CN104894269B - 基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测试剂盒 - Google Patents
基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。该方法能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，通过使用如SEQ？ID？NO.1～198所示的扩增引物进行扩增反应，接着消化反应，再使用如SEQ？ID？NO.199～297所示的延伸引物进行延伸反应，得到的产物进行MassARRAY质谱平台Iplex分析。依据该方法设计得到一款检测试剂盒，其具有如下优点：紧跟肺癌诊治国际前沿，考虑了欧美人群与亚洲人群基因谱的差异，检测位点多；价格较低；高通量，用时短；检测样本不限；高准确性与高敏感性。因此，该试剂盒在临床上应用推广的潜力大。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测肺癌的检测方法，特别涉及一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。
背景技术
肺癌是我恶性肿瘤死亡原因之首，发病率持续上升，健康危害形势严峻，其发生、发展以及治疗与基因变异关系密切，基于基因变异的“个体化”靶向治疗是继传统放化疗后肿瘤领域的新突破。非小细胞肺癌(NSCLC)样本中基因靶点变异可从相应的靶向药物治疗中获益，针对EGFR和ALK基因变异的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(erlotinib)和克佐替尼(crizotinb)等靶向治疗可延长患者的生存期。随着研究深入，ROS1、RET、ERBB2、STK11等分子变异被逐步确定为肺癌的驱动基因(drivergene)，并且新的低频基因被陆续报道。但是大部分患者在接受靶向治疗后一年左右最终都会对TKI药物耐药。在非小细胞肺癌中，对EGFRTKI药物Gefitinib/Erlotinib的抗药性分子机理包括EGFR二次变异(T790M、D761Y、L747S、T854A、G796A和Exon20插入)以及EGFR基因扩增、RAS/RAF基因变异、MAPK1基因扩增、MET基因扩增、HGF/MET激活、FGF/FGFR激活、PTEN丢失、GAS6/AXL激活、IGFBP3丢失、BRCA1高表达和CRKL基因扩增。在抗ALKTKI药物Crizotinib的肺癌中，ALK二次突变(L1196M、C1156Y、F1174L、L1152R、G1202R、S1206Y和1151T插入)及ALK基因扩增、CD74-ROS1融合、KIT基因扩增，EGFR或KRAS变异也被发现。目前本申请人所在肺癌研究进行的临床试验正在研究MET抑制剂INC280联合EGFRTKI治疗非小细胞肺癌靶向药物治疗耐药后MET突变的疗效。肿瘤发生发展耐药的多位点变异决定了肿瘤靶点的分子分型、靶向治疗以及耐药后机制探索的复杂性。
在肺癌的分子分型方面，目前临床单基因检测方法主要有qPCR、测序、FISH及IHC等多平台技术，除了EGFR、ALK、KRAS等主要基因的检测技术在临床相对成熟之外，ROS1、RET、HER2、NRTK、NRG、RICTOR、mTOR、LKB1、MET、RIT1A等分子变异的分型在临床主要限制因素有：分析的通量化(highthroughput)不够成熟和生物材料的有限性获得(limitedprocurement)。临床上肺癌早期患者接受手术(大手术或小手术活检)具有充足的组织，晚期患者通常通过经皮肺穿刺、支气管镜活检、支气管内超声穿刺活检等获得只是少量标本。这些小标本为了满足现有的临床病理诊断和个别基因的分子检测，很难有剩余材料进一步用于其他重要分子分型(molecularclassification/genotying)、药物耐药机制等分析。可见肿瘤样本的匮乏、低通量、耗时性以及价格昂贵等是制约临床多次单个基因检测开展的瓶颈。
肿瘤发生发展、靶向治疗后耐药以及转移机制等分子靶点的复杂性分析，以及对肺癌患者样本多靶点变异基因进行单基因检测的局限性，决定了在临床转化医学研究中开展多基因检测平台的必要性与紧迫性。MassARRAY分子量阵列技术通过扩增延伸反应与质谱相结合实现基因的分型检测，基于此平台的Iplex技术可基于96/384孔板开展多基因检测，操作程序简单，分型结果具有质谱的高准确性和敏感性。LungCarta试剂盒是MassARRAY公司研发主要针对肺癌靶向基因检测的试剂盒，已在肺癌领域广泛应用，包含26个癌症相关基因的214个突变位点。本发明申请人已经使用LungCarta试剂盒对肺癌患者组织样本进行多基因多位点的高通量检测，检测样本目前已达到100多例，可明显提高临床检测效率，改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势，为肺癌患者的临床靶向治疗以及耐药后治疗、以及生物标志物转化医学研究提供更全面的依据。但是由于该试剂盒为国外研发，技术信息保密，价格昂贵，且未完全包括前沿分子靶点如原发MET基因变异与EGFRTKI的靶向治疗耐药相关、ALK基因的多个位点突变与Crizotinib的靶向治疗耐药相关等，以及中美地区驱动基因谱具有差异性等特点，因此研发适合中国人群的多基因同步检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，是通过上述检测方法设计得到。
本发明的再一目的在于提供上述试剂盒的应用
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法，能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包括如下步骤：
(1)设计如表1所示的扩增引物和如表2所示的延伸引物；
(2)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将分组后的扩增引物混合，得到12管扩增引物混合液；将如表2所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，得到11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物，共计12管；
(3)以人肺组织基因组为模板，将12管扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物；
(4)将步骤(3)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；
(5)将步骤(4)消化后的产物进行延伸反应：12管扩增引物得到的产物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推；
(6)在96孔板或384孔板将步骤(5)延伸反应后得到的产物、清洁树脂和水混合；旋转96孔板或384孔板进行脱盐去离子防干扰处理；接着离心；对上清进行分析；
(7)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。
表1扩增引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| EGFR_p.L747_T751delLREAT-P1-F | ACGTTGGATGTCTGGATCCCAGAAGGTGAG |
| EGFR_p.L747_T751delLREAT-P1-R | ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC |
| FGFR1_p.S125P-P1-F | ACGTTGGATGTTCTTCCCATAGATGCTCTC |
| FGFR1_p.S125P-P1-R | ACGTTGGATGGCATACGGTTTGGTTTGGTG |
| STK11_p.F354L-P1-F | ACGTTGGATGTGACTGTGGTGCCGTACTTG |
| STK11_p.F354L-P1-R | ACGTTGGATGTCCTGAGTGTAGATGATGTC |
| PTEN_p.R130G-P1-F | ACGTTGGATGGCAGCAATTCACTGTAAAGC |
| PTEN_p.R130G-P1-R | ACGTTGGATGCCCGATGTAATAAATATGCAC |
| FGFR2_p.C382Y-P1-F | ACGTTGGATGTTACAGCTTCCCCAGACTAC |
| FGFR2_p.C382Y-P1-R | ACGTTGGATGCCACCATACAGGCGATTAAG |
| ALK_p.F1174ILV-P1-F | ACGTTGGATGTTGGTTACATCCCTCTCTGC |
| ALK_p.F1174ILV-P1-R | ACGTTGGATGATTGCAGGCTCACCCCAATG |
| ERBB2_p.V777LM-P1-F | ACGTTGGATGTTGTCCCCAGGAAGCATACG |
| ERBB2_p.V777LM-P1-R | ACGTTGGATGAGAAGGCGGGAGACATATGG |
| FGFR2_p.A648D-P1-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.A648D-P1-R | ACGTTGGATGGCCATCGACTTACATTGGTG |
| KRAS_p.G13CRS-P1-F | ACGTTGGATGAGGCCTGCTGAAAATGACTG |
| KRAS_p.G13CRS-P1-R | ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC |
| BRAF_p.V600ED-P1-F | ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG |
| BRAF_p.V600ED-P1-R | ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG |
| PIK3CA_p.E542KQ-P2-F | ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC |
| PIK3CA_p.E542KQ-P2-R | ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC |
| ALK_p.F1174L-P2-F | ACGTTGGATGTTGGTTACATCCCTCTCTGC |
| ALK_p.F1174L-P2-R | ACGTTGGATGATTGCAGGCTCACCCCAATG |
