TWI674409B - 新穎結核病生物標誌物、以之評估結核病發生風險、治療效果及其預後之方法 - Google Patents

新穎結核病生物標誌物、以之評估結核病發生風險、治療效果及其預後之方法 Download PDF

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Abstract

本發明之主要目的係在提供至少一種新穎生物標幟物：miR-889及或TWEAK，其表現係與潛伏結核感染相關，亦即藉由檢測一樣本中之該生物標誌物之表現或表現量，係能評估或判斷該樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險、結核病之預後或對於治療效果之反應，並且，透過檢測該樣本中之該生物標誌物之表現或表現量，亦能作為篩選結核病治療藥物之標準。

Description

新穎結核病生物標誌物、以之評估結核病發生風險、治療效果及其預後之方法
本發明係有關於二種生物標幟物及以之進行檢測之方法，特別係指新穎結核病生物標誌物、以之評估結核病發生風險、治療效果及其預後之方法。
按，結核病係為全球重要之傳染疾病之一，根據統計，台灣每年結核病之發生率及死亡率係高於其他國家，以2015年之統計資料來說，每10萬人內有45.7個病例及2.4個案件死亡。目前對於活動性結核病之確診方法係為痰液抹片、細菌培養、影像學檢查。由於結核桿菌生長週期緩慢、不容易培養，並且具有高度傳播性，因此，結核桿菌之檢測須於生物安全等級為第3級之實驗室中，使用特殊培養基進行分離純化，使得目前臨床上對於活動性結核病之檢測方法不僅無法達到即時檢測，更無法普遍地應用於各醫療院所。
更進一步來說，大部分結核病之患者係以潛伏結核感染（latent tuberculosis infection, LTBI）形式存在。當患者處於潛伏結核感染形式時，其體內之結核菌數量太少而無法以胸腔影像或是細菌培養之方式進行檢驗診斷。目前臨床上係以結核菌素皮膚測試（tuberculin skin test）及進行血液檢查（interferon-γ release assays）作為潛伏結核感染之主要診斷方法，具體來說，結核菌素皮膚測試操作方便且費用較低，不過於卡介苗施打普及之國家會容易出現偽陽性及靈敏度不佳之缺失；而血液檢查所使用之QFT-G （QuantiFERON-TB Gold）化驗不僅費用高昂，並且無法用於區分潛伏性結核感染及活動性結核病。
由上述說明可知，目前臨床上係缺乏能夠即時快速地檢測、診斷結核病之生物標幟物及其方法。
本發明之主要目的係在提供至少一種新穎生物標幟物：miR-889及或TWEAK，其表現係與潛伏結核感染相關，亦即藉由檢測一樣本中之該生物標誌物之表現或表現量，係能評估或判斷該樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險、結核病之預後或對於治療效果之反應，並且，透過檢測該樣本中之該生物標誌物之表現或表現量，亦能作為篩選結核病治療藥物之標準。
本發明之次一目的係在於提供一種治療或/及改善潛伏結核感染之醫藥組合物，其活性成份係為miR-889抑制劑。
緣是，為能達成上述目的，本發明之一實施例係揭露一種檢測結核桿菌潛伏感染之方法，其係包含下列步驟：
檢測一待測樣本中至少一種生物標幟物之表現量；
分析該待測樣本中生物標幟物之表現量，以判斷或評估該待測樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險。
於本發明之一實施例中，該生物標幟物係為miR-889，而當該待測樣本中miR-889之表現量高於一正常樣本中miR-889之表現量時，顯示該待測樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險為高，而當待測樣本中miR-889之表現量低於一正常樣本中miR-889之表現量時，顯示該待測樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險為低。
