CN110468206A - 一种与手足综合症相关的snp标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种与手足综合症相关的SNP标志物及其应用，以及检测该标志物的特异性扩增引物和特异性探针。所述SNP标志物为rs2853741和rs1890775，所述特异性扩增引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示，所述特异性探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5～8所示。本发明提供的SNP标志物具有高特异性、高敏感性，可以很好的预测使用肿瘤化疗药物卡培他滨治疗患者的手足综合症易感性。所述SNP标志物及其扩增引物以及相关的试剂盒，能够用于评估患者发生手足综合症的风险及其严重程度，可针对高危患者提前采取保护措施，有助于实现患者的个体化治疗，利于患者的治疗并提高患者的生存质量。

Description

一种与手足综合症相关的SNP标志物及其应用
技术领域
本发明属于基因工程与肿瘤医学技术领域。更具体地，涉及一种与手足综合症相关的SNP标志物及其应用。
背景技术
卡培他滨是一种广泛应用于治疗胃肠道恶性肿瘤和乳腺恶性肿瘤的5-FU前体药物，其口服后经小肠粘膜吸收，在肝脏经羧酸酯酶水解为5’脱氧氟胞苷，再经肝脏和肿瘤组织内的胞苷脱氨酶代谢为5’脱氧氟尿苷，最后由肿瘤组织内胸苷磷酸化酶代谢为5-FU，5-FU主要通过抑制胸苷酸合成酶而阻断DNA合成，来发挥抗肿瘤作用，80％～90％5-FU最终经双氢嘧啶脱氢酶分解代谢。
卡培他滨的不良反应常见的主要为手足综合症(HFS)、消化系统症状、骨髓抑制、神经系统症状、心脏毒性、高胆红素血症、乏力等，以及其他系统症状(如脱发、过敏反应、异常色素沉着)等。其中，发生率最高的为手足综合症，发生率可高达30％～70％。手足综合症主要表现为手掌和脚掌皮肤出现红肿、脱屑、皲裂、水泡、疼痛等症状，严重者影响日常生活。手足综合症虽然极少危及患者生命，但是会影响病人的治疗进程，严重影响患者的治疗效果，对于使用卡培他滨治疗期间出现2级或以上的手足综合症患者则需要暂停用药，直至恢复至1级或以下，与此同时，会严重影响患者生活质量，降低患者用药依从性。因此，对接受卡培他滨治疗的患者进行手足综合症的发病风险预测，对高危个体提前采取预防性的保护措施，实现个体化治疗，显得尤为重要。
目前，手足综合症的发生机制尚不明确，已有研究表明年龄、性别、肾功能、体重、药物间相互作用等因素可能与手足综合症的发生相关，但在相似条件下，不同个体手足综合症的发生仍存在较大异质性，表明个体遗传易感性是影响手足综合症发生的主要因素之一。
当前的研究发现，单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是化疗药物不良反应的重要遗传因素。关于化疗中正常组织损伤的遗传易感性研究，揭示了单核苷酸多态性在皮肤粘膜、消化系统、血液系统、神经系统、循环系统等其他系统不良反应的作用，表明遗传因素在化疗引起的正常组织损伤的个体差异中起到了重要的作用。然而，目前对于卡培他滨引起的手足综合症的研究多基于卡培他滨代谢通路上有关酶的编码基因的候选基因研究，这类研究过于局限，尚缺乏大样本基于大样本的全基因组的相关研究和验证。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述现有技术的缺陷和不足，提供一种与手足综合症相关的SNP标志物及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的SNP标志物。
本发明的第二个目的是提供一种所述SNP标志物的特异性扩增引物。
本发明的第三个目的是提供一种所述SNP标志物的特异性探针。
本发明的第四个目的是提供所述SNP标志物在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述特异性扩增引物和/或所述特异性探针在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种外周血DNA中rs2853741或rs1890775的检测方法。
本发明的第七个目的是提供所述检测方法在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第八个目的是提供一种与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的SNP标志物组合，含有SNP位点rs2853741和rs1890775。
rs2853741：GCAGTTTTGT[T/C]GACAAGACCG；
rs1890775:GCAGTTGACC[C/T]TTCTGAGTCA。
一种上述SNP标志物的特异性扩增引物，所述特异性扩增引物为：
rs2853741特异性扩增引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；
rs1890775特异性扩增引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.3～4所示。
引物rs2853741-F(SEQ ID NO.1)：TCCCTTATTAGTTGTAGGAAA；
