CN112430666A - 一种利用高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法，包括以下步骤：(1)柱提法提取DNA；(2)构建文库：首先打断DNA、末端修复和加A尾；然后连接接头进行第一步磁珠纯化后进行UDI接头引物PCR扩增，然后第二步磁珠纯化；(3)杂交捕获；包括文库杂交、文库捕获和清洗、PCR扩增和磁珠纯化；(4)测序；(5)生物信息分析与结果解读。本发明通过对捕获片段进行测序及后续的生物信息分析获取样本突变信息及MSI等信息，分析多种药物与基因变异的关系，帮助肿瘤患者进行基因检测，尤其适用于复发、转移的中晚期患者。

Description

一种利用高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法

技术领域

本发明涉及一种利用高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法。

背景技术

20世纪以来，癌症已成为困扰人类健康的主要危害之一。根据国家癌症中心2016年的数据显示，2015年中国癌症新发病例预计约429万，新增死亡总数约达281万。在众多癌症中肺癌最为常见，是癌症患者死亡的首要原因。胃癌、食管癌和肝癌也在癌症死亡原因中排在前列”。

癌症的发生、进展、转移、治疗应答和耐药可能源于肿瘤细胞克隆中突变的不断累积。肿瘤细胞中的突变几千到几十万不等，然而大多数突变在癌症进展中没有实质性作用，通常被称为伴随突变(passengermutations)。相反，少量突变是驱动突变(drivermutations)，涉及肿瘤的发生和进展。部分驱动及其相关的信号通路可能是"actionable”，即具有指导治疗和预后判断等价值。根据临床研究的证据，一部分突变可以归类为actionable突变。临床医师可以根据存在或不存在这些基因突变进行临床决策，如与结直肠癌中表皮生长因子受体(EGFR)抗体耐药相关的KRAS突变，与非小细胞肺癌相关的EML4-ALK融合等。随着研究的进展，已知的或潜在的actionable突变及相对应的治疗药物不断增加。除了传统的单基因变异靶点外，随着程序性死亡抑制因子1(PD-1)蛋白或其配体(PD-L1)抑制剂在临床的广泛应用，肿瘤突变负荷(tumor muation burden,TMB)和微卫星不稳定(micsallile insabilit,MSI)等的临床价值也得到广泛认可。对于TMB和MSI的检测，高通量测序的技术优势相对于传统Sanger测序得到更好的体现。

肿瘤基因突变检测对指导肿瘤靶向治疗、耐药监测及预后判断等具有重要意义。传统的基因突变检测方法，如Sanger测序、焦磷酸测序和实时荧光PCR等仅能对单个基因，或者单个基因的部分外显子突变进行检测，对复杂变异类型的检测存在局限性。高通量测序能够同时对上百万甚至数十亿个DNA片段进行测序，因此可在较低成本下一次对多至上百个肿瘤相关基因、全外显子及全基因组进行检测，而且需要的样本量并不增加。高通量测序技术因其在通量、成本和效率方面的优势，在肿瘤靶向治疗基因突变检测上展现了广阔的应用价值。

采用高通量测序进行肿瘤基因突变检测的实验技术策略主要有3种，全基因组测序(WGS)、全外显子组测序(WES)和靶向测序。肿瘤基因高通量测序数据的分析策略主要包括：单核苷酸变异(SNV)、小片段插入缺失(indel)、拷贝数变异(CNV)分析和结构变异(SNV)分析。其中靶向测序目前在临床的应用最为广泛，WES其实也属于靶向测序的一种，但覆盖的是基因组上所有的外显子区域。通常提到的靶向测序是指选择基因组上感兴趣的基因或基因区域作为靶向检测区域，可以是几个基因上的个别外显子区域，也可以是几百上千个基因上的全部外显子区域。靶向测序兼顾了实际检测需求，又降低了测序成本，因此目前在临床肿瘤检测中应用最为广泛。

发明内容

本发明提供了一种新的基于高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法，采用柱提法高效提取组织基因组DNA，以此为模板进行文库构建，然后再通过个性化定制探针panel对文库进行杂交捕获、产物富集、扩增纯化后得到最终的文库，然后再对文库进行高通量测序。测序数据下机后，通过生物信息学分析和比对，得到各文库中存在的变异，然后再对各个变异进行注释和解读。

