CN102399872B

CN102399872B - 一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102399872B
Application number: CN201110330793XA
Authority: CN
Inventors: 李凯; 张佳; 王庆琳; 肖莉; 王伟大; 姬云
Original assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU KEBEI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2031-10-27
Also published as: CN102399872A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，公开了一种利用PCR扩增检测K-ras基因突变的方法及试剂盒，包括：常规PCR组件，特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列。然后利用电泳分离PCR扩增的目的产物条带的有无，来判断K-ras基因是否存在12号密码子的GGT-GAT，GGT-GTT，13号密码子GGC-GAC三个热点突变中的至少一个。采用本发明所述检测K-ras基因突变的试剂盒和检测方法检测K-ras基因突变时，快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。

Description

一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种利用PCR扩增检测K-ras基因突变的方法及试剂盒。

背景技术

K-ras基因是重要的原癌基因，K-ras基因突变使ras蛋白一直处于激活状态，刺激细胞不断的生长或分化，最终导致细胞的恶性转化。大约30％的人类肿瘤细胞中出现K-ras基因突变。Bosetal分析了人体肿瘤中K-ras基因点突变的发生率，胰腺癌82％，结肠癌43％，肺癌30％c，甲状腺癌29％，膀胱、肝、肾和子宫癌10％或低于10％。Mok等报道交界瘤中，K-ras突变发生率为48％，突变分别发生于12号密码子及13号密码子。直结肠癌K-ras基因点突变率达40％-50％以上，且点突变几乎皆位于12，13，61号密码子，其中大多数点突变位于12号密码子。Pontieri-Lewis等研究证实约50％的大肠癌组织中检测出K-ras基因突变，其中约80％的点突变位于K-ras基因12号密码子，另约15％发生在K-ras基因13号密码子。K-ras基因突变的位点最常见于第12，13号密码子，可导致p21-ras蛋白的生长信号的异常变化。过度的生长信号可刺激细胞生长和增殖从而导致了癌症的发生。2008年6月在美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上发布了最新临床研究结果，即K-ras突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而K-ras野生型患者就很有可能从这类药物治疗中获益。同年10月，K-ras基因突变检测被写入最新版(2008年第3版)《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态，二是只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。国家卫生部于2010年10月14日发表了《结直肠癌诊疗规范(2010版)》(卫办医政发(2010)165号)。该规范明确指出在患者确定为复发或转移性结直肠癌接受爱必妥、帕尼单抗治疗前，必须检测肿瘤组织的K-ras基因状态。另外，《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)进行分子靶向治疗。综上所述检测K-ras基因突变的情况不仅仅有助于肿瘤的早期诊断及预防，也有利于肿瘤患者的临床治疗。准确且迅速的诊断出K-ras基因有无12，13号密码子突变对肿瘤的早期诊断及预后有着重要的意义。

目前，主要用于基因突变检测的方法包括如下几种：(1)利用单碱基变化产生新的或消除已有的内切酶识别位点；(2)利用单碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响；(3)利用单碱基变异对核酸分子杂交的影响；(4)利用单碱基变异对核酸分子在电场中迁移速度的影响；(5)直接测定单碱基变异。其中第一类的代表方法为限制性内切酶酶解片段长度多态性，这一方法具有简便、经济和十分可靠的特点，但这一方法的显著弱点是仅能用于研究小部分涉及了限制性内切酶酶解位点变化的突变，且该类方法难以直接应用于高通量平行分析。另一类种类繁多且获得广泛应用的突变检测方法，是碱基特异引物延伸反应，包括双向引物延伸反应，即应用碱基特异性引物与常规的多聚酶链式反应相结合、引物延伸反应与连接酶相结合、引物延伸反应与杂交分析相结合等。所有这些方法的共同点是使用了无校正功能的DNA聚合酶。上述不同方法所得的假阴性高低各不相同，但其共用的无校正功能的低保真聚合酶使所有这一类方法具有其结构上的缺陷，即无可避免地产生较高的假阳性。而目前常规使用的Sanger酶法测序即双脱氧核苷酸介导的单碱基延伸反应，对突变含量较低的相嵌体、突变较少的线粒体异质体、体细胞突变和频态分布较低的DNA池分析均难以应用。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种检测K-ras基因突变的方法及试剂盒，通过采用一组特异性PCR引物对待测样本进行扩增，检测是否产生扩增产物条带，以及条带的大小判断K-ras基因型，可快速、准确、简便、经济地判断待测样本是否存在K-ras基因的3个热点突变：12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT，13号密码子GGC-GAC。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3’；

