CN113584193B - 毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用 - Google Patents

毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用。本发明的研究结果表明，慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物单药治疗的有效组和无效组肠道微生物群落的物种多样性和组成没有显著差异，有效组和无效组肠道菌群差异的主要来源是毛螺菌科。根据LEfSe和qPCR分析，在毛螺菌科下属的分类单元中，有效组中毛螺菌属的相对丰度显著高于无效组。扩大队列中qPCR检测的结果也证实，与无效组相比，有效组毛螺菌属的相对丰度显著增加。ROC分析显示，毛螺菌属对CSU患者抗组胺药疗效的评价具有中等诊断价值。因此，毛螺菌属是预测CSU患者抗组胺药物疗效的一个标志物。

Description

毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的 标志物的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用。
背景技术
慢性自发性荨麻疹是一种常见的慢性复发性炎症性皮肤病，以风团和瘙痒为主要临床表现，病程超过6周。本病的年患病率约为0.02％～0.4％，大多数患者的病程在1～5年，对患者的生活质量有显著的影响。有文献报道该病对患者生活质量的影响类似于冠心病，给患者的家庭和社会造成巨大的经济负担。然而，目前该病的病因仍然未明，以二代H1受体抗组胺药物为主的对症治疗仍是慢性自发性荨麻疹患者的一线治疗方案，但约50％的患者对常规剂量的二代H1受体抗组胺药物治疗无效。虽然二代H1受体抗组胺药物较第一代H1受体抗组胺药物透过血脑屏障的能力显著降低，但仍有相当比例的患者出现不同程度的中枢神经系统副作用，如嗜睡、认知或精神运动能力下降，甚至有少数患者出现严重的不良反应。精准医疗是当今医学发展的趋势，如何预测慢性自发性荨麻疹患者对抗组胺药物的疗效，减少副作用一直是临床研究的重要课题。
目前对抗组胺药物疗效的评价多采用量表，包括UAS7评分、UCT评分等，但只能评价药物疗效，且多为主观性指标，尚缺乏对抗组胺药物疗效的预测指标。
发明内容
基于此，有必要提供一种可作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用。
本发明提供了毛螺菌属的定量检测剂在制备用于评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的试剂盒中的应用。
在其中一个实施例中，所述定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。
在其中一个实施例中，所述定量检测剂为能够特异性结合毛螺菌属16s rDNA的探针或引物。
在其中一个实施例中，所述探针或引物带有可检测的标记。
在其中一个实施例中，所述标记为荧光标记物、化学发光探针或同位素标记物。
在其中一个实施例中，所述定量检测剂为毛螺菌属16s rDNA的PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述DNA提取试剂包括消化缓冲液、裂解液、蛋白酶K和核糖核酸酶A。
在其中一个实施例中，所述试剂盒中还包括DNA建库试剂。
在其中一个实施例中，所述抗组胺药物为地氯雷他定。
本发明根据抗组胺药物单药治疗的疗效，将CSU患者分为有效者和无效者，采用16s rDNA测序15例有效者和15例无效者粪便肠道菌群，并用定量聚合酶链式反应(qPCR)对两组之间有差异的肠道微生物种类进行了验证。以30名有效者和30名无效者的粪便样本肠道菌群作为一个扩展队列，进一步通过qPCR验证上述两组之间有差异的菌种。采用受试者操作特征曲线(ROC)评价肠道菌群在正确识别有效者和无效者中的诊断价值。结果表明，15名有效者与15名无效者肠道菌群的多样性和群落组成无显著性差异，毛螺菌科及其下属分类单元是有效者与无效者肠道菌群的主要差异，有效者的毛螺菌属相对丰度高于无效者，毛螺菌属在评价抗组胺药物疗效方面具有中等预测价值。因此，毛螺菌属是预测CSU患者抗组胺药物疗效的一个标志物。
附图说明
图1为肠道菌群的稀疏曲线，测序深度达到一定程度后，检测到的OTU数量不再增加；
图2为肠道菌群的物种积累曲线，样本数量达到一定程度后，检出的细菌种类不再增多；
图3为肠道菌群的α多样性指数图，在4个α多样性指数中，R组Shannon指数略高于NR组(*p<0.05)；
