CN101275166A - 用于鉴定n-乙酰基转移酶2(nat2)基因型的核苷酸引物组和探针 - Google Patents
用于鉴定n-乙酰基转移酶2(nat2)基因型的核苷酸引物组和探针 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于鉴定N－乙酰基转移酶2(NAT2)基因型的核苷酸引物组和探针，具体地，提供了用于检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A、G857A和T341C的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组。本发明还提供了用于检测通过本发明引物组所扩增的扩增产物的核苷酸探针。本发明还提供了通过使用本发明的引物组检测NAT2基因中单核苷酸多肽性G590A、G857A和T341C的基因型的方法。
Description
发明背景
本发明涉及用于检测N-乙酰基转移酶2(NAT2)基因中单核苷酸多态性的基因型的核酸引物组和检测探针。
N-乙酰基转移酶2(NAT2)涉及临床上重要的药物如肺结核内服药异烟肼(INH)和水杨酸偶氮磺胺吡啶的代谢。水杨酸偶氮磺胺吡啶用于治疗溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎等疾病。
已知在编码NAT2的基因中存在遗传多态性。NAT2活性较高的表现型称为快型乙酰化者(RA)，而NAT2活性较低的表现型称为慢型乙酰化者(SA)。据报道在日本人群中存在四种类型的多态型(NAT2＊4，NAT2＊5，NAT＊6，NAT2＊7)。NAT2＊4是野生型。通过分析单核苷酸多态性T341C、G590A和G857A基因型可以分别鉴定出突变体等位基因NAT2＊5、NAT＊6和NAT2＊7。具有纯合子突变体等位基因或混合杂合子突变体等位基因的人很可能是SA，并且具有更高的有害药物作用发生率。
为此，鉴定NAT2基因突变体有助于避免有害的药物反应。还有可能通过确定NAT2基因的基因型来选择适用于个体病人的药物施用和治疗。
通常通过借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增靶核苷酸并用特异性探针检测野生型和突变体扩增产物来检测单核苷酸多态性(见，参考文献“JainK.K.，Application of Amplicip.CYP450，Mol Diagn.9，119-27[2005]”)。然而，PCR方法具有一些缺点，例如预处理过程(包括核苷酸提取)复杂，需要复杂的温控设备，例如热循环仪，以及需要2小时或更长的反应时间。通过PCR方法扩增的产物为双链，这导致产生一个问题，即互补链降低了检测灵敏度，在检测过程中其又作为探针的竞争者起作用。已经研究了将扩增产物转变成单链的多种方法，例如通过使用酶或磁珠将互补链分解或分离。但是这些方法也存在操作复杂且昂贵的问题。
发明简述
根据本发明的一个方面，提供了用于检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其中当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且当引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，引物组包括选自表2和3所示引物组1-16的FIP引物和BIP引物、结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
表2和3所示引物组1-16如下：
引物组1：SEQ ID No：1的FIP引物和SEQ ID No：7的BIP引物；
引物组2：SEQ ID No：2的FIP引物和SEQ ID No：7的BIP引物；
引物组3：SEQ ID No：5的FIP引物和SEQ ID No：7的BIP引物；
引物组4：SEQ ID No：6的FIP引物和SEQ ID No：7的BIP引物；
引物组5：SEQ ID No：10的FIP引物和SEQ ID No：13的BIP引物；
引物组6：SEQ ID No：10的FIP引物和SEQ ID No：14的BIP引物；
引物组7：SEQ ID No：15的FIP引物和SEQ ID No：11的BIP引物；
引物组8：SEQ ID No：15的FIP引物和SEQ ID No：12的BIP引物；
引物组9：SEQ ID No：15的FIP引物和SEQ ID No：13的BIP引物；
引物组10：SEQ ID No：15的FIP引物和SEQ ID No：14的BIP引物；
引物组11：SEQ ID No：16的FIP引物和SEQ ID No：11的BIP引物；
引物组12：SEQ ID No：16的FIP引物和SEQ ID No：12的BIP引物；
引物组13：SEQ ID No：16的FIP引物和SEQ ID No：13的BIP引物；
引物组14：SEQ ID No：16的FIP引物和SEQ ID No：14的BIP引物；
引物组15：SEQ ID No：17的FIP引物和SEQ ID No：13的BIP引物；
引物组16：SEQ ID No：17的FIP引物和SEQ ID No：14的BIP引物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测NAT2基因中单核苷酸多态性G857A的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其中引物组包括选自表4所示引物组1-5的FIP引物和BIP引物、结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
表4所示引物组1-5如下：
引物组1：SEQ ID No：20的FIP引物和SEQ ID No：21的BIP引物；
引物组2：SEQ ID No：20的FIP引物和SEQ ID No：22的BIP引物；
引物组3：SEQ ID No：20的FIP引物和SEQ ID No：23的BIP引物；
引物组4：SEQ ID No：20的FIP引物和SEQ ID No：25的BIP引物；
引物组5：SEQ ID No：20的FIP引物和SEQ ID No：26的BIP引物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测NAT2基因中单核苷酸多态性T341C的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其中引物组包括选自表5所示引物组1-10的FIP引物和BIP引物、结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
表5所示引物组1-10如下：
引物组1：SEQ ID No：33的FIP引物和SEQ ID No：30的BIP引物；
引物组2：SEQ ID No：33的FIP引物和SEQ ID No：31的BIP引物；
引物组3：SEQ ID No：33的FIP引物和SEQ ID No：32的BIP引物；
引物组4：SEQ ID No：34的FIP引物和SEQ ID No：30的BIP引物；
引物组5：SEQ ID No：34的FIP引物和SEQ ID No：31的BIP引物；
引物组6：SEQ ID No：34的FIP引物和SEQ ID No：32的BIP引物；
引物组7：SEQ ID No：35的FIP引物和SEQ ID No：32的BIP引物；
引物组8：SEQ ID No：36的FIP引物和SEQ ID No：32的BIP引物；
引物组9：SEQ ID No：37的FIP引物和SEQ ID No：32的BIP引物；
引物组10：SEQ ID No：38的FIP引物和SEQ ID No：32的BIP引物。
根据本发明的另一个方面，提供了用于检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A和G857A的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其中引物组包括选自表6所示引物组1-8的FIP引物和BIP引物、结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
表6所示引物组1-8如下：
引物组1：SEQ ID No：42的FIP引物和SEQ ID No：43的BIP引物；
引物组2：SEQ ID No：42的FIP引物和SEQ ID No：44的BIP引物；
引物组3：SEQ ID No：45的FIP引物和SEQ ID No：43的BIP引物；
引物组4：SEQ ID No：45的FIP引物和SEQ ID No：46的BIP引物；
引物组5：SEQ ID No：47的FIP引物和SEQ ID No：43的BIP引物。
引物组6：SEQ ID No：48的FIP引物和SEQ ID No：43的BIP引物；
引物组7：SEQ ID No：48的FIP引物和SEQ ID No：46的BIP引物；
引物组8：SEQ ID No：48的FIP引物和SEQ ID No：44的BIP引物。
根据本发明的另一个方面，提供了检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A、G857A或T341C的基因型的方法，包括步骤：通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸得到扩增产物；和测定并比较扩增产物中所包含的野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。
本发明的另一个方面提供了用于检测通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸所得到扩增产物的NAT2基因单核苷酸多态性G590A基因型的野生型和突变体核酸探针。
在一个方面，野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有62-70℃的Tm值，而突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有61-69℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G590A位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。在另一个方面，野生型核苷酸探针具有58-68℃的Tm值，而突变体核苷酸探针具有58-68℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G875A位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。在另一个方面，野生型核苷酸探针具有61-69℃的Tm值，而突变体核苷酸探针具有58-70℃的Tm值，并且单核苷酸多态性T341C位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。
本发明的另一个方面提供了同时检测NAT2基因的单核苷酸多态性G590A、G857A和T341C的基因型的方法。
本发明还提供了用于检测NAT2基因的单核苷酸多态性基因型的核苷酸引物和检测探针。因此，可以容易且成本低廉地检测NAT2基因的T341C、G590A和G857A单核苷酸多态性位点的基因型。
附图简述
图1是LAMP方法的示意图；
图2是说明LAMP方法中中间产物以及内引物(FIP和BIP)退火位点的示意图；
