CN103205503B - 用于检测clcn1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物 - Google Patents
用于检测clcn1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于检测CLCN1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物。具体而言，本发明涉及用于检测CLCN1基因的编码区及内含子剪切位点突变的方法、试剂盒及特异性引物。
Description
本发明是申请日为2011年05月19日、申请号为201110129334.5、发明名称为“用于检测CLCN1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于检测CLCN1基因突变的方法、试剂盒及特异性引物。具体而言，本发明涉及用于非诊断目的检测CLCN1基因的编码区及内含子剪切位点突变的方法、试剂盒及特异性引物。
背景技术
真核生物基因由编码蛋白质的外显子(exon)和不编码蛋白质的间插序列内含子（intron）组成。外显子是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列,又称表达序列，是既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。
通过PCR方法对基因组DNA进行扩增，将得到的目的片段进行测序，并与正常序列进行对比，可以获得基因突变的信息。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。Sanger于1977年建立了双脱氧核糖核酸链末端终止法测序。Sanger高通量测序可以半小时完成96个样本的测序，随着测序成本的降低，这种方法越来越适合做大规模检测，既省时又高效。
氯离子通道基因CLCN1（Chloride Channel1）的核苷酸序列是已知的（GenbankAccession No.NG_009815.1）。根据HGMD等数据库提供的信息，CLCN1的突变主要分布在外显子及剪切位点侧翼区，包括100余个点突变。详细目录见表1。
表1CLCN1突变位点
| 1097_1098delTG | 1183_1187del5 | 1278_1281delTTTG | 1437_1450del14 | 2264delC |
| 2329delG | 2518_2519delCT | 1259_1260insC | 2513_2514insCTCA | 599_600insG |
| 830_831insG | 898_899delinsTA | IVS1+3A-T | IVS13+1G-A | IVS17+1G-T |
| IVS18+5C-T | IVS19+2T-A | IVS22-1G-A | IVS5+1G-A | IVS5+2T-A |
| IVS8+1G-A | R338Q | R377X | T398I | A402V |
| P408A | Q412P | F413C | A415V | I424M |
| F428S | Q445X | S471F | P480T | P480H |
| P480L | C481X | G482R | M485V | R496S |
| G499R | A531V | T550M | I556N | V563I |
| A566T | P575S | T631I | Q658X | A659V |
| E67X | R669C | Q68X | F708L | E717X |
| K752R | Q74X | Q807X | G859D | P883T |
| R894X | P932L | R105C | M128V | S132C |
| D136G | Y150C | F161V | V165G | F167L |
| E193K | L198V | G200R | A218T | G230E |
| V236L | C242X | Y261C | T268M | C271R |
| G276D | L283F | V286A | F288S | S289N |
| E291K | V299L | R300Q | W303R | F306L |
| F307S | T310M | A313T | A313V | R317X |
| R317Q | R317L | A320V | V321L | I329T |
| A331T | D644G | D265L | 2655_2656insC |
以往对CLCN1的测序是鉴别式的测序理念，其只是针对已知的一种热点突变进行检测。目前为止，本领域尚未有关于利用多个特异性引物对同时测定CLCN1基因的多个突变的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于对CLCN1基因全部编码区及剪切突变密集的内含子区进行定点扩增，从而清晰、准确地将基因中存在的突变位点检测出来。