於本發明另一實施例中，該生物標誌物係為TWEAK，當該待測樣本中TWEAK之表現量低於一正常樣本中TWEAK之表現量時，顯示該待測樣本提供者被結核菌感染或潛伏結核感染復發之風險為高；而當待測樣本中TWEAK之表現量高一正常樣本中TWEAK之表現量時，顯示該待測樣本提供者被結核菌感染或潛伏結核感染復發之風險為低。
本發明之另一實施例係揭露評估潛伏結核感染患者預後之方法，其係包含下列步驟：檢測一樣本中至少一生物標幟物之表現量；提供一治療方法；檢測接受治療方法後之另一樣本中至少一生物標幟物之表現量；分析該兩樣本中生物標幟物之表現量，以判斷或評估該樣本提供者對於該治療方法之反應或預後。
於本發明之一實施例中，該生物標幟物係為miR-889，當接受該治療方法後之該樣本中miR-889之表現量高於或等於接受該治療方法前之該樣本中miR-889之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應為差並且預後不佳；而當接受該治療方法後之該樣本中miR-889之表現量低於接受該治療方法前之該樣本中miR-889之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應佳並且預後良好。
於本發明另一實施例中，該生物標誌物係為TWEAK。當接受該治療方法後之該樣本中TWEAK之表現量高於或等於接受該治療方法前之該樣本中TWEAK之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應為差並且預後不佳；而當接受該治療方法後之該樣本中TWEAK之表現量低於接受該治療方法前之該樣本中TWEAK之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應佳並且預後良好。
再者，於本發明之一實施例係揭露一種判斷潛伏結核感染病程之方法，其包含下列步驟：
提供一待測樣本，檢測其內TWEAK或/及miR-889之表現量；
提供一正常樣本之TWEAK或/及miR-889之表現量；
比較該待測樣本與該正常樣本內之TWEAK或/及miR-889之表現量，以判斷該待測樣本提供者之潛伏結核感染病程。
舉例來說，當該待測樣本中miR-889之表現量高於一正常樣本中miR-889表現量時，顯示該待測樣本提供者為潛伏結核感染(LTBI)患者；當該待測樣本中TWEAK之表現量高於該正常樣本中TWEAK表現量，顯示該待測樣本提供者為潛伏結核感染復發患者；當該待測樣本中miR-889之表現量低於該正常樣本中miR-889表現量時，顯示該待測樣本提供者潛伏結核感染已治癒。
於本發明之實施例中，該待測樣本、該正常樣本、該樣本係分別得為血液。
於本發明之實施例中，檢測各該樣本中之該生物標幟物之方法係為本發明所屬技術領域且具通常知識者所周知之方法，如ELISA、QRT-PCR等。
又，基於miR-889之過度表現係與結核桿菌之致病機制有關，因此，於本發明之一實施例中係揭露一種醫藥組合物，其係包含一有效量之miR-889抑制劑，以及至少一藥學上能接受之載體。而藉由投予本發明所揭醫藥組合物至一具潛伏結核感染之個體，係能夠減緩或/及治療結核桿菌潛伏感染之病症。
本發明係揭露一種用於檢測結核病之新穎生物標幟物，其係為miR-889及/或TWEAK。由於該生物標幟物之表現係與結核桿菌之潛伏感染、潛伏結核感染之病程及潛伏結核感染之預後間有相關性，因此，透過檢測一樣本中之miR-889或/及TWEAK之表現量係能夠作為臨床上即時且準確地評估或判斷該樣本提供者之結核病病程、結核桿菌感染情形及結核病治療成效。
以下，為能驗證本發明之功效，將茲舉若干實例及圖式做更進一步說明如后。
本發明所揭實例中之臨床試驗係經由臺中榮民總醫院倫理委員會核准（CE13330B），並且依據赫爾辛基宣言取得各受試者之書面同意。
實例一：受試者臨床檢測結果
