WO2011131151A1 - Pik3ca基因突变检测液相芯片 - Google Patents

Pik3ca基因突变检测液相芯片 Download PDF

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WO2011131151A1
WO2011131151A1 PCT/CN2011/073224 CN2011073224W WO2011131151A1 WO 2011131151 A1 WO2011131151 A1 WO 2011131151A1 CN 2011073224 W CN2011073224 W CN 2011073224W WO 2011131151 A1 WO2011131151 A1 WO 2011131151A1
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WO
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seq
mutation
mutation site
wild type
sequence
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PCT/CN2011/073224
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English (en)
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许嘉森
李国强
余刚
秦会娟
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广州益善生物技术有限公司
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase

Definitions

  • the invention belongs to the field of molecular biology, relates to medicine and biotechnology, and specifically relates to a liquid phase chip for detecting a mutation of a PIK3CA gene. Background technique
  • PBKs phosphatidylinosito O-kinases
  • Class I proteins can include two subunits: IA and IB.
  • IA is a heterodimer consisting of a pllO catalytic subunit and a p85 regulatory subunit.
  • the PIK3CA gene is a ⁇ catalytic subunit encoding the IA class.
  • PI3Ks can be activated by growth factor receptor tyrosine kinase (RTK). Activation of ⁇ 3 ⁇ produces a variety of biological effects, including regulation of cell proliferation, survival, and cell cycle regulation.
  • RTK growth factor receptor tyrosine kinase
  • PIK3CA point mutation sites are found in a plurality of exons, 0 but mainly the most common mutations occur in "kinase” and "Spiral” two domains (the kinase and helical domains) exon 9 (Exon 9) E542K and E545K, and exon 20 (Exon 20) H1047R, as shown in the following table:
  • the established PIK3CA gene mutation detection technology is mainly PCR-sequencing and real-time fluorescent quantitative PCR detection technology.
  • PCR-sequencing has the advantage of being able to determine the range and type of mutations. It is currently widely used, but the sensitivity of sequencing is only 20%-25%, which is far from meeting the needs of clinical applications, especially for heterogeneity. Mutations in tumor somatic cells, low sensitivity will lead to a large number of missed tests.
  • the sequencing method has complicated detection operation and poor timeliness. The limitations of sequencing methods have been highlighted for clinical tests requiring high timeliness and high sensitivity.
  • the real-time quantitative PCR detection technology has high detection efficiency and strong timeliness, but its false positive rate is also a clinical application.
  • the "PIK3CA gene mutation detection probe, liquid phase chip and its detection method" successfully developed by the applicant in the previous period (Application No.: 200810220266.1)
  • the detection method is simple, and a large number of enzyme digestion enrichment is excluded.
  • the interference caused by the wild type sequence has good specificity, high sensitivity and accuracy of more than 99%, but the method involves two rounds of PCR operation, which is easy to cause pollution, and the hybridization detection step probe is relatively close (only the mutation sites are different) ), it is not convenient to detect multiple gene mutation sites in parallel.
  • One of the objects of the present invention is to provide a PIK3CA gene mutation detection liquid phase chip.
  • the liquid phase chip can be used to detect two normal genotypes of exon 9 of PIK3CA gene (542-w, 545-w) and five mutants (E542K, E545K, E545G, E545A, E545D), and exon 20 The normal genotype (1047-w) and the two mutants (H1047R, H1047L).
  • a liquid phase chip for detecting PIK3CA gene mutation mainly includes:
  • each ASPE primer consists of a tag sequence at the 5' end and a specific primer at the 3' end for the target gene mutation site.
  • the tag sequence is selected from the sequences of SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 10;
  • the specific primer is: a base derived from SEQ ID NO. 11 or its reverse complement SEQ ID N 0.41 against Exon 9 Codon 542 a sequence, and a base sequence derived from SEQ ID NO.
  • the amplification primer is: when the specific primer is derived from SEQ N0.11 to SEQ N0.17 or a reverse complement thereof, the amplification primer for Exon 9 is SEQ.NO.81 ⁇ SEQ.NO .82; When the specific primer is derived from SEQ NO. 18 to SEQ NO. 20 or its reverse complement, the amplification primer for Exon 20 is SEQ. NO. 83 ⁇
  • the specific primer is: SEQ ID NO. 1 or SEQ ID N0.22 against Exon9 Codon542 wild type, and 8 £0 10 ⁇ 3.23 or 8 £ 0 10 ⁇ 3.24 of Codon 542 mutant E542K; Or SEQ ID N0.25 or SEQ ID N0.26 for Exon9 Codon545 wild type, and SEQ ID N0.27 or SEQ ID N0.28 of the E545K mutation site in the mutant, SEQ ID N0 of the E545G mutation site. 29 or SEQ ID NO.
  • the specific primer is: SEQ ID N0.51 or SEQ ID N0.52 for Exon 9 Codon542 wild type, and SEQ ID N0.53 or SEQ ID N0.54 of Codon542 mutant E542K; SEQ ID N0.55 or SEQ ID N0.56 against Exon 9 Codon 545 wild type, and SEQ ID N0.57 or SEQ ID N 0.58 of the E545K mutation site in the mutant, SEQ ID N0 of the E545G mutation site. 59 or SEQ ID NO.
  • the anti-tag sequence is further provided with a spacer arm sequence in the middle of the microsphere connection; the spacer arm sequence is 5-10! 1 .
  • Another object of the present invention is to provide a specific primer for the detection of a mutation in the PIK3CA gene.
  • Specific primers for the detection of mutations in the PIK3CA gene being: a base sequence derived from SEQ ID NO. 11 or its reverse complement sequence against Exon 9 Codon 542, and derived from SEQ ID NO. a base sequence in 12 or its reverse complement sequence; a base sequence derived from SEQ ID NO. 13 or its reverse complement sequence for Exon 9 Codon 545, and derived from 8 £0 10 ⁇ «).
  • the main advantages of the invention are:
  • the coincidence rate between the detection method and the sequencing method provided by the invention is as high as 100%.
  • the prepared PIK3CA gene mutation detection liquid phase chip has a very good signal-to-noise ratio, and there is basically no cross-reaction between the designed probe and the anti-tag sequence, and multiple mutations and multiple sites at the same site can be realized. Parallel detection of mutation sites.
  • the ASPE-type specific primer designed by the present invention has very good specificity and can accurately distinguish various mutation types.
  • Various specific ASPE primers are capable of performing hybridization reactions under uniform reaction conditions, and there is substantially no non-specific binding between various primers and probes.
  • the detection method of the invention has simple steps, and the amplification of the target sequence of multiple sites can be completed by one-step multiplex PCR, thereby avoiding many uncertain factors existing in complicated operations such as repeated PCR, and thus can greatly Improve the detection accuracy, reflecting the precise simultaneous qualitative and quantitative analysis features.
  • the detection method provided by the present invention requires much less time than the commonly used sequencing technology, and is particularly in line with clinical needs.
