CN106544427A - 一种检测肺癌egfr基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒。该试剂盒包含如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.122所示的扩增引物和如SEQ ID NO.123～SEQ ID NO.183所示的延伸引物。其可检测EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF、HER2、BIM和NRAS七种相关基因的60个核酸位点，为EGFR靶向治疗成功或失败提供基因分析数据，以及后续治疗与研究提供依据。
Description
技术领域
本发明属于临床生物技术领域，特别涉及一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒。
背景技术
靶向药物个体化治疗给非小细胞肺癌(NSCLC)患者带来了新曙光，但是大部分基因变异肺癌患者在接受治疗后一年左右最终对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药，靶向药物出现抗药性的分子机理通常是下列两种类型之一：(1)变异或基因拷贝数增加影响到主要靶点；(2)靶点所在或平行信号路径中其它基因或基因产物的变化，对靶点信号抑制进行补偿或绕行。
非小细胞肺癌对EGFR TKI药物厄洛替尼/吉非替尼的抗药性分子机制主要在于EGFR-T790M突变、c-MET基因扩增或者表达。继发性T790M突变是最先在NSCLC靶向治疗后确定以及目前研究最热门的耐药分子机制，该变异提高了EGFR基因与ATP的亲和力，同时降低了EGFR与EGFR TKI靶向抑制剂的结合力，使得下游信号通路持续活化，从而导致约50％的患者耐药。另外研究较多的TKI耐药机制为c-MET基因扩增，占EGFR TKI耐药的20％左右。c-MET扩增通过激活EGFR非依赖的HER-3以及下游PI3K/AKT下游信号通路的磷酸化促进细胞对EGFR-TKI原发或继发耐药，而抑制c-MET阻断HER-3/PI3K/AKT激活，可以恢复EGFR-TKI的敏感性。EGFR-TKIs获得性耐药的机制还包括EGFR基因的其他二次变异如D761Y、L747S、T854A、G796A、C797S和Exon20插入等，以及其他变异或扩增如EGFR、HER2、MAPK1基因扩增、RAS/RAF基因变异、HGF/MET激活、FGF/FGFR激活、GAS6/AXL激活、IGF1R激活、PIK3CA突变激活、PTEN丢失、IGFBP3丢失、BRCA1高表达和CRKL基因扩增等。
面对如此多的EGFR TKI耐药基因与位点，为了探讨耐药机制和满足临床患者靶向治疗耐药后的需求，需要对多个耐药位点进行检测。大部分经晚期靶向治疗后的耐药患者一般通过经皮肺穿刺、支气管镜活检、支气管内超声穿刺活检等获得只是少量标本，这些小标本很难有剩余材料进一步用于多个耐药机制等重要分子分型的分析。另外，多个基因单次检测也存在耗时、耗费等劣势。建立多基因多位点变异的同步检测方法不仅可以节约临检样本，还省时省力，对临床基因谱分析具有很大的应用价值。因此二代测序技术、Snapshot多基因技术、MassARRAY多基因技术等在临床多基因同步检测上正在悄然崛起。目前国内外关于EGFR靶向治疗耐药基因同步检测的试剂盒的报道较少。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒。该试剂盒是基于MassARRAY平台设计的，应用MassARRAY多重PCR单碱基延伸方法和质谱技术，对EGFR基因突变肺癌靶向治疗耐药突变谱进行检测。本申请所指的EGFR基因突变肺癌靶向治疗耐药突变谱包含EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF、HER2、BIM和NRAS七种相关基因的60个核酸位点。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，包含如表1所示的扩增引物和表2所示的延伸引物：
表1 扩增引物
表3 延伸引物
所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，优选包含12管扩增引物混合物、12管延伸引物混合物；扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R的引物混合得到第1管扩增引物混合物，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R的引物混合得到第2管扩增引物混合物，类推，为12管；按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管；
所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增引物的浓度为0.5μM；
所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
第1管：如SEQ ID NO.123～131所示的延伸引物的摩尔比为6.92：7.10：7.98：8.56：9.33：9.50：10.09：10.65：11.31；
第2管：如SEQ ID NO.132～140所示的延伸引物的摩尔比为6.80：7.04：7.85：8.09：8.67：8.95：9.48：10.29：11.00；
第3管：如SEQ ID NO.141～147所示的延伸引物的摩尔比为6.92：7.16：7.94：8.68：9.24：9.50：10.38；
第4管：如SEQ ID NO.148～154所示的延伸引物的摩尔比为7.05：7.36：7.98：8.20：8.85：9.69：10.50；
第5管：如SEQ ID NO.155～161所示的延伸引物的摩尔比为6.85：7.18：8.05：9.14：9.38：10.10：10.66；
第6管：如SEQ ID NO.162～165所示的延伸引物的摩尔比为6.96：7.20：7.94：8.61；
第7管：如SEQ ID NO.166～169所示的延伸引物的摩尔比为6.89：7.11：8.05：8.93；
第8管：如SEQ ID NO.170～172所示的延伸引物的摩尔比为7.14：7.90：8.72；
第9管：如SEQ ID NO.173～175所示的延伸引物的摩尔比为8.20：9.04：11.59；
第10管：如SEQ ID NO.176～177所示的延伸引物的摩尔比为7.02：7.69；
第11管：如SEQ ID NO.178～180所示的延伸引物的摩尔比为7.01：7.73：8.57；
第12管：如SEQ ID NO.181～183所示的延伸引物的摩尔比为7.01：7.73：8.71。
所述的延伸引物混合物的延伸引物浓度更优选为如表3所示；
表3 延伸引物浓度
所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，还包括清洁树脂和PCR用酶试剂中的一种或两种。
所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液等。
所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒的应用，包含如下步骤：
(1)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将每条扩增引物配制成浓度为10μM的引物溶液后，再按分组进行混合，得到12管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM；以人肺组织基因组为模板，将12组扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物；
PCR的条件为：94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟；
PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl2(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、人肺组织基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl；
(2)将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl；消化的条件为：37℃40分钟，85℃5分钟；
(3)按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管，按表3将延伸引物配制成12管延伸引物混合液；在步骤(2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推；延伸反应的体系为：在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0.804μl、H2O补足至9μl；延伸反应的条件为：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环；72℃3分钟；
(4)使用96孔板操作时，将步骤(3)获得产物9μl、水41μl和清洁树脂(CleanResin)15mg混合；使用384孔板操作时，将步骤(3)获得产物9μl、水16μl和清洁树脂6mg混合；旋转96孔板或384孔板30～60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；对上清进行分析；
(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变；其中，对于BIM基因大片段删除，若在野生型设计质谱图谱有G碱基峰，在突变型设计质谱图谱有C碱基峰，则判断为突变；若仅在野生型设计质谱图谱有G碱基峰，则判断无突变。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的试剂盒主要针对肺癌EGFR基因突变靶向治疗发生耐药的基因和位点研发。设计盒的设计需要付出创造性的劳动成果，首先根据实际临床工作需求，需要有设计一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒的创造性思维，并寻找合适的检测平台，目前尚未见相关试剂盒报道。另外，纳入试剂盒7种基因以及相关的60个核酸位点的突变谱选择，是依据最新肺癌EGFR基因突变靶向治疗的研究进展，COSMIC数据库中突变位点的描述与频率分布，以及本肺癌研究所前期强大的研究基础，分别从EGFR基因敏感突变丢失导致耐药；EGFR基因二次突变的耐药位点；旁通路或下游通路的激活三个方面进行精心筛选的。本试剂盒基因谱的检测将为EGFR靶向治疗成功或失败提供非常全面的基因分析数据，以及为后续治疗与研究提供依据。
(2)本发明提供的检测试剂盒自主研发，在价格上存在优势，降低了患者的临床检测费用，可转化研究应用于临床，产生经济效益和优化临床资源配置。
(3)本发明提供的检测试剂盒具有高通量性、可实现“单个小样本多基因的检测”。