图4为肠道菌群的未加权unifrac分析图和加权unifrac分析图，R组与NR组肠道菌群结构无明显差异；
图5为R组和NR组共有和独有的OUT示意图；
图6为R组和NR组肠道菌群在门水平上的比较图；
图7为R组和NR组肠道菌群在纲水平上的比较图；
图8为R组和NR组肠道菌群在目水平上的比较图；
图9为R组和NR组肠道菌群的相对丰度(*p<0.05)；
图10为R组和NR组肠道菌群在科水平上的比较图(*p<0.05)；
图11为R组与NR组肠道菌群在门水平到种水平的差异，同心圆排列的黑色环分别代表门、纲、目、科、属、种(图中仅标记出纲、目、科)，环上的每个黄色点表示两组之间没有显著差异的物种，环上的每个红点表明R组物种丰度较高，环上的每个绿点表明NR组物种丰度较高，各点直径与物种相对丰度呈正相关；
图12为R组与NR组肠道菌群在属水平上的差异；
图13为R组与NR组肠道菌群在种水平上的差异；
图14为根据受试者操作特征曲线(ROC)分析R组和NR组毛螺菌属(A)、Tyzzerella(B)、Clostridium colinum(C)、Eubacterium hallii(D)和Lachnospiraceae bacteriumTf01-11(E)的潜在诊断价值；
图15为定量聚合酶链反应(qPCR)检测和受试者操作特征曲线(ROC)的分析，其中A为初始队列中R组和NR组的毛螺菌属的相对丰度(**p<0.01)，B为扩展队列中R组和NR组的毛螺菌属的相对丰度(**p<0.01)，C为毛螺菌属在初始队列中的潜在诊断价值，D为毛螺菌属在扩展队列中的潜在诊断价值。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
肠道菌群是人体最大和最复杂的微生物群落。肠道菌群编码基因的数量约为人体基因组数量的150倍，肠道菌群如此巨大的基因数量能够产生丰富的酶库，具有对药物代谢的巨大潜力。研究人员检测了来自不同分支的76种肠道细菌对271种口服药物的代谢能力，结果显示约三分之二的检测药物至少能够被一种肠道细菌所代谢。肠道菌群对药物代谢产生的结果包括如下几个方面：①促进药物发挥作用，如口服柳氮磺胺吡啶后需在肠道细菌作用下分解为5-氨基水杨酸和磺胺吡啶而发挥作用。②导致药物失效：如吉西他滨是一种细胞周期特异性的抗肿瘤药物，肠道中的γ-变形菌可通过产生胞苷脱氨酶而使其失去活性。③协同药物发挥作用：例如PD-1/PD-L1抗体药物能够通过增强宿主的免疫反应而抑制肿瘤。研究人员发现转移性黑素瘤患者肠道中存在粪肠球菌、产气柯林斯菌和长双歧杆菌能够通过激活宿主的免疫系统来协同PD-1/PD-L1抗体药物发挥作用。因此肠道菌群对药物的疗效具有重要的影响，然而，肠道菌群是否影响慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物的疗效尚未报道。
本发明提供了毛螺菌属的定量检测剂在制备用于评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的试剂盒中的应用。
本发明根据抗组胺药物单药治疗的疗效，将CSU患者分为有效者和无效者，采用16s rDNA测序15例有效者和15例无效者粪便肠道菌群，并用定量聚合酶链式反应(qPCR)对两组之间有差异的肠道微生物种类进行了验证。以30名有效者和30名无效者的粪便样本肠道菌群作为一个扩展队列，进一步通过qPCR验证上述两组之间有差异的菌种。采用受试者操作特征曲线(ROC)评价肠道菌群在正确识别有效者和无效者中的诊断价值。结果表明，15名有效者与15名无效者肠道菌群的多样性和群落组成无显著性差异，毛螺菌科及其下属分类单元是有效者与无效者肠道菌群的主要差异，有效者的毛螺菌属相对丰度高于无效者，毛螺菌属在评价抗组胺药物疗效方面具有中等预测价值。因此，毛螺菌属是预测CSU患者抗组胺药物疗效的一个标志物。
在一个具体示例中，定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。可以理解，被本领域技术人员所知的其余可定量毛螺菌属的检测试剂均属于上述“毛螺菌属的定量检测剂”。
在一个具体示例中，上述定量检测剂为能够特异性结合毛螺菌属16s rDNA的探针或引物。
在一个具体示例中，探针或引物带有可检测的标记。可选地，标记为荧光标记物、化学发光探针或同位素标记物。
在一个具体示例中，上述定量检测剂为毛螺菌属16s rDNA的PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。可以理解，引物序列不限于此，可根据需要筛选。
在一个具体示例中，试剂盒中还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。