募集80位類風濕關節炎（rheumatoid arthritis）患者（下稱RA患者），分別符合美國RA風濕病學會（ACR）2010年修訂標準，以及23名健康受試者。根據28-關節疾病活動度指數（DAS28）評估RA患者之疾病活動度，而本實例中所募集之RA患者之疾病活動度指數（DAS28）係大於 3.2，其中，66位（82.5％）RA患者接受符合英國風濕病學會指引之生物製劑治療，其餘14位（17.5％）RA患者僅接受常規合成之緩解型抗風濕藥物（csDMARDs），並且排除經細菌培養或病理檢查確診為活動性結核感染之RA患者。
所有RA患者係依據結核病感染之基準進行標準訪談、生理檢查及胸腔影像檢查，並以QFT-G分析法進行血液檢查，其中，QFT-G分析之結果為IFN-γ大於等於0.35 IU/ml時，化驗結果為陽性，顯示該RA患者具有潛伏結核感染，且為一個預防性治療之指標。所有RA患者之檢查結果係如表一所示，其中，LTBI(+)組係為具潛伏結核感染之RA患者，NTM組係為非結核分枝桿菌感染之RA患者，LTBI(-)組係為未被分枝桿菌感染之RA患者。
表一：各組受試者之生理檢測、訪談結果
LTBI(+)組 （n=33） NTM組（n=12） LTBI(-)組 （n=35）
受試年紀（歲） 60.5±13.4 62.1±10.7 59.9±12.2
性別（女，%） 24（72.7） 8（66.7） 27（77.1）
疾病期間（年） 9.4±5.6 9.6±4.5 10.6±2.8
併發症
糖尿病 4（12.1） 2（16.7） 3（8.6）
慢性腎病 4（12.1） 3（25.0） 5（14.3）
類風濕因子（陽性，％） 25（75.8） 5（41.6） 25（71.4）
抗環瓜氨酸（CCP）抗體（陽性，％） 30（90.9） 8（66.7） 25（71.4）
受試時之DAS28 3.9±1.5 3.8±1.7 3.6±0.2
紅血球沉降率（mm/h） 28.7±8.3 11.5±3.5 16.4±8.8
C反應蛋白（mg/dL） 0.95±1.47 1.14±1.15 0.98±1.49
Prednisolone劑量（mg/day） 4.4±2.8 4.7±1.7 3.9±1.8
Methotrexate（％） 20（60.6） 4（33.3） 15（42.9）
Hydroxychloroquine（％） 17（51.5） 7（58.3） 8（22.9）
Sulfasalazine（％） 7（21.2） 2（16.7） 4（11.4）
生物製劑療法（％） 27（81.8） 9（75.0） 30（85.7）
Adalimumab 12（36.4） 3（25.0） 12（34.3）
Etanercept 8（24.2） 4（33.3） 8（22.9）
Rituximab 6（18.2） 2（16.7） 7（20.0）
Abatacept 0（0） 0（0） 2（5.7）
Tocilizumab 1（3.0） 0（0） 1（2.9）
實例二：分離miRNA
以TRIzol試劑（Invitrogen, ThermoFisher 140 Scientific, USA）萃取總RNA，並以RNeasy MinElute Cleanup套組（QIAGEN, Germany）進行純化。純化後之RNA以分光光度計於OD 260及280nm下進行定量，並使用Bioanalyzer 2100（Agilent Technology，Palo Alto，CA，USA）以毛細管凝膠電泳鑑定分離之miRNA。而為了以QRT-PCR驗證萃取自血漿之miRNA，添加合成秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）miRNA （cel-miR-39, 147 Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA）作為內控。
實例三：反轉錄定量聚合酶鏈鎖反應（下稱QRT-PCR）