在一个方面，本发明提供了一种非诊断目的检测CLCN1基因的全部编码区及内含子剪切位点突变的方法，其包括以下步骤：
（1）使用特异性扩增引物对通过PCR扩增待测样本的CLCN1基因，从而获得PCR扩增产物；
（2）采用所述特异性扩增引物对中的正向引物将步骤（1）中的扩增产物进行测序扩增，从而获得测序扩增产物；
（3）对步骤（2）中获得的测序扩增产物进行测序，并将测序峰图与数据库中的正常CLCN1基因序列进行对比，从而确定基因的突变位点。
在本文中所使用的术语“非诊断目的”是指不以获得疾病诊断结果或者健康状况为目的。
在一个实施方式中，步骤（1）所述扩增引物针对的是CLCN1基因的全部外显子及内含子剪切位点；优选所述扩增引物根据NCBI等数据库中正常CLCN1基因进行设计，分别在突变位点的5’端上游和3’端下游，根据碱基互补配对原则设计正反向引物，优选引物长度为15～30BP，所述引物对在基因序列的保守区域内具有特异性。
在一个具体的实施方式中，上述步骤（1）所述PCR扩增引物的序列如表2所示。
表2.CLCN1基因PCR扩增引物
在本发明中，将CLCN1分成15段，然后为每一段分别设计一对引物。例如CLCN1-P1-F是指针对第一段的正向引物，CLCN1-P1-R是指针对第一段的反向引物，依此类推。
在一些实施方式中，本发明的方法所使用的PCR扩增引物对的核苷酸序列包含SEQ IDNO:1和16、SEQ ID NO:2和17、SEQ ID NO:3和18、SEQ ID NO:4和19、SEQ ID NO:5和20、SEQ ID NO:6和21、SEQ ID NO:7和22、SEQ ID NO:8和23、SEQ ID NO:9和24、SEQ ID NO:10和25、SEQ ID NO:11和26、SEQ ID NO:12和27、SEQ ID NO:13和28、SEQ ID NO:14和29、SEQ ID NO:15和30中的一对或多对。
在本发明中，用于测序扩增的引物可以是第一步PCR扩增引物的一部分，也可以完全不同。在优选的实施方式中，测序扩增引物为PCR扩增引物对中的正向扩增引物。在一些实施方案中，本发明的方法所使用的测序扩增引物的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1-15中的一个或多个。
在一个优选实施方案中，样品选自血样，优选的来自哺乳动物，特别是人。
优选采用第一代测序技术，如SANGER测序(3730测序仪)，或第二代测序技术，如Illumina GA、Illumina Hiseq2000。
在优选的实施方式中，在本发明方法的步骤（1）和步骤（2）之间包括纯化PCR扩增产物的步骤，优选采用的纯化方法为凝胶电泳和millipore纯化板进行纯化。在另一个优选的实施方式中，在步骤（2）和步骤（3）之间还包括纯化所述测序扩增产物的步骤，优选采用的纯化方法为EDTA和无水乙醇进行纯化。本领域技术人员可以理解，不进行PCR扩增产物的纯化仍可以实现本发明的目的，但纯化步骤可以去除RNA、盐离子等杂质，提高扩增片段纯度。并且测序扩增产物的纯化也不是实现本发明所必须，但纯化测序扩增产物可以有利于测序反应的精确度。
在另一个方面，本发明提供了一种用于检测CLCN1基因突变位点的试剂盒，其包含用于PCR扩增的特异性引物。在具体的实施方案中，所述特异性引物的核苷酸序列为SEQ IDNO:1和16、SEQ ID NO:2和17、SEQ ID NO:3和18、SEQ ID NO:4和19、SEQ ID NO:5和20、SEQ ID NO:6和21、SEQ ID NO:7和22、SEQ ID NO:8和23、SEQ ID NO:9和24、SEQ ID NO:10和25、SEQ ID NO:11和26、SEQ ID NO:12和27、SEQ ID NO:13和28、SEQ ID NO:14和29、SEQ ID NO:15和30中的一对或多对。在一些实施方案中，本发明的试剂盒还包含用于测序扩增的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1-15中的一个或多个。
在一些实施方案中，本发明试剂盒还包括用于PCR扩增反应的酶和试剂，和/或用于测序扩增反应的酶和试剂。在一个实施方式中，所述的试剂盒还包括用于提取血液DNA的试剂。在另一个方面，本发明还提供了上述试剂盒用于非诊断目的检测CLCN1基因突变的用途。
在另一个方面，本发明涉及上述的PCR扩增引物对和/或测序扩增引物用于非诊断目的检测CLCN1基因突变位点的用途。在一些实施方案中，本发明涉及上述的PCR扩增引物对和/或测序扩增引物用于制备试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测CLCN1基因突变位点。