在一个具体示例中，DNA提取试剂包括消化缓冲液、裂解液、蛋白酶K和核糖核酸酶A。可选地，试剂盒中还包括DNA建库试剂。
在一个具体示例中，抗组胺药物为氯雷他定、地氯雷他定、西替利嗪、左旋西替利嗪或非索非那定，但不限于此。
本发明一实施例的慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的评估方法，其包括以下步骤：对慢性自发性荨麻疹患者体内的毛螺菌属进行定量检测，毛螺菌属的丰度越高抗组胺药物疗效越好。
毛螺菌属在评价抗组胺药物疗效方面具有中等预测价值，毛螺菌属的丰度与抗组胺药物疗效正相关，因此，毛螺菌属是预测CSU患者抗组胺药物疗效的一个标志物，根据其丰度可以有效评估抗组胺药物疗效。
下面主要结合具体实施方式和附图对本发明作进一步详细的说明。
一、实验方法
1.伦理批准
所有慢性自发性荨麻疹患者均为中南大学湘雅医院皮肤科就诊的患者。该项研究已经通过了湘雅医院伦理委员会的批准。每例患者在入组之前均需签署知情同意书。
2.研究对象的纳入和排除
具有丰富临床经验的医师根据国际上慢性自发性荨麻疹的诊疗指南来诊断慢性自发性荨麻疹患者。慢性自发性荨麻疹患者的入选标准如下：①首次诊断为CSU并在研究期间单用地氯雷他定治疗的患者；②年龄在18～60岁；③无其他已知疾病(如高血压病、糖尿病、哮喘、肿瘤等)；④采样前3个月内未使用益生元或益生菌、抗生素、糖皮质激素等；⑤采样前1个月内未使用抗组胺药；⑥采样前3天内未食用奶酪、酸奶或泡菜；⑦样品采集前在长沙居住一年以上。排除标准如下：①与其他亚型荨麻疹共存(如人工荨麻疹)；②未按要求采集标本；③在研究期间使用其他药物(如抗组胺药西替利嗪和糖皮质激素)；④妊娠期或哺乳期。
3.样本的收集和保存
入组的患者按以下要求留取粪便标本。①患者排便后5分钟之内收集样本。②使用无菌棉签伸入粪便内部，旋转5圈，然后将带有粪便标本的棉头放入含有DNA保存液的收集管中，轻轻晃动使棉头上的粪便均匀的分散在液体中，将棉签丢弃。③收集管标记好样本信息后放-80℃冰箱保存备用。
4.粪便样本中肠道菌群基因组DNA的提取和扩增
采用CTAB/SDS法提取粪便基因组DNA。用2％琼脂糖凝胶电泳法测定DNA的浓度和纯度。用带特定编码的特异性引物(341F(cctayggrbgcascag)、806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT))扩增16s rDNA的v3-v4区。PCR反应混合物包括：模板DNA 10ng，正反向引物各0.2μM和15μL PCR反应混合物。PCR反应步骤如下：98℃预变性1分钟，30个热循环步骤(98℃变性10秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒)，最后在72℃延伸5分钟。
5.粪便样品的16s rDNA测序
利用TruSeq PCR-Free DNA建库试剂盒制备带有指示码的测序文库。测序文库的质量通过Qubit@2.0荧光计和Agilent Bioanalyzer 2100系统进行评估。最后，在Illuminanovaseq6000平台上对该文库进行测序以产生250bp配对末端读长。
6.测序数据的生物信息学分析
根据唯一的指示码将成对的末端读长与样品匹配，并去除指示码和引物序列。使用FLASH软件拼接成对的末端读长以产生原始标签。使用QIIME过滤原始标签以获得高质量的清洁标签。通过UCHIME算法将清洁标签与参考数据库(Silva数据库)进行比对，然后检测并去除嵌合体序列以获得有效标签。使用Uparse软件将相似序列≥97％的视为同一个操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。每个OTU的代表性序列在Silva数据库中被进一步注释以获得菌种分类信息。OTU丰度用序列数最少的样本进行标准化。
物种多样性分析采用α多样性指数，包括Shannon、Observed species、Chao1和Simpson。β多样性指数用来分析组间物种组成的差异，并用基于加权和非加权unifrac距离的主坐标分析图进行表示。如果两组数值变量符合正态分布，则采用t检验，否则采用Wilcoxon秩和检验。采用线性判别分析(LDA)效应大小(LEfSe)确定两组间存在显著差异的物种作为潜在的生物标志物。进行受试者操作特征曲线(ROC)分析以确定特定物种的潜在诊断效能。P<0.05被认为具有统计学意义，除非另有说明。
7.16S rDNA的定量PCR(Quantitative PCR，qPCR)验证