图3是说明环引物位置的示意图；
图4是说明LAMP方法中中间产物以及环引物(LFc和LBc)退火位点的示意图；
图5是说明扩增产物检测位置的示意图；
图6是探针固定化支持物的一个实施方案的平面示意图；
图7是说明该探针固定化支持物的一个实施方案的平面示意图；
图8显示FIP引物位置的示意图；
图9A显示NAT1和NAT2基因的序列，O指出报道的突变位点；
图9B是图9A的延续，显示NAT1和NAT2基因序列，O指出报道的突变位点；
图10显示通过使用引物组得到的扩增产物的电泳图，左图为1小时扩增，右图为1小时扩增，符号M、1、2、3、4、5和6分别代表100bp梯、引物组1、引物组2、引物组18、引物组19、引物组3和引物组4；图11显示通过使用引物组得到的扩增产物的另一张电泳图，符号M、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16分别代表100bp梯、引物组20、引物组21、引物组5、引物组6、引物组7、引物组8、引物组9、引物组10、引物组11、引物组12、引物组13、引物组14、引物组22、引物组23、引物组15和引物组16；
图12显示扩增产物(包括非特异扩增产物)的电泳图，符号M、1和2分别代表100bp梯、无非特异扩增和有非特异扩增；
图13显示了通过使用检测G590A的探针所获得的试验结果1的图；
图14显示了通过使用检测G590A的探针所获得的试验结果2的图；
图15A显示了通过使用检测G590A的探针所获得的试验结果3(野生型纯合子)的图，(a)、(b)、(c)和(d)分别代表不洗涤、40℃洗涤、45℃洗涤和50℃洗涤的情况；
图15B显示了通过使用检测G590A的探针所获得的试验结果3(突变体纯合子)的图，(a)、(b)、(c)和(d)分别代表不洗涤、40℃洗涤、45℃洗涤和50℃洗涤的情况；
图15C显示了通过使用检测G590A的探针所获得的试验结果3(杂合子)的图，(a)、(b)、(c)和(d)分别代表不洗涤、40℃洗涤、45℃洗涤和50℃洗涤的情况；
图16A显示了通过使用检测G857A的探针所获得的试验结果1(引物组1)的图；
图16B显示了通过使用检测G857A的探针所获得的试验结果1(引物组5)的图；
图17显示了通过使用检测G857A的探针所获得的试验结果2的图，(a)、(b)和(c)分别代表野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的情况；
图18A显示了通过使用检测T341C的探针所获得的试验结果1(引物组6)的图，(a)、(b)和(c)分别代表野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的情况；
图18B显示了通过使用检测T341C的探针所获得的试验结果1(引物组10)的图，(a)、(b)和(c)分别代表野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的情况；
图19显示了同时扩增G590A和G857A的结果的图，(a)、(b)和(c)分别代表野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的情况；
图20A显示了同时检测G590A、G857A和T341A(用于T341C的引物组6)的结果的图，(a)、(b)和(c)分别代表野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的情况，G590A代表引物组9，G857A代表引物组5，T341C代表引物组6；和
图20B显示了同时检测G590A、G857A和T341A(用于T341C的引物组10)的结果的图，(a)、(b)和(c)分别代表野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的情况，G590A代表引物组9，G857A代表引物组5，T341C代表引物组10。
发明详述
PCR方法经常用于检测单核苷酸多态性，但是PCR方法具有上述缺点。因此，在本发明中单核苷酸多态性通过替代PCR方法的环介导的等温扩增(LAMP)方法检测。在LAMP方法中，核苷酸在60-65℃等温条件下扩增。LAMP方法具有优点，即与PCR方法相比可以在更短的时间内得到更大量的扩增产物。还报道，反应受样品中杂质的影响较小。因此通过LAMP方法可以容易地扩增靶核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，通过LAMP方法扩增了靶核苷酸，并且分别测定了扩增产物中野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。当存在许多野生型扩增产物时，可将所试验靶核苷酸的基因型判定为野生型纯合子。相反，当存在许多突变体扩增产物时，可将靶核苷酸的基因型判定为突变体纯合子。备选地，当野生型和突变体扩增产物的量几乎相等时，将靶核苷酸的基因型判定为杂合子。
例如使用核苷酸探针测定扩增产物的量。核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的探针和与突变体扩增产物互补的探针。允许扩增产物与各个核苷酸探针彼此杂交，并且测定结合至各个核苷酸探针的扩增产物的量。通过比较结合至野生型核苷酸探针的扩增产物的量和结合至突变体核苷酸探针的扩增产物的量可以确定靶核苷酸的基因型。
LAMP方法概述
在下文将简要描述LAMP方法。在本说明书中，将进行单核苷酸多态性检测的核苷酸(包括基因组DNA等)将称作分析物核苷酸。通过LAMP方法扩增的NAT2基因的区域被称作靶核苷酸。通过LAMP方法得到的产物将称作扩增产物。包含人基因组DNA的溶液将称作样品溶液。
在LAMP方法中，将靶核苷酸设计成从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区。使用图1所示的4种引物扩增靶核苷酸。F1c、F2c、F3c、B1、B2和B3区是互补链上分别对应于F1、F2、F3、B1c、B2c和B3c区的区域。
在LAMP方法中用于扩增核苷酸的4种引物是(1)在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物；(2)具有与F3区相同的序列的F3引物；(3)在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物；和(4)具有与B3c区互补的序列的B3引物。通常，FIP和BIP引物称作内引物，而F3和B3引物称作外引物。
使用4种引物进行LAMP扩增得到如图2所示具有哑铃结构的中间产物。FIP和BIP引物结合至单链环的F2c区和B2c区，并且延伸反应从每一引物的3’末端和中间产物自身的3’末端开始进行。细节见日本专利号3313358。
通过在LAMP方法中任选地使用称作环引物的引物，可以缩短扩增时间段。在此情况下，如图3所示，在从F2区至F1区的区域内设计LF区并且在从B2c区至B1c区的区域内设计LBc区。这些区域称作环引物区。除了使用4种引物之外，还使用具有与LF区互补的序列的环引物LFc和具有与LBc区相同的序列的环引物LBc。细节见WO2002/024902。这些环引物LFc和LBc可同时使用，或者备选地，仅使用它们中的一个。如图4所示，环引物与环退火，与其退火的环与FIP和BIP引物所退火的环是不同的环，从而给出另外的合成起点并因此加速扩增。
检测LAMP扩增产物；核苷酸探针
为了检测单核苷酸多态性，如图5所示，待检测的多态性位点位于FP区或BPc区。备选地，不同的多态性可以位于FP区或BPc区。如图5所示，从F2区至F1区的区域是在扩增产物中变成单链的部分。类似地，从B2c区至B1c区的区域也是在扩增产物中变成单链的部分。通过将待检测的多态性位点至于单链部分，使得通过核苷酸探针的检测更容易。
将核苷酸探针设计成结合至包含多态性位点的FP区或BPc区。因此，核苷酸探针具有与在FP区或BPc区包含多态性位点的区域互补的序列。
在扩增产物中还存在与FP区互补的FPc区以及与BPc区互补的BP区。因此，可以使用FPc区和BP区用于检测。
在本说明书中，包含与野生型扩增产物序列互补的序列的核苷酸探针称作野生型核苷酸探针，而包含与突变体扩增产物序列互补的序列的核苷酸探针称作突变体核苷酸探针。
核苷酸探针可以包括，但不限于，DNA、RNA、PNA、LNA、具有甲基磷酸酯骨架的核苷酸或者合成的核苷酸链。为了将其固定化于支持物上，其末端可以用活性官能团如氨基、羧基、羟基、巯基或磺酰基修饰。可在官能团和核苷酸之间导入间隔区。间隔区可以具有例如烷烃骨架、乙二醇骨架等。
核苷酸探针固定化支持物
核苷酸探针可以例如作为固定化于支持物上的探针使用。在已知的装置，如所谓的DNA芯片和DNA微点阵中可以使用核苷酸探针固定化支持物。
探针固定化支持物的一个实施方案如图6所示。探针被固定化于支持物1的固定化区域2中。支持物1可以用硅基质制备，但不限于硅基质。探针可以通过任意已知方法固定化。可以将一种探针固定化于支持物上，或者将不同种类的探针固定化于支持物上，其位置和数量根据本领域技术人员的需要而变化。如将在下文所述，根据本发明的探针固定化支持物可用于探针的荧光检测。
探针固定化支持物的另一个实施方案的示意图如图7所示。在本实施方案中，在支持物11上形成电极12。探针固定化在电极12上。每一电极12与提取电信息的垫(pad)13相连。支持物11可以从例如硅基质制备，但不限于硅基质。电极的产生和探针的固定化可通过任何已知方法开展。电极可由任何材料制成，包括但不限于单一金属如金、金合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓和钨、其合金、碳如石墨和玻璃碳、以及它们的氧化物或化合物。
图7中所示的固定化支持物具有10个电极，但是在单一支持物上形成的电极的数量不限于此并且可以任选地改变。电极的位置模式也不限于图中所示的模式，其可以根据本领域技术人员的需要而改变。根据需要，可在支持物1上形成参比电极和反电极。如下文将描述，该实施方案的探针固定化支持物可用于电化学检测。
核苷酸探针与扩增产物的杂交
在适宜条件下，扩增产物杂交至核苷酸探针。适宜条件根据扩增产物的种类和结构、在待检测序列中包含的核苷酸的种类、以及核苷酸探针的种类而改变。具体而言，杂交在离子强度范围为0.01-5并且pH范围在5-10的缓冲溶液中开展。可向反应溶液中加入硫酸葡聚糖(一种杂交促进剂)、鲑精DNA、牛胸腺DNA、EDTA、表面活性剂等。反应温度例如在10-90℃范围内，反应混合物可以搅拌或振荡以改善反应效率。反应之后，例如离子强度范围为0.01-5并且pH范围为5-10的缓冲溶液用于洗涤。
检测方法
固定化于支持物上的探针与扩增产物之间的杂交产生双链核苷酸。双链核苷酸可用电化学方式检测或荧光检测。
(a)电流检测系统
下面将描述双链核苷酸的电化学检测。方法使用识别双链的化合物，该化合物特异识别双链核苷酸。识别双链的化合物的实例包括但不限于Hoeches 33258、吖啶橙、米帕林、柔红霉素、金属嵌入剂、双嵌入剂如双吖啶、三嵌入剂和多嵌入剂。这些物质可以用电化学活性金属络合物，如二茂铁或紫精修饰。
识别双链的化合物的浓度会根据其种类而改变，但通常使用的浓度范围为1ng/mL至1mg/mL。在该情况下，优选使用离子强度范围为0.001-5并且pH范围为5-10的缓冲溶液。
在杂交过程中或杂交后向反应溶液中加入识别双链的化合物。如果通过杂交形成了双链核苷酸，则识别双链的化合物结合至双链核苷酸。例如通过施加高于导致识别双链的化合物发生电化学反应的电位的电位可以测量从识别双链的化合物产生的反应电流。在该情况下，可以恒定速度施加电位，或者以脉冲形式施加或者以恒定电压施加。在测定过程中，通过使用装置如恒电位仪、数字多用表或函数发生器控制电流和电压。例如，优选使用在JP-A 10-146183(KOKAI)中公开的已知的电化学检测方法。