  • the invention not only overcomes the defects of low sensitivity of the conventional solid phase chip and poor repeatability of the detection result, but also improves the existing liquid phase chip technology, so that the prepared microsphere can be applied to different detection items. Has a strong expansion.
  • the detected fluorescence signal value is greatly improved, so that the sensitivity of the detection is further improved, the signal-to-noise ratio is enhanced, and the detection result is more accurate and reliable.
  • Example 1 The PIK3CA gene mutation detection liquid phase chip mainly includes:
  • the ASPE primer consists of a "Tag sequence + specific primer sequence".
  • the 5' end is a Tag sequence designed based on the PIK3CA gene mutation detection.
  • the designed Tag sequence can avoid the secondary structure that ASPE primers may form in the reaction system to the maximum extent, and the Tag sequence and Tag sequence, Tag sequence and specificity. There is no cross-reactivity between the sex primer sequences.
  • Tag sequence and special The heterologous primer sequences form intact ASPE primers, and all ASPE primers can be synchronized in a uniform reaction system (ie, buffered environment of the same reaction, the same reaction temperature, etc.) to complete parallel detection.
  • the designed Tag sequence is as shown in Table 1.
  • the 3' end is a specific primer sequence designed according to the PIK3CA gene mutation detection, and the specific primer has a Tm value between 52 and 58 ° C; wherein the specific primer sequence for each mutant type has a 3' end One of the last three bases should be a mutation site; one of the last three bases of the 3' end of the specific primer sequence of the Exon 9 or Exon 20 wild type is the wild corresponding to the mutation site. Type site.
  • PIK3CA gene mutation detection specific primer source sequence (within the base corresponding to the mutation site)
  • the 10 microspheres selected were purchased from Luminex, USA, and the anti-tag sequence was coated with the microspheres.
  • the anti-tag sequence and the microspheres are connected with a 5-10 T-spacer sequence, that is, a 5-10 T-spacer sequence is added before each anti-tag sequence, and the anti-tag sequence is generated by Shanghai. Engineering Bioengineering Technology Services Co., Ltd. Synthesis.
  • the synthetic anti-tag sequences with sterile ddH 2 0 stock solution was formulated 100nmol / ml of.
  • the spacer arm is a sequence for spacing the anti-tag from the surface of the microsphere or placing the anti-tag in a hydrophilic environment.
  • Common spacer sequences include poly dT, poly (dT), oligomeric tetraethylene glycol, and (CH2) n spacer arms (n > 3 ), such as (CH2) 12, (CH2) 18 and the like.
  • poly (dA) interference is present, poly (TTG) can also be used as the spacer arm.
  • the process of the spacer arm of the present invention preferably of 5-10 1 ⁇ microspheres is as follows:
  • Target detection PIK3CA gene Two normal genotypes of Exon9 (542-w, 545-w) and five mutants (E542K,
  • E545K, E545G, E545A, E545D) are all located in exon 9, and the normal genotype of Exon20 (1047-w) and the two mutants (H1047R, H1047L) are located in exon 20.
  • Two pairs of primers were designed using Primer 5.0 to amplify the target sequence with the detection site.
  • Tris Buffer 10 mmol/L Tris Buffer was formulated into a 100 pmol/mL stock solution.
  • the ExoSAP-IT kit was purchased from USB Corporation of the United States.
  • Biotin-labeled dCTP was purchased from Shanghai Shenggong Bioengineering Technology Service Co., Ltd.
  • Primers were designed using Prim e r5.0, and the target sequence with the detection site was amplified by multiplex PCR-step, and the product sizes were 141 bp and 108 bp, respectively.
  • Primer sequences (SEQ N0.81-84) are shown in Table 7 above.
  • each of the primer stock solutions of SEQ N0.81-84 was taken in a 1.5 ml microcentrifuge tube, and uniformly mixed to obtain a multiplex PCR primer working solution.
  • the PCR reaction system is as follows:
  • Taq enzyme (5U/ul) 0.5 ul
  • the PCR amplification procedure was: 95 °C 3 min; 94 °C 20 s, 56 °C 30 s, 72 °C 30 s, 30 cycles; 72 °C lOmin; 4 °C for storage.
  • the primer extension reaction was carried out by using the ASPE primer designed above, and biotin-labeled dCTP was incorporated during the reaction, so that the product after the reaction was labeled with a plurality of biotin labels.
  • the mixed ASPE primer working solution Take the corresponding wild type and mutant ASPE primers of Exon9 and Exon20 (specifically shown in Table 8), and store the lOul in 2 different 1.5ml microcentrifuge tubes and add 10mmol/L. Tris Buffer is added to 200 ul, and evenly mixed is the ASPE mixed primer working solution.
  • the ASPE reaction system is as follows:
  • Groupl and Group3 are simultaneously performed in one reaction system, that is, parallel detection of Groupl and Group3.
  • Group2 and Group4 are also being performed simultaneously in the same reaction system, and Group2 and Group4 are detected in parallel.
  • Table 8 Design of liquid phase chip preparation
  • Biotin-dCTP 400umol/L 0.25 ul dATP, dGTP, dTTP mixture (each lOOumol/L) 1 ul Tsp enzyme (5U/ul) 0.25 ul mixed ASPE primer working solution (500nmol/L each) 1 ul
  • the PCR amplification product processed 5 ul dd3 ⁇ 40 10. ul a total of 20 ul reaction procedure: 96 ° C 2 min; 94 ° C 30 s, 52 ° C lmin, 72 ° C 2 min, 30 cycles; 4 ° C storage, Five, hybridization reaction
  • the corresponding optimal microspheres were selected for each group (the concentration of microspheres was 2.5 ⁇ 10 5 /ml).
  • Each microsphere has a different color code, and each microsphere is connected to a 24 bp specific oligonucleotide sequence (anti-tag), and these anti-tag sequences can be respectively associated with the corresponding ASPE bow
  • the tag sequence of the 5' end of the object specifically binds; 2. Take each M number of microspheres in a 1.5 ml microcentrifuge tube;
  • microspheres are centrifuged at ⁇ 10000g for l-2min;
  • microspheres after hybridization are ⁇ 300 (3 ⁇ 4 centrifugation for 2-4 min;
  • microspheres are centrifuged at ⁇ 3000g for 2-4 minutes;
  • the reacted product was detected by a Luminex series of analytical instruments.
  • MFI mutant fluorescence value
  • the MFI value of the mutant detection is greater than 100, it is determined that the mutation type exists in the sample, otherwise the sample is determined to be the corresponding wild type.
  • the test results are shown in Table 9, Table 10 and Table 11.
  • the PIK3CA gene mutation of a large number of samples was detected by the method, and the coincidence rate of the detection results of the method provided by the present invention was calculated by the sequencing method and the liquid phase chip result.
  • the method detects that the PIK3CA genotype test results of 20 samples are 100% coincident with the sequencing results. It can be seen that the PIK3CA gene mutation detection liquid chip provided by the invention can accurately detect the mutation type of the PIK3CA gene, and the result is stable and reliable.
