KR20130029748A

KR20130029748A - ＩＬ28Ｂ(ｒｓ8099917)와 ＩＴＰＡ(ｒｓ1127354)의 변이를 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20130029748A
Application number: KR1020120102098A
Authority: KR
Inventors: 가오루 구로세; 도시야 호소미
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-09-15
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2013-03-25
Also published as: EP2570492A3; US9057103B2; JP2013074888A; US20130309663A1; EP2570492A2; CN102994629A; EP2570492B1

Abstract

IL28B 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브. (P1) 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드. (P1') 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드. ITPA 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P2～P3'에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브. (P2) 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 239번째의 염기에 상보적인 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, (P2') 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 239번째의 염기에 상보적인 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, (P3) 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, (P3') 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

Description

ＩＬ28Ｂ(ｒｓ8099917)와 ＩＴＰＡ(ｒｓ1127354)의 변이를 검출하는 방법{METHOD FOR DETECTING MUTATIONS AT IL28B(RS8099917) AND ITPA(RS1127354)}

본 발명은, IL28B(rs8099917)와 ITPA(rs1127354)의 변이 검출법, 및 그것을 위한 핵산 프로브 및 키트에 관한 것이다.

C형 간염은, C형 간염 바이러스(HCV)에 감염하는 것에 의해 발증하는 바이러스성 간염의 일종이다. 일본에 있어서의 HCV 환자수는 약 200만명으로 되어 있고, HCV 환자의 6～8할이 만성 간염으로 이행한다. 이것을 치료하지 않고, 만성 간염의 상태를 10～30년 경과하는 것에 의해, 3～4할이 간경변, 간암으로 이행한다. HCV를 배제하는 항바이러스 요법으로서는, 인터페론 요법이 있고, 리바비린 병용이나 인터페론의 페그화에 의해 치료 성적이 개선되고 있다.

페그 인터페론+리바비린 병용 요법이 유효한 일본인의 환자와 무효한 환자 314명에 관하여, 인간 유전자 중에서 개인차가 있다고 하는 약 90만 개소를 분석한 결과, 인터페론(IFN)의 일종인 IL28B 유전자 및 그 유전자 주변에 존재하는 SNP가 치료 효과에 관련되고 있는 것이 보고되어 있다(Nature Genetics 41, 1105-1109 (2009)). 또한, 페그 인터페론+리바비린 병용 요법의 효과에 관련있다고 예측한 6개의 SNP 중, rs8099917이 가장 치료 효과에 영향이 있다고 보고되어 있다(PLoS One. 2010 Oct 29; 5(10):e13771).

리바비린 유발성 빈혈은, 항C형 간염 바이러스(HCV) 요법의 치료 중단 및 감량의 주요 요인의 하나이다(Hepatol Res. 2010 Nov; 40(11):1063-1071). 페그 인터페론(PEG-IFN)/리바비린 병용 요법을 받은 일본인의 C형 간염 환자를 대상으로, ITPA 유전자 변이가 미치는 임상적인 의의에 대하여 평가한 결과, ITPA 엑손 내의 기능적 SNP인 rs1127354가 리바비린 유발성의 빈혈의 유용한 예측 인자인 것이 보고되어 있다(Gastroenterology. 2010 Oct; 139(4):1190-7. Epub 2010 Jul 14).

PLoS One. 2010 Oct 29; 5(10):e13771.에서는, IL28B(rs8099917)의 변이가 C형 간염 환자의 페그 인터페론+리바비린 요법에 강하게 관여하고 있는 것이 보고되어 있고, IL28B(rs8099917)의 변이의 유무가, 시퀀스 해석을 사용하여 검출되어 있다. HePATOLOGY, Vol.53, Issue 2, pages 415-421, 2011에서는, ITPA(rs1127354)의 변이가 페그 인터페론/리바비린 요법 시의 빈혈에 강하게 관여하고 있는 것이 보고되어 있고, ITPA(rs1127354)의 변이의 유무가, 시퀀스 해석을 사용하여 검출되어 있다.

그러나, PLoS One. 2010 Oct 29; 5(10):e13771. 및 HePATOLOGY, Vol.53, Issue 2, pages 415-421, 2011과 같이, C형 간염 환자의 SNP 변이를 조사하기 위해 전혈로부터 게놈 추출을 행하는 것은 실제의 임상 현장에서는 수고와 비용이 매우 든다. 그 때문에, 전혈로부터 직접 변이의 유무를 자동적으로 측정하는 기술의 요망이 높아진다고 예측된다. 또한, 페그 인터페론+리바비린 요법 시에는 IL28B(rs8099917) 및 ITPA(rs1127354)가 효과에 관여하므로, IL28B(rs8099917) 및 ITPA(rs1127354)의 변이 유무를 동시에 측정하는 기술은 임상 분야에서 필요하게 될 가능성이 매우 높다. 그러나, PLoS One. 2010 Oct 29; 5(10):e13771. 및 HePATOLOGY, Vol.53, Issue 2, pages 415-421, 2011은 시퀀스 해석을 행하여 IL28B(rs8099917) 및 ITPA(rs1127354)의 변이의 유무를 보고 있으므로 양 변이의 유무를 동시에 검출할 수 없다.