| FGFR2_p.S252W-P2-F | ACGTTGGATGTTCTTCCCTCTCTCCACCAG |
| FGFR2_p.S252W-P2-R | ACGTTGGATGACAAACTCTACGTCTCCTCC |
| EGFR_p.L747_A750>P-P2-F | ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC |
| EGFR_p.L747_A750>P-P2-R | ACGTTGGATGTTCCTTGTTGGCTTTCGGAG |
| BRAF_p.V600KR-P2-F | ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG |
| BRAF_p.V600KR-P2-R | ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG |
| EGBB2_p.V842I-P2-F | ACGTTGGATGGATGAGCTACCTGGAGGATG |
| EGBB2_p.V842I-P2-R | ACGTTGGATGACATGGTTGGGACTCTTGAC |
| FGFR3_p.G370C-P2-F | ACGTTGGATGCTCAACGCCCATGTCTTTGC |
| FGFR3_p.G370C-P2-R | ACGTTGGATGAGCTGAGGATGCCTGCATAC |
| PTEN_p.R173H-P2-F | ACGTTGGATGTCTGTCCACCAGGGAGTAAC |
| PTEN_p.R173H-P2-R | ACGTTGGATGGTGCCACTGGTCTATAATCC |
| BRAF_p.G469R-P2-F | ACGTTGGATGGGGACTCGAGTGATGATTGG |
| BRAF_p.G469R-P2-R | ACGTTGGATGCATGCCACTTTCCCTTGTAG |
| ALK_p.G1269A-P2-F | ACGTTGGATGAGAAACTGCCTCTTGACCTG |
| ALK_p.G1269A-P2-R | ACGTTGGATGACTCACCTGTAGATGTCTCG |
| EGFR_p.L747_E749delLRE-P3-F | ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC |
| EGFR_p.L747_E749delLRE-P3-R | ACGTTGGATGTTCCTTGTTGGCTTTCGGAG |
| ERBB2_p.A775_G776insYVMA-P3-F | ACGTTGGATGTCTCAGCGTACCCTTGTCC |
| ERBB2_p.A775_G776insYVMA-P3-R | ACGTTGGATGAGAAGGCGGGAGACATATGG |
| ALK_p.F1174SC-P3-F | ACGTTGGATGAAGATTTGCCCAGACTCAGC |
| ALK_p.F1174SC-P3-R | ACGTTGGATGTGCAGCGAACAATGTTCTGG |
[0018]
| ALK_p.R1275QL-P3-F | ACGTTGGATGTGGCCAAGATTGGAGACTTC |
| ALK_p.R1275QL-P3-R | ACGTTGGATGTGAGGCAGTCTTTACTCACC |
| PTEN_p.R130QPL-P3-F | ACGTTGGATGGCAGCAATTCACTGTAAAGC |
| PTEN_p.R130QPL-P3-R | ACGTTGGATGCCCGATGTAATAAATATGCAC |
| FGFR2_p.N549H-P3-F | ACGTTGGATGGACCTTTCTGATCTGGTGTC |
| FGFR2_p.N549H-P3-R | ACGTTGGATGCTACTCACCATCCTGTGTGC |
| PIK3CA_p.E542VAG-P3-F | ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC |
| PIK3CA_p.E542VAG-P3-R | ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC |
| FGFR2_p.A648T-P3-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.A648T-P3-R | ACGTTGGATGGCCATCGACTTACATTGGTG |
| AKT_p.E17K-P3-F | ACGTTGGATGTCTGACGGGTAGAGTGTGC |
| AKT_p.E17K-P3-R | ACGTTGGATGTTCTTGAGGAGGAAGTAGCG |
| MET_p.R988CS-P3-F | ACGTTGGATGCCATGATAGCCGTCTTTAAC |
| MET_p.R988CS-P3-R | ACGTTGGATGTGAGGAGTGTGTACTCTTGC |
| FGFR3_p.G380R-P4-F | ACGTTGGATGATGTCTTTGCAGCCGAGGAG |
| FGFR3_p.G380R-P4-R | ACGTTGGATGCAGGATGAACAGGAAGAAGC |
| EGFR_p.E746_T751>A-P4-F | ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC |
| EGFR_p.E746_T751>A-P4-R | ACGTTGGATGGATTTCCTTGTTGGCTTTCG |
| PIK3CA_p.E545KQ-P4-F | ACGTTGGATGTACACGAGATCCTCTCTCTG |
| PIK3CA_p.E545KQ-P4-R | ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC |
| FGFR2_p.M640I-P4-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.M640I-P4-R | ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC |
| MET_p.T1010I-P4-F | ACGTTGGATGGATAGGCTTGTAAGTGCCCG |
| MET_p.T1010I-P4-R | ACGTTGGATGGGAAAAGTAGCTCGGTAGTC |
| FGFR3_p.K650MT-P4-F | ACGTTGGATGACGTGCACAACCTCGACTAC |
| FGFR3_p.K650MT-P4-R | ACGTTGGATGAGGCGTCCTACTGGCATGA |
| KRAS_p.Q61H-P4-F | ACGTTGGATGTGGAGAAACCTGTCTCTTGG |
| KRAS_p.Q61H-P4-R | ACGTTGGATGCATGTACTGGTCCCTCATTG |
| FGFR2_p.N549K-P4-F | ACGTTGGATGGACCTTTCTGATCTGGTGTC |
| FGFR2_p.N549K-P4-R | ACGTTGGATGCTACTCACCATCCTGTGTGC |
| PIK3CA_p.H1047RL-P4-F | ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG |
| PIK3CA_p.H1047RL-P4-R | ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC |
| BRAF_p.V600ML-P4-F | ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG |
| BRAF_p.V600ML-P4-R | ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG |
| ERBB2_p.R678Q-P5-F | ACGTTGGATGTCTGCTGGTCGTGGTCTTG |
| ERBB2_p.R678Q-P5-R | ACGTTGGATGTCGTGTACTTCCGGATCTTC |
| ERBB2_p.S310FY-P5-F | ACGTTGGATGCAACTACCTTTCTACGGAC |
| ERBB2_p.S310FY-P5-R | ACGTTGGATGCTGTCACCTCTTGGTTGTGC |
| FGFR2_p.Y375C-P5-F | ACGTTGGATGTGTGATCTGCAATCTAGCG |
| FGFR2_p.Y375C-P5-R | ACGTTGGATGACAGGCGATTAAGAAGACCC |
| FGFR3_p.R248C-P5-F | ACGTTGGATGGGCCCCTGAGCGTCATCT |
| FGFR3_p.R248C-P5-R | ACGTTGGATGTTGCAGTGGAACTCCACGTC |
| ALK_p.F1245L-P5-F | ACGTTGGATGTGGCTGTCAGTATTTGGAG |
| ALK_p.F1245L-P5-R | ACGTTGGATGGAGCACAGTCACTTTGACTC |
| KRAS_p.G13DAV-P5-F | ACGTTGGATGGGCCTGCTGAAAATGACTG |
| KRAS_p.G13DAV-P5-R | ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC |
| FGFR2_p.M640V-P5-F | ACGTTGGATGATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.M640V-P5-R | ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC |
| MET_p.Y1253D-P5-F | ACGTTGGATGCTTGCCAGAGACATGTATG |
| MET_p.Y1253D-P5-R | ACGTTGGATGTCCAAAGCCATCCACTTCAC |
| EGFR_p.G719SC-P5-F | ACGTTGGATGCTCTTGAGGATCTTGAAGG |
| EGFR_p.G719SC-P5-R | ACGTTGGATGTTACCTTATACACCGTGCCG |
| BRAF_p.D594GVA-P5-F | ACGTTGGATGCTTCATGAAGACCTCACAG |
| BRAF_p.D594GVA-P5-R | ACGTTGGATGCCATCGAGATTTCACTGTAG |