依据NCCN、ACMG、AMP等联合发布的癌症变异注释及报告指南和文献报告及各种专家共识，本发明精心挑选了与肿瘤密切相关的150个基因，涵盖指南推荐的所有基因及临床热点基因，检测范围包括基因编码区单核苷酸位点变异(SNV)、小片段插入/缺失(INDEL)、融合基因(Fusion)、拷贝数变异(CNV)等突变类型，设计合成探针panel，捕获这150个基因的全外显子区域，通过对捕获片段进行测序及后续的生物信息分析获取样本突变信息及MSI等信息，分析多种药物与基因变异的关系，帮助肿瘤患者进行基因检测，尤其适用于复发、转移的中晚期患者。

本发明采用以下技术方案实现上述目的：

一种利用高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)柱提法提取DNA；

(2)构建文库：首先打断DNA、末端修复和加A尾；然后连接Universaladapter进行第一步磁珠纯化后进行UDI接头引物PCR扩增，然后第二步磁珠纯化；

(3)杂交捕获；包括文库杂交、文库捕获和清洗、PCR扩增和磁珠纯化；

(4)测序；

(5)生物信息分析与结果解读。

进一步地，步骤(3)中PCR扩增程序为98℃，45sec；98℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，12个循环；72℃，1min；4℃保存。

进一步地，步骤(5)中生物信息分析包括数据预处理、数据比对、数据质控、突变分析和突变注释的步骤。

进一步地，步骤(5)中结果解读方法为突变丰度≥0.2％为突变阳性；反之，则判断为阴性。

与现有技术相比，本发明技术方案具有如下优点：

本发明是一种高效的提取FFPE样本中基因组DNA方法，该方法从福尔马林固定、石蜡包埋组织中分离纯化基因组DNA，克服了福尔马林交联造成的抑制效应。使用的脱蜡液，较之二甲苯更安全；并通过特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，可得到高品质的DNA。整个提取过程只需20min(除消化时间)，提取的基因组完整性好，纯度高，质量稳定可靠，非常适用于下游的文库构建。

本发明是一种高效靶向文库制备方法：首先该方法构建DNA文库，模板起始量可低至50ng，将酶切打断、末端补平和加A尾在一个体系里完成，耗时短，效率高；其次杂交时间最短可至15min即可实现一般过夜杂交的效率。最终得到文库片段大小在300-400bp左右(如图2)，能够兼容illumina各种测序平台进行测序。

本发明包括一套完整生信分析解读流程，包含数据预处理，数据比对、数据质控、突变分析、突变注释及解读等一系列过程。

附图说明

图1是本发明方法流程图。

图2是根据本发明方法获得的文库片段大小示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。

1.1样品处理

所有石蜡样品均需先由病理切片，HE染色，病理镜检。在经过病理镜检后，要求含有肿瘤组织且样品量＞100个细胞，然后才能进入后续的样品准备和核酸提取流程，组织进入实验室后按图1流程处理。

1.1.1 DNA提取(柱提法)

1.1.1.1取石蜡切片(5～10μm厚，1×1cm2大小)5～8张，用干净刀片去除多余石蜡，把样品(<20mg)剪切成尽量小的碎片，并转移至1.5ml离心管中。去除多余石蜡或用剪刀、刀片把样品剪切成尽量小的碎片有利于后续脱蜡。

1.1.1.2加入0.6ml Deparaffinization Solution至样品中，剧烈涡旋5sec，短暂离心让样品浸泡到脱蜡液中，56℃水浴6min，剧烈涡旋20sec。

1.1.1.3 14,000×g离心2min，弃上清。注意：不要吸到沉淀。

1.1.1.4加入200μl Buffer FTL和20μl Proteinase K工作液至样品中，涡旋混匀。56℃水浴1h至样品完全消化，其间需颠倒混匀数次。

1.1.1.5 90℃水浴1h。注意：90℃处理可以去除DNA与蛋白质的交联，明显提高DNA的产量。

1.1.1.6加入200μl Buffer FL和200μl无水乙醇至上述处理液中，涡旋混匀15sec。

1.1.1.7将FFPE DNA吸附柱置于收集管中，转移混合液至吸附柱中。10,000×g离心60sec。

1.1.1.8弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入500μl Buffer FW1(已加入乙醇)至吸附柱，10,000×g离心60sec。

1.1.1.9弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入650μl Buffer FW2(已加入乙醇)至吸附柱，10,000×g离心60sec。