  • Specific primer sequences for the 3' ends of wild-type and mutant ASPE primers were designed for the Exon9 and Exon20 mutation sites of PIK3CA gene.
  • the specific primer sequences for detecting Exon9 and ⁇ 20 mutations were derived from SEQ ID NO. 11 - SEQ ID, respectively.
  • the Tag sequences at the 5' end of the wild type and mutant ASPE primers are respectively selected from the group consisting of SEQ ID NO.
  • the anti-tag sequences coated on the microspheres complementary to the corresponding tag sequences are respectively selected from the group consisting of SEQ ID NO .71-80.
  • the specific design is shown in the following table (Table 12). The synthesis of ASPE primers, anti-tag sequence-coated microspheres, amplification primers, detection methods, and the like are as described in Example 1 and Example 2.
  • Groupl and Group3 are simultaneously performed in one reaction system, that is, parallel detection of Groupl and Group3.
  • Group2 and Group4 are simultaneously running in the same reaction system, and Group2 and Group4 are detected in parallel.
  • Table 12 Design of liquid chip preparation
  • Genotype experimental group genotype specific primer tag sequence anti-tag sequence ll
  • test results of the samples 21-40 were as follows according to the detection process and method described in Example 2:
  • the 3'-end primer sequence of ASPE primer was designed for the wild type of ⁇ 9 and ⁇ 20, and the E542K and E545K were selected for the ⁇ 9 and ⁇ 20 mutants, respectively.
  • H1047R mutation site, the specific primer sequence of the 3' end of the ASPE primer targeting E542K, E545K, H1047R sites are respectively selected from SEQ ID NO.
  • Wild type and mutant specific specificity sequences for the same mutation site (wherein the wild type specific primers of Exon9 and Exon20 are respectively selected from SEQ ID N0.21-22, SEQ ID NO. 25-26 and SEQ ID NO.35-36, specific primers for their corresponding mutation sites are selected from the group consisting of SEQ ID N0.23-24, SEQ ID NO. 27-34 and PSEQ ID NO. 37-40, respectively. Both can be tested and the test results are consistent. Similarly, the specific primers derived from SEQ ID NO. 11-20 or SEQ ID NO. 41-50, which were designed according to the above-mentioned ASPE primer design, can be detected, and the results are stable and reliable. Specific test data for other similar situations is omitted.
  • the sample 61-80 was tested according to the detection process and method described in Example 2, and the test results were as follows:

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Description

PIK3CA基因突变检测液相芯片
技术领域
本发明属于分子生物学领域， 涉及医学和生物技术， 具体的是涉及 PIK3CA基因突变 检测液相芯片。 背景技术
PBKs (phosphatidylinositoO-kinases)是一组蛋白的多聚体，这些多聚体分为三类（Class I、 II和 111)。 I类 （Class I) 蛋白可包括两个亚单位： IA和 IB。 IA是由一个 pllO催化亚单 位和一个 p85调节亚单位组成的异源二聚体。 PIK3CA基因是编码 IA类的 ρΐΐθα催化亚单位。 PI3Ks可由生长因子受体酪氨酸激酶 （RTK) 激活。 ΡΙ3Κ 的活化可产生多种生物学效应， 包 括调节细胞增殖、 存活和细胞周期调控等方面。
PIK3CA点突变的位点在多个外显子中都有发现， 但主要是发生在"激酶"和"螺旋"两个结 构域 （the kinase and helical domains )0 其中最常见的突变是外显子 9 (Exon 9)的 E542K和 E545K, 和外显子 20 (Exon 20) 的 H1047R, 如下表：
Figure imgf000002_0001
目前， 已经建立的 PIK3CA基因突变检测技术， 主要是 PCR—测序法和实时荧光定量 PCR 检测技术。 PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点， 是目前应用较为广泛的检测方 法， 但测序法的灵敏度只有 20%— 25 %， 远远不能满足临床应用的需要， 尤其是对于异质性 的肿瘤体细胞突变， 低灵敏度将导致大量的漏检。 同时， 测序法检测操作复杂， 时效性差， 对于要求高时效性和高灵敏度临床检测， 测序法的局限性早已凸显。 而实时荧光定量 PCR检 测技术， 其检测效率高， 时效性强， 但其高居不下的假阳性率也为临床应用所诟病。 基于上 述检测技术存在的问题， 申请人前期成功开发的" PIK3CA基因突变的检测探针、 液相芯片及 其检测方法" （申请号： 200810220266.1) 检测方法操作简单， 通过酶切富集排除了大量野生 型序列造成的干扰， 结果特异性好， 灵敏度高， 准确度达 99%以上， 但该方法涉及两轮 PCR 操作， 较易造成污染， 且杂交检测步骤探针较为接近（只有突变位点不同）， 不便于多种基因 突变位点并行检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供 PIK3CA基因突变检测液相芯片。 该液相芯片可用于检测 PIK3CA基因外显子 9的两种正常基因型 （542-w、 545-w) 和五种突变型 （E542K、 E545K、 E545G、 E545A、 E545D), 以及外显子 20的正常基因型 （1047-w) 和两种突变型 （H1047R、 H1047L)。