藉由TaqMan miRNA檢測套組（Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific, USA）檢測樣本中miRNA表現，並以StepOnePlus即時PCR系統進行QRT-PCR，將小核RNA（small nuclear RNA，下稱RUN6）及合成cel-miR-39（下稱cel-miR-39）分別作為細胞及血漿之內控基因。目標基因之倍數表現係以比較閥值循還（Ct）法計算目標基因相對於樣本中內控基因之平均表現而得者，並由2dCt進行評估，其中，dCt 為健康控制組平均值（Ct miRNAs gene–Ct Rnu6/cel-miR-39）扣除病患組平均值（Ct miRNAs gene–Ct Rnu6/cel-miR-39）。
實例四：細胞培養
以Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden）藉由密度梯度離心之方式自靜脈血中分離出周邊血液單核細胞。 將周邊血液單核細胞和人類單核細胞株（下稱THP-1細胞，ATCC TIB-202）培養於添加10％胎牛血清、1x非必需氨基酸、100 單位/ ml青黴素和100單位/ ml鏈黴素之RPMI培養液1640（Gibco, ThermoFisher Scientific, USA）中，並於含有5％二氧化碳及37℃之環境下進行培養。為能誘導分化形成巨噬細胞，THP-1細胞（1× 106 cells/mL）於RPMI培養液培養，並且以10ng/ml PMA（phorbol myristate acetate, Sigma, USA）處理過夜
實例五：以次世代定序分析miRNA之差異表現
分別取LTBI(+)組及LTBI(-)組之受試者的周邊血液單核細胞，並且分別進行miRNA次世代定序分析，結果如第一圖及表二所示，其中，當miRNA之倍數變化值大於2.00或小於0.33時，該差異係被定義為顯著。
而miRNA 次世代定序（NGS）分析流程如下：以總RNA-Seq套組v2.0（ThermoFisher Scientific, USA）建制小RNA庫，並以Ion PGM Template OT2 200 套組（ThermoFisher Scientific, USA）製備模板，而Ion PGM Template OT2 200 套組與晶片係與Ion PGM定序儀一起使用。以配對軟體（built-in Torrent Suite software v4.0, ThermoFisher Scientific, USA）進行與人類hg19基因組進行比對，並以Partek Genomic Suite 6.6（Partek）進行差異表現分析。
表二：以次世代定序分析法檢測LTBI(+)組受試者與LTBI(-)組受試者之周邊血液單核細胞內之miRNA表現
正調控miRNA 倍數變化（中位數） 負調控miRNA 倍數變化（中位數）
has-miR-889 4.02 has-miR-9-5p 0.32
has-miR-193a 3.03 has-miR-4676 0.30
has-miR-21 2.22 has-miR-1229 0.20
has-miR-539-3p 2.40 has-miR-3657 0.32
has-miR-941 2.14 has-miR-634 0.28
has-miR-485-3p 2.32 has-miR-450a 0.28
has-miR-7e-3p 0.31
has-miR-337 0.20
has-miR-125a-3p 0.27
has-miR-766-5p 0.24
has-miR-32-3p 0.16
由第一圖及表二之結果顯示於周邊血液單核細胞（peripheral blood mononuclear cells）共有17個miRNA顯著表現，其中，相較於LTBI(-)組，於LTBI(+)組中有6個miRNA為正調控，11個miRNA為負調控。
實例六：分枝桿菌會誘導周邊血液單核細胞表現miR-889
將牛分枝桿菌BCG（M. bovis BCG）培養於Middlebrook 7H11培養基，並於含有5％二氧化碳及37℃之環境下進行培養。