(b)荧光检测方法
下面将描述通过荧光检测双链核苷酸的方法。先前用荧光活性物质标记引物。备选地，使用用荧光活性物质标记的二级探针检测。可使用带有多重标记的二级探针。荧光标记物质的实例包括但不限于荧光色料，例如FITC、Cy3、Cy5和罗丹明。荧光材料用例如荧光检测器检测。适宜标记种类的检测器用于检测标记的待检测序列或二级探针。
核苷酸引物的选择
图8是显示核苷酸引物的示意图，其中单核苷酸多态性G590A位于F2和F1之间的区域，即FP区。FIP引物具有与F2区序列相同的序列和与F1区序列互补的序列。可以设计多种类型的引物，只要F2区和F1区的位置使得G590A位于它们之间即可。
然而，本发明人的研究已经显示，通过LAMP方法的扩增效率根据引物的种类而改变。例如，使用图8内所示4种引物中的一个引物和共同的3个引物(BIP、F3和B3引物)开展扩增。结果，甚至在足够的时间段之后，例如2小时之后具有引物1的样品仍然没有扩增。具有引物2的样品在大约1小时之后扩增，但出现引物的非特异扩增。具有引物3的样品没有导致引物的非特异扩增，但是需要的扩增时间段为1.5-2小时。具有引物4的样品没有导致引物的非特异扩增并且在1小时内完成扩增。在该情况下，优选用于扩增的引物是引物3和引物4，并且最佳引物是引物4。因此它是优越的引物，扩增效率更高，允许在短时间内扩增并且未导致非特异性扩增。
为了用核苷酸探针检测扩增产物，扩增产物优选地用核苷酸探针以高效率杂交。因此，在评估引物时还可考虑扩增产物的杂交效率。
人NAT2基因与人NAT1非常高度同源。NAT2和NAT1基因的序列显示于图9A和9B。由于NAT2和NAT1基因彼此高度同源，为了特异性括增NAT2必须在NAT2和NAT1之间序列不同的区域设置引物。
因此，至少一条引物需要设置于在NAT2和NAT1之间序列不同的区域。优选地，至少F1、F2、B1和B2区域之一需要设置于在NAT2和NAT1之间序列不同的区域。而且没有引物设置于报道有如图9中所示突变体的区域。如果一条引物不可避免地设置于此种突变体位点，则会导入通用碱基如混合碱基或脱氧肌苷(dI)。另一条内部不含单核苷酸多态性的内引物优选地放置于长度为450bp或更短、更加优选为350bp或更短的F2至B2的区域内。此外，两条内引物优选地设计成使得单链环长度为100bp或更短，更加优选为70bp或更短。
引物间的非特异性扩增是LAMP反应中常见的现象。包含F1c区和F2区的引物FIP常常是长链核苷酸。同样，包含B1c区和B2区的BIP引物常常是长链核苷酸。因此，在FIP引物当中、在BIP引物当中或者FIP和BIP引物彼此纠缠在一起，常常允许以引物为模板进行扩增。与PCR反应相比，LAMP反应中的非特异性反应的可能性较高，因为反应溶液包含F3和B3引物，并且在一些情况下还额外包含LFc和LBc引物。此类非特异性反应导致通过使用分析物核苷酸作为模板得到的目的LAMP产物的量降低。
如果在未加入分析物核苷酸的阴性对照反应溶液中出现非特异性反应，则不能确定随着扩增的进行释放的焦磷酸和Mg的白色沉淀是由非特异扩增导致的还是由污染导致的。因此，排除可能导致非特异扩增的引物是重要的。
因此，本发明人已经开展试验，以选择最适合扩增NAT2基因的单核苷酸多态性G590A以及还用于扩增单核苷酸多态性G857A和T341C的核苷酸引物。
[试验1-1：用于G590A的引物；FP区]
通过使用在FP区包含NAT2G590A多态性位点的6种核苷酸引物组，于63℃开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯水代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所使用的核苷酸引物组示于表2。
表1LAMP反应组成
| Bst DNA聚合酶 | 1μL |
| 2×缓冲液 | 12.5μL |
| Tris·HCl pH 8.0 40mM | |
| KCl 20mM | |
| MgSO4 16mM | |
| (NH4)2SO4 20mM | |
| Tween 200.2％ | |
| 甜菜碱 1.6M | |
| dNTP 2.8mM |
| F3引物(10μM) | 0.5μL |
| B3引物(10μM) | 0.5μL |
| FIP引物(40μM) | 1μL |
| BIP引物(40μM) | 1μL |
| LFc引物(20μM) | 1μL |
| 人基因组(30ng/μL) | 1μL |
| 无菌超纯水 | 6.5μL |
| 总计 | 25μL |
F3引物含有SEQ ID No.8的序列，而B3引物含有SEQ ID No.9的序列，并且两条引物共同用于全部组。
[试验1-1：结果]
将通过使用表2中所示的6种引物组获得的扩增产物进行电泳。结果总结于图10中。扩增1小时后，使用引物组3和4获得了足够量的扩增产物(泳道5和6)。扩增2小时后，使用引物组1、2、3和4获得了足够量的扩增产物(泳道1、2、5和6)。使用引物组18和19(泳道3和4)，仅获得少量产物，或者没有检测到产物。在任意引物组中都没有观察到非特异性扩增。上面的结果表明，引物组1、2、3和4是优选的，并且引物组3和4是最优选的。结果总结于表2。
[试验1-2：用于G590A的引物；BP区]
通过使用在BP区包含NAT2 G590A多态性位点的16种核苷酸引物组，于63℃开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯水代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所使用的核苷酸引物组示于表3。
F3引物含有SEQ ID No.18的序列，而B3引物含有SEQ ID No.19的序列，并且两条引物共同用于全部组。
[试验1-2：结果]
将通过使用表3中所示的16种引物组获得的扩增产物进行电泳。结果总结于图11中。扩增1小时后，使用引物组9产生了足够量的扩增产物(泳道7)。扩增2小时后，使用引物组5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20和21产生了足够量的扩增产物。使用引物组22和23未获得扩增产物。如图12所示使用引物组20和21产生了非特异性扩增。上面的结果表明，引物组5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16是优选的，并且引物组9是最优选的。结果总结于表3。
[试验2：用于G857A的引物；BP区]
通过使用在BP区包含NAT2 G857A多态性位点的6种核苷酸引物组，于63℃开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯水代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所使用的核苷酸引物组示于表4。
F3引物含有SEQ ID No.27的序列，而B3引物含有SEQ ID No.28的序列，并且两条引物共同用于全部组。
[试验2：结果]
将通过使用表4中所示的6种引物组获得的扩增产物进行电泳。扩增1小时后，使用引物组1、2、3、4和5产生了足够量的扩增产物。同样，扩增2小时后，使用引物组1、2、3、4和5产生了足够量的扩增产物。使用引物组6甚至是在2小时后仍未观察到扩增。在任意组中未观察到非特异性扩增。结果表明引物组1、2、3、4和5是最优选的。结果总结于表4。
[试验3：用于T341C的引物；BP区]
通过使用在BP区包含NAT2 T341C多态性位点的13种核苷酸引物组，于63℃开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯水代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所使用的核苷酸引物组示于表5。
引物组1、2、3、4、5、11、12、13和14中的F3引物含有SEQ ID No.39的序列。引物组6、7、8和9中的F3引物含有SEQ ID No.41的序列。B3引物含有SEQ ID No.40的序列，并共同用于全部组。
[试验3：结果]
将通过使用表5中所示的13种引物组获得的扩增产物进行电泳。扩增1小时后，使用引物组3、6、9和10产生了足够量的扩增产物。扩增2小时后，使用引物组1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11产生了足够量的扩增产物。使用引物组12和13甚至是在2小时后仍未观察到扩增。使用引物组11观察到非特异性扩增。使用引物组1、2、3、4、5、6、7、8、9和10未观察到非特异性扩增。上面的结果表明，引物组1、2、3、4、5、6、7、8、9和10是优选的，并且引物组3、6、9和10是最优选的。结果总结于表5。
选择用于同时扩增G590A和G857A多态性位点的核苷酸引物
多态性位点可以放置于FP区和BP区两区域内。这样，有可能仅使用一种扩增产物测量两个或多个单核苷酸多态性位点。例如，关于G590A和G857A，G590A可以放置于FP区，且G857A放置于FP区。尽管由于G590A和G857A在一定程度上彼此分离且靶长度(从F2到B2的长度)变为大约350bp，从而使扩增效率低到一定程度，但是仍然有可能例如通过导入环引物在1个小时的短周期内进行扩增。为了同时扩增G590A和G857A，有可能使用在单一反应管中扩增各自产物的方法(多重扩增)，但是多重扩增需要严格的条件设置。而且，即便严格的控制可能导致仅一种产物的优先扩增而不扩增其他产物。因此，通过上述方法用一种扩增产物同时测量2个或多个单核苷酸多态性位点是特别有利的。
[试验4：用于G590A(FP区)的引物和用于G857A(BP区)的引物；]
通过使用在FP区包含NAT2 G590A多态性位点和在BPc区包含NAT2 G857A多态性位点的11种核苷酸引物组，于63℃开展扩增1小时或2小时。反应溶液成分如表1所示。使用的模板DNA是人基因组。为了检查污染和非特异性扩增存在与否，在所有组中准备了用灭菌超纯水代替人基因组的阴性对照。在扩增反应之后，扩增产物通过3％琼脂糖电泳鉴定。
所使用的核苷酸引物组示于表6。
F3引物含有SEQ ID No.49的序列，而B3引物含有SEQ ID No.50的序列，并且两条引物共同用于全部组。
[试验4：结果]
将通过使用表6中所示的11种引物组获得的扩增产物进行电泳。扩增1小时后，使用任意引物组均未观察到扩增。扩增1.5小时后，使用引物组1、6、7和8产生了足够量的扩增产物。扩增2小时后，使用引物组1、2、3、4、5、6、7、8和10产生了足够量的扩增产物。使用引物组9和11甚至是在2小时后仍未观察到扩增。使用引物组10观察到非特异性扩增。使用引物组1、2、3、4、5、6、7和8未观察到非特异性扩增。上面的结果表明，引物组1、2、3、4、5、6、7和8是优选的，并且引物组1、6、7和8是最优选的。结果总结于表6。
通过上面的试验确定了本发明所提供的优选的内引物。对于本领域的技术人员而言显而易见地是，LAMP反应中最重要的引物是内引物。虽然内引物是扩增反应所必需的，但是外引物和环引物不是必需的。向扩增反应溶液中添加外引物和环引物会导致扩增效率提高，但是与内引物相比其位置的改变对扩增效率的影响较小。因此，外引物(F3和B3引物)可以任选设计。例如，其优选位于距F2区5’末端60个碱基范围内的区域内或者距B2c区的3’末端60个碱基内的区域内。因此，具有与F3引物相同的序列的F3区优选位于距F2区5’末端60个碱基范围内的区域内，并且具有与B3引物互补的序列的B3c区优选位于距B2c区3’末端60个碱基范围内的区域内。优选将环引物设计成结合至不同于内引物所结合环的环，并且环引物不位于内引物区。
