CN116926221B - 一种构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组，属于生物检测技术领域。本发明优化得到的54对引物组能排除宿主基因干扰，且相互之间不干扰，能准确检测结核分枝杆菌分型，对快速鉴定和结核病流行性分析提供基础，且本发明提供一种针对DNA测序结果判断菌株分型的判断标准，为结核分枝杆菌分型的判断提供参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组。
背景技术
测定结核分枝杆菌基因分型可及时发现结核病的疫情流行特点，分析不同辖区患者之间的传播链条，从而及时制定有效的结核病防治政策，为早期发现和控制结核病流行特征提供有力的依据。
1970 年代后期，随着分子生物学技术的发展和应用，一系列用于鉴别 MTB 菌株基因分型技术应运而生，包括：
1. 限制性内切酶多态性及凝胶电泳。该技术通过识别特定的核苷酸序列，在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割，使用内切酶 BstEⅡ能较好地区分不同菌株，使用脉冲场凝胶电泳技术取代普通电泳可以提高限制性内切酶分型方法的分辨率；但该技术较小片段DNA 的分辨率仍有待提高。
2. IS6110 限制性片段长度多态性分析。该技术是将PCR 技术、RFLP 分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA片段进行复制扩增，然后应用DNA 限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA 片段是否被切割而分型；但该技术操作相对复杂，需要大量的 MTB 菌株，需要多种昂贵仪器，结果不易分析，对于低拷贝或无拷贝的菌株难以鉴定，不便于实验室比对。
3. 间隔区寡核苷酸分型技联重复序列分型。该技术是指针对多种不同的间隔序列（位于结核分枝杆菌染色体上DR序列之间），设计各自特异的寡核苷酸探针并固定在尼龙膜上，引物标记后的扩增产物与膜上的探针进行反向杂交的技术；但此技术分辨率不足，不能识别复合感染。
4. 分枝杆菌散布重复单元-可变数目串联重复序列分型。该技术检测手段常用聚合酶链反应产物进行凝胶电泳或者进行桑格测序分析，是以聚合酶链反应为基础的分型方法；但该技术分辨率相对不高，若通过增加位点提高分辨率，则需要增加更多的实验室工作量，仪器和试剂价格昂贵。
5. 全基因组测序技术。该技术首先进行结核分枝杆菌的培养，提取基因组后，利用酶切、物理打断技术，将一个基因组长度的DNA片段或单个染色体长的DNA片段分割成较小的片段，避免整个基因组的同时测序产生的种种技术困难。接着，由于片段的大小大约在200bp-500bp，所以可以利用多种方法将此片段分叉成若干个物种，然后放在illumina上，实现物种的大规模测序的技术手段，该技术分析最为全面准确，但菌种需求量较大，操作繁琐。
发明内容
基于上述背景，本发明提供一种用于判断结核分枝杆菌分型的引物组以及包括所述引物组的试剂盒，使用所述试剂盒能准确测定结核分枝杆菌分型。
第一方面，本发明提供一种构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组，其特征在于，所述引物组由SEQ ID NO.1-108所示的序列组成。
具体的，所述引物组序列，以及所述引物组与结核分枝杆菌分型的对应关系如下表所示：
表1 引物组序列信息及对应结核分枝杆菌亚型
本发明提供的引物组能判断的结核分枝杆菌分型包括亚型1、亚型1.1、亚型1.1.1、亚型1.1.2、亚型1.1.3、亚型1.2.1、亚型1.2.2、亚型2、亚型2.1、亚型2.2、亚型2.2.1、亚型2.2.2、亚型3、亚型3.1.1、亚型3.1.2、亚型4、亚型4.1、亚型4.1.1、亚型4.1.2、亚型4.2、亚型4.2.1、亚型4.2.2、亚型4.3、亚型4.3.1、亚型4.3.2、亚型4.3.3、亚型4.3.4、亚型4.4、亚型4.4.1、亚型4.4.2、亚型4.5、亚型4.6、亚型4.6.1、亚型4.6.2、亚型4.7、亚型4.8、亚型4.9、亚型5、亚型6、亚型7、亚型BOV、亚型BOV_AFRI。
本发明提供的上述54对引物组可以对应检测结核分枝杆菌分型，其优势在于，通过引物序列优化，使本发明提供的上述54对引物组在检测中互不干扰，不会出现构建的基因文库出现无条带或主条带不清晰，或者出现引物二聚体的情况。
第二方面，本发明提供一种试剂盒，用于判断结核分枝杆菌分型，其特征在于，所述试剂盒包括上述由SEQ ID NO.1-108所示的序列组成的引物组。
进一步的，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、多重PCR扩增试剂、接头序列 PCR反应试剂和PCR产物纯化试剂。