將周邊血液單核細胞分為2組，其中一組係以牛分枝桿菌BCG (MOI=0.1)進行感染處理，另一組則為空白組，而分別於培養6及8天後檢測其內miR-889之表現量，結果如第二圖所示。
由第二圖之結果顯示，周邊血液單核細胞經牛分枝桿菌BCG感染後會使其內miR-889之表現量增加，並且，miR-889之表現量會隨著感染時間增加而提高。
實例七：以QRT-PCR驗證miR-889係為結核病之生物標幟物
以QRT-PCR檢測LTBI(+)組受試者及LTBI(-)組受試者之周邊血液單核細胞內miR-889之表現，結果如第三圖所示。以QRT-PCR檢測LTBI(+)組受試者、NTM組受試者、LTBI(-)組受試者及健康控制組受試者之血漿內miR-889之表現，並以健康控制組為控制組，結果第四圖所示。
又，於LTBI組受試者接受3個月藥物rifapentine及isoniazid治療後，檢測其內miR-889之表現，結果如第五圖所示，並且，藉由QFT-G分析法檢測IFN-γ與miR-889間之關聯性，結果如第六圖所示。
由第三圖之結果可知，當樣本提供者為潛伏結核感染(LTBI)者時，其周邊血液單核細胞內miR-889之表現量為7.42±1.04倍，係高於未感染之樣本提供者（2.22±0.33倍）。由第四圖之結果可知，LTBI(+)組受試者血漿內miR-889之表現量（dCt 3.94±0.59）係分別明顯大於NTM組受試者血漿內miR-889之表現量（dCt 0.77±0.60）、LTBI(-)受試者血漿內miR-889之表現量（dCt 0.68±0.27）及健康控制組之血漿內miR-889之表現量（dCt 0.00±0.26）。
由第五圖及第六圖之結果可知，經投予藥物治療後，LTBI(+)組受試者周邊血液單核細胞內miR-889之表現量係由4.31±0.81倍降低0.92±0.47倍，並且，miR-889之表現量係與IFN-γ間具有正相關。
由此可知，miR-889係能夠作為評估結核桿菌潛伏感染之患者預後及療效之生物標幟物。換言之，當一樣本提供者於接受抗潛伏結核感染療法後，若miR-889之表現量於治療後仍無法降低，顯示該樣本提供者之預後不佳，或是該療法無效。
實例八：以人類結核肉芽腫模式（tuberculosis granuloma model）檢測miR-889表現
牛分枝桿菌BCG之培養方法係如實例六中所述。
將牛分枝桿菌BCG以感染劑量MOI=0.1感染新鮮分離之周邊血液單核細胞(模擬潛伏結核感染模式)，再以添加20％人類血清之RPMI培養基1640，於含有5％二氧化碳及37℃之環境下培養11天，其中，每4天更換血清及培養基。而於感染後之第4、6及8天分別裂解類肉芽腫結構，並將裂解液稀釋培養於培養於Middlebrook 7H11培養基上，並且檢測其內miR-889表現以及菌落數量，結果如第七圖所示。
由第七圖之結果可知，感染牛分枝桿菌BCG第4天時，miR-889表現量為1.00±0.08倍，而感染牛分枝桿菌BCG第8天時，miR-889表現量係增加為2.85±0.21倍。由此結果可知，miR-889表現量係會隨著肉芽腫結構的形成與結核分枝桿菌生長而增加，顯示miR-889係能作為潛伏結核感染及區分結核病病程之生物標幟物。
實例九：TWEAK係為miR-889之靶點
將人類TWEAK（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis）3’UTR端之序列克隆於pMIR-REPORT螢光素酶載體，構築出一TWEAK WT螢光素酶報導質體。
以生物資訊分析法預測miR-889之靶點係為TWEAK（tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis）（基因庫：NM_003809），其3’UTR端係能與miR-889配對，如第八圖所示，進而將該TWEAK之3’UTR端之預測結合點進行突變，構築出一TWEAK MT螢光素酶報導質體，作為控制組。