| FGFR3_p.S371C-P6-F | ACGTTGGATGATGTCTTTGCAGCCGAGGAG |
| FGFR3_p.S371C-P6-R | ACGTTGGATGATGAACAGGAAGAAGCCCAC |
| STK11_p.P281L-P6-F | ACGTTGGATGTTTGAGAACATCGGGAAGGG |
| STK11_p.P281L-P6-R | ACGTTGGATGATGAGGCTCCCACCTTTCAG |
| FGFR3_p.S249C-P6-F | ACGTTGGATGTGAGCGTCATCTGCCCCCA |
[0019]
| FGFR3_p.S249C-P6-R | ACGTTGGATGTTGCAGTGGAACTCCACGTC |
| EGFR_p.E746_S752>V-P6-F | ACGTTGGATGTCTGGATCCCAGAAGGTGAG |
| EGFR_p.E746_S752>V-P6-R | ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC |
| FGFR2_p.P253R-P6-F | ACGTTGGATGTTCTTCCCTCTCTCCACCAG |
| FGFR2_p.P253R-P6-R | ACGTTGGATGACAAACTCTACGTCTCCTCC |
| FGFR2_p.C382R-P6-F | ACGTTGGATGTTACAGCTTCCCCAGACTAC |
| FGFR2_p.C382R-P6-R | ACGTTGGATGCCACCATACAGGCGATTAAG |
| ALK_p.F1245IV-P6-F | ACGTTGGATGGTGGCTGTCAGTATTTGGAG |
| ALK_p.F1245IV-P6-R | ACGTTGGATGGAGCACAGTCACTTTGACTC |
| KRAS_p.G12DVA-P6-F | ACGTTGGATGAGGCCTGCTGAAAATGACTG |
| KRAS_p.G12DVA-P6-R | ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC |
| FGFR2_p.I642V-P6-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.I642V-P6-R | ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC |
| MET_p.N375S-P6-F | ACGTTGGATGCCATGTGTGCATTCCCTATC |
| MET_p.N375S-P6-R | ACGTTGGATGTGGGTCCGTAAAAATGCTGG |
| EGFR_p.L861Q-P7-F | ACGTTGGATGAAACACCGCAGCATGTCAAG |
| EGFR_p.L861Q-P7-R | ACGTTGGATGCCTCCTTCTGCATGGTATTC |
| ALK_p.L1196M-P7-F | ACGTTGGATGACATTGTTCGCTGCATTGGG |
| ALK_p.L1196M-P7-R | ACGTTGGATGTCTCTCGGAGGAAGGACTTG |
| FGFR2_p.K659E-P7-F | ACGTTGGATGGACTCGCCAGAGATATCAAC |
| FGFR2_p.K659E-P7-R | ACGTTGGATGACTGTGTTACTGCCATCGAC |
| BRAF_p.G469AVE-P7-F | ACGTTGGATGGGGACTCGAGTGATGATTGG |
| BRAF_p.G469AVE-P7-R | ACGTTGGATGCATGCCACTTTCCCTTGTAG |
| PIK3CA_p.H1047Y-P7-F | ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG |
| PIK3CA_p.H1047Y-P7-R | ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC |
| STK11_p.D194YN-P7-F | ACGTTGGATGTGTGCACAAGGACATCAAGC |
| STK11_p.D194YN-P7-R | ACGTTGGATGCTAGCACGTGCCTACCTCG |
| EGFR_p.L747_P753>S-P7-F | ACGTTGGATGGTTAAAATTCCCGTCGCTATC |
| EGFR_p.L747_P753>S-P7-R | ACGTTGGATGAGCAGAAACTCACATCGAGG |
| FGFR1_p.S125L-P7-F | ACGTTGGATGTTCTTCCCATAGATGCTCTC |
| FGFR1_p.S125L-P7-R | ACGTTGGATGGCATACGGTTTGGTTTGGTG |
| PIK3CA_p.E545AGV-P7-F | ACGTTGGATGTACACGAGATCCTCTCTCTG |
| PIK3CA_p.E545AGV-P7-R | ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC |
| BRAF_p.L597RQP-P7-F | ACGTTGGATGTCCTTTACTTACTACACCTC |
| BRAF_p.L597RQP-P7-R | ACGTTGGATGCCACTCCATCGAGATTTCAC |
| EGFR_p.E746_A750delELREA-P8-F | ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC |
| EGFR_p.E746_A750delELREA-P8-R | ACGTTGGATGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG |
| FGFR3_p.Y373C-P8-F | ACGTTGGATGATGTCTTTGCAGCCGAGGAG |
| FGFR3_p.Y373C-P8-R | ACGTTGGATGATGAACAGGAAGAAGCCCAC |
| ALK_p.C1156Y-P8-F | ACGTTGGATGCTCTGTAGGCTGCAGTTCTC |
| ALK_p.C1156Y-P8-R | ACGTTGGATGCCATGAGGAAATCCAGTTCG |
| KRAS_p.G12CRS-P8-F | ACGTTGGATGAGGCCTGCTGAAAATGACTG |
| KRAS_p.G12CRS-P8-R | ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC |
| FGFR2_p.Y375H-P8-F | ACGTTGGATGCTGTGATCTGCAATCTAGCG |
| FGFR2_p.Y375H-P8-R | ACGTTGGATGACAGGCGATTAAGAAGACCC |
| BRAF_p.L597S-P8-F | ACGTTGGATGTCCTTTACTTACTACACCTC |
| BRAF_p.L597S-P8-R | ACGTTGGATGCCACTCCATCGAGATTTCAC |
| EGFR_p.L858R-P8-F | ACGTTGGATGAAACACCGCAGCATGTCAAG |
| EGFR_p.L858R-P8-R | ACGTTGGATGCCTCCTTCTGCATGGTATTC |
| PIK3CA_p.E545D-P8-F | ACGTTGGATGTACACGAGATCCTCTCTCTG |
| PIK3CA_p.E545D-P8-R | ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC |
| ALK_p.F1245C-P8-F | ACGTTGGATGGTGGCTGTCAGTATTTGGAG |
| ALK_p.F1245C-P8-R | ACGTTGGATGGAGCACAGTCACTTTGACTC |
| FGFR2_p.I642T-P8-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.I642T-P8-R | ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC |
| ERBB2_p.L755S-P9-F | ACGTTGGATGTGAAAATTCCAGTGGCCATC |
| ERBB2_p.L755S-P9-R | ACGTTGGATGGGGCTTACGTCTAAGATTTC |
| FGFR3_p.G697C-P9-F | ACGTTGGATGTGCTCTGGGAGATCTTCACG |
| FGFR3_p.G697C-P9-R | ACGTTGGATGTCCTTCAGCAGCTTGAAGAG |
[0020]
| EGFR_p.T790M-P9-F | ACGTTGGATGATCTGCCTCACCTCCACCGT |
| EGFR_p.T790M-P9-R | ACGTTGGATGTGTTCCCGGACATAGTCCAG |
| BRAF_p.V600EAG-P9-F | ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG |
| BRAF_p.V600EAG-P9-R | ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG |
| FGFR1_p.T141A-P9-F | ACGTTGGATGTCTTCCCATAGATGCTCTCC |
| FGFR1_p.T141A-P9-R | ACGTTGGATGGCATACGGTTTGGTTTGGTG |
| FGFR2_p.I642M-P9-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.I642M-P9-R | ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC |
| EGFR_p.L747_S752delLREATS-P9-F | ACGTTGGATGTCTGGATCCCAGAAGGTGAG |
| EGFR_p.L747_S752delLREATS-P9-R | ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC |
| EGFR_p.E746_A750delELREA-P10-F | ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC |
| EGFR_p.E746_A750delELREA-P10-R | ACGTTGGATGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG |
| FGFR3_p.K650EQ-P10-F | ACGTTGGATGACGTGCACAACCTCGACTAC |
| FGFR3_p.K650EQ-P10-R | ACGTTGGATGAGGCGTCCTACTGGCATGA |
| FGFR3_p.A391EV-P10-F | ACGTTGGATGGCTTCTTCCTGTTCATCCTG |
| FGFR3_p.A391EV-P10-R | ACGTTGGATGAGATCTTGTGCACGGTGGG |
| BRAF_p.D594NH-P10-F | ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG |
| BRAF_p.D594NH-P10-R | ACGTTGGATGCCATCGAGATTTCACTGTAG |
| ERBB2_p.D769YHN-P10-F | ACGTTGGATGGAAAACACATCCCCCAAAGC |
| ERBB2_p.D769YHN-P10-R | ACGTTGGATGTCCTTCCTGTCCTCCTAGC |
| FGFR1_p.K656E-P10-F | ACGTTGGATGACATTCACCACATCGACTAC |
| FGFR1_p.K656E-P10-R | ACGTTGGATGTCTCAGATGAAACCACCAGC |
| FGFR2_p.N549S-P11-F | ACGTTGGATGGACCTTTCTGATCTGGTGTC |
| FGFR2_p.N549S-P11-R | ACGTTGGATGCTACTCACCATCCTGTGTGC |
| EGFR_p.G719DA-P11-F | ACGTTGGATGTCTCTTGAGGATCTTGAAGG |
| EGFR_p.G719DA-P11-R | ACGTTGGATGTTACCTTATACACCGTGCCG |
| FGFR2_p.M640T-P11-F | ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG |
| FGFR2_p.M640T-P11-R | ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC |
| BRAF_p.L597V-P11-F | ACGTTGGATGTCCTTTACTTACTACACCTC |
| BRAF_p.L597V-P11-R | ACGTTGGATGCCACTCCATCGAGATTTCAC |
| PTEN_p.R173C-P11-F | ACGTTGGATGTCTGTCCACCAGGGAGTAAC |
| PTEN_p.R173C-P11-R | ACGTTGGATGGTGCCACTGGTCTATAATCC |
| EGFR_p.L747_T751delLREAT-P12-F | ACGTTGGATGGTTAAAATTCCCGTCGCTATC |
| EGFR_p.L747_T751delLREAT-P12-R | ACGTTGGATGCAAAGCAGAAACTCACATCG |
表2延伸引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| EGFR_p.L747_T751delLREAT-E1 | CGTCGCTATCAAGGAAT |
| FGFR1_p.S125P-E1 | ATAGATGCTCTCCCCTCC |
| STK11_p.F354L-E1-F | TGATGTCATCCTCGATGTC |
| PTEN_p.R130G-E1 | CTGTAAAGCTGGAAAGGGA |
| FGFR2_p.C382Y-E1 | GCGATTAAGAAGACCCCTATG |
| ALK_p.F1174ILV-E1 | TCCCTCTCTGCTCTGCAGCAAA |
| ERBB2_p.V777LM-E1 | AGGAAGCATACGTGATGGCTGGT |
| FGFR2_p.A648D-E1 | TAGTCTATATTGTTGATATCTCTG |
| KRAS_p.G13CRS-E1 | TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT |
| BRAF_p.V600ED-E1 | TGATGGGACCCACTCCATCGAGATTT |
| PIK3CA_p.E542KQ-E2 | CACGAGATCCTCTCTCT |
| ALK_p.F1174L-E2 | ACAATGTTCTGGTGGTT |
| FGFR2_p.S252W-E2 | AGGATGGGCCGGTGAGGC |
| EGFR_p.L747_A750>P-E2 | TCCCGTCGCTATCAAGGAA |
| BRAF_p.V600KR-E2 | GACCCACTCCATCGAGATTTC |
| EGBB2_p.V842I-E2 | TACCTGGAGGATGTGCGGCTC |
| FGFR3_p.G370C-E2 | GCTGGTGGAGGCTGACGAGGCG |
| PTEN_p.R173H-E2 | AGTAACTATTCCCAGTCAGAGGC |
| BRAF_p.G469R-E2 | CAAAGAATTGGATCTGGATCATTT |
| ALK_p.G1269A-E2 | GGCCCTGGAAGAGTGGCCAAGATTG |
| EGFR_p.L747_E749delLRE-E3 | CCGTCGCTATCAAGGAA |
| ERBB2_p.A775_G776insYVMA-E3 | GGAAGCATACGTGATGGC |
[0023]
| ALK_p.F1174SC-E3 | TCTCTGCTCTGCAGCAAAT |
| ALK_p.R1275QL-E3 | TGGAGACTTCGGGATGGCCC |
| PTEN_p.R130QPL-E3 | GCACATATCATTACACCAGTT |
| FGFR2_p.N549H-E3 | TGGGAAACACAAGAATATCATA |
| PIK3CA_p.E542VAG-E3 | AATCTTTCTCCTGCTCAGTGATT |
| FGFR2_p.A648T-E3 | ATGAAAATAGCAGACTTTGGACTC |
| AKT_p.E17K-E3 | TCTCACCACCCGCACGTCTGTAGGG |
| MET_p.R988CS-E3 | AGGAGTGTGTACTCTTGCATCGTAGC |
| FGFR3_p.G380R-E4 | CAGGCATCCTCAGCTAC |
| EGFR_p.E746_T751>A-E4 | GTTGGCTTTCGGAGATG |
| PIK3CA_p.E545KQ-E4 | TCCTCTCTCTGAAATCACT |
| FGFR2_p.M640I-E4 | AGTCCAAAGTCTGCTATTTT |
| MET_p.T1010I-E4 | TTCATTTGAAACCATTTCTGTA |
| FGFR3_p.K650MT-E4 | GGCCGGGCTCACGTTGGTTGTC |
| KRAS_p.Q61H-E4 | GTCCCTCATTGCACTGTACTCCTC |
| FGFR2_p.N549K-E4 | ATCCTGTGTGCAGGCTCCAAGAAG |
| PIK3CA_p.H1047RL-E4 | CCATTTTTGTTGTCCAGCCACCATGA |
| BRAF_p.V600ML-E4 | AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA |
| ERBB2_p.R678Q-E5 | GATCCTCATCAAGCGAC |
| ERBB2_p.S310FY-E5 | GGCAGACGAGGGTGCAG |
| FGFR2_p.Y375C-E5 | TAAATGGCTATCTCCAGG |
| FGFR3_p.R248C-E5 | ATGGGCCGGTGCGGGGAGC |
| ALK_p.F1245L-E5 | ACTTTGACTCACCGGTGGAT |
| KRAS_p.G13DAV-E5 | CGTCAAGGCACTCTTGCCTACG |
| FGFR2_p.M640V-E5 | TTTGGTAACAGAAAACAATGTG |
| MET_p.Y1253D-E5 | CACCTGTTTTGTTGTGTACACTAT |
| EGFR_p.G719SC-E5 | GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG |
| BRAF_p.D594GVA-E5-F | GAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAA |
| FGFR3_p.S371C-E6 | GATGCCTGCATACACAC |
| STK11_p.P281L-E6 | TTCAGCAGGTCAGAGAGC |
| FGFR3_p.S249C-E6 | CAGGATGGGCCGGTGCGGG |
| EGFR_p.E746_S752>V-E6 | TTTCCTTGTTGGCTTTCGGA |
| FGFR2_p.P253R-E6 | GCTTGGAGGATGGGCCGGTGA |
| FGFR2_p.C382R-E6 | CTACCTGGAGATAGCCATTTAC |
| ALK_p.F1245IV-E6 | GTCAGTATTTGGAGGAAAACCAC |
| KRAS_p.G12DVA-E6 | GTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCA |
| FGFR2_p.I642V-E6 | GGTAACAGAAAACAATGTGATGAAA |
| MET_p.N375S-E6 | TCACATTGTTTTTGTTGACGATCTTG |
| EGFR_p.L861Q-E7 | TTTTGGGCTGGCCAAAC |
| ALK_p.L1196M-E7 | CCCCCGCCATGAGCTCCA |
| FGFR2_p.K659E-E7 | CGACTTACATTGGTGGTCT |
| BRAF_p.G469AVE-E7 | CACTTTCCCTTGTAGACTGTT |
| PIK3CA_p.H1047Y-E7 | ATGAAACAAATGAATGATGCA |
| STK11_p.D194YN-E7 | CCGGTGGCACCCTCAAAATCTCC |