在本发明的具体实施方式中，所述DNA提取试剂、多重PCR扩增试剂、接头序列 PCR反应试剂和PCR产物纯化试剂均是本领域技术人员常规使用试剂，可通过商业途径购买或者自行配制。
第三方面，本发明提供一种引物组或试剂盒在制备具有以下任意一种用途的产品中的应用，其特征在于，所述用途包括：（1）用于结核分枝杆菌亚型判断；（2）用于结核分枝杆菌亚型菌株水平鉴定；（3）用于结核分枝杆菌亚型菌株进化分析。
第四方面，本发明提供一种引物组或试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断与结核分枝杆菌相关疾病的产品中的应用。
第五方面，本发明提供一种结核分枝杆菌亚型判断和/或菌株水平鉴定和/或进化分析的方法，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的，其特征在于，所述方法包括利用本发明提供的引物组对所述基因位点进行检测，再依据基因位点与亚型的对应关系得到结核分枝杆菌亚型和/或菌株水平和/或进化分析结果。
进一步的，所述方法包括如下步骤：样本前处理、DNA提取、构建基因组文库，DNA测序仪测序，数据分析。
所述样本包括痰液、胸水、腹水。
在本发明的具体实施方式中，所述样本为痰液。
具体的，痰液样本前处理方法为：
S1：收集 2-3ml 痰液，加入等体积NALC-NaOH缓冲液，室温孵育至痰液明显液化；
S2：加磷酸盐缓冲液稀释，混匀，室温下离心，弃上清留沉淀；
S3：将沉淀混匀，转移至离心管中，80℃加热30min，-20℃冻存备用。
本发明所述的DNA提取方法可根据技术人员常规操作进行，例如使用市售基因组DNA提取试剂盒提取样本DNA。
本发明所述的构建基因文库的方法包括：
（1）以待测样本提取的DNA为模板，利用本发明提供的引物组进行多重PCR扩增；
（2）将多重PCR扩增产物与接头引物混合，进行接头序列PCR扩增，得到所述基因文库。
优选的，所述构建基因文库的方法还包括：使用磁珠纯化PCR扩增产物，且使用磁珠纯化接头序列PCR扩增产物。
更优选的，所述构建基因文库的方法还包括基因文库质量检测和基因文库浓度测定。
本发明所述的数据分析包括：根据DNA测序仪的测序结果确定基因位点，依据基因位点与分型的对应关系确定结核分枝杆菌分型。
具体结核分枝杆菌分型判断标准如下：
（Ⅰ）单一亚型菌株判断标准
（a）单一基因位点对应单亚型：mean(deep)>100×，且site(mutation)=，则判定样本为对应的亚型。
（b）多基因位点对应单亚型，满足mean(deep)>100×，且number(site)>1，site(mutation)=，则判定样本为对应的亚型。
（c）同一样本对应到多种亚型，满足mean(deep)>100×，且site(mutation)=，A(reads)>10且B(reads)>10时：
①当A(number(site))>B(number(site))，且A(number(site))-B(number(site))>2，则判定样本为亚型A；
②当A(number(site))<B(number(site))，且A(number(site))-B(number(site))<-2，则判定样本为亚型B。
（Ⅱ）多种亚型菌株判断标准
同一样本对应到多种亚型，满足mean(deep)>100×，且site(mutation)=, A(reads)>10且B(reads)>10时，且-2<A(number(site))-B(number(site))<2，则判定样本为A和B两种亚型。
在上述判断方法中，mean(deep)表示平均测序深度，mutaion表示突变频率，reads表示突变reads数，deep表示测序深度，A表示一种亚型，B表示另一种亚型，number表示数量，site表示突变位点。
本发明提供的用于构建基因文库的引物组、包含所述引物组的试剂盒，以及结核分枝杆菌亚型的判断方法具有如下技术优势：（1）常规的结核分枝杆菌基因型检测样本需要对待检样本进行培养，本发明的检测样本可为痰液、胸水、腹水，对快速鉴定和结核病流行性分析提供基础；（2）与培养的菌株作为待检样本相比，痰液、胸水、腹水的基质更复杂，会出现宿主本身的基因干扰，本发明优化得到的54对引物组能排除宿主基因干扰，且相互之间不干扰，能准确检测结核分枝杆菌分型；（3）本发明提供了一种针对DNA测序结果判断菌株分型的判断标准，为结核分枝杆菌分型的判断提供参考依据。
附图说明
图1 基因文库构建示意图；
图2 引物组1构建文库构建的质检结果；
图3 引物组2构建文库构建的质检结果；
图4 引物组3构建文库构建的质检结果；
图5 引物组4构建文库构建的质检结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组
引物组1
表2 引物组1序列信息
引物组2