一种 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 主要包括有：
( A)针对 PIK3CA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的 ASPE引物对：每种 ASPE 引物由 5'端的 tag序列和 3'端针对目的基因突变位点的特异性引物组成， 所述 tag序列选自 SEQ IDNO.l〜SEQIDNO.10中的序列；所述特异性引物是：针对 Exon 9 Codon542的、来源于 SEQ IDNO.ll或其反向互补序列 SEQIDN0.41中的碱基序列、 和来源于 SEQ ID NO.12或其反向互 补序列 SEQ IDN0.42中的碱基序列； 针对于 Exon 9 Codon545的、来源于 SEQ IDN0.13或其反 向互补序列 SEQIDN0.43中的碱基序列、和来源于8£010^3.14〜8£010^3.17中一种以上 的碱基序列， 或来源于其反向互补序列8£010^«).44〜8£010^«).47中的一种以上的碱基序 列； 禾口 /或针对 Exon 20 Codonl047的、 来源于 SEQ ID NO.18或其反向互补序列 SEQ ID N0.48 中的碱基序列、 和来源于8£010^3.19〜8£010^3.20中一种以上的碱基序列， 或来源于其 反向互补序列8£010^3.49〜8£010^3.50中的一种以上的碱基序列； 上述特异性引物的 3' 端的最后 3位碱基中的一个碱基为突变位点或其对应的野生型位点， 所述特异性引物的 Tm值 在 52~58°C之间；
(B) 分别包被有特异的 anti-tag序列的、 具有不同颜色编码的微球， 所述 anti-tag序列选自 SEQIDNO.71〜SEQIDNO.80中的序列， 且所述 anti-tag序列能相应地与 （A) 中所选的 tag 序列互补配对； (C) 用于扩增出具有 Exon 9和 /或 Exon 20的相应突变位点的 PIK3CA基因目标序列的扩增 引物。
优选地， 所述扩增引物为： 当特异性引物来源于 SEQ N0.11〜SEQ N0.17或其反向互补 序列时， 针对 Exon 9的扩增引物为 SEQ.NO.81~ SEQ.NO.82; 当特异性引物来源于 SEQ NO.18〜SEQ NO.20或其反向互补序列时， 针对 Exon 20的扩增引物为 SEQ.NO.83~
SEQ.NO.84。
优选地， 所述特异性引物为： 针对 Exon9 Codon542野生型的 SEQ ID N0.21或 SEQ ID N0.22, 以及 Codon542突变型 E542K的 8£0 10 ^3.23或8£0 10 ^3.24； 和 /或针对 Exon9 Codon545野生型的 SEQ ID N0.25或 SEQ ID N0.26,以及突变型中的 E545K突变位点的 SEQ ID N0.27或 SEQ ID N0.28、 E545G突变位点的 SEQ ID N0.29或 SEQ ID NO.30、 E545A突变位点 的 SEQ ID N0.31或 SEQ ID N0.32 禾口 /或 E545D突变位点的 SEQ ID N0.33或 SEQ ID N0.34; 禾口 /或针对 Exon 20 Codonl047野生型的 8£0 10 ^3.35或8£0 10 ^3.36， 以及突变型中的 H1047R突变位点的 SEQ ID N0.37或 SEQ ID N0.38 禾 P/或 H1047L突变位点的 SEQ ID N0.39 或 SEQ ID NO.40。
或者，所述特异性引物为：针对 Exon 9 Codon542野生型的 SEQ ID N0.51或 SEQ ID N0.52, 以及 Codon542突变型 E542K的 SEQ ID N0.53或 SEQ ID N0.54; 禾口 /或针对 Exon 9 Codon545野 生型的 SEQ ID N0.55或 SEQ ID N0.56, 以及突变型中的 E545K突变位点的 SEQ ID N0.57或 SEQ ID N0.58、 E545G突变位点的 SEQ ID N0.59或 SEQ ID NO.60、 E545A突变位点的 SEQ ID N0.61或 SEQ ID N0.62 和 /或 E545D突变位点的 SEQ ID N0.63或 SEQ ID N0.64; 和 /或针对 £ 00 20 0 (10^047野生型的8£0 10 ^3.65或8£0 10 ^3.66， 以及突变型中的 H1047R突变位 点的 SEQ ID N0.67或 SEQ ID N0.68、 和 /或 H1047L突变位点的 SEQ ID N0.69或 SEQ ID NO.70 o
优选地， 所述 anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列； 所述间隔臂序列为 5— 10 个！1。
本发明的另一目的是提供一种用于 PIK3CA基因突变检测的特异性引物。
具体技术方案如下：
用于 PIK3CA基因突变检测的特异性引物， 所述特异性引物是： 针对 Exon 9 Codon542的、 来源于 SEQ ID NO.11或其反向互补序列中的碱基序列、 和来源于 SEQ ID NO.12或其反向互补 序列中的碱基序列； 针对于 Exon 9 Codon545的、来源于 SEQ ID NO.13或其反向互补序列中的 碱基序列、 和来源于8£0 10 ^«).14〜8£0 10 ^^0.17中一种以上的碱基序列， 或来源于其反向 互补序列中的一种以上的碱基序列； 禾 P/或针对 Exon 20 Codonl047的、 来源于 SEQ ID N0.18 或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于 SEQ ID NO.19〜SEQ ID NO.20中一种以上的碱基 序列， 或来源于其反向互补序列中的一种以上的碱基序列； 上述特异性引物的 3'端的最后 3位 碱基中的一个碱基为突变位点或其对应的野生型位点， 所述特异性引物的 Tm值在 52~58°C之 间。 本发明的主要优点在于：
1. 本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达 100 %。 所制备的 PIK3CA基因突变检测 液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及 anti-tag序列之间基本上不存 在交叉反应， 可实现同一位点多种突变型和多种突变位点的并行检测。
2. 本发明设计的 ASPE型特异性引物具有非常好的特异性， 能准确区分各种突变类型。 各种 特异性 ASPE引物， 能够在均一的反应条件下进行杂交反应， 且各种引物、 探针之间基本 不存在非特异性结合。
3. 本发明的检测方法步骤简单， 可通过一步多重 PCR即可完成多个位点的目标序列的扩增， 避免了反复多次 PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素， 因而可大大提高检测准 确率， 体现了精确的同时定性、 定量分析特征。
4. 本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术， 特别符合临床需要。
多种 ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
5. 本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高， 检测结果的可重复性差的缺陷， 同时对现 有的液相芯片技术进行改进， 使得所制备微球能适用于不同的检测项目， 具有很强的拓 展性。 检测的荧光信号值大大提高， 从而使得检测的灵敏度进一步得到提高， 信噪比增 强， 检测结果更加准确可靠。 具体实施方式
实施例 1 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 主要包括有：
一、 ASPE引物
针对 PIK3CA基因 Exon9的五种突变型： E542K、 E545K、 E545G、 E545A、 E545D, 以及 Exon20两种突变型： H1047R、 H1047L, 分别设计特异性的引物序列。
PIK3CA基因突变检测的 ASPE引物的设计要点为：