(4)本发明提供的检测试剂盒不仅可检测临床新鲜组织样本，也可检测核酸破坏严重的石蜡组织样本。
(5)对于靶向治疗耐药的晚期患者而言，组织取材较难，可利用MassARRAY平台的高敏感性，采用本耐药试剂盒检测靶向治疗失败后的胸水、血液等易取材样本，为患者提供个体化治疗信息。
(6)本发明采用2条序列分开设计BIM基因的野生型与2903个碱基删除的突变型，在MassARRAY平台实现了大片段基因删除在单碱基延伸技术上检测的可行性。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测H1975肺癌细胞株得到的EGFR_L858R、EGFR_T790M突变结果图；其中，A为EGFR_L858R突变G，分子量为5512.60；B为EGFR_T790M突变，T分子量为6035.80。
图2为本发明试剂盒检测20455肺癌组织样本得到的BIM_DEL的结果图；其中，A为BIM基因野生型G，分子量为6468.20；B为BIM基因突变型C，分子量为6382.20。
图3为检测22840肺癌组织样本得到的EGFR_L858R、PIK3CA_E542K突变结果图；其中，A为LungCarta检测EGFR_L858R突变G，分子量为6139.00；B为LungCarta检测PIK3CA_E542K突变A，分子量为6563.30；C为本发明试剂盒检测EGFR_L858R突变G，分子量为5512.60；D为本发明试剂盒检测PIK3CA_E542K突变A，分子量为6867.50。
图4为检测33052肺癌组织样本得到的EGFR_Exon19del突变结果图；其中，A为LungCarta检测EGFR_Exon19del变异，分子量为5724.70；B为本发明试剂盒检测EGFR_p.L747_P753>S变异，分子量为5436.60。
图5为检测20455肺癌组织样本BIM基因的一代(Sanger)测序图。
图6为延伸引物浓度对第9孔检测结果质谱峰的影响的结果图；其中，A为优化延伸引物后的检测质谱图；B为优化延伸引物前的检查质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的选择
根据最新肺癌EGFR基因突变靶向治疗的研究进展，COSMIC数据库中突变位点的描述与频率分布，以及本肺癌研究所的前期研究基础，本发明纳入了检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗耐药相关7个基因的60个碱基变异位点。这些基因与位点是分别从EGFR基因敏感突变丢失导致耐药(如Exon19删除、L858R、G719X、L861Q等敏感突变丢失)；EGFR基因二次突变的耐药位点(p.T790M、p.G796SDA、p.C797YSA、p.L747S、p.D761YN、p.T854APS、Exon20插入突变)；旁通路或下游通路的激活(KRAS、BIM、PIK3CA、BRAF、NRAS基因的相关耐药变异位点)三个方面进行精心筛选的，本试剂盒包含了检测EGFR靶向治疗发生耐药的较为全面的基因谱。检测7个基因的核酸与氨基酸变异位点如表4所示。
表4 试剂盒包含7个基因的核酸与氨基酸变异位点
实施例2肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的引物试剂盒制备
1、软件设计多重引物文档：根据实施例1确定纳入试剂盒的7个基因是EGFR(NM_005228)、KRAS(NM_033360)、PIK3CA(NM_006218.2)、BRAF(NM_004333.4)、ERBB2(NM_004448)、BIM(NM_138621.4)、NRAS(NM_002524.4)。上述7个基因在COSMIC数据库的基因号分别为EGFR(ENST00000275493)、KRAS(ENST00000256078)、PIK3CA(ENST00000263967)、BRAF(ENST00000288602)、ERBB2(ENST00000269571)、BIM(ENST_00000393256)、NRAS(ENST00000369535)。在PUBMED数据库中查询纳入试剂盒7个基因的基因组gDNA序列分别为EGFR(NG_007726.3)、KRAS(NG_007524.2)、PIK3C(NG_012113.2)、BRAF(NG_007873.3)、ERBB2(NG_007503.1)、BIM(NG_029006.1)、NRAS(NG_007572.1)。根据COSMIC数据库中基因的CDS序列在gDNA序列中标记7个基因的60个变异位点，并根据MassARRAY平台公司突变标示方式，将每个变异位点侧翼约200个碱基拷贝到引物设计固定格式文本中设计引物。其中BIM基因变异检测设计，因为删除片段较大(2903个碱基)，在同一序列难以同步完成检测，本发明将分开BIM基因突变型和野生型进行设计。所以多种引物文档共设计61个序列。
例如：普通序列EGFR_L858R(c.2573T>G)和BIM_2903del的序列设计分别如下：
EGFR_L858R位点野生型与变异型检测设计序列：
GACGTGGAGAGGCTCAGAGCCTGGCATGAACATGACCCTGAATTCGGATGCAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAGCCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[T/G]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTAACACATG；为T时表示野生型，为G时表示突变型；
BIM基因野生型检测设计序列：
TTATAATTTAGATTGTACCTCATGATGAAGGCTAACTCAACAAACCCATCAGAACAGACACTGGAACAAAATGACATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAGGCTTCAGTGAGGTAAATCA[G/A/C/T]GCAGGCCTTTGCCCATGTTATAGAATTGGAAAGAACCTCAGAGTGGTGGTCACTTGTCAGAGGTTGGGCACACCTGTGAGGTGGTGGGGAGAAATGACAGACATCCCAGCAGCTACACATGCTGGCTGCACGTCTCTTGCCAAATGCCAGGAGGTAATTTTTTAGGGTCCCTCCTTAGGGAAAGGGGCTGGAAGT；为G时表示野生型，A/C/T碱基为配合设计设置；
BIM基因2903个碱基大片段删除检测设计序列：
TTATAATTTAGATTGTACCTCATGATGAAGGCTAACTCAACAAACCCATCAGAACAGACACTGGAACAAAATGACATTTCTAAATACCATCCAGCTCTGTCTTCATAGGCTTCAGTGAGGTAAATCA[C/A/G/T]TGTTCTCCATAGAGGCTGTGCCATTTTACATTCCCACCAACAGGGCACAAGGGTTCCAGTTTCTCCACATACTTACCAACACTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGTAGTCATCCTAGAGGATATAGGTGATCTTTCACTGTGCTTTGGATTTATATTTACTGGCTTAGATTT；为C时表示突变型型，A/G/T碱基为配合设计设置。
2、多重引物设计：通过MassARRAY网站ADS(Assay Design Suite)引物设计软件，运行第1步变异位点序列的文档，调整相关参数，将7个基因60个变异位点全部纳入引物设计试剂盒。共设计183条引物，61条正向、61条反向PCR引物和61条延伸引物。依据延伸产物的长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到目标产物，将183条引物分别分布在12孔里面，PCR引物(如表1所示)的分组以表1中的扩增引物进行分组，引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；延伸引物的分组以表2中的延伸引物进行分组，引物名称末尾为E1为第1组，引物名称末尾为E2为第2组，类推，分为12组。12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。
关于设计时参数的调整是本试剂盒多重设计的难点：
首先，为了方便PCR板(8×12孔)排枪操作，我们需要在12孔里面纳入全部设计位点。所以对Advanced settings(高级设置)的参数设置至关重要。
我们首先设计BIM基因。在高级设置中改Identify OptimalPrimer Areas(确定最佳的引物区域)中Amplicon Length minimum(最小扩增长度)为60，Amplicon Lengthmaximum(最大扩增长度)为400，并选择Designable Sequences Retained(设计保留序列)为0and1×Mapped(匹配)；设置Design Assays(设计分析)中AmpliconLength(扩增长度)为60-400，并设置Minimum Multiplex Level(最小多重水平)为1。
BIM基因成功设计后，然后选择Re-multiplexassay(再多重分析)再设计其他基因位点。设置Advanced settings(高级设置)的参数，选择ExtendPrimerPotential(延伸引物潜能)中False Priming(错配引物)以及Hairpin/Dimer Extension(发夹/二聚体延伸)均为0.5.Extend Primer Overall Confidence Score Cut off(延伸引物总可信分截点)为0.3。并设置Minimum Multiplex Level(最小的多重水平)为1。
3、多重引物的合成与配制(试剂盒制备)：在上海生工生物工程有限公司合成ADS软件导出的183条引物，并进行配制：(1)PCR引物先稀释成10μM，然后工作液以每条引物浓度为0.5μM进行混合，得到扩增引物混合液，共12管(每管包括正、反向引物)；(2)延伸引物先稀释成500μM，然后根据每一条延伸引物的分子量，按相应体积(如表3)进行混合，得到延伸引物混合液，共12管。
实施例3使用实施例2的耐药试剂盒检测肺癌细胞株
1、选用已知突变位点的H460、PC9、H1650、H1975、A549、GLC82、HCC827、H2228、H1299这9个肺癌细胞株(均能从ATCC购买得到)进行本试剂盒的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(Promega公司人类基因组gDNA：Male做为阴性对照，水(H2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA120ng，即10ng/孔×12孔。本发明试剂盒的操作如下：
(1)PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl2(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、肺癌组织样本基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl。94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟；