表3 引物组2序列信息
引物组3
表4 引物组3序列信息
引物组4
表5 引物组4序列信息
应用实例1
收集到11例痰液样本，使用本发明提供的试剂盒进行结核分枝杆菌分型检测，具体步骤如下：
一、痰液样品前处理
S1：收集 2-3ml 痰液样品，加入等体积的 NALC-NaOH缓冲液，在室温孵育 15min，至样品明显液化；
S2：用 0.067M 的磷酸盐缓冲液（pH6.8）补齐样品总体积到 50ml，彻底混匀，室温5000 rpm 离心 15min（利用水平转头进行离心），去上清，保留沉淀（上清液不要吸的太干净，保留1ml离心管底部的残留液，操作动作要轻缓，避免位于离心管底部的细菌沉淀被损失）；
S3：将位于50ml离心管底部的残留液充分混匀（使位于离心管底部的细菌沉淀充分悬浮），并转移至1.5ml离心管中，80℃加热30min，-20℃冻存备用。
二、样本DNA提取
S1：取2ml液化后的痰液样本于离心管中，室温 13000 rpm，10 min；
S2：去除上清，用 220µl Buffer STE，30µl SDS，涡旋充分重悬细菌，100℃ 20min；
S3：加入30µl Lysozyme和10µl RNase A至细菌沉淀团中，涡旋充分重悬细菌，37℃孵育20分钟；
S4：加入 DL 250µl和 10µl Proteinase K至样品中，颠倒混匀，90℃ 20分钟，10000×g离心3分钟，将上清液至新的离心管中，（根据情况加入0.2mgGlass Beads）；
S5：加入250µl无水乙醇至裂解液或上清液中，涡旋混匀15秒，若有明显的絮状沉淀，用移液枪吸打几次尽量打散沉淀；
S6：把HiPure DNA Column II装在2ml收集管中，转移步骤S5获得的混合液（包括沉淀）至柱子中，静置3min，10,000 x g离心1分钟；
S7：将第6步骤的滤液再重复上柱一次，以使基因组充分结合到HiPure DNAColumn II上，每次离心前，使流出液与HiPure DNA Column II结合3min；
S8：倒弃流出液，把柱子装回收集管中，加入500µl Buffer GWA（已用乙醇稀释）至柱子上，10,000 x g离心1分钟，Buffer GW1用无水乙醇稀释，按标签或说明书指示进行稀释；
S9：倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入650µl Buffer GWB（已用乙醇稀释）至柱子中，10,000 x g离心1分钟，Buffer GW2用无水乙醇稀释，按标签或说明书指示进行稀释；
S10：倒弃流出液，把柱子装回收集管中，10,000 x g离心2分钟；
S11：将柱子装在新的1.5ml离心管中，加入50µl预热至70℃Elution Buffer至柱子膜中央，放置3分钟，10,000 x g离心2分钟；
S12：丢弃DNA结合柱，以 0.8%-1%琼脂糖电泳检测样品质量，测 OD 值，测DNA浓度，保存2-8℃，长期保存需保存于-20℃。
三、基因组文库构建
本发明具体的基因文库构建过程如图1所示。
步骤1：第 1 轮多重 PCR 扩增反应
多重 PCR 反应体系如下：
；
其中，gDNA 起始量均为 40 ng/反应管。
多重 PCR 反应条件如下：
。
步骤2：磁珠纯化第1轮PCR扩增产物
S1：向 30 μl一管或多管混匀的 PCR产物加入 27μl 室温平衡后的 AMPure XP磁珠，用移液器轻缓吸打混匀 20 次；
S2：室温孵育 5 min 后，将 PCR 管置于 DynaMag -96 Side 磁力架上 3 min；
S3：移除上清，PCR 管继续放置在磁力架上，向管内加入 180μl 80%乙醇溶液，静置 30 s；
S4：移除上清，PCR 管继续放置在磁力架上，向管内加入 180 μl 80%乙醇溶液，静置 30 s 后彻底（建议使用 10 μl 移液器移除底部残留乙醇溶液）；
S5：室温静置 3 min，使残留乙醇彻底挥发；
S6：将 PCR 管从磁力架取下，加入 24 μl Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置 2 min；
S7：将 PCR 管重新置于磁力架上，静置 3 min；
S8：用移液器吸取 13.5 μl 上清液，转移到新的 200 μl PCR 管内，管内上清液为合并后的多重 PCR 产物。
步骤3：第 2 轮接头序列 PCR 扩增反应
PCR 反应体系如下：
；
PCR 反应条件如下：
。
步骤4：磁珠纯化第2轮PCR反应产物
S1：向 30 μl PCR 反应体系内加入 27 μl 室温平衡后的 AMPure XP 磁珠，用移液器轻缓吸打混匀 20 次；
S2：室温孵育 5 min 后，将 PCR 管置于 DynaMag -96 Side 磁力架上 3 min；
