CN106047998A - 一种肺癌基因的检测方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种肺癌基因的检测方法及应用。本申请的检测方法，包括对cfDNA进行文库构建，并采用针对肺癌相关的105个基因设计的12659条探针对cfDNA文库进行杂交捕获，上机测序，对测序结果进行数据分析，获得全面、准确的肺癌基因信息。本申请的检测方法，只需少量外周血即可进行，真正实现了无创检测。本申请的检测方法针对ctDNA中的肺癌重要基因进行捕获测序分析，在肺癌早期进行筛查，针对肺癌患者提供用药相关基因突变信息，为肺癌早期诊断、个体化精准用药指导、药效评估以及预后动态监测提供了重要的参考依据。

Description

一种肺癌基因的检测方法及应用
技术领域
本申请涉及基因检测领域，特别是涉及一种肺癌相关基因的检测方法，及其应用。
背景技术
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。近50多年来，世界各国特别是工业发达国家，肺癌的发病率和病死率均迅速上升，死于癌病的男性病人中肺癌已居首位。肺癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，5年生存率仅为16.8％，每年新确诊肺癌患者达到160万，肺癌同时也是癌症患者死亡的首要病因，每年有140万的人口死于肺癌。2015年美国癌症协会(American CancerSociety,ACS)预计将有222,200新发肺癌病例，158,040人死于肺癌，约占美国所有癌症死亡的27％。肺癌多在40岁以上发病，发病年龄高峰在60～79岁之间，男女患病率为2.3:1。另外种族、家属史与吸烟对肺癌的发病均有影响。临床上对肺癌有一个简单的分法，将之分为小细胞肺癌(缩写SCLC)以及非小细胞肺癌(缩写NSCLC)。
小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的15％，小细胞肺癌肿瘤细胞倍增时间短、进展快，常伴内分泌异常或类癌综合征；由于患者早期即发生血行转移且对放化疗敏感，故小细胞肺癌的治疗以全身化疗为主，联合放疗和手术进行综合治疗。综合治疗是治疗小细胞肺癌成功的关键。非小细胞肺癌约占所有肺癌病理类型中的85％。这两种类型的肺癌的治疗方案是截然不同的。小细胞肺癌患者主要用化学疗法治疗，外科手术治疗对这种类型肺癌患者并不起主要作用。但是，外科手术治疗对非小细胞肺癌患者来说确实一个很重要的治疗手段。目前对于肺癌的检测包括X-射线扫描、CT、PET-CT、核磁共振、穿刺活检等，但是大于70％的患者确诊时已处于癌症晚期。肿瘤的治疗效果与肿瘤的早期发现有很大的关系，越早发现就越有可能治愈。因此研发一种为肺癌早期诊断提供参考信息的检测技术迫在眉睫。
《ASCO年度报告：2015临床肿瘤学进展》中，液体活检技术被列为肿瘤治疗领域下一个十年趋势之一。循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，缩写ctDNA)，作为液体活检的首选已逐渐从科研走向临床。而欧盟批准将ctDNA检测用于易瑞沙的伴随诊断则更是标志着ctDNA临床应用的大规模实现。循环肿瘤DNA指的是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA。由于其基本无创，并且能够获得肿瘤的所有突变信息，很好的解决了肿瘤异质性等问题，因此是一类具备广泛应用前景的肿瘤标志物，可用于肿瘤发展及预后状态的无创检测。血浆游离DNA(cell-free DNA，缩写cfDNA)在很早期就被发现，但是其在肿瘤方面的研究却经历了漫长的过程。1948年，科学家第一次报告了人体血液中存在DNA循环；1977年，明确提出癌症患者血液中的DNA循环。人们又花费17年时间指出，这些DNA出现了与癌症有关的突变。但循环DNA的首次实际使用来自另一个领域。目前就职于中国香港中文大学的化学病理学家Dennis Lo推断，如果肿瘤涌出携带DNA的血液，胎儿也能如此。1997年，他成功论证了怀有男婴的孕妇血液中会携带Y染色体。这一发现使得医生可以在孕期初期不干扰胎儿的前提下检查胎儿性别，并能不依靠侵入性试验筛查唐氏综合征等发育性疾病。这也成为妇产诊断学领域的革命性成果。但是存在于外周血液中的游离DNA与癌症关系的理解十分缓慢，部分原因是ctDNA比胎儿DNA更难探测。ctDNA在血液中的含量非常少且极为多变。对患有晚期癌症的患者而言，外周血中ctDNA的含量相对较高；但一般而言，ctDNA仅占总数的1％，甚至少到0.01％。随着肿瘤的疾病进展，ctDNA在血液中的含量也随之升高。因此，如果在超早期就能对血液中含有的极微量的ctDNA进行捕获测序，为肿瘤早期诊断及相关突变提供参考依据，那么对于癌症的早期发现将是革命性的进步。
ctDNA可能比蛋白质生物标识表现得更好。蛋白质被用于临床疾病诊断，并对正在接受治疗的患者进行监控。例如，前列腺特异性抗原是前列腺肿瘤的生物标识，但它却会出现假阳性结果，因为出于其他原因，如机体炎症、甚至饮食等，前列腺特异性抗原在血液中的含量也会升高，导致假阳性结果。但ctDNA出现假阳性的几率更低，因为它是由具有癌细胞印记的突变和其他遗传变化定义的。尽管大多数蛋白质生物标识能在血液中存在数周，而ctDNA的半衰期不到两个小时，这增加了ctDNA检测难度。剑桥团队与约翰斯·霍普金斯团队分别发现，在监测乳癌和肠癌时，与蛋白质生物标识相比，ctDNA更加敏感，并且在追踪肿瘤消失、扩散和复发时，ctDNA也更准确。另外，完整的循环肿瘤细胞(缩写CTC)也会在血流中移动，剑桥团队与约翰斯·霍普金斯团队还发现，ctDNA比CTC更敏感。在实验中，Diaz研究小组发现，当ctDNA和CTC两者都存在时，ctDNA碎片在数量上要超过循环肿瘤细胞，两者的数量比例大概是50：1。而Johns Hopkins的研究小组进一步发现，凡是血液里发现了CTC的也能发现ctDNA，但是发现了ctDNA的却不见得一定能发现CTC。