引物rs2853741-R(SEQ ID NO.2)：CTGAGAGTCTTAGGAAACC；
引物rs1890775-F(SEQ ID NO.3)：CTCGGCATTTGTCATCTG；
引物rs1890775-R(SEQ ID NO.4)：CTCAGTCTTCAGCTCTTG。
一种上述SNP标志物的特异性探针，所述特异性探针为：
rs2853741特异性探针的C碱基探针和T碱基探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示；
rs1890775特异性探针的C碱基探针和T碱基探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示。
rs2853741C碱基探针(SEQ ID NO.5)：CAGCAGTTTTGTCGACAAGACCGC；
rs2853741T碱基探针(SEQ ID NO.6)：CAGCAGTTTTGTTGACAAGACCGC；
rs1890775C碱基探针(SEQ ID NO.7)：AGGCAGTTGACCCTTCTGAGTCAT；
rs1890775T碱基探针(SEQ ID NO.8)：AGGCAGTTGACCTTTCTGAGTCAT。
本发明利用肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症患者外周血DNA中的单核苷酸多态性，筛选出了与手足综合症高度相关的高特异性和敏感性的SNP位点，并研制出了便于临床应用的、预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症患者发病风险的试剂盒，对肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症高危病人进行预测和提前干预，以协助治疗的顺利实施，提高肿瘤患者的生活质量和依从性，为探索和发现具有潜在治疗价值的新药物提供了数据支持。
因此，以下内容都应在本发明的保护范围之内：
所述SNP标志物在作为与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的标志物中的应用。
所述SNP标志物在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
所述特异性扩增引物和/或所述特异性探针在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种基于所述SNP标志物预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的风险评分模型，其特征在于，包括以下步骤：
S1.检测外周血DNA中SNP的基因型，所述SNP为权利要求1所述SNP标志物；
S2.收集患者的临床资料；
S3.通过以下风险评分公式计算患者接受治疗后发生手足综合症的风险评分；
风险评分＝(0.7588×rs2853741分型的评分)+(-0.5382×rs1890775分型的评分)；
其中，分型的评分：对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”。
S4.当风险评分大于等于0.604时，该样本是发生手足综合症的高危人群(HFSgrade≥2)；当风险评分小于0.604时，该样本是发生手足综合症的低危人群(HFS grade≤1)。
另外，本发明还提供了一种检测/预测与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测外周血DNA中rs2853741和rs1890775的组分。
优选地，所述组分包括所述特异性扩增引物和/或所述特异性探针。
优选地，所述组分还包括基因检测所需的试剂。
更优选地，所述试剂包括PCR反应酶、dNTP混合液、MgCl2溶液和去离子水。
更进一步优选地，所述试剂还包括标准品和对照品。
优选地，所述试剂盒的PCR反应体系为：上下游引物和碱基探针共0.3μL，dNTPMixture(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.4μL，buffer 1μL，PCR反应酶0.1μL，双蒸水2μL和待测样本外周血DNA 1μL。
优选地，所述试剂盒的PCR反应程序为：60℃30s，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s和60℃1min，45个循环；60℃30s，1个循环。
优选地，所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.统计待测样本SNP分型；
S2.计算患者接受肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症的风险评分，公式如下：
风险评分＝(0.7588×rs2853741分型的评分)+(-0.5382×rs1890775分型的评分)；
其中，分型的评分：对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”。
当风险评分大于等于0.604时，该样本是发生手足综合症的高危人群(HFS grade≥2)，当风险评分小于0.604时，该样本是发生手足综合症的低危人群(HFS grade≤1)。