ASPE引物由 "Tag序列 +特异性引物序列"组成。 其中， 5'端为根据 PIK3CA基因突变检测 所设计的 Tag序列，所设计的 Tag序列在反应体系能最大限度的避免 ASPE引物可能形成的二级 结构， 且 Tag序列与 Tag序列， Tag序列与特异性引物序列之间不发生交叉反应。 Tag序列和特 异性引物序列形成完整的 ASPE引物， 并使所有的 ASPE引物能够在一个均一的反应体系中同 步反应 （即同一反应的缓冲环境， 同一反应温度等）， 完成并行检测。 所设计的 Tag序列具体 如表 1。 3'端为根据 PIK3CA基因突变检测所设计的特异性引物序列， 所述特异性引物的 Tm值 在 52~58°C之间； 其中针对各种突变型的特异性引物序列， 其 3'端的最后 3位碱基中的一个碱 基应为突变位点；所述 Exon 9或 Exon 20野生型的特异性引物序列 3'端的最后 3个碱基中的一个 碱基为突变位点对应的野生型位点。所述 Tm值的计算方式为 Tm= ( G+C) χ4+ ( Α+Τ) χ2 - 4。
表 1 Tag序列
Figure imgf000006_0001
PIK3CA基因突变检测特异性引物的来源序列 （ 内为突变位点对应的碱基)
Figure imgf000006_0002
根据上述的 ASPE引物中特异性引物序列的设计要点， 设计得到一系列的特异性引物序 列， 其中例举部分野生型和突变型特异性引物， 如表 3 :
表 3 PIK3 CA基因突变检测特异性弓 I物序列一
Figure imgf000007_0001
同样的， 表 2中特异性引物的来源序列的反向互补序列也可以用于设计 ASPE的特异性引 物， 具体的序列备选范围如表 4 :
表 4 PIK3CA基因突变检测特异性弓 I物的来源序列二
Figure imgf000007_0002
44 E545K AGATCCTCTCTCTGAAATCACT0AGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAG
45 E545G AGATCCTCTCTCTGAAATCACTG§GCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAG
46 E545A AGATCCTCTCTCTGAAATCACT(¾GCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAG
47 E545D AGATCCTCTCTCTGAAATCACTGA|CAGGAGAAAGATTTTCTATGGAG
48 1047-w CATGAAACAAATGAATGATGCAC囚 TCATGGTGGCTGGACAACAAA
Exon
49 H1047R CATGAAACAAATGAATGATGCAC回 TCATGGTGGCTGGACAACAAA 20
50 H1047L CATGAAACAAATGAATGATGCAC@TCATGGTGGCTGGACAACAAA 同样的，根据上述的 ASPE引物中特异性引物序列的设计要点， 由表 4中特异性引物来源序 列设计得到一系列的特异性引物序列， 其中例举部分野生型和突变型特异性引物， 如表 5:
表 5 PIK3CA基因突变检测特异性引物序列二
SEQ ID NO. 位点 类型 特异性引物 (5'— 3') Tm
51 542-w TACACGAGATCCTCTCTClj^ 56
52 (野生型） ACACGAGATCCTCTCTCT^A 56
53 E542K TACACGAGATCCTCTCTCT Ξ 54
54 (突变型） ACACGAGATCCTCTCTCT^ ]A 54
55 E545-W CTCTCTCTGAAATCACTGAG 54
56 (野生型） CCTCTCTCTGAAATCACTGAG 58
57 E545K ATCCTCTCTCTGAAATCACl 「 54
Exon 9 s
58 (突变型） CCTCTCTCTGAAATCACT^ \G 56
59 E545G CCTCTCTCTGAAATCACTG 56
60 (突变型） TCTCTCTGAAATCACTG§G rC 56
61 E545A CCTCTCTCTGAAATCACTG @ 56
62 (突变型） TCTCTCTGAAATCACTG^G rC 56
63 E545D CCTCTCTCTGAAATCACTG 56
64 (突变型） TCTCTCTGAAATCACTGA@( A 54
65 1047-w ATGAAACAAATGAATGATGC AC囚 56
66 (野生型） AAACAAATGAATGATGCAC^ ^rc 54
67 H1047 TGAAACAAATGAATGATGCAC回 56
Exon 20
68 (突变型） AAACAAATGAATGATGCACgrC 56
69 H1047L ATGAAACAAATGAATGATGCACg 56
70 (突变型） AAACAAATGAATGATGCAC ^TC 54 所有 ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用 10mmol/L Tris Buffer配制成 100pmol/mL的贮存液。
二、 anti-tag序列包被的微球
根据所设计的 ASPE特异性引物序列， 选择 tag序列， 最大限度地减少各微球的 anti-tag序 列之间以及 tag与 ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构， 选择的十种微球编号与微球上 相应的 anti-tag序列如表 6所示：
微球编号与微球上相应的 anti-tag序列
Figure imgf000009_0001
选择的 10种微球购自美国 Luminex公司， 将 anti-tag序列包被与微球上。 anti-tag序列与微 球之间连接有 5— 10个 T的间隔臂序列， 即在每个 anti-tag序列前加上一段 5— 10个 T的间隔臂序 列， anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 将合成的 anti-tag序列用灭菌 ddH20配成 100nmol/ml的贮存液。 所述间隔臂为用于将 anti-tag与微球表面间隔开来或是将 anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在 anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列， 可减少空间位阻， 提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。 常见的间隔臂序列包括多聚 dT， 即 poly ( dT)， 寡聚四聚乙二醇以及 ( CH2) n间隔臂 (n>3 ), 如 ( CH2) 12、 ( CH2) 18 等。 另外， 如果存在 poly ( dA) 干扰， 还可以用 poly ( TTG) 作为间隔臂。 本发明间隔臂优 选为 5— 10个1\ 微球包被的过程如下：
分别取 5χ 106个上述编号的羧基化的微球 （购自 Luminex公司） 悬浮于 50ul 0.1mol/L的
MES溶液中 （pH4.5 )， 加入 lOul合成的 anti-tag分子 （ 100nmol/ml)。 配制 10ng/ml的 EDC (N-
( 3-Dimethylaminopropyl ) -N-ethylcarbodiimide ) (购自 Pierce Chemical公司)工作液。 往微球 悬液中加入 2.5ul的 EDC工作液， 恒温孵育 30分钟， 再加入 2.5ul的 EDC工作液， 再恒温孵育 30 分钟。 反应结束后， 用 0.02 %的 Tween-20洗涤一次， 再用 0.1 %的 SDS液洗涤一次。 将洗涤后 的包被有 anti-tag序列的微球重悬于 lOOul的 Tris-EDTA溶液 [10mmol/L Tris (pH8.0), lmmol/L EDTA中， 2-8 °C避光保存。
扩增出具有检测位点的目标序列的引物：
目标检测 PIK3CA基因 Exon9的两种正常基因型（542-w、545-w)和五种突变型（E542K、
E545K、 E545G、 E545A、 E545D)均位于外显子 9中， Exon20的正常基因型 ( 1047-w)禾口 两种突变型（H1047R、 H1047L)位于外显子 20中。利用 Primer5.0设计两对引物（见表 7)， 扩增出具有检测位点的目标序列。
扩增出具有突变位点的目标序列的引物
Figure imgf000010_0001