ctDNA检测很好的解决了肿瘤的异质性问题。2012年，Charles Swanton与同事在英国癌症研究中心伦敦研究所从少量肾脏肿瘤组织中提取DNA，以期找到一些不同的变异，但是单一肿瘤的遗传多样性的宽度让他们十分震惊。扩散到其他部位的继发性肿瘤又出现了不同。然而ctDNA是来自于肿瘤细胞的碎片DNA，携带原位肿瘤和转移灶的基因变异信息。ctDNA的检测技术很好的解决了肿瘤的异质性问题。
传统的肺癌治疗方式包括外科手术治疗、放疗和化疗等。外科手术治疗虽然可以切除肿瘤，但是手术过程中可能无法完全切除或引起肿瘤转移，还可能造成器官损伤及身体免疫力降低；化疗是一种全身性的治疗，效果明显和迅速，但是在杀伤肿瘤细胞的同时也可能会把正常细胞一起杀灭，所以，化疗算得上是一种“玉石俱焚”的治疗方法；放疗在某些肿瘤方面可以达到手术切除的效果，但放疗成本高，周期长，并发症也较多。靶向治疗作为一种新兴治疗手段，由于其毒性小，副作用少并且能够大大提升患者生存周期以及生活质量而得到广泛的应用。然而靶向药物的选择依赖于患者的基因分型，靶向药物往往有其对应的靶基因，当该基因发生突变时某条调控细胞增殖分裂的信号通路被持续激活，或者是调控细胞凋亡的信号通路被抑制，当使用相应的靶向药物之后，该通路被阻断，肿瘤细胞被杀死。因此针对肺癌的靶基因以及其驱动基因的检测技术的开发是应用靶向治疗的基础。
现有的肿瘤基因检测方法主要包括PCR、一代测序、FISH、IHC等。这些方法基本上都只能针对已知的基因突变信息进行检测，而且检测步骤繁琐，检测基因的数量少，且敏感度低，况且针对FISH以及IHC的检测结果还需要有经验的人进行鉴定。
综上所述，现有的肺癌检测方法存在如下缺陷与不足：第一，传统检测方法不能在肺癌早期及早发现相关症状；第二，现有的基于肺癌基因的检测方法，通常要求比较高的建库起始量，测序灵敏度和准确性都比较低；第三，市场上已有的用于肺癌基因检测的panel囊括的基因不全面，针对肺癌相关基因的捕获非常少，会遗漏很多重要的基因突变信息，又或者涵盖一些与肺癌不是很相关的基因，不能全面有效的反映肺癌及肺癌相关基因的突变。
发明内容
本申请的目的是提供一种肺癌基因的检测方法及其应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种肺癌基因的检测方法，包括对血浆中cfDNA进行文库构建，并采用针对肺癌相关的105个基因设计的12659条捕获探针对构建的cfDNA文库进行杂交捕获，然后进行测序，并对测序结果进行数据分析，获得全面、准确的肺癌基因信息。
本申请的检测方法，以ctDNA为检测对象，能够实时的反映肺癌相关基因的突变情况，检测只需要外周血液样品即可，真正实现了无创检测。并且，本申请的检测方法，针对肺癌相关的105个基因设计了12659条捕获探针，用于捕获cfDNA文库，能够准确而全面的获得所有肺癌相关基因的全部信息。本申请中，肺癌相关基因包括与肺癌用药相关的靶标基因、肺癌相关信号通路的靶标基因等，肺癌用药相关的靶标基因，主要是指影响肺癌治疗或控制的药物使用的基因，这些基因的突变对用药的效果以及用药的选择都有影响。肺癌相关基因虽然不是直接的肺癌组织突变的基因，但是，直接或间接的影响肺癌用药或疗效，可以为肺癌用药或治疗药物、方法的选择提供可靠的分析依据。
需要说明的是，本申请的肺癌基因的检测方法，其检测结果，仅仅用于分析和判断靶标基因的生物学信息，并为用药或治疗提供可靠的分析依据。本申请的检测方法可以对受检对象的外周血中极其微量的ctDNA进行检测，从而为肺癌的早期治疗、个体化精准用药指导以及预后动态监测等提供了可靠的分析依据。
还需要说明的是，本申请中，cfDNA是指外周血中游离的DNA片段，这些片段包括ctDNA，并且，如前面提到的，ctDNA在其中的含量很低，甚至少到0.01％；因此，本申请提出了利用肺癌相关的105个基因的12659条捕获探针对cfDNA文库进行捕获，以保障能够有效的获取极其微量的ctDNA。在本申请的一种优选方案中，还对cfDNA文库的构建进行了详细限定，进一步保障ctDNA能够全面而有效的检测。
优选的，针对cfDNA进行文库构建，具体包括，提取外周血中的cfDNA，并对提取的cfDNA进行质量控制，测定其片段大小和浓度，依序对提取的cfDNA进行双链末端修复、样品纯化、3’末端加T、连接接头、PCR扩增富集，最后对PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化即获得cfDNA文库；其中，接头中包含有PCR扩增富集的引物结合位点、索引序列；PCR扩增富集中，PCR循环数根据cfDNA的建库起始量N而定，具体的，cfDNA建库起始量为小于或等于5ng，PCR循环数为11-12个循环，cfDNA建库起始量为5ng≤N≤10ng，PCR循环数为9-11个循环，cfDNA建库起始量为10ng≤N≤25ng，PCR循环数为8-9个循环，cfDNA建库起始量为25ng≤N≤50ng，PCR循环数为7-8个循环，cfDNA建库起始量为50ng≤N≤100ng，PCR循环数为5-7个循环，cfDNA建库起始量为100ng≤N≤250ng，PCR循环数为3-5个循环，cfDNA建库起始量为250ng≤N≤500ng，PCR循环数为1-3个循环。
需要说明的是，本申请的肺癌基因检测方法，其中一个关键步骤就在于cfDNA文库的构建，ctDNA在外周血中的含量极低，特别是在肺癌初期，其含量甚至低至总DNA的0.01％，因此，如何构建DNA文库，以满足超微量ctDNA的检测，是直接影响检测效果和检测质量的关键因素。本申请在接头中设计引物结合位点，采用PCR扩增富集，并针对不同的cfDNA建库起始量，对PCR循环数进行优化，详见表1；本申请采用特殊设计的接头序列进行cfDNA文库构建，并采用PCR扩增富集，能够有效的降低DNA的建库起始量，为肺癌的早期诊断提供了重要的参考依据。
表1 DNA的建库起始量与PCR循环数
DNA的建库起始量 PCR循环数
5ng 11～12
10ng 9～11
25ng 8～9
50ng 7～8
100ng 5～7
250ng 3～5
500ng 1～3