일본 특개2002-119291호 공보에는, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 표적 핵산에 하이브리다이제이션시켜, 형광 색소의 발광의 감소량을 측정하는 방법이 기재되어 있다. 그러나, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 표적 핵산에 하이브리다이제이션시켜, 형광 색소의 발광의 감소량 측정을 실시하는 것에 있어서 어느 임의 서열로 실시할 수 있는 것은 아니고, 변이 마다 적정한 서열을 찾을 필요가 있다.

본 발명은, IL28B 유전자 다형의 rs8099917과 ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 검출하는데 유효한 프로브를 특정하고, IL28B 유전자 다형의 rs8099917과 ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 검출하는 방법, 및 그것을 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, IL28B 유전자 다형의 rs8099917을 포함하는 특정의 영역 및 ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 포함하는 특정의 영역에 근거하여 프로브를 설계하고, 당해 프로브를 사용하여, 표적 핵산의 하이브리드 형성·해리에 근거하는 시그널을 검출하는 것에 의해 당해 변이를 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) IL28B 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.

(P1) 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드.

(P1') 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드.

(2) ITPA 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P2～P3'에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.

(P2) 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 239번째의 염기에 대응하는(즉, 상보적인) 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P2') 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 239번째의 염기에 대응하는(즉, 상보적인) 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P3) 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P3') 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(3) P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호307에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1～3번째의 위치에 가지고,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호239에 대응하는(즉, 상보적인) 염기를 3' 말단부터 세어 1～3번째 중 어느 위치에 가지고,

P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호256에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1～3번째 중 어느 위치에 갖는, (1) 또는 (2)기재의 프로브.

(4) P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호307에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호239에 대응하는(즉, 상보적인) 염기를 3' 말단에 가지고,

P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호256에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖는, (1) 또는 (2)기재의 프로브.

(5) 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는, (1)～(4)의 어느 1항 기재의 프로브.

(6) 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는, (5)기재의 프로브.

(7) P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 7～23이며,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 13～23이며,

P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 6～27인, (1)～(6)의 어느 1항 기재의 프로브.

(8) P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 7～18이며,

P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 13～18이며,

P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 6～22인, (1)～(6)의 어느 1항 기재의 프로브.

(9) 상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인, (1)～(8)의 어느 1항에 기재의 프로브.

(10) IL28B 유전자 또는 ITPA 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, (1)～(9)의 어느 1항 기재의 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법. 상기 방법은, 상기 다형을 함유할 수 있는 핵산을 함유하는 시료에 대하여 행해지고, 상기 프로브와 상기 시료를 접촉시키는 것 및 상기 다형의 유무를 검출하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한, 상기 다형을 검출하기 위한 프로브의 사용을 포함한다.

(11) IL28B 유전자와 ITPA 유전자에 있어서의 다형을 각각 혹은 1개의 반응계에서 동시에 검출하는 방법으로서,

하기 공정(Ⅰ)～(Ⅳ)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

(Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에, (1)～(9)의 어느 1항에 기재의 프로브를 첨가하여 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,

(Ⅱ) 온도를 변화시켜서 상기 DNA와 상기 프로브의 하이브리드 형성체를 해리시켜, 하이브리드 형성체의 해리에 근거하는 시그널의 변동을 측정하는 공정,

(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정하는 공정, 및

(Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 목적의 다형의 유무 또는 다형을 갖는 염기서열의 존재비를 결정하는 공정.

(12) 또한, (Ⅰ)의 공정 전 또는 (Ⅰ)의 공정과 동시에 DNA를 증폭하는 것을 포함하는, (11)기재의 방법.

(13) (10)～(12)의 어느 1항에 기재의 방법에 의해 IL28B 유전자와 ITPA 유전자에 있어서의 다형을 각각 혹은 1개의 반응계에서 동시에 검출하는 공정, 및 다형의 유무에 근거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정(또는 예측)하는 것을 포함하는, C형 간염 바이러스 치료약의 약효의 판정(또는 예측) 방법. 상기 방법은, 상기 판정/예측이 행해지는 피험자(예를 들면, 사람) 유래의 시료로 실시될 수 있다. 본 명세서 중에서 사용되는 경우, 「시료」란, 상기 다형을 함유할 수 있는 핵산(예를 들면, DNA)을 함유한다.

(14) IL28B 유전자와 ITPA 유전자에 있어서의 다형을 각각 혹은 1개의 반응계에서 동시에 검출하기 위한 시약 키트로서, (1)～(9)의 어느 1항에 기재의 프로브를 포함하는 키트.

(15) P1 혹은 P1'의 올리고뉴클레오티드 및 P2 혹은 P2'의 올리고뉴클레오티드 또는 P3 혹은 P3'의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, (14)에 기재의 키트.