优选地，本发明所述肿瘤为结直肠癌。
本发明以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液标本，系统收集并随访符合纳入标准的病人，采用Illumina HumanOmniExpress BeadChip芯片和Infinium GlobalScreening Array-24v1.0芯片进行全基因组SNP扫描，筛选出来的位点采用TaqMan(Applied Biosystems)基因分型进行验证。具体地，本发明解决问题的技术方案包括：
(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序采集符合标准的血液标本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；
(2)在患者每个化疗疗程结束进行定期随访，并根据患者随访记录诊断手足综合症；
(3)基因型检测：对具有完整临床资料和化疗病历随访的病人，利用全基因组SNP芯片，寻找与手足综合症相关的SNP位点；
(4)对于筛选出来的显著相关的SNP位点，进一步采用TaqMan(AppliedBiosystems)基因分型平台进行检测，验证将其应用于风险预测的可重复性；
(5)预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒的研制：根据化疗后发生重度手足综合症的患者、未发生或轻度手足综合症的患者中的基因型分布频率有显著差异的SNP位点，开发预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒。
本发明通过两阶段全基因组关联研究，首先，选择了514例符合标准的样本纳入发现阶段，具体得到148例发生重度手足综合症(grade≥2)的结直肠癌患者，以及366例未发生或轻度的手足综合症(grade≤1)结直肠癌患者，进行全基因组SNP扫描，其中，115例利用Illumina HumanOmniExpress BeadChip芯片进行全基因组SNP扫描，399例利用InfiniumGlobal Screening Array-24v1.0芯片进行全基因组SNP扫描，建立风险评分模型；然后，采用590例符合标准的样本纳入独立的验证阶段，进行风险评分模型的验证，其中，181例发生重度手足综合症(grade≥2)的结直肠癌患者，409例未发生或轻度的手足综合症(grade≤1)结直肠癌患者。将两阶段全基因组关联研究后获得相关结果。
具体来说，本发明的研究线路主要包括：研究样本的选择、外周血DNA的提取、全基因组芯片扫描、TaqMan基因分型检测、用于预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒的制备。
本发明的统计分析方法如下：
在发现阶段，运用卡方检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)，分析了人口学因素和临床因素(性别、年龄、临床分期、病理分型、化疗方案、用药剂量、同期放疗、既往FU类药物用药史、手足综合症预防用药情况、身高、体重、体表面积、吸烟、饮酒等)与手足综合症严重程度的相关性。利用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析，将与手足综合症发生显著相关的因素(年龄、化疗方案、同期放疗、既往FU类药物用药史、手足综合症预防用药情况)作为协变量。计算每个SNP的比值比(Odds ratio，OR)以及他们的95％置信区间。定义OR值大于1的为危险型SNP，OR值小于1的为保护型SNP。
使用HaploReg v4.1、RegulomeDB、Haploview v4.2进一步对具有显著关联的SNP进行筛选，并于590例结直肠癌患者独立人群中进行验证，确定与手足综合症发生显著相关的SNP位点(rs2853741和rs1890775)。
为进一步研究SNP位点构建风险评分模型用于手足综合症风险预测的效果，我们构建了一个数学公式，综合考虑SNP的三种基因型进行评分。分析时以多因素logistic回归系数β为权重，得到基于rs2853741和rs1890775分型风险评分的公式如下：
风险评分＝(0.7588×rs2853741分型的评分)+(-0.5382×rs1890775分型的评分)；
其中，分型的评分：对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”。
获得的风险评分与最优界限值进行比较，应用于验证阶段的所有样本。
统计学分析均通过分析软件R、Stata(v11.0)、plink(v1.9)完成，统计学显著性水平P值设为0.05，所有统计学检验均为双侧检验。
以下是本发明的进一步说明：
对上述接受卡培他滨治疗且满足入组条件的514例结直肠癌患者进行每个化疗疗程结束的定期随访，并根据NCI Common Toxicity Criteria for Adverse Events(CTCAE)V.3.0评估患者手足综合症等级。同时，对这514例结直肠癌患者进行全基因组SNP扫描，其中115例利用Illumina HumanOmniExpress BeadChip芯片进行全基因组SNP扫描，399例利用Infinium Global Screening Array-24v1.0芯片进行全基因组SNP扫描，通过全基因组关联分析获得相关结果。
