다고 예측하는 단계를 포함하는,
    대사성 및 염증성 질환의 위험도를 예측하는 방법.
PCT/KR2015/000440 2014-03-28 2015-01-15 장내 세균의 군집과 기능의 변화를 이용한 대사성 및 염증성 질환의 조기진단 WO2015147432A1 (ko)

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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105030841A (zh) * 2015-08-24 2015-11-11 上海交通大学医学院附属瑞金医院 Akkermansia muciniphila BAA-835菌株的应用
CN108367031A (zh) * 2015-10-05 2018-08-03 瑞士达沃斯高山气候和医学研究院 嗜黏蛋白阿克曼氏菌用于治疗炎症病况的用途
CN105296620B (zh) 2015-10-26 2019-01-15 上海市内分泌代谢病研究所 肠道宏基因组特征作为2型糖尿病阿卡波糖疗效筛选标志
CN105368944B (zh) * 2015-11-23 2019-03-19 广州基迪奥生物科技有限公司 可检测疾病的生物标志物及其用途
CN106974939B (zh) * 2016-01-15 2020-08-25 深圳华大生命科学研究院 厚壁菌类益生菌在治疗和预防肥胖及其相关疾病中的应用
GB2557823A (en) * 2016-03-04 2018-06-27 Univ California Microbial consortium and uses thereof
KR101815692B1 (ko) * 2016-07-25 2018-01-16 주식회사 고바이오랩 구강 세균의 군집을 이용한 대사성 질환 진단용 바이오 마커
KR101833502B1 (ko) 2016-12-16 2018-03-05 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 위암 진단방법
US11129858B2 (en) 2016-12-20 2021-09-28 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for inhibiting seizures
KR101833348B1 (ko) 2016-12-26 2018-03-02 주식회사 엠디헬스케어 세균 메타게놈 분석을 통한 유방암 진단방법
TWI609959B (zh) * 2016-12-27 2018-01-01 財團法人國家實驗研究院 減少體重獲得、體脂肪堆積或肝臟中三酸甘油酯累積之屎副擬桿菌及包含其之組成物及其用途
US11834695B2 (en) 2017-05-18 2023-12-05 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Marker and method for determination of Parkinson's disease
CN107506582A (zh) * 2017-08-16 2017-12-22 周礼红 一种基于肠道微生物的健康风险预测系统
CN107674912B (zh) * 2017-09-27 2021-04-30 苏州大学 血清16SrDNA作为糖尿病肾病的生物标志的应用
EP3773645A4 (en) 2018-04-10 2021-11-24 Siolta Therapeutics, Inc. MICROBIAL CONSORTIA
KR102225939B1 (ko) * 2018-04-19 2021-03-10 주식회사 고바이오랩 신규한 Bacteroides vulgatus 균주 및 이를 유효 성분으로 하는 면역 및 대사성 질환 예방 또는 치료용 조성물
CN108796100B (zh) * 2018-06-21 2020-09-29 中国科学院微生物研究所 基于惰性真杆菌预测艾滋病人haart治疗效果的引物
JP6533930B1 (ja) * 2018-08-23 2019-06-26 一般社団法人日本農業フロンティア開発機構 疾病評価指標算出方法、装置、システム、及び、プログラム、並びに、疾病評価指標を算出するためのモデル作成方法。
KR102134534B1 (ko) * 2019-01-11 2020-07-16 울산대학교 산학협력단 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 유아의 아토피피부염 조기 진단용 조성물
KR102208193B1 (ko) * 2019-01-31 2021-01-27 울산대학교 산학협력단 장내 미생물 군집의 변화를 이용한 아토피피부염 발생 및 지속성 예측
WO2020251249A1 (ko) * 2019-06-11 2020-12-17 주식회사 천랩 영유아의 장내 미생물 불균형도를 탐지하는 방법
WO2021071864A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Siolta Therapeutics, Inc. Therapeutic pharmaceutical compositions
CN110672858A (zh) * 2019-10-18 2020-01-10 郑湘榕 一种检测试剂盒在制备用于婴幼儿喘息性疾病的检测试剂盒中的应用
KR102363092B1 (ko) 2020-06-19 2022-02-16 한국식품연구원 장내 미생물을 이용한 비만 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 그를 이용한 진단키트, 정보제공방법 및 비만 예방 또는 치료제 스크리닝 방법
KR102363088B1 (ko) 2020-06-19 2022-02-16 한국식품연구원 장내 미생물을 이용한 당뇨병 위험도 예측 또는 진단용 조성물, 그를 이용한 진단키트, 정보제공방법 및 당뇨병 예방 또는 치료제 스크리닝 방법
KR20220041401A (ko) 2020-09-25 2022-04-01 한국식품연구원 장내 미생물을 이용한 당뇨병 개선, 예방 또는 치료용 조성물 및 그를 이용한 당뇨병의 치료방법
KR20220041403A (ko) 2020-09-25 2022-04-01 한국식품연구원 장내 미생물을 이용한 비만 개선, 예방 또는 치료용 조성물 및 그를 이용한 비만의 치료방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070178478A1 (en) * 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
US20130005586A1 (en) * 2010-03-01 2013-01-03 Stanislav Ehrlich Method of diagnostic of obesity
KR20130094730A (ko) * 2010-07-05 2013-08-26 소니 주식회사 생체 정보 처리 방법 및 장치, 기록 매체 및 프로그램
KR20140012052A (ko) * 2010-12-30 2014-01-29 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 표적 미생물 검출을 위한 용품 및 방법

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1281772A1 (en) * 2001-07-31 2003-02-05 Aladar A. Szalay Light-emitting microorganisms and cells for tumour diagnosis/therapy
EP1992351B1 (en) * 2007-05-18 2016-05-11 Nestec S.A. Lactobacillus johnsonii for prevention of postsurgical infection
WO2010080836A2 (en) 2009-01-06 2010-07-15 C3 Jian, Inc. Antibacterial and antifungal peptides
JP2014525266A (ja) * 2011-08-26 2014-09-29 マイクロバイオータ ダイアグノスティクス， エルエルシー 心欠陥を診断および治療する方法
CN103131647B (zh) * 2011-11-29 2017-06-27 上海上药信谊药厂有限公司 婴儿双歧杆菌及其制剂
CN102743420A (zh) * 2012-06-06 2012-10-24 上海交通大学 改善肠道菌群结构的方法及应用
US20150211053A1 (en) * 2012-08-01 2015-07-30 Bgi-Shenzhen Biomarkers for diabetes and usages thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070178478A1 (en) * 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
US20130005586A1 (en) * 2010-03-01 2013-01-03 Stanislav Ehrlich Method of diagnostic of obesity
KR20130094730A (ko) * 2010-07-05 2013-08-26 소니 주식회사 생체 정보 처리 방법 및 장치, 기록 매체 및 프로그램
KR20140012052A (ko) * 2010-12-30 2014-01-29 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 표적 미생물 검출을 위한 용품 및 방법

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