(2)在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl。37℃40分钟，85℃5分钟，将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；
(3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推；在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液0.804μl、H2O补足至9μl。94℃30秒；94℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒、52℃5秒、80℃5秒，35个循环；72℃3分钟，进行延伸反应；
(4)将步骤(3)获得产物中加入水41μl，清洁树脂(Clean Resin)15mg(96孔板)或者加入水16μl，清洁树脂6mg(384孔板)，旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；
(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。其中，对于BIM基因大片段删除，若在野生型设计质谱图谱有G碱基峰，在突变型设计质谱图谱有C碱基峰，则判断为突变；若仅在野生型设计质谱图谱有G碱基峰，则判断无突变。
2、建立方法检测9例肺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(www.atcc.org)细胞株的变异情况一致，具体基因的变异蛋白与碱基位点结果如表5。其中由于本发明试剂盒不包含PTEN缺失位点，因此未检测到H1650细胞株的PTEN缺失。另外，H2228是一种含EML4-ALK融合基因的肺癌细胞株，本EGFR基因靶向治疗相关试剂盒未纳入此基因。阴性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本试剂盒具有可行性。如图1所示在H1975耐药细胞株检测到EGFR_L858R和EGFR_T790M突变，EGFR_L858R突变为EGFRTKI靶向治疗的敏感位点，而EGFR_T790M突变则会导致靶向治疗耐药。
表5 本发明耐药试剂盒在肺癌细胞株检测的验证结果
实施例4使用实施例2的试剂盒检测肺癌患者组织样本
1、验证选用已经使用LungCarta试剂盒检测出突变的7例人肺腺癌组织样(来自广东省人民医院)以及未检测出突变的3例肺癌组织样本(来自广东省人民医院)，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)做为阴性对照，水(H2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA120ng，即10ng/孔×12孔。其中，LungCarta试剂盒按其说明书操作。本发明试剂盒的操作同实施例3。
2、本发明耐药试剂盒检测10例肺癌组织样本，与MassARRAY平台商品化LungCarta试剂盒检测结果比较(见表6)。使用本发明试剂盒在1例使用LungCarta试剂盒检测未发现突变的20455号样本中检测到BIM基因的突变(野生型G碱基分子量为6468.2；删除突变分子量为6382.2，见图2)。BIM基因是EGFR靶向治疗的原发耐药基因，若检测到该基因2903碱基删除，可为临床患者EGFR靶向治疗耐药机制提供更准确的个体化信息，同时为医生提供更准确的临床治疗抉择。另外，因本发明未含有P53基因(因与EGFR靶向治疗耐药无关，未纳入本发明)，与LungCarta试剂盒比较，在33070号样本未检测到P53基因突变，在其它组织样本中本发明与LungCarta试剂盒检测结果基本一致。阴性对照以及空白对照均没有检测到变异，表明本试剂盒具有可行性。如图3所示在22840号组织样本检测到EGFR_L858R和PIK3CA_E542K突变，EGFR_L858R突变为EGFR TKI靶向治疗的敏感位点，而PIK3CA_E542K突变则会导致靶向治疗耐药。如图4所示在33052号组织样本检测到EGFR_p.L747_P753>S敏感突变。
表6 本发明耐药试剂盒与LungCarta试剂盒验证结果比较
3、进一步对本发明耐药试剂盒检测BIM基因阳性的20455号肺癌组织样本进行一代(Sanger)测序验证，设置对照，测序分析引物序列如下：正向引物(F):cctcatgatgaaggctaactcaa；反向引物(R-野生型):tggtggtcacttgtcagaggtt；反向引物(R-突变型):tgttctccatagaggctgtgcc。一代测序结果blast分析显示此样本存在BIM基因野生型与突变型两种基因序列。图5为检测此样本BIM基因的Sanger测序图。表明本试剂盒对BIM基因检测具有可靠性。
对比例1：
多重引物设计方法与实施例2所述的肺癌基因谱多种引物设计方法一致，区别仅在于：BIM基因不优先设计，而是与其他基因采用相同的高级参数共同设计，则会因为BIM基因涉及大片段删除，在软件运行第3步Identify Optimal Primer Areas(确定最佳的引物区域)被拒绝，而无法纳入试剂盒。
或者，多重引物设计方法与实施例2所述的肺癌基因谱多种引物设计方法一致，区别仅在于：在选择Re-multiplex assay(再多重分析)再设计其他基因位点时，选择ExtendPrimer Potential(延伸引物潜能)中Extend Primer Overall Confidence Score Cutoff(延伸引物总可信分截点)为0.4，则会导致EGFRp.S768I位点被拒绝，然后剩余位点分布在13孔中。
该对比例说明，在多重引物设置时，每个位点具有序列特点，比如大片段删除的设计，容易形成发夹结构设计以及二聚体结构等，设计它们在一个限定12孔的试剂盒里面需要具有设计理念，并不断的调整高级设置的参数，直到所有目的位点全部纳入设计并限定在12孔，最终还要符合引物设计的输出要求。设计理念不正确或参数设置不合适，会导致某些目的基因位点在ADS引物设计过程的任何一步都会发生拒绝，而无法纳入设计中，造成不完整性；或者是参数设置不合适导致所有位点均能纳入设计，但分布在超过或少于12孔中，造成排枪加样的不方便性。所以需要对大片段删除序列具有分开并优先设计的理念，并选择合适的高级参数，即能全部纳入设计位点、又能满足限定在12孔，并符合引物的输出要求。这对于多重引物的设计至关重要。
对比例2：
操作步骤与条件基本与实施例3、4所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别仅在于：E1组延伸引物的浓度有变化，具体为EGFR_L858R浓度降低一半由8.52μM变为4.26μM，BRAF_G469AVE浓度降低1/2由12.78μM变为6.39μM，KRAS_G61H浓度降低1/4由13.58μM变为3.395μM，其他六个延伸引物浓度不变。结果显示FGFR1_T141A的电泳峰明显降低，如图6所示。本对比例旨在说明，在其他条件不变的情况下，延伸引物的混合物中，各个引物成分的浓度比例是实验成败的一个关键因素。
该对比例说明，在进行多重PCR及延伸反应时，引物混合物中，各种引物之间存在着相互竞争作用，某些引物的反应效率高以及受分子量大小影响，产生的峰形较高，但有些引物效率则受到抑制，所以引物混合中各种引物的浓度和比例对结果影响很大，需要不断调整，获得最佳引物浓度比例。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省人民医院（广东省医学科学院）
<120> 一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒
<130> 1
<160> 189
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.H1047Y_P1_F
<400> 1
acgttggatg aactgagcaa gaggctttgg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.H1047Y_P1_R
<400> 2
acgttggatg tccatttttg ttgtccagcc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L858R_P1_F
<400> 3
acgttggatg aaacaccgca gcatgtcaag 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L858R_P1_R
<400> 4
acgttggatg cctccttctg catggtattc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.H773_V774insNPH_P1_F
<400> 5
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.H773_V774insNPH_P1_R
<400> 6
acgttggatg gcatgagctg cgtgatgag 29
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.D761YN_P1_F
<400> 7
acgttggatg gttaaaattc ccgtcgctat c 31
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.D761YN_P1_R
<400> 8
acgttggatg ccacacagca aagcagaaac 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E542KQ_P1_F
<400> 9
acgttggatg gcaatttcta cacgagatcc 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E542KQ_P1_R
<400> 10
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.D769YHN_P1_F
<400> 11
acgttggatg gaaaacacat cccccaaagc 30
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.D769YHN_P1_R
<400> 12
acgttggatg tccttcctgt cctcctagc 29
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597S_P1_F
<400> 13
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597S_P1_R
<400> 14