还需要说明的是，本申请中双链末端修复、样品纯化以及3’末端加T都可以参考常规的方法进行，只是，本申请的优选方案中对其中个别步骤进行了特殊限定，这将在后续的技术方案中详细介绍。
优选的，样品纯化以及PCR产物纯化都采用磁珠吸附法进行。
优选的，肺癌相关的105个基因包括，17个肺癌靶向药物靶点基因、18个肺癌化疗药物靶点基因、8个肺癌耐药基因、49个肺癌信号通路相关基因，以及13个DNA修复相关的基因。
需要说明的是，本申请的检测方法涵盖了所有肺癌相关的105个基因，这些基因包括已明确临床应用的癌症靶向和化疗用药基因，处于癌症药物适用临床调查阶段的基因，及所有已知的癌症驱动基因：如对于肺癌治疗，临床已经应用的靶向药物包括了吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、克唑替尼、色瑞替尼、曲妥珠单抗等，化疗药物包括顺铂、卡铂、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨、吉西他滨、依托泊苷、伊立替康、长春碱、丝裂霉素、异环磷酰胺、培美曲塞等。而还处于临床实验的靶向药物包括阿斯利康的AZD9291、ClovisOncology的CO-1686、勃林格殷格翰与韩美制药联合推出的HM61713、安斯泰来的ASP8273、诺华的EGF816等。通过本申请的检测方法能够全面的了解肺癌及其用药相关基因的点突变、基因重排、扩增、缺失、插入等信息。
优选的，捕获探针的3’端具有生物素标记。
需要说明的是，生物素标记可以与亲和链霉素的磁珠发生化学反应，从而将探针以及与探针互补配对的靶标基因调取出来，达到基因捕获的目的。
优选的，杂交捕获中，按照一份探针捕获10-12个ctDNA文库的用量添加捕获探针。
需要说明的是，通常一份探针可以应用于16个DNA文库的基因捕获，但是，本申请优选的，将一份探针应用于10-12个ctDNA文库的基因捕获，从而有效的保障基因捕获效率。
优选的，在进行测序之前还包括对捕获产物进行PCR扩增，然后采用PCR扩增产物进行测序，PCR扩增的循环数根据捕获区域的大小而定，具体的，捕获区域为1-499kb，循环数为12-14个循环，捕获区域大于499kb，并小于或等于1.49Mb，循环数为9-11，捕获区域大于1.49Mb，循环数为8-10。
需要说明的是，为了保障测序质量，本申请在对cfDNA文库进行捕获后，还对其预先进行了PCR扩增，以放大测序信号，提高检测质量。
优选的，数据分析包括去除低质量数据、对数据进行剪裁，以及去除polyN误差信息；去除低质量数据包括去除mapping质量为Q10的数据；对数据进行剪裁包括剪裁去掉barcode数据，以及barcode后面7-10nt，以及reads最后8-10nt；去除polyN误差信息包括去除数据中连续20个以上polyN的数据。
本申请的另一面还公开了本申请的检测方法在肺癌检测试剂盒或肺癌检测设备中的应用。
可以理解，本申请的检测方法就是针对肺癌基因设计的，因此，完全可以应用于各种肺癌检测试剂盒或检测设备，获得实时、准确、全面的肺癌及相关基因的突变信息，从而为肺癌用药等提供参考依据。
本申请的另一面公开了一种肺癌基因检测的试剂盒，试剂盒中含有本申请的肺癌及肺癌相关的105个基因的12659条捕获探针，并且，试剂盒采用本申请的检测方法对待测样品进行检测。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的肺癌基因检测方法，以ctDNA为检测对象，并针对肺癌相关的105个基因设计了12659条捕获探针，能够全面、准确、实时的反映肺癌相关基因的变异情况。并且，以ctDNA为检测对象，只需要少量的外周血即可完成检测，真正实现了无创检测。本申请的检测方法针对ctDNA中的肺癌重要基因进行捕获测序分析，在肺癌早期进行疾病筛查，针对肺癌患者提供用药相关基因的突变等信息，为肺癌早期诊断、个体化精准用药指导、药效评估以及预后动态监测提供了重要的参考依据。
附图说明
图1是本申请实施例中提取的cfDNA的质控检测结果图；
图2是本申请实施例中构建的cfDNA文库的质控检测结果图；
图3是本申请实施例中ctDNA杂交文库的质控检测结果图；
图4是本申请实施例中生物信息学分析的流程示意图；
图5是本申请实施例中编号为LC2014112的肺癌样本的突变检测结果图；
图6是本申请实施例中肺癌基因检测方法的操作流程示意图。
具体实施方式
21世纪初，随着分子生物学研究的不断深入，可以根据各种分子标志物表达的不同将NSCLC进行分子表型分类，并以与肿瘤发生、发展相关的驱动性基因为靶点，研发新的药物，进行有针对性的个体化分子靶向治疗。据美国国家综合癌症网(缩写NCCN)NSCLC临床指南推荐，肺癌患者在使用EGFR-Tki之前应进行EGFR的基因检测，以选择获益人群。2012年，NCCN NSCLC临床指南推荐，晚期NSCLC患者开始治疗前应进行EML4-ALK检测，并建议阳性患者首先接受克唑替尼治疗。约40％的ALK突变阳性NSCLC患者对克唑替尼原发耐药。目前市场上针对肺癌的基因检测主要是全基因组或者全外显子组检测，或者是针对特定一两个基因的检测。这些检测手段都存在很多弊端，例如：全基因组或者全外显子组检测，虽然检测内容丰富，但是成本高，而且检测出来的绝大多数信息与肺癌无关；针对特定一两个基因的检测，检测信息相当有限。因此迫切需要针对肺癌相关基因进行全面的检测，以获得更加准确而全面的基因突变信息。
本申请正是在这样的基础上，针对目前市场上的肺癌检测方法存在的不足或缺陷，创造性的提出了一种实时、无创、精准、全面的肺癌基因的检测方法。本申请的检测方法以外周血中极其微量的ctDNA为检测对象，与传统的通过手术提取病变组织进行检测的方法相比，不仅实现了真正的无创检测，而且在本申请的一种实现方式中，通过优化cfDNA文库构建，使得检测方法所需建库起始量低、灵敏度高、准确性好。
并且，本申请的检测方法，涵盖了目前已明确临床应用的肺癌靶向和化疗用药基因，处于癌症药物适用临床调查阶段的基因，以及所有已知的肺癌驱动基因，共计105个基因，针对这105个基因设计了12659条捕获探针。可检测所有肺癌相关基因的突变类型，包括点突变、插入/缺失、基因融合和拷贝数变化等；使得检测结果精准而全面，为用药及预后动态监测提供了可靠的分析依据。