用qPCR进一步验证慢性自发性荨麻疹患者有效组和无效组之间有差异的菌种。总细菌的引物参考已发表的文献获得，毛螺菌属的引物利用BioEdit软件获得毛螺菌属下所包括的三种菌V3-V4区的共有序列，基于共有序列利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)软件设计引物，利用TestPrime 1.0(https://www.arb-silva.de)软件评估每对引物的特异性和覆盖度，引物如表1所示。PCR反应混合物包括：5ng基因组DNA、5μL UltraSYBR混合物和0.2μL上游和下游引物。PCR反应步骤如下：95℃预变性10分钟，40个热循环(95℃变性15秒，56℃退火20秒，72℃延伸1分钟)，然后在72℃延伸5分钟。计算特定菌株(i)的相对丰度：相对丰度(i)＝2-ΔCT＝2-(CTi-CTt)，其中CTi和CTt分别代表物种i和细菌总数的引物循环阈值。
表1
8.抗组胺药物单药治疗疗效评价
对患者抗组胺药物的疗效进行门诊或电话随访。根据以往的文献报道，疗效评价指标为服用抗组胺药物4周UAS评分下降≥50％为抗组胺药物有效，UAS评分下降＜50％为无效。
二、实验结果
1.纳入的CSU患者的临床特征
共有90名CSU患者被纳入初始队列和扩展队列。初始队列包括15名有效者和15名无效者(表2)，扩展队列包括30名有效者和30名无效者(表3)。有效组和无效组在性别、年龄、腰围、体重指数、病程、皮肤病生活质量指数(DLQI)和UAS7方面无显著性差异(表2～表3)，表明现有的混杂因素对两组之间的差异无显著影响。在初始队列中进行粪便样本的16SrDNA测序和qPCR。在扩大的队列中，仅对粪便样本进行qPCR。
表2
表3
2.肠道菌群α多样性和β多样性分析
通过16S rDNA测序，平均每个样本获得63949个有效标签和414nt碱基长度(表4)。然后，共获得746个OTU并进一步注释以供后续分析。稀疏曲线(图1，R：有效组，NR：无效组)和物种积累曲线(图2)的稳定趋势表明，两组的测序量和样本量都足够大，可以覆盖所有类群，反映物种多样性。如图3所示，在四个α多样性指数中，只有香农指数显示两组之间有轻微差异。如图4所示，未加权unifrac(Adonis:R2＝0.047，p＝0.162)和加权unifrac(Adonis:R2＝0.082，p＝0.067)的β多样性在两组间无显著差异。
表4
3.肠道菌群变化及潜在的生物标志物
如图5所示，有效组和无效组共有724个OTU，有效组和无效组分别独有13个OTU和9个OTU。如图6～8所示，从门水平到目水平，两组之间的分类单元没有显著差异。如图9～10所示，在科水平上，有效组中毛螺菌科的相对丰度显著高于无效组。如图11所示，通过线性判别分析，发现毛螺菌科是区分有效组和无效组的主要分类单元。如图12～13所示，与无效组相比，有效组中7个属和6个种的相对丰度增加，而1个属和4个种的相对丰度减少。如图14所示，进一步的ROC分析显示，毛螺菌属(AUC:0.782，相对丰度：5.97％，图14A)、Tyzzerella(AUC:0.724，相对丰度：0.19％，图14B)、Clostridium colinum(AUC:0.783，相对丰度：0.08％，图14C)、Eubacterium hallii(AUC:0.756，相对丰度：0.33％，图14D)和Lachnospiraceae bacterium Tf01-11(AUC:0.731，相对丰度：0.15％，图14E)在评估抗组胺药物疗效方面具有中等诊断价值(AUC>0.7)。
4.初始队列和扩展队列的QPCR验证
由于16S rDNA测序的局限性，我们通过qPCR在初始队列中验证了上述具有潜在诊断价值的种或属。结果表明，只有毛螺菌属在有效组和无效组之间有显著差异(图15A)。为了克服小样本量的局限性，我们在扩大的队列中通过qPCR进一步验证了毛螺菌属，发现有效组中毛螺菌属的丰度仍然显著高于无效组(图15B)。我们用ROC分析了qPCR计算的物种相对丰度，结果表明，无论是在初始队列(图15C)还是在扩展队列(图15D)中，毛螺菌属在评估抗组胺药对CSU患者的疗效方面仍然显示出中等的诊断价值。
5.结论
我们的研究结果表明，有效组和无效组肠道微生物群落的物种多样性和组成没有显著差异。有效组和无效组肠道菌群差异的主要来源是毛螺菌科。根据LEfSe和qPCR分析，在毛螺菌科下属的分类单元中，有效组中毛螺菌属的相对丰度显著高于无效组。此外，扩大队列中qPCR检测的结果也证实，与无效组相比，有效组毛螺菌属的相对丰度显著增加。ROC分析显示，毛螺菌属对CSU患者抗组胺药疗效的评价具有中等诊断价值。