SEQ ID No.2：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3’；

SEQ ID No.3：5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3’；

SEQ ID No.4：5’-TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’。

上述技术方案中，正向引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和反向引物序列SEQ ID NO.4检测的位点分别对应12号密码子GGT-GAT、GGT-GTT、13号密码子GGC-GAC，正向引物三末端第二个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基。

上述技术方案中，所述常规PCR组件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。

上述技术方案中，所述检测K-ras基因突变的试剂盒还包括三个检测位点的阳性对照突变质粒，所述三个检测位点的阳性对照突变质粒分别为，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GAT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GTT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因13号密码子GGC-GAC的突变序列。

采用上述检测K-ras基因突变的试剂盒检测待测样本是否存在K-ras基因的3个热点突变(12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT，13号密码子GGC-GAC)的方法，包括以下步骤：

(1)采用常规方法提取待测组织样本基因组DNA或外周血游离DNA；

(2)以步骤(1)所得样本基因组DNA或外周血游离DNA为模板，采用特异性引物进行多重PCR扩增，根据PCR扩增的结果判断样本中是否含有K-ras基因的3个热点突变中的至少一种；判断规则为：如果出现扩增产物，则表明样本中含有上述3个热点突变中的至少一种；如果没有出现扩增产物，则表明样本中不含上述3个热点突变中的任意一种；所述3个热点突变为：12号密码子GGT-GAT突变，12号密码子GGT-GTT突变，13号密码子GGC-GAC突变。

上述技术方案中，进行多重PCR扩增时，每25μL的多重PCR扩增体系包括：1μL模板(40ng/μL)，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1.5μL反向引物(10μM)，三条正向引物(10μM)各0.5μL，0.2μL Pfu酶(2.5U/μL)，0.4μLdNTPs(各10μM)，剩下加水补足；多重PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒(退火温度每个循环递减1℃)，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，59℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

进一步的技术方案中，PCR扩增结束后采用常规技术进行纯化和电泳鉴定。

本发明的基本原理为：由于低保真酶对突变的分辨率仅为10^-4，而高保真酶的分辨率为10^-7，远远大于低保真酶对突变的识别能力。采用高保真聚合酶与硫化修饰引物构成的分子开关系统，具备对突变位点高度辨认的能力。对三末端错配的硫化修饰碱基的特异性引物而言，由于其修饰了的三末端耐外切酶的特点，致使高保真聚合酶分子中无法酶解错配碱基，造成“关”闭DNA聚合反应的效果；对于配对的引物，高保真聚合酶则继续完成DNA聚合反应，形成“开”的效应。这种配对引物被延伸，而不配对引物则不被延伸的二元化效果，满足了突变分析时需要对特定位点进行非此即彼的二元化辨认。具体地，当待测样本为K-ras野生型时，三条正向引物的三末端第二个碱基与K-ras野生型模板序列不配对，且硫化修饰，利用高保真酶的分子开关效应，无目的产物扩增；当待测样本中至少含有K-ras的三个热点突变中的一个时，三条正向引物的三末端第二个碱基在与K-ras突变模板互补的情况下，可以扩增出相对应的目的产物。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.采用本发明所述检测K-ras基因突变的试剂盒和检测方法检测K-ras基因突变时，具备快速，准确、方法简单、成本低的优点，因采用多重PCR技术，在2小时内可检测出三种K-ras基因突变位点，与临床检测金标准序列测定至少所需5小时相比，检测时间大大缩短；本发明所述试剂盒对突变模板最低检测拷贝数可达10²拷贝数，且出现假阳性的检测起始模板拷贝数为10⁶，远高于临床样本基因组DNA起始模板10⁴拷贝数(如图4)；本发明所述试剂盒在检测临床肿瘤样本中突变检出率，经测序验证结果一致(如图5)。由于上述优点，有利用临床使用和推广。