1.1.1.10弃滤液，将吸附柱置于收集管中，10,000×g离心空柱3min。

1.1.1.11将吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，开盖3min(挥发乙醇)，加入15～50μl Elution Buffer至吸附柱膜中央。室温静置1min，10,000×g离心1min。

1.1.1.12丢弃吸附柱，将DNA保存于﹣20℃，长期保存需放置于﹣70℃。

1.1.1.13取收集到的DNA溶液1ul用Qubit检测所得DNA的浓度，同时取1.5ul用Nanodrop检测所得DNA的纯度。提取后的样本DNA，如不立即进行后续实验，可在-20℃以下保存12个月。

1.1.2 DNA样本质量要求

提取后的DNA使用

dsDNA HS Assay Kit定量，DNA总量应不少于50ng；使用Nanodrop检测纯度，OD260/280应不低于1.8。

1.2酶切法文库构建

1.2.1 DNA打断、末端修复和加A尾(扩增区)

首先打开PCR仪，将PCR仪热盖温度设置为70℃。

1.2.1.1 DNA建库起始量为50ng，根据Qubit定量出每个样品的DNA浓度，用水稀释到5ng/uL，充分混匀瞬离后冰上待用。

1.2.1.2至试剂准备区，取1新的1.5ml离心管，配制酶切反应混合液。将10xFragmentation Buffer和5x Fragmentation Enzyme于冰上融化后，根据下表配制混合液，并混匀离心后，将混合液分装至八联管中，然后通过传递窗转移至扩增区。(同时可将下一步纯化所用的DNA纯化磁珠液从冰箱中取出，充分振荡混匀后，一起转移至扩增区，至室温平衡至少30min)

试剂	单反应体积
		Water	25ul
10x Fragmentation Buffer	5ul
		5x Fragmentation Enzyme	10ul
Total	40ul

1.2.1.3稀释好的待检样品各10ul分别加至配制好反应混合液的八联管中，轻轻震荡混匀，瞬离后迅速放入PCR仪，确定PCR仪热盖温度为70℃，然后采用如下程序：

温度	时间
		32℃	22min
65℃	30min
		4℃	HOLD

1.2.2连接Universal adapter

1.2.2.1在以上步骤完成后的每个反应体系分别加入5uL Universal adapter。用轻轻震荡混匀，离心后置于冰上待用。

1.2.2.2至试剂准备区，配制连接反应混合液。将DNA Ligation Buffer和DNALigation Mix于冰上融化后，根据下表配制混合液，混匀离心置于冰上转移至扩增区待用。

试剂	单反应体积
		Water	15ul
DNA Ligation Buffer	20ul
		DNA Ligation Mix	10ul
Total	45ul

1.2.2.3在每个1.2.2.1步骤准备好的样本中，加入45ul 1.2.2.2步骤中配置好的连接反应混合液。轻轻震荡混匀，离心后迅速放入PCR仪，20℃连接15分钟(热盖关闭)。结束后取出，立即开始磁珠纯化。

1.2.3第一步磁珠纯化(扩增区)

1.2.3.1文库纯化磁珠在使用前需从4℃取出，充分漩涡震荡混匀，室温平衡至少30min备用。

1.2.3.2将室温平衡好的纯化磁珠悬浮液振混1min，按80ul(样品体积0.8倍)/样本分装至1.5ml离心管中。

1.2.3.3将连接产物全部转到对应离心管的磁珠中，轻轻震荡混匀，避免产生气泡。1.2.3.4将离心管于室温下静置5min后，置于磁力架上5min，直至上清澄清。小心移去上清。

1.2.3.5保持离心管于磁力架上，向各管中加入200ul新鲜配制的80％乙醇，室温静置1min，吸弃上清。

1.2.3.6重复步骤9.2.2.5，瞬时离心后将离心管放回磁力架，用10ul移液器尽量吸除管底所有残留乙醇溶液。

1.2.3.7离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，使乙醇全部挥发，切忌过度干燥。

1.2.3.8向各管中加入17ul无酶水，使用移液器上下混匀10次。室温孵育5min。

1.2.3.9将各管置于磁力架上静置5min，直至上清澄清。

1.2.4 UDI接头引物PCR扩增

1.2.4.1步骤1.2.3.9静置期间可至试剂准备区，根据样品数，准备八联管于冰盒上，取25ul KAPAHiFi HotStartReadyMix分装至八联管各孔内。