本申请以ctDNA为检测对象，ctDNA的检测存在很多技术上的壁垒，不仅因为ctDNA在血液中的含量很低，而且其半衰期很短，所以难以捕获。虽然这增加了ctDNA的检测难度，但是，本申请通过对cfDNA文库构建，捕获探针设计，以及杂交捕获等进行优化，克服了这些技术问题；其半衰期短反而能够实时的反映肺癌的变化情况。
本申请的肺癌基因的检测方法，全面、系统、准确地解读肿瘤药物与基因的关系，可为癌症靶向用药、生物免疫治疗及化疗用药提供关键的靶标突变位点信息，并可根据患者的个体差异性，辅助医生选择合适的治疗药物、制定个体化的治疗方案，延长患者生存时间，提高生活质量。本申请的肺癌基因检测方法也能为癌症的早期筛查提供重要的参考依据。本申请的一种实现方式中，测序深度能达到10,000x以上，测序的灵敏度能达到0.1％。
本申请的肺癌基因检测方法针对肺癌患者或者高危人群进行无创基因检测，为肺癌的早期筛查与肺癌患者的个体化精准用药指导以及预后动态监测提供重要的参考依据。在目前市场上针对肺癌相关基因设计探针的产品非常少，而且也存在很多缺陷的情况下，本申请提出了基于ctDNA的肺癌相关基因的检测方法，能够捕获超微量的ctDNA、平行扩增，并且，能且仅能够对肺癌相关基因进行特异性捕获，这样在尽可能减少成本的基础上获得最有效的信息；检测灵敏度可达到0.1％，解决了ctDNA含量低、检测难的问题。
本申请中涉及的名词解释如下：
捕获探针，是指针对肺癌相关的105个基因的不同位点设计的12659条短核苷酸序列，这12659条捕获探针确保了105个基因能够被全面、准确的捕获，不遗漏，也没有其它基因的干扰，保障了检测的全面、精准。
杂交捕获，是指利用捕获探针对ctDNA进行基因捕获，将血浆游离DNA中包含的105个基因分离出来的过程。
PCR扩增富集，是指利用PCR扩增的方法，对外周血中提取的极其微量的cfDNA进行扩增。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例的检测方法主要包括，从血液中提取游离循环DNA、构建cfDNA文库，利用设计的肺癌相关基因的捕获探针进行目标区域的捕获、上机测序，最后利用生物信息学进行大数据分析，获得肺癌相关基因的变异信息，如图6所示。
本例的检测方法主要由三部分组成，其中提出了一种实时、无创、精准、全面的肺癌cfDNA检测技术解决方案。
第一部分，cfDNA的提取、纯化、文库构建。
第二部分，ctDNA肺癌相关基因的特异性捕获。
第三部分，ctDNA肺癌基因测序深度10,000x以上的超高深度测序分析，检测出与肺癌发生发展相关的基因变异信息，配合临床指导用药、预后监测。
第一部分cfDNA文库的构建
外周血中的ctDNA含量很低，比例约为1/1000，因此保证血浆cfDNA提取质量至关重要。本例以来自深圳市人民医院的编号为LC2014112的肺癌样本为例，cfDNA提取方案详细步骤如下：
1.外周血cfDNA的提取纯化，通常采用5～10mL全血，本例具体采用5mL全血进行试验，在获得血液的3h内分离血浆，将全血4℃1600g离心10min，收集上清至5mL离心管中；再将上清4℃16000g离心10min，收集上清血浆转移至5mL离心管中。分离好的血浆最好是立即提取DNA，这样是为了保证血浆中DNA的完整性。提取血浆中游离DNA的试剂盒有很多种，如：QIAGEN公司的血浆/血清游离DNA提取试剂盒、厦门艾德公司的血浆游离DNA提取试剂盒、天根的血浆/血清游离DNA提取试剂盒等。本例具体采用QIAGEN公司的血浆/血清游离DNA提取试剂盒进行试验，提取步骤参考试剂盒说明书。
需要说明的是，如果分离好的血浆不能立即提取DNA也可以放置在-80℃冰箱保存，以后再提取DNA。
2.cfDNA质控，采用Agilent 2100检测提取的cfDNA的片段大小，采用q-PCR测定提取的cfDNA的浓度。
结果显示，LC2014112样本采用5mL全血，最后提取获得的cfDNA浓度为0.8ng/μL；提取的cfDNA的片段大小如图1所示，在166bp左右有一个大峰，332bp左右有一个小峰，可见，样本完整性较好，而且没有基因组DNA污染。
3.文库构建
cfDNA文库的构建可以采用市面上多种产品实现，例如：KAPA HTP LibraryPreparation Kitplatforms、UltraTM DNA Library Prep Kit forSureSelectXT2 Target Enrichment System for Illumina Paired-EndSequencing Library，以及深圳市海普洛斯生物科技有限公司的发明专利CUBE-ctDNA Seq中的建库方法等。
以LC2014112样本为例，采用Agilent的建库方法(SureSelectXT2 TargetEnrichment System for Illumina Paired-End Sequencing Library)，在有些步骤做了相应的改进与优化，取5ng cfDNA起始进行建库，具体操作如下：
(1)cfDNA双链末端修复
用nuclease-free water将5ng cfDNA定容至50μL，将定容后的50μL cfDNA全部加入表2的反应体系，混匀之后放置在PCR仪上20℃反应30min。
表2 ctDNA双链末端修复反应体系
试剂 单反应用量
End Repair Enzyme Mix(Agilent) 40μL
End Repair Oligo Mix(Agilent) 10μL
Total 50μL
(2)纯化
本例采用磁珠法对末端修复的cfDNA进行纯化。具体可以采用的磁珠包括：AMPureXP磁珠、OMEGA磁珠等。cfDNA与磁珠的孵育时间为10-15min，在孵育过程中每5min温和混匀，使得DNA充分与磁珠结合，并使用80％的新鲜乙醇清洗磁珠，使得小片段的DNA也能够结合到磁珠上，而不是被乙醇洗去。具体操作如下：