(16) IL28B 유전자의 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 P1 또는 P1'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 및/또는

ITPA 유전자의 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 P2 혹은 P2' 또는 P3 혹은 P3'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는, (14) 또는 (15)에 기재의 시약 키트. 본 발명은 또한, 상기 다형을 검출하기 위한 키트의 사용을 포함한다.

본 발명의 프로브를 PCR 등의 유전자 증폭계 중에 첨가해 둠으로써, 유전자 증폭 반응 종료 후, Tm 해석을 행하는 것만으로, IL28B 유전자 다형의 rs8099917과 ITPA 유전자 다형의 rs1127354의 타이핑이 가능하게 된다. 또한, 전혈이나 구강 점막 현탁액 등을 직접 검사하는 것이 가능하기 때문에, 수고나 비용을 저감할 수 있다.

본 발명의 프로브는, 특이성이 높다.

본 발명의 방법을 사용하는 것에 의해, PCR을 행하는 경우여도, 증폭 산물을 취출할 필요가 없기 때문에, 컨태미네이션의 위험성이 거의 없다. 또한, 본 발명의 방법은, 순서가 간단하므로 자동화가 용이하다.

본 발명의 방법에 의해, IL28B 유전자 다형의 rs8099917과 ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 동시에 검출할 수도 있다. 페그 인터페론+리바비린 요법은, IL28B (rs8099917) 및 ITPA(rs1127354)가 요법의 효과에 크게 관여하므로, 임상적으로 2변이를 동시에 검출할 수 있는 의의는 매우 크다.

도 1은, (A) 핵산 혼합물의 융해 곡선, 및 (B) 미분 융해 곡선의 일례를 나타내는 도면.
도 2는, 본 발명의 실시예1에 따른 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선이다. 세로축은, 단위 시간당의 형광 강도의 변화량(d형광 강도 증가량/t), 가로축은, 온도(℃)이다. 사각은 야생형, 마름모형은 변이형, 삼각은 헤테로형을 나타낸다(이하 같음).
도 3은, 비교예1에 따른 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선이다.
도 4는, 본 발명의 실시예2에 따른 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선이다.
도 5는, 비교예2에 따른 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선이다.
도 6은, 본 발명의 실시예3의 정제 인간 게놈에 따른 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선이다. 왼쪽 도면은 Il28B 유전자 다형 검출의 융해 곡선, 오른쪽 도면은 ITPA 유전자 다형 검출의 융해 곡선이다(이하 같음).
도 7은, 본 발명의 실시예3의 전혈에 따른 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선이다.

<1> 본 발명 프로브 및 본 발명 검출 방법

본 발명의 (P1) 프로브는, IL28B 유전자 다형의 rs8099917을 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이 문맥에서 참조하는 경우, 「상동인 서열」이란, 서열번호1 또는 서열번호1의 상기 기재 부분에 상동인 서열이다. 염기길이 7～28의 염기서열은, 그 전부가, 서열번호1 또는 「상동인 서열」에 연속하여 포함된다.

본 발명의 (P1') 프로브는, IL28B 유전자 다형의 rs8099917을 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이 문맥에서 참조하는 경우, 「하이브리다이즈하는 서열」은, 서열번호1 또는 서열번호1의 상기 기재 부분의 상보쇄와 하이브리다이즈한다. 염기길이 7～28의 염기서열은, 그 전부가, 서열번호1 또는 「하이브리다이즈하는 서열」에 연속하여 포함된다.

여기에서, IL28B 유전자 다형의 rs8099917은, 서열번호1의 301번째의 염기이다. 이 rs 번호는, National Center for Biotechnology Information의 dbSNP 데이터 베이스(//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)의 등록 번호를 나타낸다. 또, 서열번호1의 301번째를 k로 나타내고 있지만, 야생형의 염기가 T이며, 변이형의 염기가 G이다. 본 발명의 (P1) 또는 (P1') 프로브에 있어서는, 서열번호1의 301번째의 염기는 변이형의 염기G인 것이 바람직하다.

본 발명의 (P1) 또는 (P1') 프로브는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서 상기 특정된 서열을 갖는 것 외에는, 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 프로브와 같이 하여 제작할 수 있다. (P1) 또는 (P1') 프로브의 길이로서는, 예를 들면, 7～48염기길이, 7～28염기길이, 7～23염기길이, 7～18염기길이이다.

본 발명에 사용되는 (P1) 또는 (P1') 프로브의 염기서열의 예로서는, 5'-ctgtgagcaatGtcaccc-3'(서열번호3)를 들 수 있고, 대문자의 염기G가 301번째의 염기에 대응한다.

본 발명의 (P2) 프로브는, ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 239번째의 염기에 대응하는(즉, 상보적인) 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이 문맥에서 참조하는 경우, 「상동인 서열」이란, 서열번호2 또는 서열번호2의 상기 기재 부분에 상동인 서열이다. 즉, 상기 올리고뉴클레오티드는, 상기 「상동인 서열」의 상보쇄를 포함한다. 염기길이 13～28의 염기서열은, 그 전부가, 서열번호2 또는 「상동인 서열」에 연속하여 포함된다.