acgttggatg ccactccatc gagatttcac 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.G469AVE_P1_F
<400> 15
acgttggatg gggactcgag tgatgattgg 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.G469AVE_P1_R
<400> 16
acgttggatg catgccactt tcccttgtag 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G61H_P1_F
<400> 17
acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G61H_P1_R
<400> 18
acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G12CRS_P2_F
<400> 19
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G12CRS_P2_R
<400> 20
acgttggatg gctgtatcgt caaggcactc 30
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.S768I_P2_F
<400> 21
acgttggatg ctccaggaag cctacgtga 29
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.S768I_P2_R
<400> 22
acgttggatg gcatgagctg cgtgatgag 29
<210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.S310FY_P2_F
<400> 23
acgttggatg acaactacct ttctacggac 30
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.S310FY_P2_R
<400> 24
acgttggatg ctgtcacctc ttggttgtgc 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.R678Q_P2_F
<400> 25
acgttggatg ttctgctggt cgtggtcttg 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.R678Q_P2_R
<400> 26
acgttggatg tcgtgtactt ccggatcttc 30
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G719SC_P2_F
<400> 27
acgttggatg tctcttgagg atcttgaagg 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G719SC_P2_R
<400> 28
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545D_P2_F
<400> 29
acgttggatg tacacgagat cctctctctg 30
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545D_P2_R
<400> 30
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 31
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.D594GVA_P2_F
<400> 31
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.D594GVA_P2_R
<400> 32
acgttggatg ccactccatc gagatttcac 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.R1023Q_P2_F
<400> 33
acgttggatg ctctggaatg ccagaactac 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.R1023Q_P2_R
<400> 34
acgttggatg tactccaaag cctcttgctc 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRAS_p.Q61K_P2_F
<400> 35
acgttggatg gtgaaacctg tttgttggac 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRAS_p.Q61K_P2_R
<400> 36
acgttggatg cctgtcctca tgtattggtc 30
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E542VAG_P3_F
<400> 37
acgttggatg gcaatttcta cacgagatcc 30
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E542VAG_P3_R
<400> 38
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.D770_N771insSVD_P3_F
<400> 39
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.D770_N771insSVD_P3_R
<400> 40
acgttggatg gcatgagctg cgtgatgag 29
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600ED_P3_F
<400> 41
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600ED_P3_R
<400> 42
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.G469R_P3_F
<400> 43
acgttggatg gggactcgag tgatgattgg 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.G469R_P3_R
<400> 44
acgttggatg catgccactt tcccttgtag 30
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G13CRS_P3_F
<400> 45
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G13CRS_P3_R
<400> 46
acgttggatg gctgtatcgt caaggcactc 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G719DA_P3_F
<400> 47
acgttggatg tctcttgagg atcttgaagg 30
<210> 48
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G719DA_P3_R
<400> 48
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.L755S_P3_F
<400> 49
acgttggatg tgaaaattcc agtggccatc 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.L755S_P3_R
<400> 50
acgttggatg gggcttacgt ctaagatttc 30
<210> 51
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L861Q_P4_F
<400> 51
acgttggatg tgaaaacacc gcagcatgtc 30
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L861Q_P4_R
<400> 52
acgttggatg cctccttctg catggtattc 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545KQ_P4_F
<400> 53
acgttggatg tacacgagat cctctctctg 30
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545KQ_P4_R
<400> 54
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_A750delELREA_1_P4_F
<400> 55
acgttggatg tctctctgtc atagggactc 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_A750delELREA_1_P4_R
<400> 56
acgttggatg atttccttgt tggctttcgg 30
<210> 57
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.C797YS_P4_F
<400> 57
acgttggatg actgacgtgc ctctccctc 29
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.C797YS_P4_R
<400> 58
acgttggatg tttgtgttcc cggacatag 29
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G13DAV_P4_F
<400> 59
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 60
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G13DAV_P4_R
<400> 60
acgttggatg gctgtatcgt caaggcactc 30
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597V_P4_F
<400> 61
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597V_P4_R
<400> 62
acgttggatg ccactccatc gagatttcac 30
<210> 63