70μL cfDNA反应体系中加入120μL的OMEGA磁珠，混匀之后，室温孵育15min，在孵育过程中每5min温和混匀。15min之后将装有DNA以及磁珠的离心管放到磁力架上，室温静置3～5min，等磁珠完全吸附到磁力架上之后，吸去上清，加入500μL 80％的新鲜乙醇，温和的上下颠倒磁力架7～10下，然后室温静置3min左右，吸去上清，重复用乙醇洗涤一次。尽可能的将所有液体吸取干净，将离心管管盖打开，将离心管放置在37℃金属浴上晾干，以磁珠表面没有光泽为止。向磁珠中加入22μL nuclease-free water，充分重悬磁珠，然后室温放置5min左右，使得cfDNA充分溶解于水中。将离心管放置到磁力架上，室温放置5min，将上清转移至新的PCR管中，即获得纯化的末端修复的cfDNA。
(3)DNA的3’末端加dTTP
向步骤(2)中得到的上清中加入20μL dT-Tailing Master Mix，混匀后将反应体系放置在PCR仪上，先37℃反应30min，使所有DNA 3’末端加T，然后60℃反应10min使酶失活。
(4)adapter制备
本例的adapter采用的是深圳市海普洛斯生物科技有限公司自主发明专利CUBE-ctDNA Seq中的adapter。adapter从5’端到3’端依序包括Tag序列、PolyN序列、发夹序列、第一索引序列、第一通用引物结合序列、dUTP、第二通用引物结合序列和发夹序列；其中，接头的5’端具有磷酸化标记。这种adapter在退火之后通过前后两个发夹序列形成发夹结构，然后进行一端的延伸，使得两端平齐，但是DNA聚合酶会在延伸DNA的3’端引入一个dATP。这种特定的adapter能够使得每一个DNA都带上不同的标签，实现单分子标记。具体的，本例设计的adapter具体为Seq ID No.1所示序列。
Seq ID No.1：
5’-P-ACTGNNNNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXTAGAGCATACGGCAGAAGACGAACUAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。
Seq ID No.1所示序列adapter序列中，由5’端开始，P为磷酸化标记，“ACTG”为Tag序列，“NNNNNNNNNNNN”为PolyN序列，PolyN序列中N为随机序列，“AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC”为发夹序列，“XXXXXX”为第一索引序列，同样的X表示随机序列，即第一索引序列为随机生成的6bp的序列，“TAGAGCATACGGCAGAAGACGAAC”为第一通用引物结合序列，“U”为dUTP，“AATGATACGGCGACCACCGAG”为第二通用引物结合序列，“ATC TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT”为发夹序列，前后两个发夹序列在退火时形成发夹结构。本例的adapter序列由life technology公司合成。
(5)DNA两端连接adapter
向步骤(3)的反应体系中加入5μL Ligation Master Mix以及适量的105nmol/L的adapter，最后加入nuclease-free water使总体积为50μL。将此反应体系放置在PCR仪上20℃反应15min。本例经过大量的试验和研究提出，对于5～50ng起始建库DNA量可以加入0.01～0.05nmol的adapter，而如果起始量为50～150ng可以加入0.1nmol的adapter，起始量为150～250ng可以加入0.2nmol的adapter。Adapter的量太高会影响文库扩增以及目标基因的捕获，adapter的量太低则会影响建库效率。起始DNA：adapter＝1:15～1:20为最佳。
具体到本例，以LC2014112样本为例，该样本的cfDNA建库起始DNA含量为5ng，因此，加入0.01μL adapter，adapter序列配合Illunima测序平台。本专利多以Illunima测序平台示例，不适合于Roche/454、Life Technologies/Ion ProtonTM等测序平台。
待测DNA两端连接的单端barcode的adapter序列为Seq ID No.1所示序列，本例具体合成的adapter序列中，第一索引序列具体为“ATCACG”。
在PCR仪上20℃反应15min后，用磁珠纯化，以除去没有连接到DNA上的adapte以及酶等杂质。具体操作同cfDNA双链末端修复后的纯化，并用80％的乙醇洗涤两次。最后用25μL nuclease-free water重悬磁珠，静置5min后放置在磁力架上静置3～5min，然后将上清转移至新的PCR管中，即获得连接好接头的cfDNA。在PCR扩增之前用USER酶(NEB公司)将adapter中的U切除，从而形成双链DNA library。具体操作过程见产品说明书
(5)PCR扩增富集
在步骤(4)得到的约24μL上清中加入扩增体系，具体配方见表3，混匀之后，将反应体系放置在PCR仪上，具体反应程序见表4。
表3 PCR扩增富集反应体系
试剂 单管用量
引物混合物 1μL
PCR Master Mix 25μL
总计 26μL
表4 PCR扩增富集反应条件
需要说明的是，PCR扩增富集中，PCR循环数根据cfDNA的建库起始量而定的，cfDNA的建库起始量与PCR循环数的关系如表1所示，本例中建库起始量为5ng，因此，PCR循环数为12个循环。PCR扩增富集完成即获得本例的cfDNA文库。
(6)cfDNA文库纯化
向PCR扩增富集产物中加入50μL磁珠进行纯化，具体操作同cfDNA双链末端修复后的纯化。最后用25μL nuclease-free water重悬磁珠，静置5min后放置在磁力架上静置3～5min，然后将上清转移至新的1.5mL EP管中，即本例的纯化后的cfDNA文库。
(7)cfDNA文库质量的鉴定