| EGFR_p.L747_P753>S-E7 | GAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCG |
| FGFR1_p.S125L-E7 | GTCATCATCATCATCATCATCCTCC |
| PIK3CA_p.E545AGV-E7 | GACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGC |
| BRAF_p.L597RQP-E7 | CACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTC |
| EGFR_p.E746_A750delELREA-E8 | ATTCCCGTCGCTATCAA |
| FGFR3_p.Y373C-E8 | AGCTGAGGATGCCTGCA |
| ALK_p.C1156Y-E8 | CAGTTCGTCCTGTTCAGAG |
| KRAS_p.G12CRS-E8 | AACTTGTGGTAGTTGGAGCT |
| FGFR2_p.Y375H-E8 | GAGATTACAGCTTCCCCAGAC |
| BRAF_p.L597S-E8 | AGTAAAAATAGGTGATTTTGGT |
| EGFR_p.L858R-E8 | ATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC |
| PIK3CA_p.E545D-E8 | GACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTG |
| ALK_p.F1245C-E8 | CAGTCACTTTGACTCACCGGTGGATG |
| FGFR2_p.I642T-E8 | GGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAA |
| ERBB2_p.L755S-E9 | AGTGGCCATCAAAGTGT |
[0024]
| FGFR3_p.G697C-E9 | GGGGGCTCCCCGTACCCCG |
| EGFR_p.T790M-E9 | AGCCGAAGGGCATGAGCTGC |
| BRAF_p.V600EAG-E9 | GACCCACTCCATCGAGATTTC |
| FGFR1_p.T141A-E9 | CGGTTTGGTTTGGTGTTATCTG |
| FGFR2_p.I642M-E9 | ATCTCTGGCGAGTCCAAAGTCTGC |
| EGFR_p.L747_S752delLREATS-E9 | TTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAA |
| EGFR_p.E746_A750delELREA-E10 | TTCCCGTCGCTATCAAG |
| FGFR3_p.K650EQ-E10 | CAACCTCGACTACTACAAG |
| FGFR3_p.A391EV-E10 | GCGGCAGAGCGTCACAGCC |
| BRAF_p.D594NH-E10 | GACCTCACAGTAAAAATAGGT |
| ERBB2_p.D769YHN-E10 | CCAAAGCCAACAAAGAAATCTTA |
| FGFR1_p.K656E-E10 | TTGTCGGCACTCACGTTGGTTGTCT |
| FGFR2_p.N549S-E11 | TGCAGGCTCCAAGAAGA |
| EGFR_p.G719DA-E11 | CGTGCCGAACGCACCGGAG |
| FGFR2_p.M640T-E11 | TGGTAACAGAAAACAATGTGA |
| BRAF_p.L597V-E11 | CAGTAAAAATAGGTGATTTTGGT |
| PTEN_p.R173C-E11 | GGGAGTAACTATTCCCAGTCAGAGG |
| EGFR_p.L747_T751delLREAT-E12 | CGTCGCTATCAAGGAAT |
步骤(2)中所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增引物的浓度为0.5μM；
步骤(2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
第1管：如SEQIDNO.199～SEQIDNO.208所示的延伸引物的摩尔比为7.04：7.36：8.05：8.30：9.10：9.34：10.12：10.35：10.91：11.11；
第2管：如SEQIDNO.209～SEQIDNO.218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83：7.11：7.84：8.05：8.93：9.16：9.76：9.94：10.42：10.90；
第3管：如SEQIDNO.219～SEQIDNO.228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01：7.74：7.99：8.69：8.96：9.60：9.84：10.41：10.66：11.20；
第4管：如SEQIDNO.229～SEQIDNO.238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89：7.18：7.89：8.55：9.44：9.58：10.15：10.40：11.02：11.20；
第5管：如SEQIDNO.239～SEQIDNO.248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.28：7.59：8.34：8.59：9.44：9.63：10.30：10.45：11.16；
第6管：如SEQIDNO.249～SEQIDNO.258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.67：8.34：8.57：9.31：9.47：10.03：10.26：10.91：11.11；
第7管：如SEQIDNO.259～SEQIDNO.268所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05：7.35：8.11：8.95：9.18：9.80：9.99：10.52：11.01：11.22；
第8管：如SEQIDNO.269～SEQIDNO.278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87：7.12：8.09：8.74：9.00：9.69：10.42：10.65：11.13：11.29；
第9管：如SEQIDNO.279～SEQIDNO.285所示的延伸引物的浓度分别依次为7.11：8.04：8.72：8.93：9.63：10.34：11.10；
第10管：如SEQIDNO.286～SEQIDNO.291所示的延伸引物的浓度分别依次为6.90：7.97：8.14：9.11：9.90：10.74；
第11管：如SEQIDNO.292～SEQIDNO.296所示的延伸引物的浓度分别依次为7.10：8.14：9.20：10.09：10.85；
步骤(2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物的浓度优选为如表3所示；
表3延伸引物浓度
步骤(3)中所述的PCR的体系优选为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl2(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、人肺组织基因组(10ng/μl)2μl，水补足5μl；
步骤(3)中所述的PCR的条件优选为：94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟；
步骤(4)中所述的消化的体系为：在PCR产物中加入核酸外切酶SAP0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl；
步骤(4)中所述的消化的条件优选为：37℃40分钟，85℃5分钟；
步骤(5)中所述的延伸反应的体系优选为：在消化后得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0.804μl、H2O补足至9μl；
步骤(5)中所述的延伸反应的条件优选为：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环；72℃3分钟。
步骤(6)中：当使用96孔板操作时，将延伸反应后的产物9μl、水41μl和清洁树脂(CleanResin)15mg混合；当使用384孔板操作时，将延伸反应后的产物9μl、水16μl和清洁树脂6mg混合；
步骤(6)中所述的脱盐去离子防干扰处理的时间优选为30～60分钟；
步骤(6)中所述的离心的条件优选为3200g离心5分钟。
一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，为依据上述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒设计得到，能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包含如表1所示的扩增引物和表2所示的延伸引物：
所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，优选包含12管扩增引物混合物、11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物；扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R的引物混合得到第1管引物混合物，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R的引物混合得到第2管引物混合物，类推，为12管；按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管；
所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增引物的浓度为0.5μM；
所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：
第1管：如SEQIDNO.199～SEQIDNO.208所示的延伸引物的摩尔比为7.04：7.36：8.05：8.30：9.10：9.34：10.12：10.35：10.91：11.11；