1.2.4.2再向八联管的各孔中分别加入10ul事先设定好的不同index的UDI引物。然后通过传递窗转移至扩增I区。

1.2.4.3按照已设置好的位置顺序，吸取步骤1.2.3.9得到的15ul纯化上清液加入至已分装好PCR反应混合液的各孔中，盖上管盖，轻轻震荡，短暂离心收集液体。

1.2.4.4将配制好的PCR反应管通过传递窗转移至扩增区进行PCR反应。热盖105℃，反应程序设置如下表。

1.2.5第二步磁珠纯化(扩增区)

1.2.5.1文库纯化磁珠在使用前需从4℃取出，充分漩涡震荡混匀，室温平衡至少30min备用。

1.2.5.2将室温平衡好的纯化磁珠悬浮液振混1min，按50ul(样品等体积)/样本分装至1.5ml离心管中。

1.2.5.3取出PCR反应产物，离心机离心30s，将产物全部转到对应离心管的磁珠中，轻轻震荡，避免产生气泡。

1.2.5.4室温下静置5min后，置于磁力分离架上5min，直至上清澄清。小心移去上清。

1.2.5.5置于磁力分离架上，加入200ul新鲜配制的80％乙醇，室温静置1min，吸弃上清。

1.2.5.6重复步骤9.2.7.5，并尽量去除所有残留乙醇溶液。

1.2.5.7离心管留于磁力架上室温开盖5min干燥，保证所有乙醇全部挥发。

1.2.5.8加入22ul无酶水，轻轻震荡。室温孵育5min。

1.2.5.9置于磁力架上5min，取20ul上清(文库)进入下一步文库富集。取1ul稀释10倍后，使用Qubit和片段分析仪分别进行文库浓度和片段大小测定，检测文库的平均片段长度应该在400bp左右。

1.3杂交捕获

1.3.1文库杂交

1.3.1.1文库池DNA混合方案：文库池常包含多个不同样本文库，根据文库DNA浓度计算文库池进入量，混合获得文库池。文库池DNA总量为1.5-4μg，建议同质量样本建立文库池。DNA文库用量参考下表：

混合样本数量	每个文库的用量	每个反应文库总量
			1	500ng	500ng
2	500ng	1,000ng
			3	833.3ng	2,500ng
4	625ng	2,500ng
			8	312.5ng	2,500ng

1.3.1.2计算好不同文库用量，于1.5ml离心管中对各文库进行混合，轻轻震荡，瞬离备用。

1.3.1.3在混合好的样本中分别加入以下预杂交试剂，混匀，尽量不要产生气泡。

试剂	体积
		探针Panel	6ul
Universal Blockers	8ul
		Blocking Solution	5ul

1.3.1.4将以上混合好的预杂交试剂管打开管盖，在管口上缠绕3层封口膜，用10ul吸头在封口膜上刺数个小孔，然后将管置于真空浓缩仪中，配平后，常温烘干直至管内溶液干燥完全。烘干过程约1小时。

1.3.1.5烘干快结束时，可先将Fast Hybridization Mix在65℃孵育10min或直至所有沉淀溶解，然后按照下表，设置PCR仪程序，热盖85℃：

温度	时间
		95℃	5min
60℃	15min-4h

1.3.1.6烘干结束后，从干燥仪中取出离心管，撕下封口膜，将FastHybridizationMix迅速涡旋并取20uL加至管中重悬样本(请不要让杂交液恢复至室温)，指尖轻弹混匀，避免产生气泡，室温静置5min。使用移液器上下吹吸10次，完全溶解DNA后，将管内所有溶液尽可能全部转移至一个新的PCR管中，避免产生气泡。

1.3.1.7再向管中加入30uL Hybridization Enhancer覆盖在其内试剂表面，然后瞬时离心去除气泡。

1.3.1.8将PCR管放入预热好的PCR仪中杂交，孵育2小时。(在此期间可至试剂准备区将下一步捕获所用的Streptavidin Binding Beads从冰箱中取出，充分振荡混匀后，至室温平衡至少30min)

1.3.2文库捕获和清洗

1.3.2.1至试剂准备区，按下表分装富集试剂(单个富集反应试剂用量)至1.5ml离心管中，然后将各组分和平衡好的磁珠组分(Streptavidin Binding Beads)通过传递窗转移至扩增区。

组分	所需体积
		Fast Binding Buffer	900ul
Fast Wash Buffer 1	450ul
		Wash Buffer 2	700ul