附图说明

图1为实施例一中K-ras野生型DNA测序图谱；

图2为实施例二中K-ras 12号密码子GGT-GAT或GGT-GTT DNA测序图谱；

图3为实施例二中K-ras 13号密码子GGC-GAC测序图谱；

图4为实施例二中分子开关敏感性与特异性的电泳图；

图5为实施例二中9个肿瘤组织DNA模板的分子开关检测电泳图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：制备K-ras野生型及突变型质粒DNA，具体步骤如下：

1)用常规方法提取人全血样本基因组DNA，DNA测序证明样本为k-ras野生型，测序结果如图1所示。

2)设计并制备k-ras基因12号及13号密码子的三个点突变模板的引物分别为引物A对和引物对B，引物对C和引物对D，引物对E和引物对F，序列如下：

其中，引物对A包括正向引物T1k-rasmut和反向引物T3k-rasmut，扩增突变模板上游引物；引物对B包括正向引物T4k-rasmut和反向引物T2k-rasmut，扩增突变模板下游引物；引物对A和引物对B扩增k-ras12号密码子GGT-GTT的突变模板。

其中，引物对C包括正向引物T1k-rasmut和反向引物T5k-rasmut，扩增突变模板上游引物；引物对D包括正向引物T6k-rasmut和反向引物T2k-rasmut；扩增突变模板下游引物；引物对C和引物对D扩增k-ras12号密码子GGT-GAT的突变模板。

其中，引物对E包括正向引物T1k-rasmut和反向引物T7k-rasmut，扩增突变模板上游引物；引物对F包括正向引物T8k-rasmut和反向引物T2k-rasmut，扩增突变模板下游引物；引物对E和引物对F扩增k-ras12号密码子GGT-GAT的突变模板。具体的引物序列请参见下表：

利用重叠延伸剪接术定点诱变。设计的突变引物T3k-rasmut与T4k-rasmut，T5k-rasmut与T6k-rasmut，T7k-rasmut与T8k-rasmut分别对应12codon GGT-GTT，12codon GGT-GTT，13codon GGC-GAC，每对突变引物的5’端都有大于5个碱基的重叠。

3)分别用引物对A和B，引物对C和D，引物对E和F，以人全血样本基因组DNA为模板，PCR扩增得到突变模板上游目的片段和下游目的片段；25μL的PCR扩增体系包括：12.5μL 2×Tag mix(Biomega，上海)，0.5μL正向引物(10μM)，0.5μL反向引物(10μM)，1μL DNA(40ng/μL)；其PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共30个循环。

4)凝胶电泳分离突变模板的上下游目的片段并且切割目的产物，使用DNA纯化试剂盒(天根)进行PCR产物回收。

5)利用突变模板的上下游目的片段的相互重叠部分，进行PCR产物重叠延伸，获得产物长度更长，分别包含完整K-ras基因12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT，和13号密码子GGC-GAC的突变序列。PCR的反应总体系为25μL，包括12.5μL 2×Tag mix(Biomega，上海)，纯化好的包含点突变的上下游产物各1μL(约40ng/μl)，1μL T1k-rasmut(10μm)，1μL T2k-rasmut(10μm)。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共30个循环。

6)PCR扩增k-ras基因野生型序列目的片段。25μL的PCR扩增体系包括：12.5μL 2×Tag mix(Biomega，上海)，0.5μL T1k-rasmut(10μm)，0.5μLT2k-rasmut(10μm)，1μL DNA(40ng/μL)；其PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，58℃退火20秒，72℃延伸30秒，共30个循环。

7)凝胶电泳分离野生模板目的片段并且切割目的产物，使用DNA纯化试剂盒(天根)进行PCR产物回收。

8)TA克隆：将野生和突变产物切胶纯化之后，将产物与TA载体相连转染感受态细胞。经抗性筛选阳性菌落，抗性LB培养阳性菌落，提取质粒DNA进行PCR初鉴定。将凝胶电泳分离出目的条带的质粒DNA送测序。测序结果表明，K-ras野生型及突变型质粒序列正确，得到三个阳性质粒模板。