將該pMIR-REPORT螢光素酶載體（未克隆TWEAK）、該TWEAK WT螢光素酶報導質體、該TWEAK MT螢光素酶報導質體分別轉染THP-1細胞後，再分別以miR-889模擬物、控制模擬物、miR-889抑制劑、控制抑制劑處理並培養，而後分別檢測其內螢光素酶活性、TWEAK mRNA表現及TWEAK分泌量，結果如第九圖A至第九圖C所示。
由第九圖A之結果可知，相較於控制抑制劑，miR-889抑制劑係會增加轉染TWEAK WT螢光素酶報導質體之細胞內螢光素酶之活性，並且，miR-889模擬物係會降低轉染TWEAK WT螢光素酶報導質體之細胞內螢光素酶之活性。
由第九圖B及第九圖C之結果可知，經miR-889模擬物處理而過度表現miR-889之THP-1細胞，其TWEAK mRNA表現係為0.49±0.26倍，並其TWEAK分泌量係為2.2±2.6 pg/ml；而以控制模擬物處理之THP-1細胞，其TWEAK mRNA表現係為0.95±0.03倍，並其TWEAK分泌量係為12.2±1.5 pg/ml；未轉染之THP-1細胞，其TWEAK mRNA表現係為1.01±0.02倍，並其TWEAK分泌量係為11.6±0.3 pg/ml。由此可知，相較於未經任何處理之細胞或經控制模擬物處理之細胞，過度表現miR-889之細胞的TWEAK表現量係明顯降低。
因此，根據第九圖之結果顯示，TWEAK的確是miR-889之靶點，並且miR-889之過度表現會使TWEAK表現降低，亦即TWEAK受miR-889負調控。
實例十：以人類結核肉芽腫模式檢測TWEAK表現量。
參考實例十，自RA患者分離取得周邊血液單核細胞，再分別以牛分枝桿菌BCG以感染劑量MOI=0.1感染周邊血液單核細胞(模擬潛伏結核感染模式)，並於感染後第8天(肉芽腫構造形成)檢測其所釋放之TWEAK表現，結果如第十圖所示。
再以MTT分析法檢測經牛分枝桿菌BCG感染之周邊血液單核細胞及未經牛分枝桿菌BCG感染之周邊血液單核細胞之存活率，結果如第十一圖所示。
由第十圖之結果可知，於沒有被牛分枝桿菌感染之細胞分泌TWEAK之量為88.7±1.79 pg/ml，感染牛分枝桿菌之細胞分泌TWEAK之量係明顯減少（51.7±0.13 pg/ml），顯示牛分枝桿菌潛伏感染後會使細胞分泌TWEAK量下降。而由第十一圖之結果可知，感染牛分枝桿菌之細胞之存活率係為未經牛分枝桿菌感染之細胞的1.5倍。由第十圖及第十一圖之結果可知，TWEAK表現量係與細胞存活率間為負相關。
實例十一：TWEAK表現與結核病感染間之關係
分別檢測具潛伏結核感染之RA患者（LTBI(+)）、無感染之RA患者（LTBI(-)）及健康受試者之血清內TWEAK表現，結果如第十二圖A所示。
由第十二圖A之結果可知，TWEAK於具潛伏結核感染之RA患者之表現量為0.63±0.05 ng/ml；TWEAK於無感染之RA患者之表現量為0.81±0.04 ng/ml；TWEAK於健康受試者之表現量為1.02±0.05 ng/ml。
分別檢測具潛伏結核感染之RA患者接受抗潛伏結核感染治療前後之血清內TWEAK表現，結果如第十二圖B所示。
由第十二圖B之結果可知，TWEAK於具潛伏結核感染之RA患者治療前之表現量為0.63±0.05 ng/ml；TWEAK於治療後之表現量為0.81±0.06 ng/ml。
綜合實例九至實例十一之結果可知，即便樣本提供者於結核桿菌感染之潛伏狀態下，其血液內TWEAK表現量仍會具有變化，亦即透過檢測樣本中TWEAK之表現係可判斷或評估該樣本提供者潛伏感染結核桿菌之風險，當樣本中TWEAK之表現量低於一預定正常值時，顯示該樣本提供者遭遇潛伏結核感染之風險性為高；反之，當樣本中TWEAK之表現量等於或接近於一預定正常值時，顯示該樣本提供者遭遇潛伏結核感染之風險性為低。再者，由於TWEAK表現量能夠作為判斷樣本提供者受到結核桿菌感染之狀況，因此，透過檢測且比對樣本提供者接受一預定治療前後之樣本中TWEAK表現量，可以評估該樣本提供者對於該預定治療之反應及其預後。