第2管：如SEQIDNO.209～SEQIDNO.218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83：7.11：7.84：8.05：8.93：9.16：9.76：9.94：10.42：10.90；
第3管：如SEQIDNO.219～SEQIDNO.228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01：7.74：7.99：8.69：8.96：9.60：9.84：10.41：10.66：11.20；
第4管：如SEQIDNO.229～SEQIDNO.238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89：7.18：7.89：8.55：9.44：9.58：10.15：10.40：11.02：11.20；
第5管：如SEQIDNO.239～SEQIDNO.248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.28：7.59：8.34：8.59：9.44：9.63：10.30：10.45：11.16；
第6管：如SEQIDNO.249～SEQIDNO.258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.67：8.34：8.57：9.31：9.47：10.03：10.26：10.91：11.11；
第7管：如SEQIDNO.259～SEQIDNO.268所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05：7.35：8.11：8.95：9.18：9.80：9.99：10.52：11.01：11.22；
第8管：如SEQIDNO.269～SEQIDNO.278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87：7.12：8.09：8.74：9.00：9.69：10.42：10.65：11.13：11.29；
第9管：如SEQIDNO.279～SEQIDNO.285所示的延伸引物的浓度分别依次为7.11：8.04：8.72：8.93：9.63：10.34：11.10；
第10管：如SEQIDNO.286～SEQIDNO.291所示的延伸引物的浓度分别依次为6.90：7.97：8.14：9.11：9.90：10.74；
第11管：如SEQIDNO.292～SEQIDNO.296所示的延伸引物的浓度分别依次为7.10：8.14：9.20：10.09：10.85；
所述的延伸引物混合物和所述的单独延伸引物中延伸引物的浓度更优选为如表3所示；
所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒还包括清洁树脂和PCR用酶试剂中的一种或两种。
所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液等。
所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒的应用，包含如下步骤：
(1)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，扩增引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将每条扩增引物配制成浓度为10μM的引物溶液后，再按分组进行混合，得到12管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM；以人肺组织基因组为模板，将12组扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物；
PCR的条件为：94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟；
PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl2(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、人肺组织基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl；
(2)将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl；消化的条件为：37℃40分钟，85℃5分钟；
(3)按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管，按表3将延伸引物配制成11管延伸引物混合液和1管单独延伸引物溶液；在步骤(2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推；延伸反应的体系为：在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液或单独延伸引物溶液0.804μl、H2O补足至9μl；延伸反应的条件为：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环；72℃3分钟；
(4)使用96孔板操作时，将步骤(3)获得产物9μl、水41μl和清洁树脂(CleanResin)15mg混合；使用384孔板操作时，将步骤(3)获得产物9μl、水16μl和清洁树脂6mg混合；旋转96孔板或384孔板30～60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；对上清进行分析；
(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供的检测试剂盒考虑了欧美人群与亚洲人群肺癌基因谱的差异性，检测基因更前沿，并纳入了多个与肺癌靶向治疗耐药相关的位点，检测结果将为优化个体化诊疗分子分型，筛查技术方案以及靶向治疗耐药的后续治疗和研究提供依据。
(2)本发明提供的检测试剂盒自主研发，在价格上存在优势，降低了患者的临床检测费用，可转化研究应用于临床，产生经济效益和优化临床资源配置。
(3)本发明提供的检测试剂盒以96或384孔板多重反应分析为基础，具有高通量性，可同时检测13个基因的99个位点。改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势。具有在肺癌的穿刺活检小样本中实现“单个小样本多基因的检测”，满足小样本最大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。
(4)本发明提供的检测试剂盒进行的PCR反应产物片段短，不仅可在新鲜组织样本中进行检测，还可在石蜡组织、胸水等疑难样本中进行检测。
(5)本发明提供的检测试剂盒基于MassARRAY平台具有质谱的高准确性与高敏感性，并在石蜡样本残存DNA样本中检测结果稳定，较Sanger测序法具有明显优势，提高了检测阳性率。
附图说明
图1为使用本发明试剂盒检测K1747T肺癌组织样本得到FGFR2_N549H的结果图；
其中，横坐标表示延伸产物(或延伸引物)的分组量大小；纵坐标表示质谱强度，下同。
图2为检测K1736T肺癌组织样本得到的EGFR_L858R、MET_N375S突变结果图；
其中，A为LungCarta检测EGFR_L858R突变G分子量为6139.00；
B为LungCarta检测MET_N375S突变G分子量为7253.80；
C为本发明试剂盒检测EGFR_L858R突变G分子量为7679.00；
D为本发明试剂盒检测MET_N375S突变G分子量为8195.40。
图3为检测K1744T肺癌组织样本得到的EGFR_Exon19del突变结果图；
其中，A为LungCarta检测EGFR_Exon19del分子量为5376.50；
B为本发明试剂盒检测EGFR_2235_2249del15分子量为5376.50。
图4为检测K1748T肺癌组织样本得到的结果图；
其中，A为LungCarta检测STK11_F354L突变G分子量为8239.40；
B为本发明试剂盒检测STK11_F354L突变G分子量为6016.90。
图5为延伸引物浓度对第9孔检测结果质谱峰的影响的结果图；
其中，A为优化延伸引物后的检测质谱图；
B为优化延伸引物前的检查质谱图。
图6为树脂量对第10孔检测结果质谱峰的影响图；
其中，A为优化树脂量后的检测质谱图；
B为优化树脂量前的检测质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1肺癌多基因谱检测引物试剂盒的制备
1、确定肺癌相关驱动基因或靶向耐药基因：通过网络检索PUBMED数据库，查阅最新文献，统计与中国人群肺癌发病机理、化放疗、靶向耐药以及转移等相关的靶向基因或其平行、相邻通路基因，确定纳入试剂盒的基因(13个)如下：EGFR(NM_005228)、KRAS(NM_033360)、ALK(NM_004304)、FGFR1(NM_023110.2)、FGFR2(NM_000141.2)、FGFR3(NM_000142.4)、PIK3CA(NM_006218.2)、BRAF(NM_004333.4)、PTEN(NM_000314.4)、MET(NM_001127500.1)、ERBB2(NM_004448)、AKT1(NM_005163)、STK11(NM_000455.4)。
2、筛选目的基因的热点变异位点：在COSMIC数据库中查询上述13个基因的COSMIC基因号分别为EGFR(ENST00000275493)、KRAS(ENST00000256078)、ALK(ENST00000389048)、FGFR1(ENST00000447712)、FGFR2(ENST00000358487)、FGFR3(ENST00000440486)、PIK3CA(ENST00000263967)、BRAF(ENST00000288602)、PTEN(ENST00000371953)、MET(ENST00000318493)、ERBB2(ENST00000269571)、AKT1(ENST00000349310)、STK11(ENST00000326873)。查询上述基因在肿瘤中的热点变异位点，结合国内外研究进展以及本申请发明人的前期研究成果，共确定99个与驱动肺癌发生以及耐药相关的碱基位点以及相应的氨基酸位点(见表4)。
表4引物试剂盒包含检测基因的蛋白变异位点