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 合成后的每条引物分别用
10mmol/L Tris Buffer配制成 100pmol/mL的贮存液。
实施例 2 运用 PIK3CA基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的 MES缓冲液 （pH5.0) 配方 （250ml):
Figure imgf000010_0002
2xTm杂交缓冲液
Figure imgf000010_0003
过滤后贮存于 4°C。 ExoSAP-IT试剂盒购自美国 USB公司。
生物素标记的 dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、 样本的 DNA提取：
参照 《分子克隆》 关于 DNA提取的相关方法， 得到待检测的 DNA。
二、 待测样品的 PCR扩增
利用 Primer5.0设计引物， 多重 PCR—步扩增出具有检测位点的目标序列， 产物大小分别 为 141bp、 108bp。 引物序列 （SEQ N0.81-84) 见上述表 7所示。
首先配制 PCR引物工作液：分别各取 SEQ N0.81-84的引物贮存液 lOOul于 1.5ml微量离心管 中， 混合均匀即为多重 PCR引物工作液。 PCR反应体系如下：
Ιθχ缓冲液 （含 Mg2+) 5 ul
dNTP (各 2.5mmol/L) 4 ul
Taq酶 （5U/ul) 0.5 ul
多重 PCR引物工作液 （各 16.7pmol/mL) 6 ul
模板 DNA ( lOng/ul) 1 ul
ddH20 33.5 ul
Figure imgf000011_0001
PCR扩增程序为： 95 °C 3min; 94 °C 20s, 56 °C 30s, 72 °C 30s, 30个循环； 72 °C lOmin; 4°C 保存备用。
三、 PCR产物的酶切处理
详细步骤如下：
1. 取 7.5ul PCR反应后的产物， 加入 3ul ExoSAP-IT酶；
2. 37°C孵育 15min。 80°C孵育 15min， 使多余的酶灭活。 酶切处理后的产物直接用于后续的 ASPE引物延伸反应。
四、 位点特异的引物延伸反应 （ASPE)
利用上述设计的 ASPE引物进行引物延伸反应， 在反应过程中掺入生物素标记的 dCTP, 从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的 ASPE引物工作液： 分别取 Exon9和 Exon20相应的野生型和突变型 ASPE 引物（具体如表 8所示）贮存液 lOul于 2支不同的 1.5ml微量离心管中，加入 10mmol/L Tris Buffer 补至 200ul， 混合均匀即为 ASPE混合引物工作液。 ASPE反应的体系如下：
其中， Groupl和 Group3在一个反应系统中同时进行， 即对 Groupl和 Group3并行检测。 同 时， Group2和 Group4也在同一个反应系统中同时进行， 对 Group2和 Group4并行检测。 表 8 液相芯片制备的设计
Figure imgf000012_0001
10x缓冲液 2 ul
MgCl2 ( 50mmol/L) 0.5 ul
Biotin-dCTP ( 400umol/L ) 0.25 ul dATP、 dGTP、 dTTP混合液 （各 lOOumol/L) 1 ul Tsp酶 （5U/ul) 0.25 ul 混合的 ASPE引物工作液 （各 500nmol/L) 1 ul 酶切处理的 PCR扩增产物 5 ul dd¾0 10. ul 共 20 ul 反应程序为： 96°C 2min; 94°C 30s， 52 °C lmin, 72 °C 2min, 30个循环； 4°C保存备用, 五、 杂交反应
1. 根据设计的 ASPE引物， 每组选择相应的最优的微球 （微球浓度均为 2.5χ 105个 /ml)。 每种 微球分别带有不同颜色编码， 同时每种微球表面分别连接有一段 24bp的特异性的寡核苷 酸序列 （ anti-tag )， 这些 anti-tag序列能分别与对应的 ASPE弓 |物 5 '端的 tag序列特异结合； 2. 分别取 M每种编号的微球于 1.5ml的微量离心管中；
3. 微球于≥10000g离心 l-2min;
4. 弃去上清， 微球重悬于 lOOul的 2xTm杂交缓冲液中， 涡旋混匀；
5. 取 25ul上述微球悬液于 96孔滤板相应的孔中， 对照孔加 25ul的 ddH20;
6. 取 5-25ul的 ASPE反应液于相应的孔中， 用 ddH20补足至 50ul;
7. 用锡箔纸包住 96孔板以避光， 95 V 60s, 37V 15min孵育杂交；
8. 杂交后的微球于≥300(¾离心 2— 5min;
9. 去上清， 将微球重悬于 75ul的 l xTm 杂交缓冲液中；
10. 微球于≥3000g离心 2— 5min;
11 将微球重悬于 75ul的 l xTm 杂交缓冲液中， 加入 15ul浓度为 10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋 白 （SA-PE);
12. 37°C孵育 15min， 于 Luminex仪器上检测。
六、 结果检测与数据分析
反应后产物通过 Luminex系列分析仪器检测。以突变型荧光值 (MFI)大于 100为 cut-off 值， 当突变型检测的 MFI值大于 100时， 判定该样本存在该突变类型， 否则判定该样本为相应的野 生型。 检测结果如表 9、 表 10和表 11所示。
使用本方法检测大量样本的 PIK3CA基因突变， 以测序法检测与液相芯片结果作对照， 计 算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测 20份样本的 PIK3CA基因型检测结果与 测序结果吻合率达到 100 %。 可见本发明所提供的 PIK3CA基因突变检测液相芯片能够准确地 检测出 PIK3CA基因的突变类型， 且结果稳定可靠。 表 9 样本检测结果一 （MFI)
Figure imgf000014_0001
样本检测结果二 （MFI )
Figure imgf000015_0001
表 11 样本 PIK3CA基因突变检测结果分析 样本号 液相芯片检测结果 测序检测结果
1 野生型 野生型
2 野生型 野生型
3 野生型 野生型
4 野生型 野生型
5 野生型 野生型
6 野生型 野生型
7 E542K突变 E542K突变
8 野生型 野生型 9 野生型 野生型
10 野生型 野生型
11 野生型 野生型
12 E542K突变 E542K突变
13 野生型 野生型
14 野生型 野生型
15 野生型 野生型
16 E545K突变 E545K突变
17 野生型 野生型
18 野生型 野生型
19 野生型 野生型
20 H1047R突变 H1047R突变 针对同一突变位点所设计的 2组特异性引物序列对样品的检测， 均取得一致的检测效果。 根据上述 ASPE引物设计的要点分别设计的不同液相芯片， 其特异性引物序列不同， 而检测 结果一致。 其他类似情况的具体检测数据省略。 实施例 3 来源序列不同的野生型和突变型特异性弓 I物序列的选择
一、 液相芯片制备的设计 （野生型和突变型特异性引物序列的选择）
针对 PIK3CA基因 Exon9和 Exon20突变位点，分别设计野生型和突变型的 ASPE引物 3 ' 端的特异性引物序列， 检测 Exon9和 Εχοη20突变的特异性引物序列分别是来源于 SEQ ID NO.11- SEQ ID NO.20的 SEQ ID N0.21-SEQ ID NO.40, 或来源于 SEQ NO.41-50的 SEQ ID NO.51 -SEQ ID NO.70。野生型和突变型 ASPE引物 5'端的 Tag序列分别选自 SEQ ID NO.1-10， 相应的，包被于微球上的与对应 tag序列互补配对的 anti-tag序列分别选自 SEQ ID NO.71-80。 具体设计如下表 （表 12 ) 所示。 ASPE引物的合成、 anti-tag序列包被微球、 扩增引物、 检测 方法等如实施例 1和实施例 2所述。
其中， Groupl和 Group3在一个反应系统中同时进行， 即对 Groupl和 Group3并行检测。 同 时， Group2和 Group4也在同一个反应系统中同时进行， 对 Group2和 Group4并行检测。 表 12 液相芯片制备的设计二
基因型 实验组 基因型 特异性引物 Tag序列 anti-tag序歹 ll
