CN109504769B - 检测her2基因突变的特异性引物、液相芯片试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测HER2基因突变的液相芯片试剂盒,其包括有:根据HER2基因的各种突变类型及野生型所设计的延伸引物对,所述延伸引物由5’端tag序列和3’端针对目的基因突变位点所设计的特异性引物序列组成,具有不同anti‑tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠;扩增引物。本发明所提供的HER2基因突变检测液相芯片试剂盒可对7种突变型进行联合检测并分型,单次操作即可对96个样本的7个突变位点单独或者同时进行准确分析,检测灵敏度高,其检测结果与测序法结果高度吻合,一致率高达100%,且检测效率远高于常用的测序技术,符合实际应用需求。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及医学及生物技术,具体的是涉及一种检测HER2基因突变的特异性引物、液相芯片试剂盒和方法。
背景技术
HER2基因,又被称为表皮生长因子受体2(EGFR2),ERBB-2或NEU,定位于染色体17q21,全长28515bp,转录4624nt的mRNA,编码的蛋白质是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白,分子质量约为185ku,长度为1255个氨基酸,前653个氨基酸为胞外区,654-675个氨基酸的区域为穿膜区,676-1255个氨基酸区域为胞内区。
HER2是ERBB受体酪氨酸激酶家族的成员之一,该家族还包括其它3个成员,分别为EGFR(HER1/ERBB1),HER3(ERBB3)和HER4(ERBB4),所以HER2与人表皮生长因子受体(EGFR)癌基因有很高的同源序列。配体能与EGFR、HER3、HER4的细胞外结构域结合,诱导这些受体形成同源或异源二聚体,催化激活与细胞增殖、分化和迁移相关的细胞内信号通路级联反应。这些反应是由细胞质信号转换因子如PLC-γ1,Ras-Raf-MEK-MAPKs,磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),Src等(信号转导和转录激活因子,STATs)所诱导的。HER2无已知的配体,通常被erbB家族的其它成员通过同型或异型二聚化作用激活。在静止的状态下,这些细胞表面受体以皱褶的单体形式存在,即所谓“关闭状态”,无活性的构象阻止二聚化作用。当配体结合到胞外域时,构象的重排导致其处于“打开状态”,暴露二聚化作用的界面,胞外二聚物结构导致胞内酪氨酸激酶部分受体的反式激活。
HER2突变可以使HER2基因激活,导致酪氨酸激酶结构域构象改变,ATP结合袋缩小,激酶活性增加,受体和下游AKT和MEK通路的激活,从而使多种细胞发生恶性转化或者细胞恶性程度增加,更为有效地激活信号传导、磷酸化EGFR、诱导肿瘤的形成和扩散。研究表明HER2突变(HER2YVMA)能够诱导不依赖于配体的磷酸根转移,较HER2野生型具有更强能力与介导细胞增殖、能动、生存的信号转换因子关联,HER2YVMA能够在缺乏ERBB配体以及EGFR激酶活性的情况下激活EGFR。
阿法替尼是EGFR和HER2酪氨酸激酶的强效、不可逆双重抑制剂。研究表明,HER2突变的非小细胞肺癌患者可从药物阿法替尼中获益,HER2基因突变也因有望成为新靶点而备受关注。
截至目前,市场上检测HER2基因突变的试剂盒也非常少,其检测技术主要为荧光定量PCR及高通量测序,荧光定量PCR检测技术无法做到单管多个基因同时检测分型,通量相对较低;高通量测序检测技术设备投资要求高,操作较繁琐,数据较难处理。液相芯片检测技术有一定的优势,设备成本相对较低、特异性强、检测结果准确、可重复性好、通量高等优点。要实现该技术的优势,引物和探针设计、磁珠选择及反应体系优化都是至关重要的。
发明内容
本发明的目的之一是提供HER2基因突变检测的液相芯片试剂盒,该试剂盒可用于HER2基因外显子20及外显子19上七种常见基因型的单位点或多位点联合检测。七种突变基因型分别为:2325-2336ins(YVMA776-779ins)、2326-2337ins(YVMA776-779ins)、2327-2339ins(G776V,Cins)、2340-2348ins(GSP 781-783ins)、2331-2336ins(CG 778-779ins)、2326G>T(G776C)和2264T>C(L755S),前六种类型位于外显子20,最后一种类型位于外显子19上。
实现上述目的的技术方案如下。
一种检测HER2基因突变的液相芯片试剂盒,包括有:
(A).根据HER2基因的各种突变类型及野生型所设计的延伸引物延伸引物由5’端tag序列和3’端针对目的基因突变位点所设计的特异性引物序列组成,
所述特异性引物序列选自以下描述中的一对:针对2325-2336ins(YVMA776-779ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ IDNO.11、针对2326-2337ins(YVMA776-779ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.12、针对2327-2339ins(G776V,Cins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.13、针对2340-2348ins(GSP 781-783ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ IDNO.14、针对2331-2336ins(CG 778-779ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.15、针对2326G>T(G776C)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.16、针对2264T>C(L755S)位点的SEQ IDNO.17及SEQ ID NO.18所述tag序列选自SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.9;
(B).具有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠,anti-tag序列与磁珠连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.19~SEQ IDNO.27,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).扩增引物:是针对不同的突变位点所设计的具有特异性的正反向引物对,用于扩增出待检测的目标序列,包含所述延伸引物所能检测的相应突变位点。