3、软件设计多重引物文档：在PUBMED数据库查询纳入试剂盒13个基因的基因组gDNA序列，分别为EGFR(NG_007726.3)、KRAS(NG_007524.2)、ALK(NG_009445.1)、FGFR1(NG_007729)、FGFR2(NG_012449.1)、FGFR3(NG_012632.1)、PIK3C(NG_012113.2)、BRAF(NG_007873.3)、PTEN(NG_007466.2)、MET(NG_008996.1)、ERBB2(NG_007503.1)、AKT1(NG_012188.1)、STK11(NG_007460.2)。根据COSMIC中基因的CDS序列在gDNA序列中标记变异位点，并根据SEQUENOM公司突变标示方式，将变异位点侧翼约200个碱基拷贝到引物设计固定格式文本中设计引物。
4、多重引物设计：通过MassARRAY网站ADS(AssayDesignSuite)引物设计软件，运行第3步变异位点序列的文档，调整相关参数，将13个基因99个位点全部纳入引物设计试剂盒。共设计297条引物，99条正向、99条反向PCR引物和99条延伸引物。依据延伸产物的长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到目标产物，将297条引物分别分布在12孔里面，PCR引物(如表1所示)的分组以表1中的扩增引物进行分组，引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；延伸引物的分组以表2中的延伸引物进行分组，引物名称末尾为E1为第1组，引物名称末尾为E2为第2组，类推，分为12组。12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。
5、多重引物的合成与配制(试剂盒制备)：在上海生工生物工程有限公司合成ADS软件导出的297条引物，并进行配制：(1)PCR引物先稀释成10μM，然后工作液以每条引物浓度为0.5μM进行混合，得到扩增引物混合液，共12管(每管包括正、反向引物)；(2)延伸引物先稀释成500μM，然后根据每一条延伸引物的分子量，按相应体积(如表3)进行混合，得到延伸引物混合液，共12管。
实施例2使用实施例1的试剂盒检测肺癌细胞株
1、选用已知突变位点的H460、PC9、H1650、H1975、A549、GLC82、HCC827、H1299的8个肺癌细胞株(均能从ATCC购买得到)进行本试剂盒的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(来源于就诊广东省人民医院的正常人的包皮组织提取得到)做为阴性对照，水(H2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA120ng，即10ng/孔×12孔。本发明试剂盒的操作如下：
(1)PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl2(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、肺癌组织样本基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl。94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟。
(2)在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl。37℃40分钟，85℃5分钟，将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化。
(3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液0.804μl、H2O补足至9μl。94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环；72℃3分钟，进行延伸反应。
(4)将步骤(3)获得产物中加入水41μl，清洁树脂(CleanResin)15mg(96孔板)或者加入水16μl，清洁树脂6mg(384孔板)，旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；
(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。
2、建立方法检测8例肺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(www.atcc.org)细胞株的变异情况一致，具体基因的变异蛋白与碱基位点结果如表5。其中由于本发明试剂盒不包含PTEN缺失位点，因此未检测到H1650细胞株的PTEN缺失。阴性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本试剂盒具有可行性。
表5本发明试剂盒在肺癌细胞株检测的验证结果
实施例3使用实施例1的试剂盒检测肺癌患者组织样本
1、验证选用已经使用LungCarta试剂盒检测出突变的3例人肺腺癌组织样(来自广东省人民医院)以及未检测出突变的3例肺癌组织样本(来自广东省人民医院)，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)做为阴性对照，水(H2O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA120ng，即10ng/孔×12孔。其中，LungCarta试剂盒按其说明书操作。本发明试剂盒的操作如下：
(1)PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl2(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、肺癌组织样本基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl。94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟。
(2)在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl。37℃40分钟，85℃5分钟，将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化。
(3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液0.804μl、H2O补足至9μl。：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环；72℃3分钟，进行延伸反应。
(4)将步骤(3)获得产物中加入水41μl，清洁树脂(CleanResin)15mg(96孔板)或者加入水16μl，清洁树脂6mg(384孔板)，旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；
(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。
2、本发明试剂盒检测6例肺癌组织样本，与LungCarta试剂盒检测结果比较(见表6)。使用本发明试剂盒在1例使用LungCarta试剂盒检测未发现突变的K1747T样本中检测到FGFR2基因的突变(N549位点野生型A碱基分子量为7055.7；突变C碱基分子量为7031.6，见图1)，在其它组织样本中与LungCarta试剂盒检测结果完全一致(图2～4)。FGFR2基因是肿瘤治疗的新靶点，本试剂盒包含此新突变位点，而LungCarta试剂盒未含此突变位点，表明本试剂盒具有前沿优势，可为临床患者提供更准确的基因变异信息。阴性对照以及空白对照均没有检测到变异，表明本试剂盒具有可行性。
表6本发明试剂盒与LungCarta试剂盒比较的验证结果
实施例4本发明试剂盒与直接测序法比较
选取100例肺癌组织样本使用本发明试剂盒进行检测，与本研究所已经建立的EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF直接测序法比较敏感性与特异性。直接测序法按ABI3730测序仪标准操作流程进行。本发明试剂盒灵敏度为100％，特异度为96.3％，阳性预测值为95.8％，阴性预测值为100％(见表7)。结果显示本发明试剂盒具有高灵敏度，与直接测序法比较特异度为96.3％，可能与质谱的高敏感性相关，可弥补直接测序法低敏感度导致的假阴性。
表7本发明试剂盒的灵敏度与特异度
对比例1：
操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别仅在于：E9组延伸引物的浓度有变化，具体为FGFR1_T141A由9.63μM变为3.21μM，其他六个延伸引物浓度不变。结果显示FGFR1_T141A的电泳峰明显降低，如图5所示。本对比例旨在说明，在其他条件不变的情况下，延伸引物的混合物中，各个引物成分的浓度比例是实验成败的一个关键因素。
该对比例说明，在进行多重PCR及延伸反应时，引物混合物中，各种引物之间存在着相互竞争作用，某些引物的反应效率高以及受分子量大小影响，产生的峰形较高，但有些引物效率则受到抑制，所以引物混合中各种引物的浓度和比例对结果影响很大，需要不断调整，获得最佳引物浓度比例。
对比例2：
操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别仅在于：建立应用方法的第4步在96孔板操作时清洁树脂(CleanResin)每孔加入由15mg变为10mg。结果显示在每个反应的主峰后面约40分子量大小处形成一个K+副峰，干扰结果判读，如图6所示为反应第十孔6重反应6个主峰后面均含有1个副峰。本对比例旨在说明，在其他条件不变的情况下，在树脂的脱离子(K+、Na+等)作用下对质谱结果的影响，树脂加入量的多少是实验成败的一个关键因素。
该对比例说明，在点样芯片进行质谱扫描前，应该对产物进行充分的脱离子处理，调整树脂到合适量，否则将会在产物主峰的后面形成副峰，严重干扰结果判读。所以考虑树脂量对结果的影响比较大，需要调整加入合适量的树脂，在芯片点样前将样本充分脱盐，减少离子对结果的影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：包含如SEQIDNO.1～SEQIDNO.198所示的扩增引物和如SEQIDNO.199～SEQIDNO.297所示的延伸引物。
2.根据权利要求1所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：包含12管扩增引物混合物、11管延伸引物混合物和1管单独延伸引物；