Exon9 Grou l 542-wl SEQ ID N0.21 SEQ ID NO. l SEQ ID N0.71
E542K-ml SEQ ID N0.23 SEQ ID N0.2 SEQ ID N0.72 545-wl SEQ ID N0.25 SEQ ID N0.3 SEQ ID N0.73
E545K-ml SEQ ID N0.27 SEQ ID N0.4 SEQ ID N0.74
E545G-ml SEQ ID N0.29 SEQ ID N0.5 SEQ ID N0.75
E545A-ml SEQ ID N0.31 SEQ ID N0.6 SEQ ID N0.76
E545D-ml SEQ ID N0.33 SEQ ID N0.7 SEQ ID N0.77
Group2 542-w2 SEQ ID N0.51 SEQ ID NO.l SEQ ID N0.71
E542K-m2 SEQ ID N0.53 SEQ ID N0.2 SEQ ID N0.72
545-w2 SEQ ID N0.55 SEQ ID N0.3 SEQ ID N0.73
E545K-m2 SEQ ID N0.57 SEQ ID N0.4 SEQ ID N0.74
E545G-m2 SEQ ID N0.59 SEQ ID N0.5 SEQ ID N0.75
E545A-m2 SEQ ID N0.61 SEQ ID N0.6 SEQ ID N0.76
E545D-m2 SEQ ID N0.63 SEQ ID N0.7 SEQ ID N0.77
Group3 1047-wl SEQ ID N0.35 SEQ ID NO.8 SEQ ID N0.78
H1047R-ml SEQ ID N0.37 SEQ ID N0.9 SEQ ID N0.79
H1047L-ml SEQ ID N0.39 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.80
Exon20
Group4 1047-w2 SEQ ID N0.65 SEQ ID NO.8 SEQ ID N0.78
H1047R-m2 SEQ ID N0.67 SEQ ID N0.9 SEQ ID N0.79
H1047L-m2 SEQ ID N0.69 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.80 样品检测
采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例 2所述检测过程和方法对样品 21-40进行检 结果如下：
表 13 样本检测结果一 （MFI)
Figure imgf000018_0001
表 14样本检测结果二 （MFI)
Figure imgf000019_0001
表 15 样本 PIK3CA基因突变检测结果分析
Figure imgf000019_0002
28 野生型 野生型
29 野生型 野生型
30 E542K突变 E542K突变
31 野生型 野生型
32 野生型 野生型
33 E545G突变 E545G突变
34 野生型 野生型
35 野生型 野生型
36 野生型 野生型
37 野生型 野生型
38 野生型 野生型
39 野生型 野生型
40 野生型 野生型 针对同一突变位点的来源于 SEQ ID NO.11- 20或来源于 SEQ IDNO.41-50的特异性弓 |物 序列， 符合上述 ASPE引物设计的要点， 均可用于 Exon9和 Εχοη20突变型检测， 且检测结果一 致， 结果稳定可靠。 其他类似情况的具体数据省略。 实施例 4 野生型和突变型特异性引物序列的选择
一、 液相芯片制备的设计 （野生型和突变型特异性引物序列的选择）
分别以 PIK3CA基因的 Εχοη9和 Εχοη20中一个突变位点的检测液相芯片为例， 针对 Εχοη9和 Εχοη20的野生型设计 ASPE引物 3 '端特异性引物序列， 而 Εχοη9和 Εχοη20突变型 分别选取 E542K、 E545K、 H1047R突变位点， 针对 E542K、 E545K、 H1047R位点的 ASPE 引物 3'端的特异性引物序列分别选自 SEQ ID NO.23-24, SEQ ID N0.27-28 禾卩 SEQ ID N0.37~38o Exon9和 Exon20的野生型（542-w、 545-w和 1047-w) Tag序列分别固定为： SEQ IDNO 1 SEQIDN0.2 D SEQIDNO.3,其相应的突变型分别固定为： SEQIDN0.4、 SEQ ID NO.5和 SEQ ID NO.6， 相应的， 包被于微球上的与对应 tag序列互补配对的 anti-tag序列选 自 SEQIDNO.71~SEQIDNO.76。具体设计如下表（表 16)所示。 ASPE引物的合成、 anti-tag 序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例 1和实施例 2所述。 表 16液相芯片制备的设计三
Figure imgf000020_0001
SEQ ID N0.24 Group 2
SEQ ID N0.27 Group3
SEQ ID N0.25
SEQ ID N0.28 Group4
SEQIDN0.37 Group 5
Exon20 SEQIDN0.35
SEQIDN0.38 Group6 采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例 2所述检测过程和方法对样品 41-60进行
表 17 样本检测结果 （MFI)
Figure imgf000022_0001
表 18 样本 PIK3CA基因突变检测结果分析
Figure imgf000023_0001
针对同一突变位点的野生型和突变型特异性弓 I物序列 （其中， Exon9和 Exon20的野生型 特异性引物分别选自 SEQ ID N0.21-22、 SEQ ID NO.25-26和 SEQ ID NO.35-36, 针对其相应突 变位点的特异性引物分别选自 SEQ ID N0.23-24、 SEQ ID NO.27-34禾 PSEQ ID NO.37-40)， 所 组成的液相芯片均可进行检测， 且检测结果一致。 同样的， 根据上述 ASPE引物设计的要点分 别设计的来源于 SEQ ID NO.11-20或 SEQ ID NO.41-50的特异性引物， 均可进行检测， 结果稳 定可靠。 其他类似情况的具体检测数据省略。 实施例 5 Tag序列及 Anti-Tag序列的选择
一、 液相芯片制备的设计 （Tag序列及 Anti-Tag序列的选择） 以 PIK3CA基因 Exon9中 E452K位点突变的检测液相芯片为例， 针对 Exon9的野生型 和 E452K突变型设计 ASPE引物 3 '端的特异性引物序列，而 ASPE引物 5'端的 Tag序列则选 自 SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.10中的 6条，相应的，包被于微球上的与对应 tag序列互补配对 的 anti-tag序列选自 SEQ ID N0.71 - SEQ ID NO.80ο 具体设计如下表 （表 19) 所示。 ASPE 引物的合成、 anti-tag序列包被微球、 扩增引物、 检测方法等如实施例 1和实施例 2所述。
表 19液相芯片制备的设计四
Figure imgf000024_0001
二、 样品检测
采用上述设计制备的液相芯片， 按实施例 2所述检测过程和方法对样品 61-80进行检测， 检测结果如下：
表 20样本检测结果 （MFI)
Figure imgf000024_0002
76 4377 44 4353 40 4231 53
77 4479 42 4542 43 4069 57
78 4102 46 4185 60 4186 47
79 4432 57 4022 53 4115 59
80 4414 57 4489 59 4045 48 表 21 样本 PIK3CA基因突变检测结果分析
Figure imgf000025_0001
其它针对不同的突变位点的液相芯片， ASPE引物运用上述所设计的不同的 Tag序列， 其 结果依然稳定可靠， 具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明， 但该实施例并非用以限制本发明的专利范 围， 凡未脱离本发明的等效实施或变更， 均应包含于本发明的专利范围中。

Claims

权 利 要 求
1、 一种 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 其特征是， 主要包括有：