对cfDNA文库进行质检，包括，采用life technology公司的Qubit或者是q-PCR测定cfDNA浓度，采用Agilent 2100鉴定片段大小。
结果显示，本例的LC2014112样本构建的cfDNA文库的浓度为32ng/μL，共25μL。cfDNA文库的片段大小如图2所示。根据之前图1所示结果，我们知道提取得到的cfDNA的片段大小在166bp左右有一个大峰，332bp左右有一个小峰；而cfDNA文库中的DNA是在cfDNA的基础上两端加上adapter，两端adapter的区域长度加起来是138bp，因此构建文库之后的cfDNA文库的片段应该在300bp左右有一个大峰而在470bp左右有一个小峰，如图2所示。
第二部分ctDNA肺癌及肺癌相关基因的特异性捕获
本例的肺癌panel主要基于以下几个方面考虑：
i.针对多个癌症相关信号通路作为靶点，如EGFR是一个由486个氨基酸组成的受体蛋白，属于受体酪氨酸激酶家族，可触发一系列信号通路，导致细胞生长、增殖及存活。这类通路包括RAS-RAF-MEK-ERK通路及PI3K-AKT-mTOR通路。因此EGFR是一个大有潜力的转化治疗靶点。目前还没有可靠的临床表现或特征可以准确预测EGFR突变，因此所有肿瘤均应进行突变检查。
ii.基因的耐药突变导致药物疗效差以及相应解决方案：例如：接受第一代EGFRTKI治疗的患者中，有50％的患者在10个月左右后通常会出现耐药现象，这种耐药机制的产生很大比例是发生了EGFR T790M突变，而目前针对该位点研发的药物主要有阿斯利康的AZD9291、Clovis Oncology的CO-1686以及勃林格殷格翰与韩美制药联合推出的HM61713。
iii.收录已明确临床应用的癌症靶向和化疗用药基因，处于癌症药物适用临床调查阶段的基因，及所有已知的癌症驱动基因，如对于肺癌治疗，临床已经应用的靶向药物包括了吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、克唑替尼、色瑞替尼、曲妥珠单抗等，化疗药物包括顺铂，卡铂，紫杉醇，多西紫杉醇，长春瑞滨，吉西他滨，依托泊苷，伊立替康，长春碱，丝裂霉素，异环磷酰胺，培美曲塞等。而还处于临床实验的靶向药物包括阿斯利康的AZD9291、Clovis Oncology的CO-1686、勃林格殷格翰与韩美制药联合推出的HM61713、安斯泰来的ASP8273、诺华的EGF816等。
iv.结合多个数据库，包括COSMIC、TCGA、DrugBank、NCCN、PharmGKB、HGMD、CGAP/Mitelman、OMIM、NIH、KEGG等，用以分析基因的重要性。其中，TCGA是目前最大的癌症基因信息的数据库。
v.紧密结合临床研究热点，包括在2015年ASCO以及CSCO等大型会议上都提到的肺癌研究的三大热点，第一，ALK、RET、ROS1等融合基因的研究。目前至少发现了14种EML4-ALK变体。几乎所有研究均显示EML4-ALK融合基因主要存在于NSCLC中，其出现频率为5％-10％。ROS1基因重排代表一类新的独特的NSCLC分子亚型，其发生频率为1％-2％。RET融合基因主要在肺腺癌中出现，约占亚裔与非亚裔肺腺癌的1％～2％。第二，MET 14exonskipping，之前针对c-MET的研究主要是对其扩增的研究，而现今MET的14号外显子剪接突变可能成为一类新的NSCLC的亚型，并且克唑替尼对这类突变患者有效。第三，肺癌的免疫治疗，目前针对免疫检查点的治疗药物主要有默克的Keytruda(pembrolizumab)，即MK-3475。该药物于2014年9月4日获FDA批准，成为FDA批准的第一个PD-1抗体。百时美施贵宝的Opdivo(Nivolumab,BMS-936559)，PD-1抗体。罗氏的MPDL3280A。该药物为PD-L1抗体。阿斯利康的MEDI4736，PD-L1抗体。
vi.多种变异信息检测分析，包括点突变、基因重排、扩增、缺失、插入等；如在肺癌中常见的EGFR突变、ALK重排、HER2突变、BRAF突变、MET扩增、ROS1重排、RET重排、KRAS突变等。
基于以上六个方面的考虑，本例的肺癌特异性捕获的靶向基因中包括了17个靶向药物靶点基因，18个化疗药物靶点基因，8个耐药基因，49个信号通路相关基因，以及13个DNA修复相关的基因，共计105个基因。选取这105个基因的全部外显子以及部分内含子区域并且在区域两端延伸10bp，以获取个别重要的剪接突变信息，如：c-MET的14exon skipping可能成为非小细胞肺癌的一种新亚型。本例针对这105个基因的各个位点设计了12659条捕获探针。本例设计的探针分别在Agilent、Roche公司合成。这105个基因的12659条捕获探针在一个单管中，因此一次杂交反应即可捕获这105个基因。以EGFR为例，文献报道在肺癌中这个基因的突变主要发生在18、19、20以及21号外显子区域，但是为了发现一些新的变异信息，本例针对EGFR的所有外显子都设计了捕获探针。EGFR 18号外显子的序列如Seq IDNo.2所示，针对EGFR 18号外显子设计了两条捕获探针，两条捕获探针的序列分别为Seq IDNo.3和Seq ID No.4所示序列。
Seq ID No.2：
5’-C TTGTGGAGCC TCTTACACCC AGTGGAGAAG CTCCCAACCA AGCTCTCTTGAGGATCTTGA AGGAAACTGA ATTCAAAAAG ATCAAAGTGC TGGGCTCCGG TGCGTTCGGC ACGGTGTATAAG-3’
Seq ID No.3：
5’-GAACACCTCGG AGAATGTGGG TCACCTCTTC GAGGGTTGGT TCGAGAGAAC TCCTAGAACTTCCTTTGACT-biotin-3’
Seq ID No.4：
5’-TCCTAGAACT TCCTTTGACT TAAGTTTTTC TAGTTTCACG ACCCGAGGCC ACGCAAGCCGTGCCACATAT TC-biotin-3’