實例十二：miR-889及TWEAK係能作為判斷潛伏結核感染病程及預後之生物標誌物
所募集之LTBI組受試者中，有一位患者經接收4個月Adalimumab藥物治療後發展為肺部結核病且併發腹水，而後以抗結核桿菌療法進行治療，並以胸腔影像檢查及細菌培養確認該名患者已經完成治療。而分別檢測該名患者於潛伏結核感染狀態、潛伏結核感染復發為活動性結核病及完成抗結核病治療時之周邊血液單核細胞中miR-889及TWEAK mRNA之表現，結果如第十三圖A及第十三圖B所示。
由第十三圖A之結果可知，miR-889之表現量係於來自潛伏結核感染之周邊血液單核細胞中最高，表現量為1.52±0.07倍；次之為潛伏結核復發為活動性結核病狀態時，其周邊血液單核細胞中miR-889之表現量為0.87±0.03倍；而當樣本提供者經過抗結核病治療且已被臨床檢測為結核病陰性時，其周邊血液單核細胞中miR-889之表現量最低（0.33±0.03倍）。
由此可知，檢測一樣本中miR-889之表現，當該樣本中miR-889之表現量高於正常表現量時，顯示該樣本提供者為潛伏結核感染(LTBI)患者風險為高；當該樣本中miR-889之表現量低於正常表現量，顯示該樣本提供者為潛伏結核感染(LTBI)患者風險為低。因此，miR-889可做為檢測潛伏結核感染之生物標誌物。
另外，由第十三圖B之結果可知，該生物標誌物係為TWEAK，當該樣本提供者潛伏結核復發為活動性結核病狀態時，其周邊血液單核細胞中TWEAK mRNA之表現量最高，表現量為1.37±0.03倍；次之為潛伏結核感染狀態時，其周邊血液單核細胞中TWEAK mRNA之表現量為0.46±0.05倍；而當樣本提供者經過抗結核病治療且已被臨床檢測為結核病陰性時，其周邊血液單核細胞中TWEAK mRNA之表現量最低（0.36±0.02倍）。
由此可知，檢測一樣本中TWEAK之表現，當樣本中TWEAK之表現量高於一正常樣本中TWEAK之表現量時，顯示該樣本提供者由潛伏結核感染復發為活動性結核病之風險為高；而當該樣本中TWEAK之表現量低於正常表現量，顯示該樣本提供者為發生潛伏結核感染復發之風險為低。因此TWEAK可做為檢測潛伏結核感染是否復發之生物標誌物。
無
第一圖係以次世代定序分析潛伏結核感染（LTBI(+)）組受試者與未被分枝桿菌感染（LTBI(-)）組受試者之周邊血液單核細胞內miRNA差異表現之結果，其中，紅色代表相對表現量高於所有樣品中之中位數，綠色代表相對表現量低於所有樣品中之中位數。 第二圖係檢測周邊血液單核細胞經牛分枝桿菌BCG感染處理後之miR-889表現之結果。 第三圖係以QRT-PCR檢測LTBI(+)組受試者及LTBI(-)組受試者之周邊血液單核細胞內miR-889表現之結果。 第四圖係以QRT-PCR檢測LTBI(+)組受試者、NTM組受試者、LTBI(-)組受試者及健康控制組受試者之血漿內miR-889表現之結果 第五圖係顯示LTBI組受試者接受藥物治療3個月後，其miR-889之表現係顯著減少，並與LTBI組受試者之臨床緩解平行。 第六圖顯示LTBI組受試者之周邊血液單核細胞內miR-889及IFN-γ之關聯性。 第七圖A係以倒立顯微鏡觀察經牛分枝桿菌BCG以感染劑量(multiplicity of infection, MOI) 0.1感染後第8天之周邊血液單核細胞(模擬潛伏結核感染模式)，產生類似肉芽腫(granuloma-like)結構之影像結果。 第七圖B係被牛分枝桿菌BCG感染之周邊血液單核細胞於感染後進行培養至第4、6及8天時，分別檢測其細胞內miR-889表現之結果。 第七圖C係檢測被牛分枝桿菌BCG感染之周邊血液單核細胞於感染後進行培養至第4、6及8天時，分別檢測其細胞內細菌生長之結果。 第八圖係為基因TWEAK與miR-889預測配對之結果。 第九圖A係為經轉染不同質體之THP-1細胞，分別以miR-889模擬物、控制模擬物、miR-889抑制劑、控制抑制劑處理後，檢測其螢光素酶活性之結果。 