(A)针对 PIK3CA基因的突变位点， 分别设计的野生型和突变型的 ASPE引物对： 每种 ASPE引物由 5'端的 tag序列和 3'端针对目的基因突变位点的特异性引物组成， 所述 tag序列 选自 SEQIDNO.l〜SEQIDNO.10中的序列；所述特异性引物是：针对 Exon 9 Codon542的、 来源于 SEQIDNO.ll或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于 SEQ ID NO.12或其反向互 补序列中的碱基序列； 针对于 Exon 9 Codon545的、 来源于 SEQ ID NO.13或其反向互补序 列中的碱基序列、 和来源于 SEQIDN0.14〜SEQIDN0.17中一种以上的碱基序列， 或来源 于其反向互补序列中的一种以上的碱基序列； 禾 或针对 Exon20Codonl047的、 来源于 SEQ ID NO.18或其反向互补序列中的碱基序列、 和来源于 SEQIDNO.19〜SEQIDNO.20中一种 以上的碱基序列， 或来源于其反向互补序列中的一种以上的碱基序列； 上述特异性引物的 3' 端的最后 3位碱基中的一个碱基为突变位点或其对应的野生型位点， 所述特异性引物的 Tm 值在 52~58°C之间；
(B) 分别包被有特异的 anti-tag序列的、 具有不同颜色编码的微球， 所述 anti-tag序列选自 SEQIDNO.71〜SEQIDNO.80中的序列， 且所述 anti-tag序列能相应地与 （A) 中所选的 tag 序列互补配对；
(C)用于扩增出具有 Exon 9和 /或 Exon 20的相应突变位点的 PIK3CA基因目标序列的扩增 引物。
2、 根据权利要求 1所述的 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述扩增引物为： 针对 Exon 9的扩增引物为 SEQ ID N0.81~ SEQ ID N0.82; 针对 Exon 20的扩增引物为 SEQ ID
Figure imgf000026_0001
3、根据权利要求 1所述的 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述特异性引物为： 针 对 Exon9 Codon542野生型的 SEQ ID N0.21或 SEQ ID N0.22, 以及 Codon542突变型 E542K的 SEQ ID N0.23或 SEQ ID N0.24; 和 /或针对 Exon9 Codon545野生型的 SEQ ID N0.25或 SEQ ID N0.26, 以及突变型中的 E545K突变位点的 SEQIDN0.27或SEQIDN0.28、 E545G突变位点的 SEQIDN0.29或 SEQIDNO.30、 E545A突变位点的 SEQ ID N0.31或 SEQ ID N0.32、 禾口 /或 E545D突变位点的 SEQ ID N0.33或 SEQ ID N0.34;禾口 /或针对 Exon 20 Codonl047野生型的 SEQ IDN0.35或 SEQ IDN0.36, 以及突变型中的 H1047R突变位点的 SEQ IDN0.37或 SEQ ID N0.38、 和 /或 H1047L突变位点的 SEQ IDN0.39或 SEQ IDNO.40。
4、根据权利要求 1所述的 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述特异性引物为： 针 对 Exon 9 Codon542野生型的 SEQ ID N0.51或 SEQ ID N0.52, 以及 Codon542突变型 E542K的 SEQ ID N0.53或 SEQ ID N0.54; 和 /或针对 Exon 9 Codon545野生型的 SEQ ID N0.55或 SEQ ID N0.56, 以及突变型中的 E545K突变位点的 SEQ IDN0.57或 SEQ IDN0.58、 E545G突变位点的 SEQIDN0.59或 SEQIDNO.60、 E545A突变位点的 SEQ ID NO.61或 SEQ ID N0.62、 禾口 /或 E545D突变位点的 SEQ ID N0.63或 SEQ ID N0.64;和 /或针对 Exon 20 Codonl047野生型的 SEQ IDN0.65或 SEQ IDN0.66, 以及突变型中的 H1047R突变位点的 SEQ IDN0.67或 SEQ ID N0.68、 和 /或 H1047L突变位点的 SEQ IDN0.69或 SEQ IDNO.70。
5、 根据权利要求 1一 4任一所述的 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述 anti-tag 序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
6、 根据权利要求 5所述的 PIK3CA基因突变检测液相芯片， 其特征是， 所述间隔臂序列为 5— 10个 T。
7、 用于 PIK3CA基因突变检测的特异性引物， 其特征是， 所述特异性引物是： 针对 Exon 9 Codon542的、来源于 SEQ ID NO.ll或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于 SEQ ID NO.12 或其反向互补序列中的碱基序列； 针对于Exon9Codon545的、来源于SEQIDN0.13或其反向 互补序列中的碱基序列、 和来源于SEQIDN0.14〜SEQIDN0.17中一种以上的碱基序列， 或 来源于其反向互补序列中的一种以上的碱基序列； 禾 P/或针对 Exon20Codonl047的、 来源于 SEQIDN0.18或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于 SEQ ID N0.19〜SEQ ID NO.20中一 种以上的碱基序列，或来源于其反向互补序列中的一种以上的碱基序列；上述特异性引物的 3' 端的最后 3位碱基中的一个碱基为突变位点或其对应的野生型位点， 所述特异性引物的 Tm值 在 52~58°C之间。
8、根据权利要求 7所述的用于 PIK3CA基因突变检测的特异性引物， 其特征是， 所述特异性引 物为： 针对 Exon9Codon542野生型的 SEQIDN0.21或 SEQIDN0.22, 以及 Codon542突变型 E542K的 SEQ ID N0.23或 SEQ ID N0.24; 和 /或针对 Exon9 Codon545野生型的 SEQ ID N0.25 或 SEQIDN0.26, 以及突变型中的 E545K突变位点的 SEQ ID N0.27或 SEQ ID N0.28、 E545G 突变位点的 SEQ ID N0.29或 SEQ ID NO.30、 E545A突变位点的 SEQ ID N0.31或 SEQ ID N0.32、和 /或 E545D突变位点的 SEQ IDN0.33或 SEQ ID 0.34;禾口 /或针对 Exon 20 Codonl047 野生型的 SEQ ID N0.35或 SEQ ID N0.36, 以及突变型中的 H1047R突变位点的 SEQ ID N0.37 或 SEQ ID N0.38、 禾口 /或 H1047L突变位点的 SEQ ID N0.39或 SEQ ID NO.40。
9、根据权利要求 7所述的用于 PIK3CA基因突变检测的特异性引物， 其特征是， 所述特异性 引物为： 针对Exon9Codon542野生型的SEQIDN0.51或SEQIDN0.52， 以及 Codon542突 变型 E542K的 SEQ ID N0.53或 SEQ ID N0.54;和 /或针对 Exon 9 Codon545野生型的 SEQ ID N0.55或 SEQ ID N0.56,以及突变型中的 E545K突变位点的 SEQ ID NO.57或 SEQ ID N0.58. E545G突变位点的 SEQ ID NO 59或 SEQ ID NO.60、E545A突变位点的 SEQ ID NO.61或 SEQ ID N062 禾口 /或 E545D突变位点的 SEQ ID NO.63或 SEQ ID NO.64； 和 /或针对 Exon 20 Codonl047野生型的 SEQIDN0.65或 SEQIDN0.66， 以及突变型中的 H1047R突变位点的 SEQ ID NO.67或 SEQ ID N0.68,禾口 /或 H1047L突变位点的 SEQ ID NO.69或 SEQ ID NO.70。
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