1.3.2.2进入扩增区，在恒温金属浴上，66℃预热450ul Fast Wash Buffer 1；48℃预热700ul Wash Buffer 2。

1.3.2.3震荡预平衡的Binding Beads直至完全混匀，取100uL磁珠至1.5mL离心管中；

1.3.2.4向离心管中加入200uL Fast Binding Buffer并用枪头吹打混匀；

1.3.2.5将离心管置于磁力架上1min或至溶液澄清，弃去上清，取下离心管；

1.3.2.6重复以上1.3.2.3-1.3.2.5洗涤步骤2次，共3次；

1.3.2.7第三次清洗后，再加入200uL Fast Binding Buffer，震荡重悬使充分混匀；

1.3.2.8步骤1.3.1杂交结束后，打开PCR仪盖并迅速将杂交液全部转移至平衡好的磁珠液中。注意：快速将PCR仪中的试剂转移至磁珠中是关键步骤，必须直接在PCR仪上样，不要将杂交管取出防止杂交液温度下降。

1.3.2.9将离心管合盖后再用封口膜封紧管口，然后置于在Biocate振荡器上，1200rpm，室温充分混匀30min。

1.3.2.10将离心管从混匀仪上取下，快速离心后在磁力架上放置1min，去上清，取下管子，加入200uL预热的Fast Wash Buffer 1(不要将其从金属浴中取出)，轻轻震荡混匀；

1.3.2.11将离心管迅速置于66℃孵育5min；

1.3.2.12将离心管瞬离后放置于磁力架上1min，去上清，取下管子，再次加入200ul预热的Fast Wash Buffer 1，轻轻震荡混匀；

1.3.2.13将离心管迅速置于66℃孵育5min；

1.3.2.14将离心管瞬离后转移其内所有液体至一个新的1.5ml离心管；磁力架上放置1min，去上清；

1.3.2.15取下管子，加入200uL预热过的Wash Buffer 2(不要将其从金属浴中取出)，轻轻震荡混匀；

1.3.2.16将离心管迅速置于48℃孵育5min；

1.3.2.17将离心管瞬离后放置于磁力架上1min，去上清，取下管子；

1.3.2.18重复(步骤1.3.2.15-1.3.2.17)洗2次，共三次；

1.3.2.19将离心管瞬离后置于磁力架上，用10uL枪头吸干净洗液；

1.3.2.20将离心管从磁力架上取下，加入45uL无核酶水，轻轻震荡混匀，冰上孵育该溶液，如果暂时不进行PCR扩增，可以将该磁珠混合液置于20℃保存。

1.3.3 PCR扩增

1.3.3.1进入试剂准备区，取1个PCR管，配制混合液，向管中分别加入(25ul KAPAHiFi HotStartReadyMix+2.5ul Amplification Primers＝22.5ul)，然后将PCR管通过传递窗转移至扩增I区。(注意：此时可将DNA Purification Beads从冰箱中取出，充分振荡混匀，同PCR管一起转移至扩增区，至室温平衡至少30min)

1.3.3.2取步骤1.3.2.20中得到的22.5ul磁珠悬液加入到PCR管中，轻轻振荡混匀瞬时离心。剩余的22.5ul可以保存至–20℃备用。

1.3.3.3将PCR管置于PCR仪上，热盖105℃，按以下反应程序扩增：

1.3.4磁珠纯化(扩增区)

1.3.4.1涡旋充分混匀预平衡的DNA纯化磁珠，取1干净的1.5ml离心管，加入90ul(1.8*)DNA纯化磁珠，待PCR结束后，将PCR管瞬时离心，然后将PCR管内所有溶液全部转移至1.5ml离心管中，涡旋充分混匀；

1.3.4.2将离心管于室温孵育5min；

1.3.4.3将离心管置于磁力架上1min，待溶液澄清后去上清；

1.3.4.4保持离心管在磁力架上，加入新鲜配制的80％乙醇200ul，孵育1min，弃上清；重复一次80％乙醇洗涤(共2次)；

1.3.4.5将离心管瞬时离心后置于磁力架上，用10ul枪头小心去除残留的乙醇，室温放置5-10min或至磁珠干燥，忌干裂；

1.3.4.6从磁力架上取下管子并加入32ul无核酶水，轻轻震荡混匀，室温孵育5min；

1.3.4.7将离心管置于磁力架上3min或至溶液澄清；

1.3.4.8转移30ul上清至干净的1.5ml离心管，管盖上标明文库名称和建库日期，然后转移至文库质检区。注：纯化后富集文库若不能立即上机测序，可在-20℃以下保存30天。