核苷酸探针的选择
核苷酸探针链既不能太长也不能太短。通常，链长度增加导致结合力增加，但根据碱基种类会存在一些差异。核苷酸探针的链长度过短导致降低核苷酸探针与扩增产物之间的杂交效率。另一方面，核苷酸探针的链长度过长导致野生型核苷酸探针与突变体核苷酸探针间的单碱基差异降低。因此，野生型扩增产物与突变体核苷酸探针之间以及突变体扩增产物与野生型核苷酸探针之间的非特异性结合增加。因此，优选使用具有适当链长度，如10-35个碱基的核苷酸探针来检测单核苷酸多态性。
结合力可通过双链核苷酸的解离温度Tm来表示。Tm值可通过例如近邻法、Wallance法或GC％法计算。在本发明中，使用的是近邻法(Breslauer等，1986；Freier等，1986；Schildkraut等，1965)。在本发明中，于50mM的Na+浓度和0.5μM的核苷酸探针(寡核苷酸)浓度条件下计算Tm值。
在下文，将描述用于选择适用于检测根据本发明所得到扩增产物的核苷酸探针的试验。
[试验5-1：用于检测G590A的探针]
通过使用经聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析确定为杂合子的人基因组作为模板，并且使用用于检测G590A的引物组9，于63℃开展LAMP扩增1小时。用于检测G590A的引物组9是经上述试验1-2确定为最佳的引物组。所得到的扩增产物在电流检测DNA芯片上检测。
核苷酸探针：
所试验的核苷酸探针的核苷酸序列概括于表7。所使用的核苷酸探针是正链。核苷酸探针的3’末端经巯基修饰，以便固定化在电极上。阴性对照探针是其序列与NAT2基因完全无关的核苷酸。
固定化核苷酸探针支持物：
在DNA芯片上制成金电极，并且在其上固定核苷酸探针。通过使用巯基与金之间的强结合力进行固定化。将包含具有巯基修饰末端的核苷酸探针的探针溶液点在金电极上，1小时后，将DNA芯片浸在1mM巯基己醇溶液中，然后用0.2×SSC溶液洗涤。同一探针点在两个电极上。洗涤之后，用超纯水洗涤芯片，空气干燥，得到探针固定化支持物。
分别在下列电极上固定核苷酸探针：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.51)
电极3-4：野生型核苷酸探针17mer(SEQ ID No.52)
电极5-6：野生型核苷酸探针21mer(SEQ ID No.53)
电极7-8：野生型核苷酸探针26mer(SEQ ID No.54)
电极9-10：野生型核苷酸探针29mer(SEQ ID No.55)
电极11-12：突变体核苷酸探针19mer(SEQ ID No.56)
电极13-14：突变体核苷酸探针21mer(SEQ ID No.57)
电极15-16：突变体核苷酸探针23mer(SEQ ID No.58)
电极17-18：突变体核苷酸探针27mer(SEQ ID No.59)
电极19-20：突变体核苷酸探针30mer(SEQ ID No.60)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及其检测：
向通过扩增得到的扩增产物中加入终浓度为2×SSC的盐，然后允许混合物与电极上固定的核苷酸探针杂交。反应温度为35、45、50、55和60℃并且反应时间段为60分钟。然后，用超纯水温和洗涤DNA芯片。将DNA芯片浸入含50μM嵌入剂Hoechst 33258的磷酸缓冲溶液中10分钟并洗涤，然后测定Hoechst 33258分子的氧化电流反应。
[试验5-1：结果]
结果总结于图13。随着反应温度的提高，信号增加了，这表明反应温度的提高导致杂交效率的提高。于55和60℃反应温度的试验得到几乎相同的结果。
[试验5-2：用于检测G590A的探针]
然后，以与试验5-1相似的方式开展杂交，不同的是反应温度为55℃并且反应时间为10、20、40、60和120分钟。
[试验5-2：结果]
结果总结于图14。反应时间为10和120分钟的试验得到几乎相同的结果，表明在10分钟后，杂交反应已经处于饱和状态。
链长度相对较短的野生型核苷酸探针(17G：SEQ ID No.52)和突变体核苷酸探针(19A：SEQ ID No.56，21A：SEQ ID No.57和23A：SEQ ID No.58)得到强度相对较低的信号。野生型核苷酸探针(21G：SEQ ID No.53，26G：SEQ ID No.54和29G：SEQ ID No.55)和突变体核苷酸探针(27A：SEQ ID No.59和30A：SEQ ID No.60)得到强度几乎相等的信号。
[试验5-3：用于检测G590A的探针]
然后，以与试验5-1相似的方式在反应温度为55℃进行杂交反应20分钟。随后，将核苷酸探针固定化支持物浸入40、45或50℃的0.2×SSC洗涤缓冲液中20分钟。在本试验中用于扩增的分析物核苷酸是经PCR-RFLP分析分别确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的3种人基因组。
[试验5-3：结果]
结果总结于图15A-15C。当不洗涤DNA芯片时(仅用超纯水温和洗涤)，可通过突变体核苷酸探针检测到野生型扩增产物并且可通过野生型核苷酸探针检测到突变体扩增产物，表明存在非特异性杂交。洗涤温度为40℃的结果几乎与不洗涤的结果相同。
洗涤温度为45℃时，通过野生型核苷酸探针(21G和26G)可以高信号强度检测到野生型扩增产物，但是通过突变体核苷酸探针(27A)几乎检测不到信号。同样，通过突变体核苷酸探针(27A)可以高信号强度检测到突变体扩增产物，但是通过野生型核苷酸探针(21G和26G)几乎检测不到信号，表明通过45℃洗涤打破了通过非特异性杂交所形成的键。备选地，杂合子扩增产物可被野生型核苷酸探针(21G和26G)和突变体核苷酸探针(27A)以较高的信号强度检测到。
在50℃洗涤温度时，检测到的电流较低，表明通过洗涤将扩增产物从核苷酸探针上分离下来。在50℃洗涤温度时，通过野生型核苷酸探针(29G)检测到的野生型扩增产物的信号降低，但是通过野生型核苷酸探针检测到的突变体扩增产物的信号仍然高，表明仍然存在非特异性结合。同样，通过突变体核苷酸探针(30A)检测到的突变体扩增产物的信号降低，而通过突变体核苷酸探针检测到的野生型扩增产物的信号仍然高。
结果表明，野生型核苷酸探针(21G和26G)和突变体核苷酸探针(27A)给出了理想的检测模式。因此，根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针(21G：SEQ ID No.53和26G：SEQ ID No.54)和突变体核苷酸探针(27A：SEQ ID No.59)。
在试验中使用的核苷酸探针的Tm值也总结于表7。从表7中显而易见，在本发明中优选使用的核苷酸探针是Tm值为62-70℃、优选62-66℃的野生型核苷酸探针和Tm值为61-69℃、优选66-67℃的突变体核苷酸探针。
[试验6-1：用于检测G857A的探针]
通过使用经PCR-RFLP分析确定为杂合子的人基因组作为模板，并且使用用于检测G857A的引物组1和5，于63℃开展LAMP扩增1小时。用于检测G857A的引物组1和5是经上述试验2确定为最佳的引物组。所得到的扩增产物在电流检测DNA芯片上检测。
核苷酸探针：
所试验的核苷酸探针的核苷酸序列示于表8。所使用的核苷酸探针是正链。核苷酸探针的3’末端经巯基修饰，以便固定化在电极上。阴性对照探针是其序列与NAT2基因序列完全无关的核苷酸。
用于核苷酸探针固定化的支持物：
以与试验5-1相似的方式制备核苷酸探针固定化支持物。
分别在下列电极上固定核苷酸探针：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.51)
电极3-4：野生型核苷酸探针20mer(SEQ ID No.61)
电极5-6：野生型核苷酸探针23mer(SEQ ID No.62)
电极7-8：野生型核苷酸探针24mer(SEQ ID No.63)
电极9-10：野生型核苷酸探针25mer(SEQ ID No.64)
电极11-12：野生型核苷酸探针30mer(SEQ ID No.65)
电极13-14：突变体核苷酸探针24mer(SEQ ID No.66)
电极15-16：突变体核苷酸探针26mer(SEQ ID No.67)
电极17-18：突变体核苷酸探针28mer(SEQ ID No.68)
电极19-20：突变体核苷酸探针29mer(SEQ ID No.69)
电极21-22：突变体核苷酸探针31mer(SEQ ID No.70)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及其检测：
向通过扩增得到的扩增产物中加入终浓度为2×SSC的盐，然后允许混合物与电极上固定的核苷酸探针杂交。反应温度为35、45、50、55和60℃并且反应时间段为20分钟。然后，用超纯水温和洗涤DNA芯片。将DNA芯片浸入含50μM嵌入剂Hoechst 33258的磷酸缓冲溶液中10分钟并洗涤，然后测定Hoechst 33258分子的氧化电流反应。
[试验6-1：结果]
结果总结于图16。图16A显示使用引物组1获得的结果，而图16B显示使用引物组5获得的结果。随着反应温度的提高，信号增加了，这表明反应温度的提高导致杂交效率的提高。于55和60℃反应温度的试验得到几乎相同的结果。
通过对使用用于检测G857A的引物组1和5扩增的LAMP产物进行检测表明，使用引物组5的杂交信号的增加比引物组1更高。引物组1和5之间信号增强的差异原因仍然不清楚。有可能是杂交效率可能随着扩增产物中单链区的长度或结合核苷酸探针的区域的位置而改变。备选地，有可能是添加到扩增产物中的Hoechst 33258的数量可能有微小的不同。
[试验6-2：用于检测G857A的探针]
然后，通过使用用引物组5扩增得到的产物，以与试验5-3相似的方式在反应温度为55℃进行杂交反应20分钟。随后，将核苷酸探针固定化支持物浸入45℃的0.2×SSC洗涤缓冲液中20分钟。在本试验中用于扩增的分析物核苷酸是经PCR-RFLP分析分别确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的3种人基因组。
[试验6-2：结果]
结果总结于图17。通过野生型核苷酸探针(23G、24G和25G)可以高信号强度检测到野生型扩增产物，但是通过突变体核苷酸探针(26A、28A和29A)几乎检测不到信号。同样，通过突变体核苷酸探针(26A、28A和29A)可以高信号强度检测到突变体扩增产物，但是通过野生型核苷酸探针(23G、24G和25G)几乎检测不到信号。此外，杂合子扩增产物可被野生型核苷酸探针(23G、24G和25G)和突变体核苷酸探针(26A、28A和29A)以较高的信号强度检测到。
结果表明，野生型核苷酸探针(23G、24G和25G)和突变体核苷酸探针(26A、28A和29A)给出了理想的检测模式。因此，根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针(23G：SEQ ID No.62，24G：SEQ ID No.63和25G：SEQ ID No.64)和突变体核苷酸探针(26A：SEQ ID No.67，28A：SEQ ID No.68和29A：SEQ ID No.69)。
在试验中使用的核苷酸探针的Tm值也总结于表8。从表8中显而易见，在本发明中优选使用的核苷酸探针是Tm值为59-68℃、优选64-65℃的野生型核苷酸探针和Tm值为58-68℃、优选64-66℃的突变体核苷酸探针。