본 발명의 (P2') 프로브는, ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 239번째의 염기에 대응하는(즉, 상보적인) 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 염기길이 13～28의 염기서열은, 그 전부가, 서열번호2에 연속하여 포함된다.

여기에서, ITPA 유전자 다형의 rs1127354는, 서열번호2의 251번째의 염기이다. 또, 서열번호2의 251번째를 v로 나타내고 있지만, 야생형의 염기가 C이며, 변이형의 염기가 A이다. 또한, NCBI의 SNP 사이트에는 ITPA 유전자 다형의 rs1127354는 C/A/G의 3종이 등록되어 있지만, 일본인은 C의 알렐 빈도 87.5％, A의 알렐 빈도 12.5%로 기재되어 있다(G타입의 일본인은 없음). 또한, G의 보고를 한 사람(조직)은 1명 밖에 측정하여 있지 않다(P3의 프로브에 대해서도 같음). 본 발명의 (P2) 또는 (P2') 프로브는, 251번째의 염기가 변이형의 염기A인 서열번호2의 염기서열에 상보적인 것이 바람직하다.

본 발명의 (P2) 또는 (P2') 프로브는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서 상기 특정된 서열을 갖는 것 외에는, 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 소광 프로브와 같이 하여 제작할 수 있다. 본 발명의 프로브의 길이로서는, 예를 들면, 13～48염기길이, 13～28염기길이, 13～23염기길이, 13～18염기길이이다.

본 발명에 사용되는 (P2) 또는 (P2') 프로브의 염기서열의 예로서는, 5'-gcatgTaaacttatctcc-3'(서열번호4)를 들 수 있고, 대문자의 염기T가 251번째의 염기에 상당한다(즉, 상보적이다).

본 발명의 (P3) 프로브는, ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이 문맥에서 참조하는 경우, 「상동인 서열」이란, 서열번호2 또는 서열번호2의 상기 기재 부분에 상동인 서열이다. 염기길이 6～42의 염기서열은, 그 전부가, 서열번호2 또는 「상동인 서열」에 연속하여 포함된다.

본 발명의 (P3') 프로브는, ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 검출하기 위한 프로브로서, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 이 문맥에서 참조하는 경우, 「하이브리다이즈하는 서열」이란, 서열번호2 또는 서열번호2의 상기 기재 부분의 상보쇄와 하이브리다이즈하는 서열이다. 염기길이 6～42의 염기서열은, 그 전부가, 서열번호2 또는 「하이브리다이즈하는 서열」에 연속하여 포함된다.

여기에서, ITPA 유전자 다형의 rs1127354는, 서열번호2의 251번째의 염기이다. 본 발명의 (P3) 또는 (P3') 프로브에 있어서는, 서열번호2의 251번째의 염기는 야생형의 염기C인 것이 바람직하다.

본 발명의 (P3) 또는 (P3') 프로브는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서 상기 특정된 서열을 갖는 것 외에는, 일본 특개2002-119291호 공보에 기재된 소광 프로브와 같이 하여 제작할 수 있다. 본 발명의 프로브의 길이로서는, 예를 들면, 6～72염기길이, 6～42염기길이, 6～27염기길이, 6～22염기길이이다.

본 발명에 사용되는 (P3) 또는 (P3') 프로브의 염기서열의 예로서는, 5'-tctaggagataagtttCcatgc-3'(서열번호5)를 들 수 있고, 대문자의 염기C가 251번째의 염기에 상당한다.

상기 형광 색소는, 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있고, 시판의 형광 색소로서는, 예를 들면, BODIPY FL(상품명, 몰레큘러·프로브사제), FluorePrime(상품명, 아머샴파마시아사제), Fluoredite(상품명, 밀리포어사제), FAM(ABI사제), Cy3 및 Cy5(아머샴파마시아사제), TARMA(몰레큘러·프로브사제) 등을 들 수 있다. 프로브의 검출 조건은, 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 따라 적의(適宜) 결정할 수 있지만, 예를 들면, Pacific Blue는, 검출 파장 445～480㎚, TAMRA는, 검출 파장 585～700㎚), BODIPY FL은, 검출 파장 520～555㎚으로 검출할 수 있다. 이러한 프로브를 사용하면, 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합 방법은, 통상의 방법, 예를 들면 일본 특개2002-119291호 공보에 기재의 방법을 따라서 행할 수 있다.

본원에 있어서의 「상동인 서열」이란, 특정의 염기서열에 있어서, 염기서열(예를 들면, 서열번호1 혹은 2 또는 상기 기재 부분) 또는 염기서열의 상보쇄(또는 상기 기재 부분)에 예를 들면, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 가지고 있는 염기서열을 가리킨다. 본원에 있어서는, 100%의 동일성을 가지고 있어도 된다.

본원에 있어서의 하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그것에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등을 따라서 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 상기 하이브리다이제이션은, 예를 들면, 스트린젠트한 조건 하에서 행한다.