根据两阶段全基因组关联分析，本发明人检测到与手足综合症发生最为显著相关的SNP位于TYMS基因上游启动子区域位点rs2853741和ZBTB40基因上游4Kb位点rs1890775。将这两个SNPs在Taqman(Applied Biosystems)基因分型平台进行检测。
多因素logistic回归加性模型发现，SNP位点与手足综合症的发生风险存在剂量-反应关系(dose-response)，随着风险等位基因型个数的增加，手足综合症的发生风险也随之增加。
进一步分析这两个SNPs用于手足综合症风险预测的效果，发现这个模型可以在结直肠癌患者中很好地区分使用卡培他滨治疗引起的轻度(HFS grade≤1)和重度手足综合症患者(HFS grade≥2)。
根据上述实验结果，本发明制备了一种能用于临床的、用于预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒，包含测定受试者外周血DNA中上述SNP的特异性扩增引物、探针和其他检测试剂。利用该试剂盒检验rs2853741和rs1890775位点，有助于肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症的风险预测和评估，可以对高危个体提前采取针对性的保护措施，例如预防性用药等，从而真正实现肿瘤患者的个体化治疗。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明分析得到了与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的SNP标志物rs2853741和rs1890775，可以很好的区分使用卡培他滨治疗引起的轻度(grade≤1)和重度(grade≥2)手足综合症，可以准确的评估患者发生手足综合症的风险，所用的SNP标志物作为一种新型的基因生物标志物，区别于传统生物标志物，具有稳定、微创、易于检测的优点，其高特异性、高敏感性为肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的预测提供了更加高效、便捷的评估方法；
(2)本发明制备的用于预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于评估患者发生手足综合症的风险，帮助临床医生迅速、准确地评价患者手足综合症的遗传易感性，预估患者发生手足综合症的严重程度，为及时采取预防治疗方案提供支持，利于患者的治疗效果；
(3)本发明基于大样本的全基因组的相关研究和验证，采取严密的验证和评价体系，采用大样本的全基因组关联研究联合独立阶段的人群验证，最后通过量化的风险评分得到高敏感度、高特异度的模型，确保其在临床上可以得到有效的应用，可针对高危患者提前采取保护措施，有助于实现患者的个体化治疗，利于患者的治疗并提高患者的生存质量。
附图说明
图1是rs2853741和rs1890775构建预测不同程度手足综合症的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1样本的收集和资料的整理
于2008年至2018年从中山大学附属肿瘤医院生物样本库收集了大量的血标本，通过对样本信息的整理，选择了符合下列标准的1104例样本进行全基因组芯片扫描和单个SNP Taqman基因分型：
1.研究样本的选择
纳入标准：
(1)具有明确病理诊断及临床分期的结直肠癌患者；
(2)预期生存大于6个月；
(3)功能状态评分(KPS)≥70分；
(4)年龄18岁～80岁；
(5)具有完整的病历资料(病史、体检、相关检查、既往治疗)；
(6)患者使用含有卡培他滨用药方案化疗；
(7)自愿参加且签署知情同意书。
同时，排除出现以下任意情况的患者：
(1)患者未能连续完成4个疗程含有卡培他滨用药方案的化疗；
(2)由于心理、社会、家庭及地理原因不能配合随访的患者；
(3)患者使用含有卡培他滨用药方案的化疗前有不明原因的手足掌跖感觉或者皮肤异常。
2、外周血DNA的全基因组扫描
在符合上述条件的514例样本中，通过对患者进行每个化疗疗程结束的定期随访，并根据NCI Common Toxicity Criteria for Adverse Events(CTCAE)V.3.0评估患者手足综合症等级，具体得到148例发生重度手足综合症(grade≥2)的结直肠癌患者，以及366例未发生或轻度的手足综合症(grade≤1)结直肠癌患者。进行全基因组SNP扫描，其中，115例利用Illumina HumanOmniExpress BeadChip芯片进行全基因组SNP扫描，399例利用Infinium Global Screening Array-24v1.0芯片进行全基因组SNP扫描。具体步骤为：
(1)用EDTA抗凝管采集外周静脉血3mL，3500r/min离心10分钟后吸出血浆；
(2)去除红细胞：剩余血液成分中加入等体积红细胞裂解液(10mmol/L Tris pH7.6；5mmol/L MgCl2；10mmol/L NaCl)，上下颠倒充分混匀，4000r/min离心10分钟后弃去上清，再加入5mL红细胞裂解液，上下颠倒充分混匀，4000r/min离心10分钟后弃去上清；