研究结果还表明，毛螺菌属的相对丰度与抗组胺药的疗效呈正相关。毛螺菌属是一组厌氧、弱革兰氏阳性细菌，可产生乙酸和丁酸。研究人员发现，毛螺菌属丰度的降低与IgE相关的过敏性疾病和免疫介导的炎症性疾病有关，如哮喘和克罗恩病。在克罗恩病或英夫利昔单抗治疗改善后，毛螺菌属的相对丰度增加或恢复正常。
毛螺菌属如何影响抗组胺药的疗效尚不清楚。肠道微生物可以通过各种方式影响药物的疗效。首先，肠道微生物可通过多种酶代谢药物，导致药物失效。例如，粪肠球菌通过脱羧酶将左旋多巴(一种治疗帕金森病的药物)转化为多巴胺，新生成的多巴胺会进一步降解成更小的分子，导致药物无效。再如，吉西他滨是一种细胞周期特异性代谢抗肿瘤药物。γ变性杆菌可使结肠癌患者的肠道产生胞苷脱氨酶，从而使吉西他滨失去活性，从而导致治疗失败。其次，肠道细菌可以通过免疫途径影响药物的疗效。PD-1/PD-L1抗体药物可以通过增强宿主的免疫力来抑制肿瘤的发生发展。研究人员发现，对PD-1/PD-L1抗体治疗反应良好的转移性黑色素瘤患者体内含有大量的屎肠球菌、产气柯林斯菌和长双歧杆菌，这有利于激活免疫系统，帮助药物发挥作用。CSU是一种肥大细胞驱动的疾病，与Th2免疫反应和IgE有关。我们推测毛螺菌属可能通过两种方式促进抗组胺药的作用。首先，毛螺菌属可能通过代谢途径提高抗组胺药的疗效。丁酸可通过抑制组蛋白去乙酰酶来抑制肥大细胞活化。因此，毛螺菌属可能通过产生丁酸来抑制肥大细胞的活化，从而促进抗组胺药控制慢性荨麻疹。另一方面，毛螺菌属可能通过免疫途径协助抗组胺药控制CSU。作为梭状芽胞杆菌簇XIVa的一员，毛螺菌属促进结肠调节性T(Treg)细胞积聚并降低IgE水平。由于Treg细胞可以抑制初始T细胞向Th2细胞的分化，而丁酸盐可以促进Treg细胞的分化，我们推测毛螺菌属可能通过直接促进Treg细胞的分化和降低IgE水平协助抗组胺药发挥作用，或通过产生丁酸盐间接促进Treg细胞的分化。然而，还需要进一步的研究来证实这些可能的机制。
综上所述，我们的研究结果证明毛螺菌科及其下属的分类单元是CSU抗组胺药物有效组和无效组主要的差异来源。毛螺菌属可作为抗组胺药疗效的标志，具有中等价值。我们的结果提示，除了遗传因素外，肠道微生物群也是影响抗组胺药疗效的一个因素，这可能为进一步精准治疗慢性自发性荨麻疹患者提供了一个新的视角。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 毛螺菌属作为评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的标志物的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgactaag aagctccggc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
caaaagcagt tccggggttg 20

Claims (9)

1.毛螺菌属的定量检测剂在制备用于评估慢性自发性荨麻疹患者抗组胺药物疗效的试剂盒中的应用，其特征在于，所述抗组胺药物为地氯雷他定。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂包括适用于如下至少一种方法的试剂：
荧光染料法、数字PCR、共振光散射法、实时荧光定量PCR、测序或生物质谱法。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂为能够特异性结合毛螺菌属16s rDNA的探针或引物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述探针或引物带有可检测的标记。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述标记为荧光标记物、化学发光探针或同位素标记物。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测剂为毛螺菌属16s rDNA的PCR引物，其上游引物如SEQ ID NO.1所示，下游引物如SEQ ID NO.2所示。
7.根据权利要求1～6任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、dNTPs以及DNA聚合酶中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述DNA提取试剂包括消化缓冲液、裂解液、蛋白酶K和核糖核酸酶A。
9.根据权利要求1～6、8任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA建库试剂。
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