相对于现有技术中的方案，本发明的有益效果在于：克服了现有技术中仅对热点突变检测的片面性，通过普通PCR方法即可对CLCN1基因的全部外显子进行捕获，一次性将多个潜在突变位点检测出来。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了CLCN1的part1-part15扩增后的电泳图，根据marker（DL2000，KaTara公司）的比对，可以确定15条带的大小，其中泳道1-15分别是197-910bp的片段，
阳性对照(P)是以健康人基因为模板对第15对引物进行的特异性扩增；阴性对照（N）是以水为模板对第15对引物进行的特异性扩增，但扩增无条带。
图2显示了2段外显子基因序列片段测序结果。图中上方为NCBI数据库中标准CLCN1基因，图中下方为检测的样本基因。图2A显示：在2655-2656位置有1个碱基C插入。图2B显示：在1616位置，C突变成T。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：特异性引物的设计
根据CLCN1外显子分布的特点设计扩增引物：
1）根据NCBI等数据库中CLCN1正常基因的参考序列，在突变位点的5’端上游和3’端下游，根据碱基互补配对原则设计15～30bp的引物。引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；
2）产物不能形成二级结构、碱基要随机分布，引物自身不能有连续4个碱基的互补；
3）针对每个外显子两端各延伸40-50bp设计引物，包含内含子剪切位点（包含突变位点，可引起框移突变）。
4）所有PCR片段正反向引物退火温度相差不超过5℃，各产物退火温度在56-62℃之间，保证扩增的特异性和稳定性。
5）若两个外显子相隔较近则进行简并设计，所有PCR产物长度均不超过910bp，电泳结果显示条带唯一，没有杂带。
6）PCR扩增引物的正向扩增引物即为用于测序扩增的引物，长度在20-30bp之间，正反两条引物之间不存在发夹结构。
本发明的特异性引物的序列如表2所示。
实施例2：样本DNA提取
本发明所用阳性样本，受试者来自山东，经过医院确诊为先天性肌强直，无家族史的散发病例，经知情同意，取得其血样。
使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood MINI Kit试剂盒（Cat.No.51106）提取受试者的全血样本DNA。示例性的步骤如下：
（1）向1.5ml离心管中，加入20μl蛋白酶K；
（2）向离心管中加入200μl全血样本；
（3）向离心管中加入200μl缓冲液AL，漩涡振荡15S；
（4）56°水浴15分钟；
（5）适当离心，使所有液体降到离心管底；
（6）向离心管中加200μl无水乙醇，振荡15s混匀，适当离心，使所有液体降到离心管底；
（7）将上步所的液体小心的转移到纯化柱中，不要沾湿边缘。8000转离心1min，弃掉收集管，更换新的收集管；
（8）小心打开盖，加入500μl缓冲液AW1，不要沾湿边缘。8000转离心1min，弃掉收集管，更新收集管；
（9）小心打开盖，加入500μl缓冲液AW2，不要沾湿边缘。14000转离心3min；
（10）丢弃收集管，更新收集管，14000转离心1min；
（11）丢弃收集管，将纯化柱放入1.5ml离心管中，加入52μl缓冲液AE或是超纯水，室温下放置1min，8000转离心1min；
（12）再向纯化柱中加入52μl缓冲液AE或是超纯水，8000转离心1min。
根据以上步骤便可得出100μl DNA样本。
实施例3：PCR扩增
利用实施例1中设计的PCR扩增引物对扩增实施例2中提取的DNA样品，反应采用25μl体系，其中：酶及缓冲溶液均购自KATARA公司。
PCR条件为：
95℃预变性5min
94℃30sec→特异性退火温度30sec→72℃30sec（35个循环）
之后再延伸10min。
其中，各对引物的特异性退火温度如下：
实施例4：凝胶电泳检测
PCR之后进行凝胶电泳检测，检测所扩增出的片断是否是需要的目的片段大小。Marker使用5μl的DL2000DNA Marker，同时可以检测PCR产物的浓度。电泳采用2%的琼脂糖凝胶，130V电泳30min。每个PCR扩增产物的电泳结果如图1所示。
实施例5：利用millipore纯化板进行PCR产物的纯化
用记号笔在96孔PCR产物纯化板上标记需要使用的孔，并向需要使用的孔中加入50ul超纯水，剩余孔粘贴封口膜，室温静置15分钟或连接到抽滤系统上，以-10Pa抽滤5min。每次从抽滤系统上取下纯化板时都要在吸水纸上吸干残留在纯化板底部排液口的液体。