(3)裂解有核细胞：加入1mL白细胞裂解液(50mmol/L Tris HCl pH 8.0；50mmol/LEDTA二钠盐；10mmol/L NaCl；1％十二烷基硫酸钠(w/v)，再加入10g RNA酶10g蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，65℃水浴30分钟，每隔5分钟振荡混匀1次；
(4)去除蛋白质：加入1mL饱和酚于振荡器上充分震荡混匀后，12000r/min离心10分钟，上层水相转移至新的EP管；加入等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)，振荡器上充分振荡混匀，12000r/min离心10分钟，上层水相转移至新的EP管；
(5)DNA沉淀：加入1/10体积的3M醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，上下轻摇混匀可见白色絮状沉淀物，再12000r/min离心5分钟；
(6)DNA漂洗：弃上清，加入1mL75％乙醇，上下颠倒，12000r/min离心5分钟；
(7)重复步骤(6)；
(8)干燥DNA：弃上清，于清洁环境中打开盖子让乙醇充分挥发，加入适量(50μL)TE缓冲液溶解DNA；
(9)测量浓度：用NanoDrop 2000测量DNA浓度和纯度，通常能得到20～100ng/μLDNA，纯度(OD 260/280)在1.6～2.0；
(10)在Illumina HumanOmniExpress BeadChip芯片和Infinium GlobalScreening Array-24v1.0芯片进行全基因组SNP扫描；
(11)数据分析与处理：
利用logistic回归加性模型对数据进行分析，假定SNP的风险效应满足加性模型，校正与手足综合症发生相关的非遗传因素，分析得到TYMS基因上游启动子区域rs2853741和ZBTB40基因上游4Kb位点rs1890775与手足综合症的发生显著相关，利用logistic回归加性模型对514例结直肠癌患者进行全基因组分析的结果如表1所示。
表1利用logistic回归加性模型对514例结直肠癌患者进行全基因组分析的结果
实施例2单个SNP的TaqMan基因分型检测
将实施例1经过全基因组扫描发现的与手足综合症相关的位点rs2853741和rs1890775在独立验证人群进行检测，包括590例结直肠癌患者，其中，分别包括181例发生重度手足综合症(grade≥2)的结直肠癌患者，以及409例未发生或轻度的手足综合症(grade≤1)结直肠癌患者。再利用Taqman(Applied Biosystems)基因分型对这些样本进行检测，具体步骤为：
(1)用EDTA抗凝管采集外周静脉血3mL，3500r/min离心10分钟后吸出血浆；
(2)去除红细胞：剩余血液成分中加入等体积红细胞裂解液(10mmol/L Tris pH7.6；5mmol/L MgCl2；10mmol/L NaCl)，上下颠倒充分混匀，4000r/min离心10分钟后弃去上清，再加入5mL红细胞裂解液，上下颠倒充分混匀，4000r/min离心10分钟后弃去上清；
(3)裂解有核细胞：加入1mL白细胞裂解液(50mmol/L Tris HCl pH 8.0；50mmol/LEDTA二钠盐；10mmol/L NaCl；1％十二烷基硫酸钠(w/v)，再加入10g RNA酶10g蛋白酶K，振荡器上充分振荡混匀，65℃水浴30分钟，每隔5分钟振荡混匀1次；
(4)去除蛋白质：加入1mL饱和酚于振荡器上充分震荡混匀后，12000r/min离心10分钟，上层水相转移至新的EP管；加入等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)，振荡器上充分振荡混匀，12000r/min离心10分钟，上层水相转移至新的EP管；
(5)DNA沉淀：加入1/10体积的3M醋酸钠，等体积预冷的异丙醇，上下轻摇混匀可见白色絮状沉淀物，再12000r/min离心5分钟；
(6)DNA漂洗：弃上清，加入1mL75％乙醇，上下颠倒，12000r/min离心5分钟；
(7)重复步骤(6)；
(8)干燥DNA：弃上清，于清洁环境中打开盖子让乙醇充分挥发，加入适量(50μL)TE缓冲液溶解DNA；
(9)测量浓度：用NanoDrop 2000测量DNA浓度和纯度，通常能得到20～100ng/μLDNA，纯度(OD 260/280)在1.6～2.0；
(10)在Taqman(Applied Biosystems)基因分型平台进行检测，对全基因组扫描发现的与结直肠癌患者肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症相关的SNPs，设计特异性的扩增引物和特异性的探针序列；
利用384孔板上样，每孔5μL的反应体系，包括：上下游引物和碱基探针共0.3μL，dNTP Mixture(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.4μL，buffer 1μL，PCR反应酶0.1μL，双蒸水2μL和待测样本外周血DNA1μL。
反应程序为：60℃30s，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s和60℃1min，45个循环；60℃30s，1个循环。