捕获探针与目的基因序列是互补的，并且在捕获探针的3’端有biotin标记，这样用亲和链霉素的磁珠，利用亲和链霉素与biotin的化学反应，就能将与探针互补配对的目的基因调取出来，从而实现目的基因的捕获。
本例的105个基因捕获方案可以采用多种平台实现，例如Agilent公司的SureSelect XT/XT2Target Enrichment System、Roche公司的Nimblegen SeqCap EZLibrary等。具体的，本例以肺癌样本LC2014112的cfDNA文库进行试验，采用Agilent公司的SureSelect XT2Target Enrichment System捕获试剂进行杂交捕获，具体操作如下：
1、cfDNA文库与捕获探针的杂交，Agilent公司建议对于XT2捕获试剂盒，一个探针应用于16个DNA文库的基因捕获，但是本例经过大量的试验和研究认为，一个探针应用于10～12个DNA文库的基因捕获的效率会比较好，因为文库间的竞争关系没有那么强烈。一个探针对应于1.5μg的文库DNA，这1.5μg平均分配到10～12个文库中，每个文库的用量是150ng～125ng。然后将这10～12个文库混合到一个离心管中，然后放置在金属浴上蒸干，本专利推荐金属浴的温度可以使用45～60℃。然后加入7μL的nuclease-free water以及9μLSureSelect XT2Blocking Mix，充分混匀，本例是温和混匀一分钟之后37℃孵育5min，重复此操作三次，使得粘附在离心管壁上的DNA充分溶解，将此溶液转移至PCR管中，95℃变性5min，然后65℃Hold。然后加入用RNase inhibitor配置的探针以及37μL SureSelectXT2Hybridization Buffer。这个操作是在65℃的PCR仪上操作，因此需要用带滤芯的枪头来完成。混匀之后65℃杂交24～36h。
2、洗脱，以去除未被探针识别的ctDNA以及一些非特异性结合的DNA。采用亲和链霉素标记的磁珠，因为探针是biotin标记的，biotin能与亲和链霉素发生亲和反应。取50μL磁珠，加入200μL SureSelect XT2Binding Buffer，温和的上下颠倒混匀，放置在磁力架上，静置3～5min后吸去上清，然后重复上述操作2遍，最后用200μL Binding Buffer重悬磁珠。将杂交后的反应液转移至此磁珠中，然后放置在混悬仪上，室温混匀30min。将离心管放置在磁力架上，静置3～5min后吸去上清，加入200μL SureSelect XT2Wash Buffer1，洗涤磁珠一遍。然后用事先65℃温浴的SureSelect XT2Wash Buffer2洗涤6遍，每次加完WashBuffer2重悬磁珠之后都65℃孵育5min。最后磁珠用30μL nuclease-free water重悬磁珠，静置5min后放置在磁力架上静置3～5min，然后将上清转移至新的1.5mL EP管中，分成两管做PCR。
3、捕获后的DNA扩增，按照表5配置PCR扩增反应体系配制反应液，向反应液中加入15μL杂交捕获、洗脱的产物即捕获的ctDNA，进行PCR扩增反应，反应程序见表6。
表5 PCR反应体系
试剂 单管用量
XT2Primer Mix 1μL
nuclease-free water 9μL
Herculase II PCR Master Mix 25μL
总计 35μL
表6 PCR反应条件
表6中，PCR扩增的循环数根据捕获区域的大小而定，捕获的区域越大，PCR的循环数约少，循环数与捕获区域的大小关系如表7所示。本例的肺癌panel大小为0.7M，因此PCR循环数采用10个循环。
表7 PCR循环数与捕获区域大小
捕获区域大下 PCR循环数
1～499kb 12～14
0.5～1.49Mb 9～11
>1.5Mb 8～10
4、ctDNA杂交文库质量的鉴定，包括，采用life technology公司的Qubit测定ctDNA杂交文库的浓度，采用Agilent 2100鉴定片段大小。本例的ctDNA杂交文库即从cfDNA文库中捕获的ctDNA进行洗脱、PCR扩增，获得的PCR扩增产物，该ctDNA杂交文库直接用于后续测序。
质检的结果显示，LC2014112样本血浆cfDNA library与肺癌panel杂交之后的浓度为24ng/μL，共25μL。ctDNA杂交文库的片段大小如图3所示，可见片段大小主要集中在300bp左右。根据分析，由于杂交过程中探针对短目的片段的一定偏好性，使得杂交后PCR产物大小主要集中在300bp左右，因此，图3所示结果符合理论要求。
5、ctDNA杂交文库稀释变性，采用illumina的操作手册，最后上机测序。采用illumina Nextseq 500 2*75测序试剂盒进行测序，本例中，每个样本的测序深度达到10,000x以上。例如ctDNA：cfDNA＝1:1000，那么我们的测序深度也能检测到这个突变10次。因此，可以检测低含量的ctDNA。
第三部分，测序数据的生物信息学分析，采用深圳市海普洛斯生物科技有限公司研发的自动化分析流程，如图4所示，具体包括：
1、首先进行base calling过程，提取碱基信息。
2、然后进行数据质量控制过程，包括去除低质量数据，对数据进行剪裁，去除polyX等误差信息；所述数据质量控制包括，去除低质量数据通常去除mapping质量为Q10的数据，对数据进行剪裁去掉barcode的数据，以及barcode后面的7～10nt,以及reads最后的8～10nt，去除polyN误差信息如果数据中有连续20个以上ployN就直接去掉这样的数据。
3、进行数据比对，去重，错误校正等操作，例如：运用BWA,PICARD,GATK等算法进行数据处理。
4、获取变异信息，基因型信息，SNP和INDEL等，变异信息会进一步地进行校正和过滤，以获得更高质量的变异信息；例如：GATK Realigner Target Creator，GATK IndelRealigner,GATK Base Recalibrator,GATK HaplotypeCaller等算法进行突变信息的分析。
5、变异信息注释，分析，包括蛋白序列变化分析，蛋白功能预测和注释等等；