S3：移除上清，PCR 管继续放置在磁力架上，向管内加入 180 μl 80%乙醇溶液，静置 30 s；
S4：移除上清，PCR 管继续放置在磁力架上，向管内加入 180 μl 80%乙醇溶液，静置 30 s 后彻底（建议使用 10 μl 移液器移除底部残留乙醇溶液）；
S5：室温静置 3 min，使残留乙醇彻底挥发；
S6：将 PCR 管从磁力架取下，加入 24 μl Nuclease-free water，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置 2 min；
S7：将 PCR 管重新置于磁力架上，静置 3 min；
S8：用移液器吸取 20 μl 上清液，转移到新的 PCR 管中，管中上清为制备好的多重 PCR 文库。
步骤5：基因文库质量检测
取 1 μl 文库样本使用 Qsep100 全自动核酸蛋白分析系统进行文库片段长度和纯度测量，正常文库的靶片段分布区间在 280 bp-420 bp 之间，结果如图2所示。
步骤6：基因文库浓度测定
取 1 μl 文库使用 Qubit® 4.0 Fluorometer（Qubit 1x dsDNA Assay Kit）进行文库浓度测定，记录文库浓度。
四、DNA测序仪测序
建库后文库样本采用Nova 6000测序仪进行测序。
五、数据分析
结果如下表所示：
表6 样本亚型鉴定结果
。
lib1_167 、lib1_225、lib1_286、lib1_292、lib2_316、lib2_327、lib2_437、lib2_P共8个样本的亚型判断结果符合前述的单一亚型流行性菌株判定标准（a）情形，即单一基因位点对应单亚型。检测结果是lib1_167、lib1_225、lib1_286、lib1_292、lib2_316、lib2_327、lib2_437对应的基因位点是NC_000962.3:797735:797736:lineage2.2.1:T，且满足条件mean(deep)>100×，且site(mutation)=，判定所述7个样本的亚型是lineage2.2.1；lib2_P对应的基因位点是NC_000962.3:346692:346693:lineage2.2.2:T，且满足条件mean(deep)>100×，且site(mutation)=，判定所述样本的亚型是lineage2.2.2。
lib2_193样本的亚型判断结果符合前述的单一亚型流行性菌株判定标准（b）情形，即多基因位点对应单亚型。检测结果对应两种基因位点：NC_000962.3:1881089:1881090:lineage2.1:T和NC_000962.3:4246087:4246088:lineage2.1:G，并且满足了mean(deep)>100×，且number(site)>1的条件，所以判定该样本亚型是lineage2.1。
lib2_144样本的亚型判断结果符合前述的单一亚型流行性菌株判定标准（c）情形，即同一样本对应到多种亚型时，并且满足条件mean(deep)>100×，且site(mutation)=，lineage2.2.1 (reads)>10且lineage4.4 (reads)>10，还满足：lineage2.2.1(number(site))>lineage4.4(number(site))，且lineage2.2.1(number(site))-lineage4.4(number(site))>2，则判定该样本为lineage2.2.1亚型。
lib1_187样本的亚型判断结果符合前述的多种亚型流行性菌株判定标准的情形，且满足mean(deep)>100×，且site(mutation)=，lineage4(reads)>10且lineage2.2.1(reads)>10，并且满足:-2<lineage4(number(site))-ineage2.2.1(number(site))<2，则判定该样本同时来自lineage4和lineage2.2.1两种亚型。
应用实例2
使用本发明提供的引物组2构建基因文库，构建方法同应用实例1，如图3所示，当基因文库构建完毕对其进行质量检测时，发现使用引物组2构建的基因文库无条带，技术人员分析原因认为由于分析引物之间相互干扰，特异性低至无条带。
应用实例3
使用本发明提供的引物组3构建基因文库，构建方法同应用实例1，如图4所示，当基因文库构建完毕对其进行质量检测时，发现使用引物组3构建的基因文库非特异主带不清，技术人员分析原因认为由于引物特异性不佳，有多个结合位点。
应用实例4
使用本发明提供的引物组4构建基因文库，构建方法同应用实例1，如图5所示，当基因文库构建完毕对其进行质量检测时，发现使用引物组4构建的基因文库无目的条带，出现引物二聚体，技术人员分析原因认为引物之间相互互补造成引物二聚体短片段。
