CN102747166A - 肺炎支原体耐药菌株的pcr-snp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明根据已知的Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点设计3条引物对其进行特异性扩增，为增加引物的特异性，人为在特异性引物的3′端引入一个错配碱基且3′端末端落在突变位点上；利用上述引物及其它PCR组份构建PCR反应体系；提取待测样本DNA，加入上述PCR反应体系并进行扩增，将上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，判定是否发生耐药基因突变。

Description

肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法

技术领域

本发明属于生物、医药领域，具体地涉及一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae，Mp)是社区获得性呼吸道感染的重要致病菌之一，其感染后的临床表现可以从轻度的咽喉炎、支气管炎到重症间质性肺炎(原发性非典型肺炎)及神经系统、心血管系统并发症等。Mp流行具有周期性，每3-7年在不同地区出现发病率高峰。儿童肺炎中10-30％的病例是Mp引起的，在流行高峰年Mp肺炎可高达30-50％，且流行可持续1-2年。进入21世纪以来，全球性的Mp感染暴发流行已出现了两次，分别在2005-2007年和2010-2012年初发生。Mp感染暴发流行对家庭、学校、部队、社会都会产生较大的经济损失和社会不良影响。

肺炎支原体无细胞壁，是目前已知的能在无生命培养基中生长繁殖的最小的原核细胞型微生物，其对青霉素等作用于细胞壁的抗生素天然耐药。能用于治疗支原体肺炎的药物目前仅有大环内酯类、喹诺酮类、氨基糖甙类、四环素类等药物，由于大部分药物对儿童正常生长发育有副作用，目前大环内酯类抗生素是治疗儿童支原体感染的首选药物。以往的研究表明，及时采用适当的抗生素可预防、治疗肺炎支原体感染导致的肺炎，能够缩短暴发流行的过程。但是，随着大环内酯类药物在临床上的广泛应用，其耐药现象也不断出现，并呈逐渐增加趋势。近年来，已有美国、日本、法国、德国、芬兰等多个国家报道了MP耐药株的出现，我国则有更多耐药株出现的报道，造成治疗用的抗生素失效。

目前，大量的研究资料表明，肺炎支原体耐大环内酯类药物的机制主要为基因突变，其中23S rRNA基因区部分的基因突变是其对大环内酯类药物耐药的主要原因之一。这些位点主要集中在2063、2064和2617等。而目前国内外用于Mp耐药性检测的方法主要有：对PCR产物的直接测序法，毛细管电泳法，限制性片段长度多态性，荧光定量PCR等。虽然这些方法比较可靠，但均存在费时和工作量大等问题，应用于大规模的临床检测服务还有待探讨。理想的Mp耐药突变检测方法应该是不需复杂的设备、操作简单、花费低、不需使用有害试剂或同位素、高效率、耗时短等。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，通过设计3条引物可一次性检测出肺炎支原体的任一耐药突变位点，以解决目前肺炎支原体耐药性检测方法中费时、费力且不能在临床上大规模检测标本的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，具体包括以下步骤：

根据已知的Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点(2063、2064、2611、2616、2617等)设计1条上游引物、1条下游引物和1条特异性引物对其进行特异性扩增，特异性引物是人为在引物的3′端引入一个错配碱基且3′端末端落在突变位点；

(2)提取待测样本DNA；

(3)利用上述3条引物、样本DNA及其它PCR组份构建PCR反应体系并进行扩增；

(4)对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判定是否发生耐药基因突变。

进一步，所述的步骤(1)中的3条引物为F：5’AGAAGGAGGTTAGCGCAAGCG3’，S：5’TATATTAGGCGCAACGGGACAGA 3’，R：5’CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC 3’。

进一步，所述的步骤(3)中的PCR反应体系为25μl：10×PCR reactionbuffer2.5μl，MgCl₂(25mM)2μl，dNTPs(2.5mM)2μl，上游引物F(10μM)1.0μl，下游引物R(10μM)1.0μl，特异性引物S(10μM)1.5μl，Taq DNApolymerase(2.5U)1μl，DNA模板3μl、双蒸水11μl。

进一步，所述的步骤(3)中的PCR扩增条件为预变性94℃10min，接着94℃0.5min，58℃0.5min，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

本发明的原理是根据已知的Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点(2063、2064、2611、2616、2617等)设计3条引物对其进行特异性扩增，为增加引物的特异性，人为在特异性引物的3′端引入一个错配碱基且3′端末端落在突变位点，如果特异性引物和下游引物扩增的片段的第一个碱基发生了基因突变，特异性引物则不能继续延伸扩增下去，反之，则可扩增。根据琼脂糖凝胶电泳结果结果判定是否发生耐药基因突变。以下DNA序列标记部分依次显示为2063、2064、2611、2616、2617等突变位点。

gtgacacctgcccagtgctggaaggttaaagaaggaggttagcgcaagcgaagcttttaactgaagccccagtgaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcgaaattcctagtcgggtaaattccgtcccgcttgaatggtgtaaccatctcttgactgtctcggctatagactcggtgaaatccaggtacgggtgaagacacccgttaggcgcaacgggacggaaagaccccgtgaagctttactgtagcttaatattgatcaggacattatcatgtagagaataggtaggagcaatcgatgcaagttcgctaggacttgttgatgcgaaaggtggaatactacccttggttgtgtgctgttctaattggtaactgttatccagtttcaagacagtgttaggtgggcagtttgactggggcggtcgcctcctaaaaggtaacggaggcgtacaaaggtaccttcagtacggttggaaatcgtatgtagagtgtaatggtgtaagggtgcttgactgtgagacatacaggtcgaacaggtgagaaatcaggtcatagtgatccggtggtccagtatggaatggccatcgctcaacggataaaagctactccggggataacaggctgatactgcccaagagttcatatcgacggcagtgtttggcacctcgatgtcgactcatctcatcctcgagctgaagcaggttcgaagggttcggctgttcgccgattaaagagatacgtgagttgggttcaaaccgtcgtgagacaggttggtccctatctattgtgcccgtaggaagattgaagagtgttgcttcta