使用的仪器为ABI7900型PCR仪。检测结果采用QuantStudio Real-Time PCRSoftware v1.3软件导出。
11)数据分析与处理：
利用logistic回归加性模型对数据进行分析，校正患者与手足综合症发生相关的非遗传因素，获得位点rs2853741和rs1890775在验证人群中的结果如表2所示。
表2利用logistic回归加性模型对590例结直肠癌验证人群进行分析的结果
实施例3结直肠癌患者肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症风险评分模型的构建及验证
进一步，我们将实施例1中发现，并在实施例2验证获得的手足综合症显著相关的位点rs2853741和rs1890775纳入手足综合症风险评分模型的构建，发现这个组合可以很好地区分发生轻度(HFS grade≤1)和重度(HFS grade≥2)手足综合症的结直肠癌患者。
以实施例1的514例患者作为训练集进行多因素logistic回归，将回归系数β代入公式去构建手足综合症风险模型。logistic回归的相关系数结果如表3所示。
风险评分公式为：
风险评分＝(0.7588×rs2853741分型的评分)+(-0.5382×rs1890775分型的评分)；
其中，分型的评分：对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”。
当风险评分大于等于0.604时，该样本是发生手足综合症的高危人群(HFS grade≥2)，当风险评分小于0.604时，该样本是发生手足综合症的低危人群(HFS grade≤1)。
表3logistic回归的相关系数结果
模型变量 rs2853741 rs1890775
β 0.7588 -0.5382
然后，根据上述结果，本发明人采用上述风险评分模型对实施例2的590例结直肠癌患者进行风险估算，以验证模型效果。手足综合症风险评分模型效果如表4所示。
表4手足综合症风险评分模型效果
对该风险评分绘制ROC曲线评估预测的敏感度和特异度，得到结直肠癌患者卡培他滨化疗引起的手足综合症风险评分的ROC曲线如图1所示，可以看出，该风险评分以66.1％的曲线下面积(AUC)将重度手足综合症的患者(HFS grade≥2)与轻度手足综合症的患者(HFS grade≤1)区分开，最佳临界点的特异度为71.5％，敏感度为51.9％，表明使用遗传易感位点构建的风险评分模型可以预测不同程度手足综合症的发生。
因此，以上结果表明：采用实施例2验证获得的手足综合症相关的位点rs2853741和rs1890775组合，使用本研究构建的手足综合症风险评分模型，可以将发生不同程度手足综合症患者区分。
实施例4用于预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒的制备
用于预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒的制作和操作流程是基于Taqman(Applied Biosystems)基因分型检测技术。
1、试剂盒的组成
试剂盒中含有2对SNP特异性扩增引物(引物rs2853741-F、引物rs2853741-R，核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示；引物rs1890775-F、rs1890775-R，核苷酸序列如SEQ IDNO.5～6所示)，以及2对特异性探针(rs2853741C碱基探针、rs2853741T碱基探针，核苷酸序列如SEQ ID No：5～6所示；rs1890775C碱基探针、rs1890775T碱基探针，核苷酸序列如SEQID No.7～8所示)，SNP特异性扩增引物和特异性探针的核苷酸序列分别如表5所示。试剂盒中还包括了相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTP Mixture，MgCl2，双蒸水，PCR反应酶，buffer；另外还包含有标注品和对照(确定基因型的标准品和空白对照)。
2、试剂盒的PCR反应体系
试剂盒的PCR反应体系为：上下游引物和碱基探针共0.3μL，dNTP Mixture(10mM)0.2μL，MgCl2(25mM)0.4μL，buffer 1μL，PCR反应酶0.1μL，双蒸水2μL和待测样本外周血DNA1μL。
3、试剂盒的PCR反应程序
试剂盒的PCR反应程序为：60℃30s，1个循环；95℃10min，1个循环；95℃15s和60℃1min，45个循环；60℃30s，1个循环。
4、发病风险的判断标准
首先，统计待测样本SNP分型；
分析时，以多因素logistic回归系数β为权重，得到基于rs2853741和rs2853741分型风险评分的公式如下：
风险评分＝(0.7588×rs2853741分型的评分)+(-0.5382×rs1890775分型的评分)；
其中，分型的评分：对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”。
当风险评分大于等于0.604时，该样本是发生手足综合症的高危人群(HFS grade≥2)，当风险评分小于0.604时，该样本是发生手足综合症的低危人群(HFS grade≤1)。