[试验7-1：用于检测T341C的探针]
通过使用经序列分析确定为野生型杂合子、突变体纯合子和杂合子的人基因组作为模板，并且使用用于检测T341C的引物组6和10，于63℃开展LAMP扩增1小时。用于检测T341C的引物组6和10是经上述试验3确定为最佳的引物组。所得到的扩增产物在电流检测DNA芯片上检测。
核苷酸探针：
所试验的核苷酸探针的核苷酸序列示于表9。所使用的核苷酸探针是正链。核苷酸探针的3’末端经巯基修饰，以便固定化在电极上。阴性对照探针是其序列与NAT2基因序列完全无关的核苷酸。
核苷酸探针固定化支持物：
以与试验5-1相似的方式制备核苷酸探针固定化支持物。
分别在下列电极上固定核苷酸探针：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.51)
电极3-4：野生型核苷酸探针16mer(SEQ ID No.71)
电极5-6：野生型核苷酸探针18mer(SEQ ID No.72)
电极7-8：野生型核苷酸探针19mer(SEQ ID No.73)
电极9-10：野生型核苷酸探针20mer(SEQ ID No.74)
电极11-12：突变体核苷酸探针16mer(SEQ ID No.75)
电极13-14：突变体核苷酸探针17mer(SEQ ID No.76)
电极15-16：突变体核苷酸探针18mer(SEQ ID No.77)
电极17-18：突变体核苷酸探针19mer(SEQ ID No.78)
电极19-20：突变体核苷酸探针20mer(SEQ ID No.79)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及其检测：
向通过扩增得到的扩增产物中加入终浓度为2×SSC的盐，并允许混合物与电极上固定的核苷酸探针杂交。反应温度为55℃，并且反应时间段为20分钟。然后，将芯片在45℃洗涤20分钟。将电极浸入含50μM嵌入剂Hoechst 33258的磷酸缓冲溶液中10分钟并洗涤，然后测定Hoechst33258分子的氧化电流反应。
[试验7-1：结果]
结果总结于图18。图18A显示使用引物组6获得的结果，而图18B显示使用引物组10获得的结果。用于检测野生型突变体的核苷酸探针(18T和19T)和用于检测突变体的核苷酸探针(17C、18C和19C)给出了理想的检测模式。野生型核苷酸探针(18T和19T)以高信号强度检测到野生型扩增产物，而突变体核苷酸探针(17C、18C和19C)几乎没有检测到信号增加，其中非特异性杂交被阻断。同样，突变体核苷酸探针(17C、18C和19C)以高信号强度检测到突变体扩增产物，而野生型核苷酸探针(18T和19T)几乎没有检测到信号增加，其中非特异性杂交被阻断。此外，野生型核苷酸探针(18T和19T)和突变体核苷酸探针(17C、18C和19C)都以高信号强度检测到杂合子扩增产物。通过使用检测T341C的引物组6和10分别获得的扩增产物显示了几乎相同的检测模式。
结果表明，根据本发明最优选使用的核苷酸探针是野生型核苷酸探针(18T：SEQ ID No.72和19T：SEQ ID No.73)和突变体核苷酸探针(17C：SEQ ID No.76，18C：SEQ ID No.77和19C：SEQ ID No.78)。
在试验中使用的核苷酸探针的Tm值也总结于表9。从表9中显而易见，在本发明中优选使用的核苷酸探针是Tm值为61-69℃，优选66-68℃的野生型核苷酸探针和Tm值为58-70℃，优选63-69℃的突变体核苷酸探针。
[试验8-1：用于检测G590A和G857A的探针]
通过分别使用经PCR-RFLP分析确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的人基因组作为模板，并且使用用于检测G590A和G857A的引物组6，于63℃开展LAMP扩增。用于检测G590A和G857A的引物组6经上述试验4确定为最佳的引物组。所得到的扩增产物在电流检测DNA芯片上检测。
使用环引物缩短扩增时间段：
使用用于检测G590A和G857A的引物组进行1.5小时的扩增。因此，通过引入环引物检查扩增时间段的缩短。环引物是显示于表6中的LB引物(SEQ ID No.80)。将环引物以40pmol的量加入到25μl反应溶液中。扩增结果显示引入环引物导致在1个小时内完成扩增。
DNA芯片检测结果：
通过使用以下在试验5和6中显示为最优选核苷酸探针的核苷酸探针，检测到使用引入环引物对用于检测G590A和G857A的引物组的扩增产物的扩增。
核苷酸探针：
表7中所示的用于检测野生型的探针(SEQ ID No.54)和用于检测突变体的探针(SEQ ID No.59)用于检测G590A多态性，而表8中所示的用于检测野生型的探针(SEQ ID No.62)和用于检测突变体的探针(SEQ ID No.67)用于检测G857A多态性。用于检测G590A多态性的探针为负链，而用于检测G857A多态性的探针为正链。核苷酸探针的3’末端经巯基修饰，以便固定化在电极上。
核苷酸探针固定化支持物：
以与试验5-1相似的方式制备核苷酸探针固定化支持物。
分别在下列电极上固定核苷酸探针：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.51)
电极3-4：野生型核苷酸探针26mer(SEQ ID No.54)
电极5-6：突变体核苷酸探针27mer(SEQ ID No.59)
电极7-8：野生型核苷酸探针23mer(SEQ ID No.62)
电极9-10：突变体核苷酸探针26mer(SEQ ID No.67)。
扩增产物与核苷酸探针间的杂交及其检测：
以与试验7相似的方式进行试验。
[试验8-1：结果]
结果总结于图19。用于检测G590A野生型的探针(SEQ ID No.54)、用于检测G590A突变体的探针(SEQ ID No.59)、用于检测G857A野生型的探针(SEQ ID No.62)、用于检测G857A突变体的探针(SEQ ID No.67)显示出理想的检测结果。
分析物样品
在本发明中使用的分析物样品并无特别限制，例如可使用人血液、血清、白细胞、毛根或口腔粘膜。从分析物样品中提取核苷酸成分，制备样品溶液用于试验以便检测靶核苷酸。提取方法并无特别限制，例如可使用商业上可获得的核苷酸提取工具，例如QIAamp(QIAGEN制造)或Sumaitest(Sumitomo Metal Industries Ltd.制造)。
试剂盒
本发明的另一方面提供试剂盒，其包含用于根据本发明检测方法中LAMP法的上述引物组。试剂盒还任选包含例如链替换性DNA聚合酶、合成底物和缓冲溶液。
在另一方面，本发明提供用于检测根据本发明引物组所扩增的扩增产物的核苷酸探针。本发明还提供在其上固定有本发明核苷酸探针的核苷酸探针固定化支持物。探针固定化支持物优选作为DNA芯片或DNA微点阵提供。
根据本发明的试剂盒还额外包含核苷酸探针或核苷酸探针固定化支持物。
在另一方面，本发明提供同时检测NAT2的单核苷酸多态性G590A、G857A和T341C的方法。在该方面，如上所述分别扩增G590A、G857A和T341C，然后将扩增产物混合制备成液体混合物。如上所述对液体混合物进行检测。在该方面，可以同时检测基因型G590A、G857A和T341C。
实施例
同时检测G590A、G857A和T341C
开展了同时检测G590A、G857A和T341C的试验。分别使用用于检测G590A的核苷酸引物组9(试验1-2)、用于检测G857A的核苷酸引物组5(试验2)或者用于检测T341C的核苷酸引物组6和10(试验3)，于63℃扩增人基因组样品1小时。人基因组是经PCR-RFLP分析或序列分析分别确定为野生型纯合子、突变体纯合子和杂合子的3种人基因组。扩增反应后，将3种扩增产物混合，制备混合的反应溶液。
核苷酸探针：
使用用于G590A的核苷酸探针、用于G857A的核苷酸探针和用于T341C的核苷酸探针检测混合的反应溶液。
核苷酸探针如下：
G590A：野生型核苷酸探针(SEQ ID No.54)，突变体核苷酸探针(SEQID No.59)，
G857A：野生型核苷酸探针(SEQ ID No.62)，突变体核苷酸探针(SEQID No.67)，
T341C：野生型核苷酸探针(SEQ ID No.72)，突变体核苷酸探针(SEQID No.76)。
所有的核苷酸探针均为正链，并且核苷酸探针的3’末端被巯基修饰。
核苷酸探针固定化的电极的制备：
以与上面试验5-1中描述方法相似的方式制备核苷酸探针固定化的电极。
分别在下列电极上固定核苷酸探针：
电极1-2：阴性探针(SEQ ID No.51)
电极3-4：G590A野生型核苷酸探针26mer(SEQ ID No.54)
电极5-6：G590A突变体核苷酸探针27mer(SEQ ID No.59)
电极7-8：G857A野生型核苷酸探针23mer(SEQ ID No.62)
电极9-10：G857A突变体核苷酸探针26mer(SEQ ID No.67)。
电极11-12：T341C野生型核苷酸探针18mer(SEQ ID No.72)
电极13-14：T341C突变体核苷酸探针17mer(SEQ ID No.76)。
扩增产物与核苷酸探针之间的杂交及其检测：
以与试验7相似的方式开展试验。
[结果]
结果总结于图20。图20A显示了使用引物组9、5和6获得的结果，而图20B显示了使用引物组9、5和10获得的结果。
对于G590A、G857A和T341C每一个都观察到了理想的检测模式。结果表明，使用根据本发明的DNA芯片可以同时检测G590A、G857A和T341C。
对于本领域技术人员而言，可以容易想到额外的优点和修改。因此，较宽方面的本发明并不限于本文所示和所述的特定细节和代表性实施方案。因此，在不脱离如后附权利要求及其等效物所定义的总体发明概念的精神和范围的情况下，可以进行多种修改。
序列表
<110>株式会社东芝(Kabushiki Kaisha Toshiba)
<120>用于鉴定N-乙酰基转移酶2基因型的核苷酸引物组和探针
<130>07S0651
<140>
<141>
<150>JP 2007-084289
<151>2007-03-28
<160>82
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A引物FIP-1
<400>1
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<212>DNA
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<220>
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<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G592A引物FIP-3
<400>3
cgtctgcagg tatgtattca tagactcaac aaagaagaaa caccaaaaaa tatac 55
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<212>DNA
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cgtctgcagg tatgtattca tagactcaac tcctgccaaa gaagaaacac caa 53