待纯化PCR产物离心，4000rpm×1min。在每个PCR反应体系中加入100μl超纯水。然后把加入待纯化PCR产物的纯化板连接到抽滤系统上，调节真空度至气压表显示-10±1Pa，抽滤至纯化板底部的微孔再生纤维膜上无残留液体为止，并在光照下观察为无完整液面反射光泽，通常10-15min。
向含有待纯化PCR产物的孔中加20～50μl超纯水或TE至微孔再生纤维膜上；在室温下，使用微量振荡器的中档速度振荡纯化板5min，转移相应孔内全部液体至一块新的96孔PCR板的对应孔上。
根据需要用超纯水回收已纯化的PCR产物，回收的体积根据纯化前PCR产物电泳鉴定情况决定，通常为20～50ul。
实施例6：使用测序扩增引物进行产物的扩增
使用本发明所设计的表2中引物的正向引物（F）将实施例5中纯化的PCR产物进行测序扩增。
所述测序扩增反应的条件是：
96℃2min
96℃10s→55℃5s→60℃2min（25个循环）
15℃∞
反应的体系为5μl，其组成如下表所示，其中Bigdye和缓冲溶液均购自美国应用生物系统公司（Applied Biosystems，ABI）：
| 试剂名称 | 用量 |
| 实施例5中的PCR产物 | 1μl |
| 表2中相对应的正向引物（F） | 1μl |
| ABI2.5×Bigdye | 0.3μl |
| ABI5×buffer | 0.85μl |
| ddH2O | 1.85μl |
实施例7：EDTA/无水乙醇纯化测序扩增产物
基本步骤：取下测序反应平板配平，离心3000g×1min。在96孔反应板的每5μl反应体系加0.125mol/L EDTA-Na2溶液2μl，85%乙醇33μl，盖上硅胶垫，充分振荡3min，在4℃离心3000×15min。将反应板置于避光通风处30min，风干至无乙醇气味。在96孔板的每孔中加10μl（384孔板每孔加8μl）HI-DI甲酰胺，盖上封口膜，振荡5s后1000±100rpm离心。
实施例8：在ABI3730XL上进行外显子测序
使用ABI3730测序仪对经过纯化的测序扩增产物进行测序。一个示例性的测序结果示于图2
将测序所得结果与NCBI数据库中公布的CLCN1基因标准序列进行比对；通过比对得出样品序列与标准序列的区别，找出突变位点的位置。
图2显示了2段外显子基因序列片段测序结果。图中上方为NCBI数据库中标准CLCN1基因，图中下方为检测的样本基因。图2A显示：在2655-2656位置有1个碱基C插入（2655_2656insC，Ser886GlnfsX26，杂合子，exon23）。图2B显示：在1616位置，C突变成T（1616C-T，T539I，杂合子，exon15）。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种非诊断目的检测CLCN1基因的编码区及内含子剪切位点突变的方法，其包括以下步骤：
(1)使用一组特异性扩增引物对通过PCR扩增待测样本的CLCN1基因，从而获得PCR扩增产物；
(2)采用所述一组特异性扩增引物对中的正向引物将步骤(1)中的扩增产物进行测序扩增，从而获得测序扩增产物；
(3)对步骤(2)中获得的测序扩增产物进行测序，并将测序峰图与数据库中的CLCN1基因参考序列进行对比，从而确定基因的突变位点，
其中，
所述一组特异性扩增引物对的核苷酸序列是SEQ ID NO:1和16、SEQ ID NO:2和17、SEQ ID NO:3和18、SEQ ID NO:4和19、SEQ ID NO:5和20、SEQ ID NO:6和21、SEQ IDNO:7和22、SEQ ID NO:8和23、SEQ ID NO:9和24、SEQ ID NO:10和25、SEQ ID NO:11和26、SEQ ID NO:12和27、SEQ ID NO:13和28、SEQ ID NO:14和29、SEQ ID NO:15和30，并且所述测序扩增采用相应特异性扩增引物对中的正向引物进行，所述一组特异性扩增引物对的正向引物的序列分别如SEQ ID NO:1-15所示。
2.权利要求1的方法，其中在步骤(1)和步骤(2)之间包括纯化PCR扩增产物的步骤，所述纯化方法为通过凝胶电泳和millipore纯化板进行纯化。
3.权利要求1的方法，其中在步骤(2)和步骤(3)之间还包括纯化所述测序扩增产物的步骤，所述纯化方法为通过EDTA和无水乙醇进行纯化。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中在所述步骤(3)中测序方法为Sanger法或第二代测序法。
5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述样品是血样。
6.权利要求5的方法，所述血样分离自哺乳动物。
7.权利要求6的方法，所述血样是人的血样。
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2011
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