第九圖B係為檢測經不同處理之THP-1細胞的TWEAK mRNA表現。 第九圖C係為檢測經不同處理之THP-1細胞的TWEAK分泌量。 第十圖係為檢測有無牛分枝桿菌BCG感染之RA患者周邊血液單核細胞之TWEAK分泌量。 第十一圖係以MTT分析法檢測經不同處理之RA患者周邊血液單核細胞之存活率。 第十二圖A係檢測具潛伏結核感染之RA患者、無潛伏結核感染之RA患者及健康受試者之血清內TWEAK表現。 第十二圖B係檢測具潛伏結核感染患者治療前後血清內TWEAK表現。 第十三圖A係為檢測樣本提供者於潛伏結核感染、潛伏結核感染復發為活動性結核病及完成抗結核病治療等不同感染狀態時之周邊血液單核細胞中miR-889表現之結果。 第十三圖B係為檢測樣本提供者於潛伏結核感染、潛伏結核感染復發為活動性結核病及完成抗結核病治療等不同感染狀態時之周邊血液單核細胞中TWEAK mRNA表現之結果。

Claims (8)

  1. 一種檢測結核桿菌感染之方法，其係檢測一待測樣本中TWEAK之表現，當該待測樣本中TWEAK之表現量低於一正常樣本中TWEAK之表現量時，顯示該待測樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險為高，而當待測樣本中TWEAK之表現量高於一正常樣本中TWEAK之表現量時，顯示該待測樣本提供者被結核桿菌潛伏感染之風險為低。
  2. 依據申請專利範圍第1項所述檢測結核桿菌感染之方法，其更包含檢測該待測樣本中miR-889之表現，當該待測樣本中miR-889之表現量高於一正常樣本中miR-889之表現量時，顯示該待測樣本提供者結核桿菌感染或潛伏結核感染復發之風險為高，而當待測樣本中miR-889之表現量低於或等於一正常樣本中miR-889之表現量時，顯示該待測樣本提供者發生結核桿菌感染或潛伏結核感染復發之風險為低。
  3. 依據申請專利範圍第1或2項所述檢測結核桿菌感染之方法，其中，該待測樣本係為血液。
  4. 一種評估潛伏結核感染患者預後之方法，係分別檢測接受一治療方法前後之一樣本中TWEAK之表現，當接受該治療方法後之該樣本中TWEAK之表現量低於或等於接受該治療方法前之該樣本中TWEAK之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應為差並且預後不佳；而當接受該治療方法後之該樣本中TWEAK之表現量高於接受該治療方法前之該樣本中TWEAK之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應佳並且預後良好。
  5. 依據申請專利範圍第4項所述評估結核感染患者預後之方法，其更包含分別檢測接該樣本中miR-889之表現，當接受該治療方法後之該樣本中miR-889之表現量高於或等於接受該治療方法前之該樣本中miR-889之表現量 時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應為差並且預後不佳；而當接受該治療方法後之該樣本中miR-889之表現量低於接受該治療方法前之該樣本中miR-889之表現量時，顯示該樣本提供者對於該治療方法之反應佳並且預後良好。
  6. 依據申請專利範圍第4或5項所述評估結核感染患者預後之方法，其中，該樣本係為血液。
  7. 一種判斷潛伏結核感染病程之方法，其係檢測一待測樣本中miR-889之表現，當該待測樣本中miR-889之表現量高於一正常樣本中miR-889表現量時，顯示該待測樣本提供者為潛伏結核感染(LTBI)患者；當該待測樣本中TWEAK之表現量高於該正常樣本中TWEAK表現量，顯示該待測樣本提供者為潛伏結核感染復發患者；當該待測樣本中miR-889之表現量低於該正常樣本中miR-889表現量時，顯示該待測樣本提供者潛伏結核感染已治癒。
  8. 依據申請專利範圍第7項所述判斷潛伏結核感染病程之方法，其中，該待測樣本係為血液。
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