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gcaggtatgt attcatagac tcaaaatctc accaaaaaat atacttattt acgc 54
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<212>DNA
<213>人工的
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<213>人工的
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<213>人工的
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<213>人工的
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<212>DNA
<213>人工的
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<212>DNA
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<212>DNA
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<213>人工的
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
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<220>
<223>G590A引物BIP-3
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ggggagaaat ctcgtgccca agggtttatt ttgttcctta ttc 43
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<220>
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<213>人工的
<220>
<223>G590A引物FIP-3
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cgtctgcagg tatgtattca tagacccaaa aaatatactt atttacgc 48
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A引物FIP-4
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ctgcaggtat gtattcatag actccaccaa aaaatatact tatttacgc 49
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>G590A引物F3
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A引物B3
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<210>51
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>阴性对照探针
<400>51
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<213>人工的
<220>
<223>G590A野生型探针
<400>52
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<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A野生型探针
<400>53
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<210>54
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A野生型探针
<400>54
ttgaacctcg aacaattgaa gatttt 26
<210>55
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A野生型探针
<400>55
ttgaacctcg aacaattgaa gattttgag 29
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A突变型探针
<400>56
gaacctcaaa caattgaag 19
<210>57
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A突变型探针
<400>57
gaacctcaaa caattgaaga t 21
<210>58
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A突变型探针
<400>58
ttgaacctca aacaattgaa gat 23
<210>59
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A突变型探针
<400>59
ttgaacctca aacaattgaa gattttg 27
<210>60
<211>30
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<213>人工的
<220>
<223>G590A突变型探针
<400>60
ttgaacctca aacaattgaa gattttgagt 30
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A野生型探针
<400>61
tggtgatgga tcccttacta 20
<210>62
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A野生型探针
<400>62
cctggtgatg gatcccttac tat 23
<210>63
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A野生型探针
<400>63
cctggtgatg gatcccttac tatt 24
<210>64
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A野生型探针
<400>64
acctggtgat ggatccctta ctatt 25
<210>65
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A野生型探针
<400>65
aacctggtga tggatccctt actatttaga 30
<210>66
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A突变型探针
<400>66
ctggtgatga atcccttact at 22
<210>67
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A突变型探针
<400>67
acctggtgat gaatccctta ctattt 26
<210>68
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A突变型探针
<400>68
aacctggtga tgaatccctt actattta 28
<210>69
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A突变型探针
<400>69
aacctggtga tgaatccctt actatttag 29
<210>70
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G857A突变型探针
<400>70
aacctggtga tgaatccctt actatttaga a 31
<210>71
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C野生型探针
<400>71
ggtgaccatt gacggc 16
<210>72
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C野生型探针
<400>72
aggtgaccat tgacggca 18
<210>73
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C野生型探针
<400>73
caggtgacca ttgacggca 19
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C野生型探针
<400>74
caggtgacca ttgacggcag 20
<210>75
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C突变型探针
<400>75
aggtgaccac tgacgg 16
<210>76
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C突变型探针
<400>76
aggtgaccac tgacggc 17
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C突变型探针
<400>77
aggtgaccac tgacggca 18
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C突变型探针
<400>78
caggtgacca ctgacggca 19
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>T341C突变型探针
<400>79
caggtgacca ctgacggcag 20
<210>80
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>G590A引物LB
<400>80
gtgcccaaac ctggtg 16
<210>81
<211>898
<212>DNA
<213>人
<220>
<223>NAT1
<400>81
tcttcaacac cagatccgag ctgttccctt tgagaacctt aacatccatt gtggggatgc 60
catggactta ggcttagagg ccatttttga tcaagttgtg agaagaaatc ggggtggatg 120
gtgtctccag gtcaatcatc ttctgtactg ggctctgacc actattggtt ttgagaccac 180
gatgttggga gggtatgttt acagcactcc agccaaaaaa tacagcactg gcatgattca 240
ccttctcctg caggtgacca ttgatggcag gaactacatt gtcgatgctg ggtttggacg 300
ctcataccag atgtggcagc ctctggagtt aatttctggg aaggatcagc ctcaggtgcc 360