在其中一个实施例中,所述扩增引物为:针对2325-2336ins(YVMA776-779ins)、2326-2337ins(YVMA776-779ins)、2327-2339ins(G776V,Cins)、2340-2348ins(GSP 781-783ins)、2331-2336ins(CG 778-779ins)、2326G>T(G776C)位点的SEQ IDNO.28及SEQIDNO.29,针对2264T>C(L755S)位点的SEQ ID NO.30及SEQ ID NO.31。
在其中一个实施例中,所述延伸引物为:针对2325-2336ins(YVMA776-779ins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.10组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.11组成的序列,针对2326-2337ins(YVMA776-779ins)位点的由SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.12组成的序列,针对2327-2339ins(G776V,Cins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.13组成的序列,针对2340-2348ins(GSP 781-783ins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.14组成的序列,针对2331-2336ins(CG 778-779ins)位点的由SEQID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.15组成的序列,和针对2326G>T(G776C)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.7和SEQIDNO.16组成的序列,和/或针对2264T>C(L755S)位点的由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.18组成的序列。
本发明的另一目的是提供用于HER2基因突变检测的特异性引物。
实现上述目的的技术方案如下:
用于HER2基因突变检测的特异性引物,选自以下至少一对:针对2325-2336ins(YVMA776-779ins)位点的SEQ IDNO.10及SEQ ID NO.11,针对2326-2337ins(YVMA776-779ins)位点的和SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.12,针对2327-2339ins(G776V,Cins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.13,针对2340-2348ins(GSP 781-783ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ IDNO.14,针对2331-2336ins(CG 778-779ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ IDNO.15,针对2326G>T(G776C)位点的SEQ ID NO.10及由SEQ IDNO.16,和针对2264T>C(L755S)SEQ ID NO.17及SEQ IDNO.18。
本发明的另一目的是提供一种检测HER2基因突变的方法。
具体技术方案如下。
一种利用权利要求1-5所述的液相芯片试剂盒检测HER2基因突变的方法,包括以下步骤:
(1)利用所述扩增引物进行扩增,得到扩增产物;
(2)扩增产物用SAP酶和Exo-I酶进行酶切处理;
(3)酶切后的扩增产物通过延伸引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记;
(4)与相应的anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠进行杂交反应,然后加入链霉亲和素-藻红蛋白孵育,于MAGPIX仪器上检测。
本发明的主要优点在于:
1.本发明所提供的HER2基因突变检测液相芯片试剂盒可对7种突变型进行联合检测并分型,单次操作即可对96个样本的7个突变位点选择性地或全部进行准确分析,检测灵敏度高,其检测结果与测序法结果高度吻合,一致率高达100%,且检测效率远高于常用的测序技术,符合实际应用需求。
2.本发明所述的HER2基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比,根据各突变位点所设计的探针及anti-tag序列之间不存在交叉现象,特异性延伸引物、tag标签序列、anti-tag标签序列的组合,构建了一个性能完好的检测体系,既能够避免型之间的交叉反应,又能实现多突变类型的单独和联合检测。
3.本发明通过发明人长期设计经验的积累和大规模的实验优化工作,从而得到了性能最佳的特异性引物组合,本发明设计的延伸引物能高度灵敏特异地识别突变位点,进而准确第区分基因型;整个反应体系中基本上不存在交叉反应,特异性好,交叉反应率低于3%。
4.本发明的检测方法步骤简单,7种突变位点检测可通过一步PCR实现含突变位点目的片段的多重扩增,大大提高了检测效率,本发明克服了传统固相芯片敏感性低、可重复性差的缺陷,有效地提高了检测荧光信号值和检测灵敏度,增强了信噪比,使得检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容,特举以下实施例详细说明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例所述HER2基因突变检测液相芯片试剂盒,主要包括:
一、延伸引物
针对HER2基因突变的七种常见基因型的野生型和突变型(如表1所示),分别设计特异性的引物序列。延伸引物由“tag序列+特异性引物序列”组成。延伸引物序列如下表所示:
表1 HER2基因的延伸引物序列(tag序列+特异性引物序列)
每条延伸引物包括两个部分,5’端为对应磁珠上anti-tag序列的特异性tag序列,3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有延伸引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的磁珠
根据所设计的延伸特异性引物片段,选择tag序列,最大限度地减少各磁珠的anti-tag序列之间以及tag与延伸特异性引物片段可能形成的二级结构,选择的8种磁珠编号与磁珠上相应的anti-tag序列如表2所示:
表2磁珠编号与磁珠上相应的anti-tag序列