스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되어, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM～약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM～약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH8.6), 25mM의 ＫCl, 및 1.5mM의 MgCl₂ 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을, 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것이 아니다. 그 외, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염농도 등을 변화시키는 것에 의해, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의, 올리고뉴클레오티드로서는, 올리고뉴클레오티드 외, 수식된 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

상기 올리고뉴클레오티드의 구성 단위로서는, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 인공 핵산 등을 들 수 있다. 상기 인공 핵산으로서는, DNA, RNA, RNA 아날로그인 LNA(Locked Nucleic Acid); 펩티드 핵산인 PNA(Peptide Nucleic Acid); 가교화 핵산인 BNA(Bridged Nucleic Acid) 등을 들 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는, 상기 구성 단위 중, 1종류로 구성되어도 되며, 복수 종류로 구성되어도 된다.

본 발명의 (P1) 및 (P1')의 프로브는, 서열번호1의 염기번호301～307을 포함하는 7～28염기길이의 염기서열에 상동인 서열이며, 서열번호1에 대하여 상동성을 갖는 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 (P1) 및 (P1')의 프로브는, 서열번호1의 염기번호301～307을 포함하는 7～28염기길이의 염기서열에 상동적이지만, 완전히 동일하지 않아도 된다. 또한, 307번째에 대응하는 염기는, 시토신이며, 형광 표지되어 있다.

본 발명의 (P2) 및 (P2')의 프로브는, 서열번호2의 염기번호239～251을 포함하는 13～28염기길이의 염기서열이며, 서열번호2에 상보적인 서열에 대하여 상동성을 갖는 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 (P2) 및 (P2')의 프로브는, 서열번호2의 염기번호239～251을 포함하는 13～28염기길이의 염기서열에 상보적이지만, 완전히 상보적이지 않아도 된다. 또한, 239번째에 대응하는 염기는, 시토신이며, 형광 표지되어 있다.

본 발명의 (P3) 및 (P3')의 프로브는, 서열번호2의 염기번호251～256을 포함하는 6～42염기길이의 염기서열이며, 서열번호2에 대하여 상동성을 갖는 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 (P3) 및 (P3')의 프로브는, 서열번호2의 염기번호251～256을 포함하는 6～42염기길이의 염기서열에 상동적이지만, 완전히 동일하지 않아도 된다. 또한, 256번째에 대응하는 염기는, 시토신이며, 형광 표지되어 있다.

상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 상보 서열에 하이브리다이즈하여 있지 않을 때의 형광 강도에 비교하여, 상보 서열에 하이브리다이즈하여 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들면, 상보 서열에 하이브리다이즈하여 있지 않을 때의 형광 강도에 비교하여, 상보 서열에 하이브리다이즈하여 있을 때의 형광 강도가 감소하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 구아닌 소광 프로브라고 불리고 있고, 소위 QProbe(등록상표)로서 알려져 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드를 3' 말단 혹은 5' 말단이 C가 되도록 설계하고, 그 말단의 C가, G에 가까이 가면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 올리고뉴클레오티드이다.

또한, 본 발명 프로브는, 예를 들면, 3'가 형광 색소에 의해 표지화되어 있다.

또, 본 명세서에 있어서, 「3' 말단부터 세어 1～3번째」라고 하는 경우는, 3' 말단을 1번째로 하여 센다.

본 발명 검출 방법은, IL28B 유전자 다형의 rs8099917 및/또는 ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 갖는 핵산에 대하여, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여, 형광 색소의 형광을 측정하는 것에 의해 융해 곡선 분석을 하고, 융해 곡선 분석의 결과에 근거하여 다형을 검출하는 방법으로서, 핵산 프로브는 본 발명의 프로브인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 검출 방법은, 예를 들면, 본 발명의 프로브를 사용하고, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에, 본 발명의 프로브를 첨가하여 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,

또, (Ⅲ)에서 Tm값을 평가하는 것에는, 하이브리드 형성체의 해리 온도를 평가하는 것뿐만 아니라, 하이브리드 형성체의 융해 시에 온도에 따라서 변동하는 형광 시그널의 미분값의 크기를 평가하는 것을 포함한다. 미분값의 크기에 의해, 다형을 갖는 염기서열(DNA)의 존재비를 평가할 수 있다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면, 폴리머라제를 사용하는 방법이 있고, 그 예로서는, PCR, ICAN, LAMP 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우는, 예를 들면, 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행할 수 있다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자이면 용이하다. 이것에 의해, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석하는 것뿐이므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다. 따라서, 자동화도 용이하다.

또한 PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용되는 DNA 폴리머라제를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, Gene Taq(니뽄진사제), Prime STAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제), Taq Polymerase 등을 들 수 있다.