ttgtgtcttc cgtttgacgg aagagaatgg attctggtat ctagaccaaa tcagaaggga 420
acagtacatt ccaaatgaag aatttcttca ttctgatctc ctagaagaca gcaaataccg 480
aaaaatctac tcctttactc ttaagcctcg aacaattgaa gattttgagt ctatgaatac 540
atacctgcag acatctccat catctgtgtt tactagtaaa tcattttgtt ccttgcagac 600
cccagatggg gttcactgtt tggtgggctt caccctcacc cataggagat tcaattataa 660
ggacaataca gatctaatag agttcaagac tctgagtgag gaagaaatag aaaaagtgct 720
gaaaaatata tttaatattt ccttgcagag aaagcttgtg cccaaacatg gtgatagatt 780
ttttactatt tagaataagg agtaaaacaa tcttgtctat ttgtcatcca gctcaccagt 840
tatcaactga cgacctatca tgtatcttct gtacccttac cttattttga agaaaatc 898
<210>82
<211>900
<212>DNA
<213>人
<220>
<223>NAT2
<400>82
tcttgagcac cagatccggg ctgttccctt tgagaacctt aacatgcatt gtgggcaagc 60
catggagttg ggcttagagg ctatttttga tcacattgta agaagaaacc ggggtgggtg 120
gtgtctccag gtcaatcaac ttctgtactg ggctctgacc acaatcggtt ttcagaccac 180
aatgttagga gggtattttt acatccctcc agttaacaaa tacagcactg gcatggttca 240
ccttctcctg caggtgacca ttgacggcag gaattacatt gtcgatgctg ggtctggaag 300
ctcctcccag atgtggcagc ctctagaatt aatttctggg aaggatcagc ctcaggtgcc 360
ttgcattttc tgcttgacag aagagagagg aatctggtac ctggaccaaa tcaggagaga 420
gcagtatatt acaaacaaag aatttcttaa ttctcatctc ctgccaaaga agaaacacca 480
aaaaatatac ttatttacgc ttgaacctcg aacaattgaa gattttgagt ctatgaatac 540
atacctgcag acgtctccaa catcttcatt tataaccaca tcattttgtt ccttgcagac 600
cccagaaggg gtttactgtt tggtgggctt catcctcacc tatagaaaat tcaattataa 660
agacaataca gatctggtcg agtttaaaac tctcactgag gaagaggttg aagaagtgct 720
gaaaaatata tttaagattt ccttggggag aaatctcgtg cccaaacctg gtgatggatc 780
ccttactatt tagaataagg aacaaaataa acccttgtgt atgtatcacc caactcacta 840
attatcaact tatgtgctat cagatatcct ctctaccctc acgttatttt gaagaaaatc 900
Claims (42)
1. 用于检测NAT2基因单核苷酸多态性G590A的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其特征在于：
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
引物组包括选自表2和3所示引物组1-16的FIP引物和BIP引物、结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物、以及结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
2. 根据权利要求1的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物选自表2和3所示的引物组3、4和9。
3. 根据权利要求1的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物是表3所示引物组9的引物。
4. 检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用根据权利要求1的核苷酸引物组扩增靶核苷酸得到扩增产物；和
测定并比较扩增产物中所包含的野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。
5. 权利要求4的方法，其特征在于：
通过固定化于支持物上的核苷酸探针与扩增产物杂交，然后确定结合至核苷酸探针上的扩增产物的量，来实现扩增产物的测定；以及
核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针和与突变体扩增产物互补的突变体核苷酸引物。
6. 根据权利要求5的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有62-70℃的Tm值，突变体核苷酸探针具有61-69℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G590A位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。
7. 根据权利要求6的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有62-66℃的Tm值，并且突变体核苷酸探针具有66-67℃的Tm值。
8. 根据权利要求5的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ IDNo.53或54的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ IDNo.59的序列或者其互补序列。
9. 根据权利要求8的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ IDNo.54的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.59的序列或者其互补序列。
10. 用于从通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸所得到的扩增产物检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A的基因型的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于：
野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有62-70℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G590A位点位于距末端3个或更多个碱基的内部，并且
突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有61-69℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G590A位点位于距末端3个或更多个碱基的内部；
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当核苷酸引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
FIP引物和BIP引物选自表2和3所示引物组1-16；
F3引物结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域；和
B3引物结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域。
11. 根据权利要求10的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.53或54的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.59的序列或者其互补序列。
12. 根据权利要求10的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于探针固定化于支持物上。
13. 用于检测NAT2基因单核苷酸多态性G857A的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其特征在于：
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当核苷酸引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
引物组包括：
选自表4所示引物组1-5的FIP引物和BIP引物；
结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物；以及
结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
14. 根据权利要求13的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物是表4所示引物组5的引物。
15. 检测NAT2基因中单核苷酸多态性G857A的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用根据权利要求13的核苷酸引物组扩增靶核苷酸得到扩增产物；和
测定并比较扩增产物中所包含的野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。
16. 权利要求15的方法，其特征在于：
通过固定化于支持物上的核苷酸探针与扩增产物杂交，然后确定结合至核苷酸探针上的扩增产物的量，来实现扩增产物的测定；以及
核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针和与突变体扩增产物互补的突变体核苷酸引物。
17. 根据权利要求16的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有59-68℃的Tm值，突变体核苷酸探针具有58-68℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G857A位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。