6、在获得以上注释结果后，结合数据库进行变异和注释信息的解读，并生成解读报告，由专人进行审核和复核；
7、将报告交予医生或者相关的单位，由其根据报告和患者本身的信息进行诊断和指导；
8、通过医生对患者信息的反馈和追踪，将患者相关的特征信息加入数据库，进行机器学习；
9，原始数据、重要的中间数据、报告信息以及知识库都永久存储。具体见图4。
本例对肺癌病人LC2014112样本的ctDNA进行捕获，建库起始量为5ng，检测结果显示，最后发现这个患者EGFR 20号外显子发生了T790M的EGFR-Tki耐药突变，突变率为0.208％，突变检测结果见图5。结果显示，在7号染色体的chr7：55249071位置，本身是碱基C，而患者中这个位点存在C突变成T，在蛋白水平表现为T790M突变，即一代EGFR-TKi耐药。患者在此次基因检测之前已经服用一代EGFR-TKi易瑞沙9个月，并出现疾病进展，通过检测结果，建议该病人换用三代EGFR-TKi(AZD9291、CO-1686、HM61713)，该患者服用AZD9291一个月后，影像学资料显示肿瘤明显缩小。可见，通过本例的检测，能够为患者提供准确的用药信息，提高治疗效果。
本例的肺癌基因检测方法，以ctDNA为检测对象，具有灵敏度高的优势，可以从微量的cfDNA中检测出ctDNA，ctDNA在100pg以上都可以进行检测。采用本例的肺癌基因检测方法，抽取5-10mL外周血液，通过对ctDNA的测序分析，动态评估癌症发展变化，制定精准医疗方案，整个检测过程无创伤，对病患没有任何负面影响；并且，本例的检测方法，可以全面的检测出靶向及化疗药物直接作用靶点基因、靶点相关信号通路基因、DNA损伤修复基因、表观遗传学基因以及其它高频突变基因，这为个体化精准用药指导提供了重要的参考依据。本例的检测方法，结合国际领先的基因捕获技术，检测血液ctDNA的变异情况，具有10,000x以上的测序深度，测序的灵敏度能达到0.1％；并且，能够检测点突变、插入缺失、基因融合，基因拷贝数变化等基因变异信息，给出最精准的用药指导信息。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种肺癌基因的检测方法，其特征在于：对cfDNA进行文库构建，并采用针对肺癌相关的105个基因设计的12659条探针对cfDNA文库进行杂交捕获，上机测序，对测序结果进行数据分析，获得全面、准确的肺癌基因信息。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述对cfDNA进行文库构建，具体包括，提取外周血中的cfDNA，并对提取的cfDNA进行质量控制，测定其片段大小和浓度，依序对提取的cfDNA进行双链末端修复、样品纯化、3’末端加T、连接接头、PCR扩增富集，最后对所述PCR扩增富集的产物进行PCR产物纯化即获得cfDNA文库；其中，所述接头中包含有PCR扩增富集的引物结合位点、索引序列；所述PCR扩增富集中，PCR循环数根据cfDNA的建库起始量N而定，具体的，cfDNA建库起始量N≤5ng时，PCR循环数为11-12个循环，cfDNA建库起始量为5ng＜N≤10ng时，PCR循环数为9-11个循环，cfDNA建库起始量为10ng＜N≤25ng时，PCR循环数为8-9个循环，cfDNA建库起始量为25ng＜N≤50ng，PCR循环数为7-8个循环，cfDNA建库起始量为50ng＜N≤100ng，PCR循环数为5-7个循环，cfDNA建库起始量为100ng＜N≤250ng，PCR循环数为3-5个循环，cfDNA建库起始量为250ng＜N≤500ng，PCR循环数为1-3个循环。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述样品纯化以及PCR产物纯化都采用磁珠吸附法进行。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述肺癌相关的105个基因包括，17个肺癌靶向药物靶点基因、18个肺癌化疗药物靶点基因、8个肺癌耐药基因、49个肺癌信号通路相关基因，以及13个DNA修复相关的基因。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述捕获探针的3’端具有生物素标记。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述杂交捕获中，按照一个探针捕获10-12个cfDNA文库的用量添加捕获探针。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：在进行测序之前还包括对捕获产物进行PCR扩增，然后采用PCR扩增产物进行测序，所述PCR扩增的循环数根据捕获区域的大小而定，具体的，捕获区域为1-499kb，循环数为12-14个循环，捕获区域大于499kb，并小于或等于1.49Mb，循环数为9-11，捕获区域大于1.49Mb，循环数为8-10。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述数据分析包括去除低质量数据、对数据进行剪裁，以及去除polyN误差信息；所述去除低质量数据包括去除mapping质量为Q10的数据；所述对数据进行剪裁包括剪裁去掉barcode数据、barcode后面7-10nt，以及reads最后8-10nt；所述去除polyN误差信息包括去除数据中连续20个以上polyN的数据。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法在肺癌检测试剂盒或肺癌检测设备中的应用。
10.一种肺癌检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有肺癌及肺癌相关的105个基因的12659条捕获探针，并且，所述试剂盒采用权利要求1-8任一项所述的检测方法对待测样品进行检测。
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