폴리머라제의 사용량으로서는, 통상 사용되고 있는 농도이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용하는 경우, 반응 용액량 50㎕에 대하여 0.01U～100U의 농도로 할 수 있다. 이것에 의해, 충분한 증폭 산물량을 얻을 수 있는 등의 이점을 갖는다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 DNA는, 1본쇄 DNA여도 되며 2본쇄 DNA여도 된다. 상기 DNA가 2본쇄 DNA의 경우는, 예를 들면, 상기 하이브리다이즈 공정에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 DNA를 해리시키는 공정을 포함할 수 있다. 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 해리하는 것에 의해, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈가 가능하게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 DNA에 대한, 본 발명의 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 제한되지 않지만, 검출 시그널을 충분히 확보할 수 있으므로, 예를 들면, 시료 중의 DNA에 대하여 1배 이하 또는 0.3배 이하이다. 이때, 시료 중의 DNA란, 예를 들면, 검출 목적의 다형이 발생하여 있는 검출 대상 DNA와 상기 다형이 발생하여 있지 않는 비검출 대상 DNA의 합계여도 되며, 검출 목적의 다형이 발생하여 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하여 있지 않는 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계여도 된다. 또, 시료 중의 DNA에 있어서의 상기 검출 대상 DNA의 비율은, 통상, 불명하지만, 결과적으로, 상기 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 예를 들면, 검출 대상 DNA(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대하여 100배 이하, 50배 이하, 또는, 30배 이하이다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.001배 이상, 0.01배 이상, 또는 0.2배 이상이다. 상기 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 DNA에 대한 몰비여도 되며, 1본쇄 DNA에 대한 몰비여도 된다.

Tm값에 대하여 설명한다. 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어져, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시 시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이것에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 근거하여, 융해 온도 Tm이란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전(全)상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 따르는 시그널 변동의 측정은, 상술과 같은 원리로부터 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 예를 들면, 본 발명의 프로브에 부가한 표지의 시그널에 근거하는 시그널로서 DNA와 프로브의 하이브리드 형성의 상태에 따라서 변동하는 시그널을 측정할 수 있다. 이 때문에, 본 발명의 프로브로서, 예를 들면, 상술의 표지화 프로브를 사용할 수 있다. 상기 표지화 프로브로서는, 예를 들면, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 시에는 시그널을 나타내지 않거나, 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 유리(遊離)하면 시그널을 나타내게 되거나, 시그널이 증가한다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 근거하는 시그널의 변화를 시그널 특유의 조건(흡광도 등)으로 검출하는 것에 의해, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 같이, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다. 표지화 프로브에 있어서의 표지화 물질은, 예를 들면, 상술과 같지만 형광 색소 표지화 프로브를 사용할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대하여, 형광 색소에 근거하는 시그널의 변화를 검출하는 방법에 대하여 구체적 예를 들어 설명한다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 외의 공정이나 조건에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온～85℃, 또는 25℃～70℃이며, 종료 온도는, 예를 들면, 40℃～105℃이다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃/초～20℃/초, 또는 0.3℃/초～5℃/초이다.

다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분값(-d형광 강도/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t) 이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니고, 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상술과 같이, 하이브리드 형성체를 가열하여, 온도 상승에 따르는 형광 시그널 변동(예를 들면 형광 강도의 증가)을 측정하지만, 이 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성 시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜서 하이브리드 형성체를 형성할 때의 상기 온도 강하에 따르는 형광 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, 상보 서열에 하이브리다이즈하여 있지 않을 때의 형광 강도에 비교하여, 상보 서열에 하이브리다이즈하여 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드 프로브(예를 들면, Q프로브)를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가할 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 크지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드 형성체를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 가열한 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.

한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가할 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 작지만(또는 소광), 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 따르는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산으로서는, 핵산을 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전처리한 후에 사용할 수 있다. 예를 들면, 전혈을 시료로 하는 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이언스사제) 등을 사용할 수 있다.

PCR법에 적용하는 프라이머는, 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이제이션할 수 있는 영역을 증폭할 수 있는 것이면 특히 제한되지 않고, 서열번호1 또는 2로 나타내는 염기서열로부터, 당업자이면 적의 설계할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm값은, 12mer～40mer 및 40～70℃, 또는 16mer～30mer 및 55～60℃로 할 수 있다.

또한, 프라이머 세트의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되지만, 양 프라이머의 Tm값은 거의 동일(또는, Tm값의 양 프라이머에서의 차가 5℃ 이내)한 것이 바람직하다.

Tm 해석은, 본 발명 프로브의 형광 색소의 형광을 측정하는 것 외에는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다. 형광의 측정은, 형광 색소에 따른 파장의 여기광을 사용하여 발광 파장의 광을 측정하는 것에 행할 수 있다. Tm 해석에 있어서의 승온 속도는, 통상으로는, 0.1～1℃/초이다. Tm 해석을 행할 때의 반응액의 조성은, 프로브와 그 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산의 하이브리다이제이션이 가능하면 특별히 제한되지 않지만, 통상으로는, 1가의 양이온 농도가 1.5～5mM, pH가 7～9이다. PCR 등의 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭 방법의 반응액은, 통상, 이 조건을 만족하므로, 증폭 후의 반응액을 그대로 Tm 해석에 사용할 수 있다.