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.V777LM_P4_F
<400> 63
acgttggatg ttgtccccag gaagcatacg 30
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.V777LM_P4_R
<400> 64
acgttggatg agaaggcggg agacatatgg 30
<210> 65
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.A763_Y764insFQEA_P5_F
<400> 65
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<210> 66
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.A763_Y764insFQEA_P5_R
<400> 66
acgttggatg tttgtgttcc cggacatag 29
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_T751>A_P5_F
<400> 67
acgttggatg tctggatccc agaaggtgag 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_T751>A_P5_R
<400> 68
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.T854A_P5_F
<400> 69
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<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.T854A_P5_R
<400> 70
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<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600ML_P5_F
<400> 71
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 72
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600ML_P5_R
<400> 72
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545AGV_P5_F
<400> 73
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<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545AGV_P5_R
<400> 74
acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30
<210> 75
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G12DVA_P5_F
<400> 75
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G12DVA_P5_R
<400> 76
acgttggatg gctgtatcgt caaggcactc 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.H1047RL_P5_F
<400> 77
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.H1047RL_P5_R
<400> 78
acgttggatg tccatttttg ttgtccagcc 30
<210> 79
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_P753>S_P6_F
<400> 79
acgttggatg gttaaaattc ccgtcgctat c 31
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_P753>S_P6_R
<400> 80
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.V842I_P6_F
<400> 81
acgttggatg gatgagctac ctggaggatg 30
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.V842I_P6_R
<400> 82
acgttggatg acatggttgg gactcttgac 30
<210> 83
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.T790M_P6_F
<400> 83
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<210> 84
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.T790M_P6_R
<400> 84
acgttggatg tttgtgttcc cggacatag 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.D594NH_P6_F
<400> 85
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.D594NH_P6_R
<400> 86
acgttggatg ccactccatc gagatttcac 30
<210> 87
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.C797SA_P7_F
<400> 87
acgttggatg actgacgtgc ctctccctc 29
<210> 88
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.C797SA_P7_R
<400> 88
acgttggatg tttgtgttcc cggacatag 29
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.A775_G776insYVMA_2_P7_F
<400> 89
acgttggatg ccttgtcccc aggaagcata 30
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.A775_G776insYVMA_2_P7_R
<400> 90
acgttggatg agaaggcggg agacatatgg 30
<210> 91
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_T751delLREAT_P7_F
<400> 91
acgttggatg tctggatccc agaaggtgag 30
<210> 92
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_T751delLREAT_P7_R
<400> 92
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600EAG_P7_F
<400> 93
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<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600EAG_P7_R
<400> 94
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_A750delELREA_2_P8_F
<400> 95
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<210> 96
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_A750delELREA_2_P8_R
<400> 96
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<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600KR_P8_F
<400> 97
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600KR_P8_R
<400> 98
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 99
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.A775_G776insYVMA_1_P8_F
<400> 99
acgttggatg tctcagcgta cccttgtcc 29
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.A775_G776insYVMA_1_P8_R
<400> 100
acgttggatg agaaggcggg agacatatgg 30
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G796S_P9_F
<400> 101
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 102
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G796S_P9_R
<400> 102
acgttggatg tgttcccgga catagtccag 30
<210> 103
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_S752delLREATS_P9_F
<400> 103
acgttggatg gttaaaattc ccgtcgctat c 31
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_S752delLREATS_P9_R
<400> 104
acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30
<210> 105
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597RQP_P9_F
<400> 105
acgttggatg tcctttactt actacacctc 30