本发明上述实施例中提供的引物组1为发明人优化得到的54对最佳引物组，引物组2、引物组3和引物组4分别是发明人在优化过程中放弃的引物组，原因在于引物组2-4的序列间会相互干扰，导致在构建基因文库过程中分别出现无条带、主条带不清晰和引物二聚体情况。发明人分析造成上述结果的原因可能是引物特异性不佳，引物相互之间干扰或互补，或者引物受到宿主基因干扰。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种构建用于判断结核分枝杆菌分型的基因文库的引物组，其特征在于，所述引物组由SEQ ID NO.1-108所示的序列组成。
2.一种试剂盒，所述试剂盒用于判断结核分枝杆菌分型，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的由SEQ ID NO.1-108所示的序列组成的引物组。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂、多重PCR扩增试剂、接头序列 PCR 反应试剂和PCR产物纯化试剂。
4.一种权利要求1所述的引物组或权利要求2或3任一所述的试剂盒在制备具有以下任意一种用途的产品中的应用，其特征在于，所述用途包括：（1）用于结核分枝杆菌亚型判断；（2）用于结核分枝杆菌亚型菌株进化分析。
5.一种权利要求1所述的引物组或权利要求2或3任一所述的试剂盒在制备用于诊断或辅助诊断与结核分枝杆菌相关疾病的产品中的应用。
6.一种结核分枝杆菌亚型判断和/或进化分析的方法，所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1所述的引物组对基因位点进行检测，再依据基因位点与亚型的对应关系得到结核分枝杆菌亚型和/或进化分析结果。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：样本前处理、DNA提取、构建基因文库，DNA测序仪测序，数据分析；
其中，数据分析包括：根据DNA测序仪的测序结果确定基因位点，依据基因位点与分型的对应关系确定结核分枝杆菌分型；
结核分枝杆菌分型判断标准如下：
（Ⅰ）单一亚型菌株判断标准
（a）单一基因位点对应单亚型：mean(deep)>100×，且site(mutation)=，则判定样本为对应的亚型；
（b）多基因位点对应单亚型，满足mean(deep)>100×，且number(site) > 1，site(mutation)=，则判定样本为对应的亚型；
（c）同一样本对应到多种亚型，满足mean(deep)>100×，且site(mutation)=，A(reads)>10且B(reads)>10时：
①当A(number(site))>B(number(site))，且A(number(site))-B(number(site))>2，则判定样本为亚型A；或
②当A(number(site))<B(number(site))，且A(number(site))-B(number(site))< -2，则判定样本为亚型B；
（Ⅱ）多种亚型菌株判断标准
同一样本对应到多种亚型，满足mean(deep)>100×，且site(mutation)=, A(reads)>10且B(reads)>10时，且-2<A(number(site))-B(number(site))<2，则判定样本为A和B两种亚型；
所述判断标准中，mean(deep)表示平均测序深度，mutaion表示突变频率，reads表示突变reads数，deep表示测序深度，A表示一种亚型，B表示另一种亚型，number表示数量，site表示突变位点。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样本包括痰液、胸水或腹水，其中，痰液样本前处理方法为：
S1：收集 2-3ml 痰液，加入等体积NALC-NaOH缓冲液，室温孵育至痰液明显液化；
S2：加磷酸盐缓冲液稀释，混匀，室温下离心，弃上清留沉淀；
S3：将沉淀混匀，转移至离心管中，80℃加热30min，-20℃冻存备用。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的构建基因文库的方法包括：
（1）以待测样本提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组进行多重PCR扩增；
（2）将多重PCR扩增产物与接头引物混合，进行接头序列PCR扩增，得到所述基因文库。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述构建基因文库的方法还包括：使用磁珠纯化PCR扩增产物，且使用磁珠纯化接头序列PCR扩增产物，还包括基因文库质量检测和基因文库浓度测定。
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