Tm 해석의 결과에 근거하는 IL28B 유전자 다형의 rs8099917 및/또는 ITPA 유전자 다형의 rs1127354의 검출은 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다. 본 발명에 있어서의 검출이란, 변이의 유무의 검출을 포함한다.

또, 본 발명의 프로브 및 방법에 의해, 변이의 유무의 검출이 가능하기 때문에, 변이의 유무에 근거하여, C형 간염 바이러스 치료약의 약효 및 C형 간염 바이러스 치료약에 대한 내성을 판단 또는 예측하는 것도 본 발명에 포함된다. 구체적으로는, IL28B 유전자 다형의 rs8099917의 염기가 야생형의 T인 경우(T/T)는, 페그 인터페론+리바비린 병용 요법이 유효한 것이 시사되어, 변이형의 G를 포함하는 경우(G/G 또는 T/G)는, 유효하지 않은 것이 시사된다. 또한, ITPA 유전자 다형의 rs1127354의 염기가 변이형의 A를 포함하는 경우(A/A 또는 C/A)는, 리바비린의 부작용인 중도(重度)의 빈혈이 발증하기 어렵고, 리바비린의 고용량 투여가 가능한 것이 시사된다.

또한, 본 발명의 방법에 의해, IL28B 유전자 다형의 rs8099917 및 ITPA 유전자 다형의 rs1127354를 동시에 검출하는 것도 가능하다.

<2> 본 발명 키트

본 발명 키트는, 본 발명의 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다. 이 키트는, 형광 색소로 표지되어, 하이브리다이제이션했을 때에 형광 색소의 형광이 변화하는 핵산 프로브(예를 들면, 소광 프로브)로서, 상기 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 핵산 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또, 본 발명의 키트는, C형 간염 바이러스 치료약의 약효 및 C형 간염 바이러스 치료약에 대한 내성을 판단 또는 예측하는데도 사용할 수 있다.

본 발명 검출 키트는, 프로브 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하는데 필요로 되는 시약류, 특히 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭을 위한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다.

구체적으로는, 본 발명의 프라이머는, IL28B 유전자의 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 P1 또는 P1'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 및/또는 ITPA 유전자의 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 P2 혹은 P2' 또는 P3 혹은 P3'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머이다.

본 발명 검출 키트에 있어서 프로브, 프라이머 및 그 외의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되며, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

이하에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 이들의 실시예는 예시이며, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 검출 대상이 되는 시료 중의 시료 핵산, 다형 검출용 프로브 또는 프라이머의 각각의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 근거하여 기술된 사항은, 특별히 언급하지 않는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대하여 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대하여 상보적인 당해 서열에 대하여 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

[실시예]

실시예1(IL28B의 주형 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하고, 단일 프로브를 사용하는 경우)

IL28B 유전자 다형의 rs8099917의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호1)에 근거하고, 표 1에 나타내는, 3' 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 1 중, 프로브의 위치는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. BODIPY FL에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(변이형(서열번호10) 및 야생형(서열번호11))의 서열을 표 1에 나타낸다. 표 1 중, 올리고의 위치는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 또, 헤테로형일 때는 서열번호10, 11의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합하여 시료에 사용했다.

[표 1]

하기의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 Tm 해석을 행하고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드(서열번호3)의 성능을 확인했다.

Tm 해석의 조건은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 85℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 420～485㎚ 및 520～555㎚(BODIPY FL)이었다.

[표 2]

표 1의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 야생형 올리고뉴클레오티드(사각)에 대해서는, BODIPY FL의 피크가 55℃ 부근에 보이고, 변이형 올리고뉴클레오티드(마름모형)에 대해서는, BODIPY FL의 피크가 64℃ 부근에 보였다(도 2). 또한, 야생형 및 변이형이 혼합한 헤테로형 올리고뉴클레오티드(삼각)에 대해서는, BODIPY FL의 피크가 55℃ 및 64℃ 부근에 보였다(도 2).

상기한 바와 같이, 야생형(T/T), 헤테로형(T/G), 변이형(G/G)의 어느 것에 대해서도 명확한 고유한 피크가 보였기 때문에, 서로 구별되는 것을 알 수 있었다.

비교예1(IL28B의 주형 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하고, 단일 프로브를 사용하는 경우)

IL28B 유전자 다형의 rs8099917의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호1)에 기하여, 표 3에 나타내는, 3' 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 3 중, 프로브의 위치는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. BODIPY FL에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(변이형(서열번호13) 및 야생형(서열번호14))의 서열을 표 3에 나타낸다. 표 3 중, 올리고의 위치는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 또, 헤테로형일 때는 서열번호13, 14의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합하여 시료에 사용했다.

[표 3]

하기의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 Tm 해석을 행하고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드(서열번호12)의 성능을 확인했다.

[표 4]

표 3의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 야생형 올리고뉴클레오티드(사각)에 대해서는, BODIPY FL의 피크가 56℃ 부근에 보이고, 변이형 올리고뉴클레오티드(마름모형)에 대해서는, BODIPY FL의 피크가 55℃ 부근에 보였다(도 3). 따라서, Tm값의 Δ(즉, Tm값의 차)가 작으므로 구별이 되지 않는 것을 알 수 있었다.