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597RQP_P9_R
<400> 106
acgttggatg ccactccatc gagatttcac 30
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_S752>V_P10_F
<400> 107
acgttggatg tctggatccc agaaggtgag 30
<210> 108
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_S752>V_P10_R
<400> 108
acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G796DA_P10_F
<400> 109
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 110
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G796DA_P10_R
<400> 110
acgttggatg tgttcccgga catagtccag 30
<210> 111
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747S_P11_F
<400> 111
acgttggatg tctctctgtc atagggactc 30
<210> 112
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747S_P11_R
<400> 112
acgttggatg ttggctttcg gagatgttgc 30
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.V769_D770insASV_2_P11_F
<400> 113
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 114
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.V769_D770insASV_2_P11_R
<400> 114
acgttggatg gcatgagctg cgtgatgag 29
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM_2903bpDEL_P11_F
<400> 115
acgttggatg taccatccag ctctgtcttc 30
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM_2903bpDEL_P11_R
<400> 116
acgttggatg aaatggcaca gcctctatgg 30
<210> 117
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_A750>P _P12_F
<400> 117
acgttggatg tctctctgtc atagggactc 30
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_A750>P _P12_R
<400> 118
acgttggatg ttccttgttg gctttcggag 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.V769_D770insASV_1_P12_F
<400> 119
acgttggatg tccaggaagc ctacgtgatg 30
<210> 120
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.V769_D770insASV_1_P12_R
<400> 120
acgttggatg gcatgagctg cgtgatgag 29
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM_WT_P12_F
<400> 121
acgttggatg taccatccag ctctgtcttc 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM_WT_P12_R
<400> 122
acgttggatg tgaccaccac tctgaggttc 30
<210> 123
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.H1047Y_E1
<400> 123
tgtccagcca ccatgat 17
<210> 124
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L858R_E1
<400> 124
gatcacagat tttgggc 17
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.H773_V774insNPH_E1
<400> 125
cagcgtggac aacccccac 19
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.D761YN_E1
<400> 126
aagccaacaa ggaaatcctc 20
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E542KQ_E1
<400> 127
ttctacacga gatcctctct ct 22
<210> 128
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.D769YHN_E1
<400> 128
caaagccaac aaagaaatct ta 22
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597S_E1
<400> 129
cagtaaaaat aggtgatttt ggt 23
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.G469AVE_E1
<400> 130
atgccacttt cccttgtaga ctgtt 25
<210> 131
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G61H_E1
<400> 131
ctggtccctc attgcactgt actcctc 27
<210> 132
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G12CRS_E2
<400> 132
actcttgcct acgccac 17
<210> 133
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.S768I_E2
<400> 133
agcctacgtg atggcca 17
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.S310FY_E2
<400> 134
gggcagacga gggtgcag 18
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.R678Q_E2
<400> 135
gggatcctca tcaagcgac 19
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G719SC_E2
<400> 136
tcaaaaagat caaagtgctg 20
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545D_E2
<400> 137
ccatagaaaa tctttctcct g 21
<210> 138
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.D594GVA_E2
<400> 138
tttcactgta gctagaccaa aa 22
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.R1023Q_E2
<400> 139
cttttgatga cattgcatac attc 24
<210> 140
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NRAS_p.Q61K_E2
<400> 140
gtctctcatg gcactgtact cttctt 26
<210> 141
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E542VAG_E3
<400> 141
tctcctgctc agtgatt 17
<210> 142
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.D770_N771insSVD_E3
<400> 142
gatggccagc gtggaca 17
<210> 143
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600ED_E3
<400> 143
acccactcca tcgagattt 19
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.G469R_E3
<400> 144
gaattggatc tggatcattt 20
<210> 145
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G13CRS_E3
<400> 145
cttgtggtag ttggagctgg t 21
<210> 146
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G719DA_E3
<400> 146
caccgtgccg aacgcaccgg ag 22
<210> 147
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.L755S_E3
<400> 147
aaattccagt ggccatcaaa gtgt 24
<210> 148
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_L861Q_E4
<400> 148
ttttgggctg gccaaac 17
<210> 149
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545KQ_E4
<400> 149
cctctctctg aaatcact 18
<210> 150
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_A750delELREA_1_E4