表5SNP特异性扩增引物和特异性探针的核苷酸序列
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山大学、中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
<120> 一种与手足综合症相关的SNP标志物及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcccttatta gttgtaggaa a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgagagtct taggaaacc 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcggcattt gtcatctg 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcagtcttc agctcttg 18
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagcagtttt gtcgacaaga ccgc 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagcagtttt gttgacaaga ccgc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggcagttga cccttctgag tcat 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aggcagttga cctttctgag tcat 24

Claims (10)

1.一种与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的SNP标志物组合，其特征在于，含有SNP位点rs2853741和rs1890775。
2.一种权利要求1所述SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于，所述特异性扩增引物为：
rs2853741特异性扩增引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示；
rs1890775特异性扩增引物的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示。
3.一种权利要求1所述SNP标志物的特异性探针，其特征在于，所述特异性探针为：
rs2853741特异性探针的C碱基探针和T碱基探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～6所示；
rs1890775特异性探针的C碱基探针和T碱基探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～8所示。
4.权利要求1所述SNP标志物在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
5.权利要求2所述特异性扩增引物和/或权利要求3所述特异性探针在制备与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的辅助诊断试剂盒中的应用。
6.一种检测/预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有用于检测外周血DNA中rs2853741和rs1890775的组分。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述组分包括权利要求2所述特异性扩增引物和/或权利要求3所述特异性探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述组分还包括基因检测所需的试剂。
9.权利要求1所述SNP标志物在作为与肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险相关的标志物中的应用。
10.一种基于权利要求1所述SNP标志物预测肿瘤化疗药物卡培他滨引起的手足综合症发病风险的风险评分模型，其特征在于，包括以下步骤：
S1.检测外周血DNA中SNP的基因型，所述SNP为权利要求1所述SNP标志物；
S2.收集患者的临床资料；
S3.通过以下风险评分公式计算患者接受治疗后发生手足综合症的风险评分；
风险评分＝(0.7588×rs2853741分型的评分)+(-0.5382×rs1890775分型的评分)；
其中，分型的评分：对于SNP分型，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，突变纯合型＝“2”。
S4.当风险评分大于等于0.604时，该样本是发生手足综合症的高危人群(HFS grade≥2)；当风险评分小于0.604时，该样本是发生手足综合症的低危人群(HFS grade≤1)。
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