本发明选择的8种磁珠均购自美国Luminex公司,将anti-tag序列包被于磁珠上。anti-tag序列与磁珠之间连接有5-10个T的间隔臂序列,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂用于将anti-tag与磁珠表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与磁珠之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T,磁珠包被过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的磁珠(购自Luminex公司)悬浮于50μL0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10μL合成的anti-tag分子(100nmol/mL)。配制10ng/mL的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往磁珠悬液中加入2.5μL的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5μL的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的磁珠重悬于100μL的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH 8.0)],再溶解于1mmol/L EDTA溶液中,2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点目标序列的扩增引物
针对HER2基因外显子20及外显子19上七种常见基因型2325-2336ins(YVMA776-779ins)、2326-2337ins(YVMA776-779ins)、2327-2339ins(G776V,Cins)、2340-2348ins(GSP 781-783ins)、2331-2336ins(CG 778-779ins)、2326G>T(G776C)和2264T>C(L755S),设计扩增引物对(见表3),可扩增出包含7个突变检测位点的目标序列。
表3扩增出含有突变位点目标序列的扩增引物
所有扩增引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述的HER2基因突变检测液相芯片对样本检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250mL):
2×Tm杂交缓冲液配方(250mL):
过滤后贮存于4℃
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
运用2对扩增引物,多重PCR一步扩增出7条包含HER2基因7种目标检测突变位点的目标序列,扩增产物片段长度为100-200bp,引物序列(SEQ ID NO.28-31)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ ID NO.28-31的引物贮存液50μL于1.5mL微量离心管中,使用10mmol/L Tris Buffer配制成终浓度各为10pmol/mL的多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃40s,30个循环;72℃10min;4℃保存备用
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5μL PCR反应后的产物,加入1μL 10×SAP缓冲液、1μL SAP酶和0.5μLExo-I酶;
2.37℃孵育15min,80℃孵育15min,灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的延伸引物的延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用实施例1中设计的延伸引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的延伸引物工作液:分别取待检测基因相应的野生型和突变型
延伸引物贮存液10μL于1.5mL微量离心管中,加入10mmol/L Tris Buffer补至200μL,混合均匀即为延伸混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
反应程序为:96℃2min;94℃30s,54℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的延伸引物,每组选择相应的8种包被的磁珠(如实施例1所述),每种磁珠浓度均为2.5×105个/mL,分别取1μL每种编号的磁珠于1.5mL的微量离心管中,补加2×Tm杂交缓冲液至100μL,涡旋混匀;
2.取25μL上述磁珠悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25μL的ddH2O;
3.取5-25μL的延伸反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50μL;
4.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,52℃15min孵育杂交;
5.杂交后的磁珠置于磁力板上倒掉上清,再加75μL的1×Tm杂交缓冲液静置1分钟后倒掉;
6.将磁珠重悬于75μL的1×Tm杂交缓冲液中,加入15μL浓度为10ug/mL的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
7.37℃孵育15min,于MAGPIX仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
1.当各突变型MFI值均小于Cut-Off值时,野生型的MFI必须大于300,且大于10×PCR阴性对照;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,根据经验对各检测位点的突变确定阈值(cut-off值),以划分野生型和突变型。
使用本方法检测20份阴性样本,实验数据符合上述要求。阈值(cut-off值)的设置为:平均值±5SD。
以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的HER2基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的HER2基因突变检测液相芯片能够准确地检测出各突变类型,结果稳定可靠。
表4样本检测结果(MFI)
表5 20例样本HER2基因突变类型分析结果
实施例3
不同延伸引物的液相芯片对HER2基因突变位点检测的影响
一、液相芯片制备的设计(选择不同的Tag序列及Anti-Tag序列)