<400> 150
aaattcccgt cgctatcaa 19
<210> 151
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.C797YS_E4
<400> 151
ccggacatag tccaggagg 19
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G13DAV_E4
<400> 152
tgtggtagtt ggagctggtg 20
<210> 153
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597V_E4
<400> 153
agtaaaaata ggtgattttg gt 22
<210> 154
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.V777LM_E4
<400> 154
caggaagcat acgtgatggc tggt 24
<210> 155
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.A763_Y764insFQEA_E5
<400> 155
ctccctccag gaagcct 17
<210> 156
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_T751>A_E5
<400> 156
gttggctttc ggagatg 17
<210> 157
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.T854A_E5
<400> 157
ttggccagcc caaaatctg 19
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600ML_E5
<400> 158
ggtgattttg gtctagctac a 21
<210> 159
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.E545AGV_E5
<400> 159
ccatagaaaa tctttctcct gc 22
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KRAS_p.G12DVA_E5
<400> 160
taaacttgtg gtagttggag ctg 23
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PIK3CA_p.H1047RL_E5
<400> 161
catttttgtt gtccagccac catga 25
<210> 162
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_P753>S_E6
<400> 162
ttccttgttg gctttcg 17
<210> 163
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.V842I_E6
<400> 163
tggaggatgt gcggctc 17
<210> 164
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.T790M_E6
<400> 164
tccaccgtgc agctcatca 19
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.D594NH_E6
<400> 165
acctcacagt aaaaataggt 20
<210> 166
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.C797SA_E7
<400> 166
gctcatgccc ttcggct 17
<210> 167
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.A775_G776insYVMA_2_E7
<400> 167
aagcatacgt gatggct 17
<210> 168
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_T751delLREAT_E7
<400> 168
cccgtcgcta tcaaggaat 19
<210> 169
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600EAG_E7
<400> 169
gacccactcc atcgagattt c 21
<210> 170
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_A750delELREA_2_E8
<400> 170
ttggctttcg gagatgt 17
<210> 171
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.V600KR_E8
<400> 171
cccactccat cgagatttc 19
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ERBB2_p.A775_G776insYVMA_1_E8
<400> 172
caggaagcat acgtgatggc 20
<210> 173
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G796S_E9
<400> 173
cgcagctcat gcccttc 17
<210> 174
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_S752delLREATS_E9
<400> 174
cccgtcgcta tcaaggaa 18
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BRAF_p.L597RQP_E9
<400> 175
gtaaaaatag gtgattttgg tc 22
<210> 176
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.E746_S752>V_E10
<400> 176
ccttgttggc tttcgga 17
<210> 177
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.G796DA_E10
<400> 177
acatagtcca ggaggcag 18
<210> 178
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747S_E11
<400> 178
ccgtcgctat caaggaa 17
<210> 179
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.V769_D770insASV_2_E11
<400> 179
acgtgatggc cagcgtgg 18
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM_2903bpDEL_E11
<400> 180
cacagcctct atggagaaca 20
<210> 181
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.L747_A750>P_E12
<400> 181
ccgtcgctat caaggaa 17
<210> 182
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_p.V769_D770insASV_1_E12
<400> 182
acgtgatggc cagcgtgg 18
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM_WT_E12
<400> 183
ggcttcagtg aggtaaatca 20
<210> 184
<211> 347
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR_L858R位点野生型与变异型
<220>
<221> misc_feature
<222> (209)..(209)
<223> K=T or G
<400> 184
gacgtggaga ggctcagagc ctggcatgaa catgaccctg aattcggatg cagagcttct 60
tcccatgatg atctgtccct cacagcaggg tcttctctgt ttcagggcat gaactacttg 120
gaggaccgtc gcttggtgca ccgcgacctg gcagccagga acgtactggt gaaaacaccg 180
cagcatgtca agatcacaga ttttgggckg gccaaactgc tgggtgcgga agagaaagaa 240
taccatgcag aaggaggcaa agtaaggagg tggctttagg tcagccagca ttttcctgac 300
accagggacc aggctgcctt cccactagct gtattgttta acacatg 347
<210> 185
<211> 323
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM基因野生型
<220>
<221> misc_feature
<222> (128)..(128)
<223> N=G、A、C or T
<400> 185
ttataattta gattgtacct catgatgaag gctaactcaa caaacccatc agaacagaca 60
ctggaacaaa atgacatttc taaataccat ccagctctgt cttcataggc ttcagtgagg 120
taaatcangc aggcctttgc ccatgttata gaattggaaa gaacctcaga gtggtggtca 180
cttgtcagag gttgggcaca cctgtgaggt ggtggggaga aatgacagac atcccagcag 240
ctacacatgc tggctgcacg tctcttgcca aatgccagga ggtaattttt tagggtccct 300
ccttagggaa aggggctgga agt 323
<210> 186
<211> 300
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BIM基因2903个碱基大片段删除
<220>
<221> misc_feature
<222> (128)..(128)