实施例二：检测k-ras野生型样本、k-ras突变型的样本。

1)用常规方法提取人全血样本基因组DNA，DNA测序证明样本为k-ras野生型，测序结果如图1所示，以此作为K-ras野生型样本。

2)从肿瘤组织中提取DNA，经DNA测序存在三个热点突变中的至少一个的样本，DNA测序证明为K-ras突变型，测序结果见图2，图3，以此作为K-ras突变型样本。

3)用实施例所得三个阳性质粒模板对试剂盒及其特异性引物进行敏感性及特异性的检验，所述试剂盒包括：常规PCR组件，还包括特异性引物；所述特异性包括三条正向引物和一条反向引物，其中三条正向引物的序列分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No.4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3’；

SEQ ID No.2：5’-TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3’；

SEQ ID No.3：5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3’；

SEQ ID No.4：5’-TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’。

其中，正向引物SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和反向引物序列SEQ ID NO.4检测的位点分别对应12号密码子GGT-GAT、GGT-GTT、13号密码子GGC-GAC，正向引物三末端第二个碱基(下划线标记)为硫化修饰碱基。

所述常规PCR组件包括：高保真DNA聚合酶Pfu酶，含有硫酸镁的Pfu缓冲液，dNTPs。

三个阳性质粒模板经紫外分光光度仪检测下浓度，等比拷贝数的混合。将阳性模板以及野生型模板10倍逐级稀释。每25μL的多重PCR扩增体系包括：1μL样本基因组DNA(40ng/μL)，2.5μL 10×含有硫酸镁的Pfu缓冲液，1.5μL反向引物(10μM)，三条正向引物(10μM)各0.5μL，0.2μL Pfu酶(2.5U/μL)，0.4μLdNTPs(各10μM)，剩下加水补足；多重PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性20秒，68℃退火20秒(每个循环递减1℃)，72℃延伸30秒，共10个循环；95℃变性20秒，59℃退火20秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，检测的突变范围为10⁶-10²个拷贝数。结果如图4所示，图4为分子开关敏感性与特异性的电泳图。图4中的上图PM为10⁶-10²拷贝数待测三个突变型质粒混合模板的分子开关PCR产物电泳图，下图-2mm为10⁸-10⁴拷贝数野生型质粒模板的分子开关PCR产物电泳图。由图可知，分子开关对突变模板最低检测拷贝数可达10²拷贝数，分子开关可出现假阳性的模板拷贝数为10⁶，远高于临床样本10⁴拷贝数。

4)从9个肿瘤组织中提取DNA，采用上述试剂盒检测其中是否含有3个热点突变中的至少一个突变(12号密码子GGT-GAT，GGT-GTT，13号密码子GGC-GAC)，检测结果参见图5，图5为9个肿瘤组织DNA模板的分子开关检测电泳图，其中，-表示阴性对照，+表示阳性对照2，3，5泳道的结果判断为K-ras基因有待测目的突变，经测序证实含有K-ras三个热点突变；1，4，6，7，8，9泳道的结果判断为K-ras基因无待测目的突变，经测序证实不含有K-ras三个热点突变。1-9号基因组模板中，经检测2，3，5存在三个热点突变中的一个。1，4，6，7，8，9则不存在突变。

Claims

1.一种检测K-ras基因突变的试剂盒，包括：常规PCR组件，其特征在于，还包括特异性引物；所述特异性引物包括三条正向引物和一条反向引物，并且每一条正向引物的3’末端第二个碱基为硫化修饰碱基；其中三条正向引物的序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示核苷酸序列，所述反向引物为SEQ ID No.4所示核苷酸序列；所述特异性引物的核苷酸序列具体如下所示：

SEQ ID No.1：5’- TTGTGGTAGTTGGAGCTGAT-3’；

SEQ ID No.2：5’- TTGTGGTAGTTGGAGCTGTT-3’；

SEQ ID No.3：5’- TGGTAGTTGGAGCTGGTGAC-3’；

SEQ ID No.4：5’-TCTGTATCAAAGAATGGTCC-3’；

2.根据权利要求1所述检测K-ras基因突变的试剂盒，其特征在于，所述检测K-ras基因突变的试剂盒还包括三个检测位点的阳性对照突变质粒，所述三个检测位点的阳性对照突变质粒分别为：pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT-GAT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因12号密码子GGT–GTT的突变序列，pGEM-T质粒载体插入包含K-ras基因13号密码子GGC-GAC的突变序列。