以HER2基因2325-2336ins(YVMA776-779ins)和2264T>C(L755S)位点突变检测液相芯片为例,分别针对2325-2336ins(YVMA776-779ins)和2264T>C(L755S)的野生型和突变型设计延伸引物3’端的特异性引物序列,而延伸引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.9,相应的,包被于磁珠上的与tag序列互补配对anti-tag序列选自SEQ IDNO.19-SEQ ID NO.27。延伸引物的具体设计如下表(表6)所示。延伸引物的合成、磁珠anti-tag序列的包被、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表6液相芯片设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品编号为21-40的样本进行检测,检测结果如下表所示(表7、8、9):
表7样本HER2基因2325-2336ins(YVMA776-779ins)及2264T>C(L755S)检测结果分析1
表8样本HER2基因2325-2336ins(YVMA776-779ins)及2264T>C(L755S)检测结果分析2
表9样本HER2基因2325-2336ins(YVMA776-779ins)及2264T>C(L755S)检测结果分析3
从上述实施例实验结果可知,针对不同突变位点的液相芯片,对应的特异性引物与不同的tag序列进行组合后,其结果依然稳定可靠,具体数据详见上述结果列表中。当引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配组合时,相比其它组合方式,其检测效果更佳(信噪比更好),具体参见本实施例试验组1、试验组4的实验结果。其它特异性引物与不同tag序列组合搭配时,其实验结果与实例2及3类似,具体数据省略。故综合上述结果描述,本发明中的所用到的特异性引物与Tag序列组合进行筛选后才得到的信噪比高、特异性强、灵敏度高的最佳检测效果。
实施例4 HER2基因突变检测特异性引物序列的选择
以HER2基因突变的七种常见基因型的野生型和突变型为例,分别设计特异性的引物序列,以该突变位点所在目标序列的正向或反向互补序列为模板,分别针对E19和E20的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,包括本发明实施例1中优选的特异性引物序列和2条(或2条以上)备选的特异性引物序列,如表10所示。
表10特异性引物序列
采用上述设计的特异性引物序列,按实施例1和实施例2所述检测过程和方法对表10设计的特异性引物序列进行检测,其检测样本为特异性引物类型所对应的HER2基因的野生型或突变型样本,检测结果如下表所示(表11):
表11特异性引物序列检测结果(MFI)
从上述实施例结果可知,实施例1中优选的特异性引物序列(表11中SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)和其他备选的特异性引物序列相比,荧光信号值更高、信噪比更强且与特异性引物外的各位点间的交叉反应率更低。
实施例5HER2突变型基因交叉反应率实验
将实施例1中所述的HER2基因7个突变位点2325-2336ins(YVMA776-779ins)、2326-2337ins(YVMA776-779ins)、2327-2339ins(G776V,Cins)、2340-2348ins(GSP 781-783ins)、2331-2336ins(CG 778-779ins)、2326G>T(G776C)和2264T>C(L755S)的延伸引物进行混合,按实施例2所述检测过程和方法对下表(表11)中经测序验证的14例样本进行平行重复检测,检测结果如下表所示(表12)。
表12 14例HER2基因不同突变类型样本
样品号 | 测序结果 |
21、22 | 2325-2336ins(YVMA776-779ins) |
23、24 | 2326-2337ins(YVMA776-779ins) |
25、26 | 2327-2339ins(G776V,Cins) |
27、28 | 2340-2348ins(GSP 781-783ins) |
29、30 | 2331-2336ins(CG 778-779ins) |
31、32 | 2326G>T(G776C) |
33、34 | 2264T>C(L755S) |
表13样本检测结果(MFI)
注:
实施例6:灵敏度测定实验:
选择HER2基因的野生型和突变型上述样本按如下比例进行混合:100:0.1、100:0.2、100:0.5、100:1、100:1.5、100:2、100:2.5、100:5,即突变型质粒浓度为0.1%、0.2%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、5%,以实施例1所述的检测试剂盒并按实施例2所述检测过程和方法对上述混合例样本进行平行重复检测,检测结果如下表所示:
表14灵敏度检测结果
1.当各突变型MFI值均小于Cut-Off值时,野生型的MFI必须大于300,且大于10×PCR阴性对照;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,根据经验对各检测位点的突变确定阈值(cut-off值),以划分野生型和突变型。
阈值(cut-off值)的设置为:平均值±5SD,经计算本实验cut-off值为9.83±1.66。
由上述结果可知,本发明所述试剂盒的检测灵敏度小于1%,其灵敏度高于荧光定量法。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 检测HER2基因突变的特异性引物、液相芯片试剂盒和方法
<160> 55
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaatcatta cacttttcaa caat 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttttcatct tttcatcttt caat 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaacaaactt cacatctcaa taat 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatttacca atctttcttt atac 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tacatcaaca attcattcaa taca 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatcttacta caaatccttt cttt 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaacaaactt cacatctcaa taat 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taattataca tctcatcttc taca 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcattcatat acataccaat tcat 24