<223> N=C、A、G or T
<400> 186
ttataattta gattgtacct catgatgaag gctaactcaa caaacccatc agaacagaca 60
ctggaacaaa atgacatttc taaataccat ccagctctgt cttcataggc ttcagtgagg 120
taaatcantg ttctccatag aggctgtgcc attttacatt cccaccaaca gggcacaagg 180
gttccagttt ctccacatac ttaccaacac tttttttttt ttttttttaa cagtagtcat 240
cctagaggat ataggtgatc tttcactgtg ctttggattt atatttactg gcttagattt 300
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 正向引物（F）
<400> 187
cctcatgatg aaggctaact caa 23
<210> 188
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 反向引物（R-野生型）
<400> 188
tggtggtcac ttgtcagagg tt 22
<210> 189
<211> 22
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 反向引物（R-突变型）
<400> 189
tgttctccat agaggctgtg cc 22
Claims (6)
1.一种检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，其特征在于：包含如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.122所示的扩增引物和如SEQ ID NO.123～SEQ ID NO.183所示的延伸引物。
2.根据权利要求1所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，其特征在于：包含12管扩增引物混合物和12管延伸引物混合物；
第1管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.18所示；
第2管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.36所示；
第3管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.50所示；
第4管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.64所示；
第5管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.65～SEQ ID NO.78所示；
第6管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.79～SEQ ID NO.86所示；
第7管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.87～SEQ ID NO.94所示；
第8管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.95～SEQ ID NO.100所示；
第9管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.106所示；
第10管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.107～SEQ ID NO.110所示；
第11管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.111～SEQ ID NO.116所示；
第12管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQ ID NO.117～SEQ ID NO.122所示；
第1管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.123～SEQ ID NO.131所示；
第2管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.132～SEQ ID NO.140所示；
第3管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.141～SEQ ID NO.147所示；
第4管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.148～SEQ ID NO.154所示；
第5管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.155～SEQ ID NO.161所示；
第6管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.162～SEQ ID NO.165所示；
第7管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.166～SEQ ID NO.169所示；
第8管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.170～SEQ ID NO.172所示；
第9管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.173～SEQ ID NO.175所示；
第10管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.176～SEQ ID NO.177所示；
第11管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.178～SEQ ID NO.180所示；
第12管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQ ID NO.181～SEQ ID NO.183所示。
3.根据权利要求2所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，其特征在于：所述的扩增引物混合物中的扩增引物为按等摩尔比混合。
4.根据权利要求3所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，其特征在于：所述的扩增引物混合物中的每条扩增引物的浓度为0.5μM。
5.根据权利要求2所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，其特征在于：所述的延伸引物混合物中的延伸引物按如下摩尔比混合：
第1管：如SEQ ID NO.123～131所示的延伸引物的摩尔比为6.92：7.10：7.98：8.56：9.33：9.50：10.09：10.65：11.31；
第2管：如SEQ ID NO.132～140所示的延伸引物的摩尔比为6.80：7.04：7.85：8.09：8.67：8.95：9.48：10.29：11.00；
第3管：如SEQ ID NO.141～147所示的延伸引物的摩尔比为6.92：7.16：7.94：8.68：9.24：9.50：10.38；
第4管：如SEQ ID NO.148～154所示的延伸引物的摩尔比为7.05：7.36：7.98：8.20：8.85：9.69：10.50；
第5管：如SEQ ID NO.155～161所示的延伸引物的摩尔比为6.85：7.18：8.05：9.14：9.38：10.10：10.66；
第6管：如SEQ ID NO.162～165所示的延伸引物的摩尔比为6.96：7.20：7.94：8.61；
第7管：如SEQ ID NO.166～169所示的延伸引物的摩尔比为6.89：7.11：8.05：8.93；
第8管：如SEQ ID NO.170～172所示的延伸引物的摩尔比为7.14：7.90：8.72；
第9管：如SEQ ID NO.173～175所示的延伸引物的摩尔比为8.20：9.04：11.59；
第10管：如SEQ ID NO.176～177所示的延伸引物的摩尔比为7.02：7.69；
第11管：如SEQ ID NO.178～180所示的延伸引物的摩尔比为7.01：7.73：8.57；
第12管：如SEQ ID NO.181～183所示的延伸引物的摩尔比为7.01：7.73：8.71。
6.根据权利要求5所述检测肺癌EGFR基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒，其特征在于：所述的延伸引物混合物中每条延伸引物按μM计，分别如下：
第1管：如SEQ ID NO.123～131所示的延伸引物的浓度比为6.92、7.10、7.98、8.56、9.33、9.50、10.09、10.65、11.31；
第2管：如SEQ ID NO.132～140所示的延伸引物的浓度分别依次为6.80、7.04、7.85、8.09、8.67、8.95、9.48、10.29、11.00；
第3管：如SEQ ID NO.141～147所示的延伸引物的浓度分别依次为6.92、7.16、7.94、8.68、9.24、9.50、10.38；
第4管：如SEQ ID NO.148～154所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05、7.36、7.98、8.20、8.85、9.69、10.50；
第5管：如SEQ ID NO.155～161所示的延伸引物的浓度分别依次为6.85、7.18、8.05、9.14、9.38、10.10、10.66；
第6管：如SEQ ID NO.162～165所示的延伸引物的浓度分别依次为6.96、7.20、7.94、8.61；
第7管：如SEQ ID NO.166～169所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89、7.11、8.05、8.93；
第8管：如SEQ ID NO.170～172所示的延伸引物的浓度分别依次为7.14、7.90、8.72；
第9管：如SEQ ID NO.173～175所示的延伸引物的浓度分别依次为8.20、9.04、11.59；
第10管：如SEQ ID NO.176～177所示的延伸引物的浓度分别依次为7.02、7.69；
第11管：如SEQ ID NO.178～180所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01、7.73、8.57；
第12管：如SEQ ID NO.181～183所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01、7.73、8.71。
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