18. 根据权利要求17的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有64-65℃的Tm值，并且突变体核苷酸探针具有64-66℃的Tm值。
19. 根据权利要求18的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQID No.62、63或64的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.67、68或69的序列或者其互补序列。
20. 根据权利要求19的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQID No.62的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.67的序列或者其互补序列。
21. 用于从通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸所得到的扩增产物检测NAT2基因中单核苷酸多态性G857A的基因型的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于：
野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有59-68℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G857A位点位于距末端3个或更多个碱基的内部，并且
突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有58-68℃的Tm值，并且单核苷酸多态性G857A位点位于距末端3个或更多个碱基的内部；
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当核苷酸引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
FIP引物和BIP引物选自表4所示引物组1-5；
F3引物结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域；和
B3引物结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域。
22. 根据权利要求21的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.62、63或64的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.67、68或69的序列或者其互补序列。
23. 根据权利要求21的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于探针固定化于支持物上。
24. 用于检测NAT2基因单核苷酸多态性T341C的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其特征在于：
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当核苷酸引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
引物组包括：
选自表5所示引物组1-10的FIP引物和BIP引物；
结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物；以及
结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
25. 根据权利要求24的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物选自表5所示引物组3、6、9和10。
26. 根据权利要求24的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物是表5所示引物组6和10的引物。
27. 检测NAT2基因中单核苷酸多态性T341C的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用根据权利要求24的核苷酸引物组扩增靶核苷酸得到扩增产物；和
测定并比较扩增产物中所包含的野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。
28. 权利要求27的方法，其特征在于：
通过固定化于支持物上的核苷酸探针与扩增产物杂交，然后确定结合至核苷酸探针上的扩增产物的量，来实现扩增产物的测定；以及
核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针和与突变体扩增产物互补的突变体核苷酸引物。
29. 根据权利要求28的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有61-69℃的Tm值，突变体核苷酸探针具有58-70℃的Tm值，并且单核苷酸多态性T341C位点位于距各个核苷酸探针末端3个或更多个碱基的内部。
30. 根据权利要求29的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有66-68℃的Tm值，并且突变体核苷酸探针具有63-69℃的Tm值。
31. 根据权利要求30的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQID No.72或73的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQID No.76、77或78的序列或者其互补序列。
32. 根据权利要求31的方法，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQID No.72的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.76的序列或者其互补序列。
33. 用于从通过使用核苷酸引物组扩增靶核苷酸所得到的扩增产物检测NAT2基因中单核苷酸多态性T341C的基因型的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于：
野生型核苷酸探针与野生型扩增产物互补并具有61-69℃的Tm值，并且单核苷酸多态性T341C位点位于距末端3个或更多个碱基的内部，并且
突变体核苷酸探针与突变体扩增产物互补并具有58-70℃的Tm值，并且单核苷酸多态性T341C位点位于距末端3个或更多个碱基的内部；
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，
当核苷酸引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
FIP引物和BIP引物选自表5所示引物组1-10；
F3引物结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域；和
B3引物结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域。
34. 根据权利要求33的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.72或73的序列或者其互补序列，并且突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.76、77或78的序列或者其互补序列。
35. 根据权利要求33的野生型和突变体核苷酸探针，其特征在于探针固定化于支持物上。
36. 用于检测NAT2基因单核苷酸多态性G590A和G857A的基因型的LAMP扩增的核苷酸引物组，其特征在于：
当靶核苷酸从5’末端依次具有F3区、F2区和F1区并且从3’末端依次具有B3c区、B2c区和B1c区时，并且
当核苷酸引物组包括在3’末端侧具有与F2区相同的序列并在5’末端侧具有与F1区互补的序列的FIP引物、具有与F3区相同的序列的F3引物、在3’末端侧具有与B2c区互补的序列并在5’末端侧具有与B1c区相同的序列的BIP引物、以及具有与B3c区互补的序列的B3引物时，
引物组包括：
选自表6所示引物组1-8的FIP引物和BIP引物；
结合至靶核苷酸上距F2区5’末端60个碱基内区域的F3引物；以及
结合至靶核苷酸上距B2c区3’末端60个碱基内区域的B3引物。
37. 根据权利要求36的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物选自表6所示引物组1、6、7和8。
38. 根据权利要求36的核苷酸引物组，其特征在于FIP引物和BIP引物是表6所示引物组6的引物。
39. 检测NAT2基因中单核苷酸多态性G590A和G857A的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用根据权利要求36的核苷酸引物组扩增靶核苷酸得到扩增产物；和
测定并比较扩增产物中所包含的野生型扩增产物和突变体扩增产物的量。
40. 权利要求39的方法，其特征在于：
通过固定化于支持物上的核苷酸探针与扩增产物杂交，然后确定结合至核苷酸探针上的扩增产物的量，来实现扩增产物的测定；以及
核苷酸探针包括与野生型扩增产物互补的野生型核苷酸探针和与突变体扩增产物互补的突变体核苷酸引物。
41. 根据权利要求40的方法，其特征在于野生型核苷酸探针对于G590A的野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.54的序列或者其互补序列且对于G857A的野生型核苷酸探针具有SEQ ID No.62的序列或者其互补序，并且突变体核苷酸探针对于G590A的突变体核苷酸探针具有SEQ IDNo.59的序列或者其互补序列且对于G857A的突变体核苷酸探针具有SEQ ID No.67的序列或者其互补序列。
42. 同时检测NAT2基因单核苷酸多态性G590A、G857A和T341C的基因型的方法，其特征在于包括步骤：
通过使用表3中所示引物组9扩增靶核苷酸获得扩增产物；
通过使用表4中所示引物组5扩增靶核苷酸获得扩增产物；
通过使用表5中所示引物组6和10扩增靶核苷酸获得扩增产物；
混合扩增产物以制备液体混合物；
通过将液体混合物与核苷酸探针固定化支持物接触使扩增产物与核苷酸探针杂交，其中支持物上携带有固定于其上的用于G590A的具有序列SEQ ID No.54或其互补序列的野生型核苷酸探针、用于G590A的具有序列SEQ ID No.59或其互补序列的突变体核苷酸探针、用于G857A的具有序列SEQ ID No.62或其互补序列的野生型核苷酸探针、用于G857A的具有序列SEQ ID No.67或其互补序列的突变体核苷酸探针、用于T341C的具有序列SEQ ID No.72或其互补序列的野生型核苷酸探针、和用于T341C的具有序列SEQ ID No.76或其互补序列的突变体核苷酸探针；
测量结合至各个核苷酸探针的扩增产物的量；
比较分别结合至用于G590A的野生型核苷酸探针和用于G590A的突变体核苷酸探针的扩增产物的量；
比较分别结合至用于G857A的野生型核苷酸探针和用于G857A的突变体核苷酸探针的扩增产物的量；和
比较分别结合至用于T341C的野生型核苷酸探针和用于T341C的突变体核苷酸探针的扩增产物的量。
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