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaagcatacg tgatggctg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aggaagcata cgtgatggca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggaagcatac gtgatggctt 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaagcatacg tgatggctgt 20
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgggctccc ctggctc 17
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctggtgtgtg tgggggc 17
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggaagcatac gtgatggctt 20
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggggatgtgt tttccctca 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggggatgtgt tttccctcg 19
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
attgttgaaa agtgtaatga ttga 24
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
attgaaagat gaaaagatga aaag 24
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
attattgaga tgtgaagttt gttt 24
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtataaagaa agattggtaa atga 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgtattgaat gaattgttga tgta 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaagaaagga tttgtagtaa gatt 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
attattgaga tgtgaagttt gttt 24
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgtagaagat gagatgtata atta 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atgaattggt atgtatatga atga 24
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agcgtaccct tgtccccag 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgcggttttc ccggacatg 19
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gctcttctca ctcatatcct c 21
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctaagatttc tttgttggct ttg 23
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ccagtggcca tcaaagtgtt 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cagtggccat caaagtgtt 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagtggccat caaagtgtc 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ccagtggcca tcaaagtgtc 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaagcatacg tgatggctg 19
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
atatggggag cccacacc 18
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggaagcatac gtgatggcat 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaagcatacg tgatggcata 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aagcatacgt gatggcttac 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gaagcatacg tgatggctta 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggaagcatac gtgatggctt 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tatggggagc ccacacaca 19
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
agcatacgtg atggctgtgt 20
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tggtgtgggc tcccctg 17
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
ctggtgtggg ctcccct 17
<210> 47
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ggtgtgtgtg ggggc 15
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
atatggggag cccccaca 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tatggggagc ccccacac 18