第1管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.20所示，第2管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.21～SEQIDNO.40所示，第3管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.41～SEQIDNO.60所示，第4管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.61～SEQIDNO.80所示，第5管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.81～SEQIDNO.100所示，第6管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.101～SEQIDNO.120所示，第7管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.121～SEQIDNO.140所示，第8管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.141～SEQIDNO.160所示，第9管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.161～SEQIDNO.174所示，第10管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.175～SEQIDNO.186所示，第11管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.187～SEQIDNO.196所示，第12管扩增引物混合物中的扩增引物序列如SEQIDNO.197～SEQIDNO.198所示；
第1管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.199～SEQIDNO.208所示，第2管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.209～SEQIDNO.218所示，第3管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.219～SEQIDNO.228所示，第4管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.229～SEQIDNO.238所示，第5管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.239～SEQIDNO.248所示，第6管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.249～SEQIDNO.258所示，第7管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.259～SEQIDNO.268所示，第8管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.269～SEQIDNO.278所示，第9管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.279～SEQIDNO.285所示，第10管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.286～SEQIDNO.291所示，第11管延伸引物混合物中的延伸引物序列如SEQIDNO.292～SEQIDNO.296所示；
所述的单独延伸引物中的延伸引物序列如SEQIDNO.297所示。
3.根据权利要求2所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：
所述的扩增引物混合物中的扩增引物为按等摩尔比混合；
所述的延伸引物混合物中延伸引物为按如下摩尔比混合：
第1管：如SEQIDNO.199～SEQIDNO.208所示的延伸引物的摩尔比为7.04：7.36：8.05：8.30：9.10：9.34：10.12：10.35：10.91：11.11；
第2管：如SEQIDNO.209～SEQIDNO.218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83：7.11：7.84：8.05：8.93：9.16：9.76：9.94：10.42：10.90；
第3管：如SEQIDNO.219～SEQIDNO.228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01：7.74：7.99：8.69：8.96：9.60：9.84：10.41：10.66：11.20；
第4管：如SEQIDNO.229～SEQIDNO.238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89：7.18：7.89：8.55：9.44：9.58：10.15：10.40：11.02：11.20；
第5管：如SEQIDNO.239～SEQIDNO.248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.28：7.59：8.34：8.59：9.44：9.63：10.30：10.45：11.16；
第6管：如SEQIDNO.249～SEQIDNO.258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.67：8.34：8.57：9.31：9.47：10.03：10.26：10.91：11.11；
第7管：如SEQIDNO.259～SEQIDNO.268所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05：7.35：8.11：8.95：9.18：9.80：9.99：10.52：11.01：11.22；
第8管：如SEQIDNO.269～SEQIDNO.278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87：7.12：8.09：8.74：9.00：9.69：10.42：10.65：11.13：11.29；
第9管：如SEQIDNO.279～SEQIDNO.285所示的延伸引物的浓度分别依次为7.11：8.04：8.72：8.93：9.63：10.34：11.10；
第10管：如SEQIDNO.286～SEQIDNO.291所示的延伸引物的浓度分别依次为6.90：7.97：8.14：9.11：9.90：10.74；
第11管：如SEQIDNO.292～SEQIDNO.296所示的延伸引物的浓度分别依次为7.10：8.14：9.20：10.09：10.85。
4.根据权利要求2所述基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：
所述的扩增引物混合物中的每条引物的浓度为0.5μM；
所述的延伸引物混合物中的每条延伸引物的浓度如下：
第1管：如SEQIDNO.199～SEQIDNO.208所示的延伸引物的浓度分别依次为7.04μM、7.36μM、8.05μM、8.30μM、9.10μM、9.34μM、10.12μM、10.35μM、10.91μM、11.11μM；
第2管：如SEQIDNO.209～SEQIDNO.218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83μM、7.11μM、7.84μM、8.05μM、8.93μM、9.16μM、9.76μM、9.94μM、10.42μM、10.90μM；
第3管：如SEQIDNO.219～SEQIDNO.228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01μM、7.74μM、7.99μM、8.69μM、8.96μM、9.60μM、9.84μM、10.41μM、10.66μM、11.20μM；
第4管：如SEQIDNO.229～SEQIDNO.238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89μM、7.18μM、7.89μM、8.55μM、9.44μM、9.58μM、10.15μM、10.40μM、11.02μM、11.20μM；
第5管：如SEQIDNO.239～SEQIDNO.248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94μM、7.28μM、7.59μM、8.34μM、8.59μM、9.44μM、9.63μM、10.30μM、10.45μM、11.16μM；
第6管：如SEQIDNO.249～SEQIDNO.258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94μM、7.67μM、8.34μM、8.57μM、9.31μM、9.47μM、10.03μM、10.26μM、10.91μM、11.11μM；
第7管：如SEQIDNO.259～SEQIDNO.268所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05μM、7.35μM、8.11μM、8.95μM、9.18μM、9.80μM、9.99μM、10.52μM、11.01μM、11.22μM；
第8管：如SEQIDNO.269～SEQIDNO.278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87μM、7.12μM、8.09μM、8.74μM、9.00μM、9.69μM、10.42μM、10.65μM、11.13μM、11.29μM；
第9管：如SEQIDNO.279～SEQIDNO.285所示的延伸引物的浓度分别依次为7.11μM、8.04μM、8.72μM、8.93μM、9.63μM、10.34μM、11.10μM；
第10管：如SEQIDNO.286～SEQIDNO.291所示的延伸引物的浓度分别依次为6.90μM、7.97μM、8.14μM、9.11μM、9.90μM、10.74μM；
第11管：如SEQIDNO.292～SEQIDNO.296所示的延伸引物的浓度分别依次为7.10μM、8.14μM、9.20μM、10.09μM、10.85μM；
所述的单独延伸引物中的的延伸引物的浓度为7.04μM。
5.根据权利要求1～4任一项所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：还包括清洁树脂和PCR用酶试剂中的一种或两种。
6.根据权利要求5所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP和PCR缓冲液。
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