1.3.4.9另取1ul使用

dsDNA HS Assay Kit进行文库浓度测定，文库浓度应大于0.5ng/ul。同时可采用2100片段分析仪检测文库片段长度分布，平均片段长度应该在375–425bp。

1.4测序

1.4.1.1文库预处理(文库质检区)

a)准备变性试剂：取200ul 1N文库变性液浓储，加800ul无酶水配置成0.2N文库变性液，涡旋混匀，短暂离心，室温放置备用。

b)文库变性：取5ul文库(4nM)至低吸附管管底，再加入5ul 0.2N文库变性液，吹打混匀。关闭管盖室温孵育5min，之后立即置于冰上。

c)文库稀释：向变性后的10ul文库中加入990ul冰上预冷的稀释缓冲液，混匀后快速离心，置于冰上备用。

d)使用洁净的1mL枪头刺穿Load Samples(装入样品)孔的封箔，将600ul已制备文库注入Load Samples(装入样品)孔中。避免接触封箔。

e)加载样品后检查孔中是否有气泡，如果有气泡在工作台轻轻敲打试剂盒以释放气泡。

1.4.1.2上机测序(测序区)

将加载好文库的测序试剂盒通过传递窗转移至测序区，放入MiSeqDx内，按照测序仪操作说明进行上机测序。

1.5生物信息分析与结果解读

1.5.1数据预处理：使用Illumina Sequencing Analysis Viewer v1.8软件分析每批次数据测序质量Q30碱基占比，如批次数据Q30碱基占比≥75％则质控通过；如批次数据Q30碱基占比<75％，则质控不通过。然后使用Illumina公司的bcl2fastqv2.19软件将MiSeqDx测序生成的BCL文件转化成样本对应的FastQ文件。使用相关分析软件如Trimmomatic-0.36软件，去除建库过程中引入的接头序列以及低质量碱基片段。

1.5.2数据比对：使用序列比对模块(如BWA v0.7和GATK v3.4软件)将FastQ文件中的碱基序列比对至hg19(GRCh37)人类参考基因组上生成BAM文件，并根据基因组坐标对BAM文件进行排序，然后对基因组复杂区域进行序列比对优化。

1.5.3数据质控：使用相关数据质控软件，计算每个样本的Q30碱基占比、序列比对至参考基因组比例、目标区域的平均测序深度等参数。如果Q30碱基占比≥75％，序列比对至参考基因组比例≥90％，平均测序深度≥700X，则样本数据质控通过。如数据质控不通过，则判定实验失败，需要重新实验。

1.5.4突变分析：使用变异鉴定模块(如VarScan v2.3软件)分析样本中的点突变和插入缺失突变，使用融合分析模块(如Delly v0.7及socrates v1.1软件)分析样本中的融合，分析参数设置要求序列比对质量≥30，碱基质量≥20。

1.5.5突变注释：使用注释模块(如ANNOVAR v20160425软件和VEP v83软件)对鉴定出的点突变、插入缺失和基因融合进行HGVS格式和COSMIC数据库(v71)、CLINVAR数据库(v20171231)、dbSNP数据库(v138)、1000Genomes数据库(v201508)、ExAC数据库(v0.3)注释。

1.5.6阳性判断标准：经过以上1.5.1-1.5.5步分析流程处理后，符合质量指标要求的突变结果进行阴/阳性判断。如突变丰度≥0.2％为突变阳性；反之，则判断为阴性。

Claims (4)

1.一种利用高通量测序检测肿瘤相关多基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)柱提法提取DNA；

(2)构建文库：首先打断DNA、末端修复和加A尾；然后连接接头进行第一步磁珠纯化后进行UDI接头引物PCR扩增，然后第二步磁珠纯化；

(3)杂交捕获；包括文库杂交、文库捕获和清洗、PCR扩增和磁珠纯化；

(4)测序；

(5)生物信息分析与结果解读。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增程序为98℃，45sec；98℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，12个循环；72℃，1min；4℃保存。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中生物信息分析包括数据预处理、数据比对、数据质控、突变分析和突变注释的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中结果解读方法为突变丰度≥0.2％为突变阳性；反之，则判断为阴性。

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