<210> 50
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tggtgtgtgt gggggc 16
<210> 51
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tggtgtgtgt gggggct 17
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggtgtgtgtg ggggct 16
<210> 53
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gtgtgtgtgg gggct 15
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
aggaagcata cgtgatggct t 21
<210> 55
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gaagcatacg tgatggctt 19
Claims (7)
1.一种检测HER2基因突变的液相芯片试剂盒,其特征在于,包括有:
(A).根据HER2基因的各种突变类型及野生型所设计的延伸引物对,所述延伸引物由5’端tag序列和3’端针对目的基因突变位点所设计的特异性引物序列组成;
所述延伸引物对为:
针对2325-2336ins(YVMA776-779 ins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.11组成的序列,
针对2326-2337ins(YVMA776-779ins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.12组成的序列,
针对2327-2339ins(G776V,Cins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.13组成的序列,
针对2340-2348ins(GSP 781-783ins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.14组成的序列,
针对2331-2336ins(CG 778-779ins)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.15组成的序列,和
针对2326G>T(G776C)位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.10组成的序列及由SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.16组成的序列,和
针对2264T>C(L755S)位点的由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.18组成的序列;
(B).具有不同anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠,anti-tag序列与磁珠连接中间还设有间隔臂序列;所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.19~SEQ ID NO.27,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;
(C).扩增引物:是针对不同的突变位点所设计的具有特异性的正反向引物对,用于扩增出待检测的目标序列,包含所述延伸引物所能检测的相应突变位点。
2.根据权利要求1所述的检测HER2基因突变的液相芯片试剂盒,其特征在于,所述扩增引物为:针对2325-2336ins(YVMA776-779 ins)、2326-2337ins(YVMA776-779ins)、2327-2339ins(G776V,Cins)、2340-2348ins(GSP 781-783ins)、2331-2336ins(CG 778-779ins)、2326G>T(G776C)位点的SEQ ID NO.28及SEQ ID NO.29和
针对2264T>C(L755S)位点的SEQ ID NO.30及SEQ ID NO.31。
3.根据权利要求1-2任一项所述的检测HER2基因突变的液相芯片试剂盒,其特征在于,所述间隔臂序列为:5-10个T。
4.用于HER2基因突变检测的特异性引物,其特征在于,所述特异性引物为:针对2325-2336ins(YVMA776-779 ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.11,针对2326-2337ins(YVMA776-779ins)位点的和SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.12,针对2327-2339ins(G776V,Cins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.13,针对2340-2348ins(GSP 781-783ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.14,针对2331-2336ins(CG 778-779ins)位点的SEQ ID NO.10及SEQ ID NO.15,针对2326G>T(G776C)位点的SEQ ID NO.10及由SEQ ID NO.16,和针对2264T>C(L755S)SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18。
5.一种基于非诊断目的的利用权利要求1-3所述的液相芯片试剂盒检测HER2基因突变的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)利用所述扩增引物进行扩增,得到扩增产物;
(2)扩增产物用SAP酶和Exo-I酶进行酶切处理;
(3)酶切后的扩增产物通过延伸引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记;
(4)与相应的anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的磁珠进行杂交反应,然后加入链霉亲和素-藻红蛋白孵育,于MAGPIX仪器上检测。
6.根据权利要求5所述的基于非诊断目的的检测HER2基因突变的方法,其特征在于,所述引物延伸反应的反应程序为:96℃2min;94℃30s,54℃1min,72℃2min。
7.根据权利要求5或6所述的基于非诊断目的的检测HER2基因突变的方法,其特征在于,步骤(4)所述杂交反应为:95℃60s,52℃15min,孵育杂交。
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