附图说明

图1基于SNP方法的单管PCR法(PCR-SNP法)示意图；

图2根据2063位点设计的3条引物对样本扩增后产物的琼脂糖凝胶电泳图谱：M：Marker，1-9：临床标本，FH：Mp标准株，N：阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明的技术方案做进一步解释。

根据已知的Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点2063设计3条引物对其进行特异性扩增，为增加引物的特异性，人为在特异性引物的3′端引入一个错配碱基且3′端末端落在2063位点，如果特异性引物和下游引物扩增的片段的第一个碱基即2063位点发生了基因突变，特异性引物则不能继续延伸扩增下去，反之，则可扩增，具体反应原理示意图见图1。根据琼脂糖凝胶电泳结果判定是否发生耐药基因突变。

一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，具体包括以下步骤：

(1)针对Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点2063设计3条引物：常规PCR引物的3’末端不能发生错配，因为序列的延伸是从引物的3’开始。在该PCR-SNP方法中，我们设计特异性引物(S)的3’末端最后一位碱基落在2063位点，该碱基可以与未突变株序列互补而与突变株不匹配，但是如果该引物的3’端只有一个错配碱基，在2063位点发生突变时，该引物仍可或多或少地被延伸，因此为了保证该检测的准确性，防止错配情况下序列仍被延伸，我们在特异性引物的3’端的倒数第三位人为引入一个错配碱基，即accession no.X68422.1.基因序列的2061位点g→a错配改变(表1引物S序列黄色部分)，保证了扩增的特异性，3条引物序列见表1。

表1：PCR-SNP法扩增Mp23S rRNA 2063位点的引物序列

注：1、该核苷酸位置参照GenBank中的accession no.X68422.1.

    2、364bp是上游引物(F)和下游引物(R)扩增的片段长度；183bp是特异性引物(S)和下游引物(R)扩增的片段长度，扩增示意图见图1。

(2)样本DNA的提取：样本来自疑似支原体感染患者，标本可以为痰、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、胸腔积液、脑脊液、关节液、血液等所有可来自患者的体液；取标本原液400ul，15000rpm离心15分钟，弃上清。加裂解液A 50ul(含5‰NP-40)，裂解液B2ul(蛋白酶K)。涡旋震荡混匀，稍离心，运行56℃1小时，100℃10分钟，程序结束后15000rpm离心15秒，即为样本DNA。

(3)PCR反应体系建立及扩增程序

PCR扩增体系为25μl：10×PCR reaction buffer2.5μl，MgCl₂(25mM)2μl，dNTPs(2.5mM)2.0μl，上游引物(10μM)1.0μl，下游引物(10μM)1.0μl，特异性引物(10μM)1.5μl，Taq DNA polymerase(2.5U)1μl，DNA模板3μl、双蒸水11μl。

扩增条件为预变性94℃5min，接着30个循环：变性94℃0.5min，退火58℃0.5min，延伸72℃1min，最后72℃延伸10min。同时设立阳性对照和阴性对照。

(4)琼脂糖凝胶电泳检测：PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳即可区分是否耐药。

(5)结果判定：

对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，120V 30min，紫外光下观察，或者在凝胶成像系统中观察分析，结果如图2所示，第5、6、7、8、10泳道为1条带，说明这些标本发生了耐药突变；第4、9泳道为2条带，说明这两个标本未发生耐药突变。第1、2、3泳道没有扩增产物为非肺炎支原体感染标本。

Claims (4)

1.一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，其特征在于具体包括以下步骤：

(1)根据已知的Mp23S rRNA中的耐药突变基因位点设计1条上游引物、1条下游引物和1条特异性引物对其进行特异性扩增，特异性引物是人为在引物的3′端引入一个错配碱基且3′端末端落在突变位点；

(2)提取待测样本DNA；

(3)利用上述3条引物、样本DNA及其它PCR组份构建PCR反应体系并进行扩增；

(4)对上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，判定是否发生耐药基因突变。

2.根据权利要求1所述的一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，其特征在于所述的步骤(1)中的3条引物为F：5’AGAAGGAGGTTAGCGCAAGCG3’，S：5’TATATTAGGCGCAACGGGACAGA 3’，R：5’CTGGATAACAGTTACCAATTAGAACAGC 3’。

3.根据权利要求1所述的一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中的PCR反应体系为25μl：10×PCR reaction buffer2.5μl，25mM的MgCl₂ 2μl，2.5mM的dNTPs2μl，10μM上游引物1.0μl，10μM下游引物1.0μl，10μM特异性引物1.5μl，2.5U的Taq DNA polymerase1μl，DNA模板3μl、双蒸水11μl。

4.根据权利要求1所述的一种肺炎支原体耐药菌株的PCR-SNP检测方法，其特征在于所述的步骤(3)中的PCR扩增条件为预变性94℃5min，接着94℃0.5min，58℃0.5min，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

Images