또한, 야생형 및 변이형이 혼합한 헤테로형 올리고뉴클레오티드(삼각)에 대해서는, BODIPY FL의 피크가 56℃ 부근에만 보였다(도 3). 따라서, 헤테로형에서는, 검출 피크가 1개밖에 얻어지지 않아, 야생형 및 변이형과 구별할 수 없는 것을 알 수 있었다.

따라서, 실시예1의 결과를 합하여 고려하면, 프로브의 3' 말단의 C가 형광 표지되어 있으면 어떤 프로브 서열이어도 된다고 하는 것은 아니고, 서열번호3의 프로브와 같이, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 307번째의 C가 형광 표지되는 것이 중요하다고 이해된다.

실시예2(ITPA의 주형 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하고, 단일 프로브를 사용하는 경우)

ITPA 유전자 다형의 rs1127354의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호2)에 근거하고, 표 5에 나타내는, 3' 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 5 중, 프로브의 위치는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. TAMRA에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(변이형(서열번호15) 및 야생형(서열번호16))의 서열을 표 5에 나타낸다. 표 5 중, 올리고의 위치는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 또, 헤테로형일 때는 서열번호15, 16의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합하여 시료에 사용했다.

[표 5]

하기의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 Tm 해석을 행하고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드(서열번호5)의 성능을 확인했다.

Tm 해석의 조건은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 85℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520～555㎚ 및 585～700㎚(TAMRA)이었다.

[표 6]

표 5의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 야생형 올리고뉴클레오티드(사각)에 대해서는, TAMRA의 피크가 64℃ 부근에 보이고, 변이형 올리고뉴클레오티드(마름모형)에 대해서는, TAMRA의 피크가 56℃ 부근에 보였다(도 4). 따라서, 야생형과 변이형의 구별이 되는 것을 알 수 있었다.

또한, 야생형 및 변이형이 혼합한 헤테로형 올리고뉴클레오티드(삼각)에 대해서는, TAMRA의 피크가 56℃ 및 64℃ 부근에 보였다(도 4). 따라서, 야생형과 변이형으로부터, 헤테로형을 구별할 수 있는 것을 알 수 있었다.

비교예2(ITPA의 주형 올리고뉴클레오티드를 검출 대상으로 하고, 단일 프로브를 사용하는 경우)

ITPA 유전자 다형의 rs1127354의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호2)에 기하여, 표 7에 나타내는, 3' 말단부에 C를 갖는 프로브를 설계했다. 표 7 중, 프로브의 위치는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. TAMRA에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출 대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열번호18) 및 변이형(서열번호19))의 서열을 표 7에 나타낸다. 표 7 중, 올리고의 위치는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 또, 헤테로형일 때는 서열번호18, 19의 주형 올리고뉴클레오티드를 1:1로 혼합하여 시료에 사용했다.

[표 7]

하기의 시약을 사용하여 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)로 Tm 해석을 행하고, 형광 표지 올리고뉴클레오티드(서열번호17)의 성능을 확인했다.

Tm 해석의 조건은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 520～555㎚ 및 585～700㎚(TAMRA)이었다.

[표 8]

표 7의 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행한 결과, 야생형 올리고뉴클레오티드(삼각)에 대해서는, TAMRA의 피크가 63℃ 부근에 보이고, 변이형 올리고뉴클레오티드(사각)에 대해서는, TAMRA의 피크가 59℃ 부근에 보였다(도 5).

또한, 야생형 및 변이형이 혼합한 헤테로형 올리고뉴클레오티드(마름모형)에 대해서는, TAMRA의 피크가 64℃ 부근에만 보였다(도 5). 따라서, 헤테로형에서는, 검출 피크가 1개밖에 얻어지지 않아, 야생형 및 변이형과 구별할 수 없는 것을 알 수 있었다.

따라서, 실시예2의 결과를 합하여 고려하면, 프로브의 3' 말단의 C가 형광 표지되어 있으면 어떤 프로브 서열이여도 된다고 하는 것은 아니고, 서열번호5의 프로브와 같이, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 256번째의 C가 형광 표지되는 것이 중요하다고 이해된다.

실시예3(정제 인간 게놈 또는 전혈을 검출 대상으로 하고, 복수 프로브를 사용하는 경우)

아래와 같이, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 정제 인간 게놈 또는 전혈의 다형 영역을 증폭하고, 서열번호3, 4에 나타내는 프로브를 사용하여 Tm 해석을 행했다.

우선, IL28B 유전자 다형의 rs8099917의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호1)에 근거하고, 다형의 부위를 증폭할 수 있도록 표 9에 나타내는 프라이머를 설계했다. 표 9 중, 프라이머의 위치는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

또한, ITPA 유전자 다형의 rs1127354의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호2)에 근거하고, 다형의 부위를 증폭할 수 있도록 표 10에 나타내는 프라이머를 설계했다. 표 10 중, 프라이머의 위치는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

다음으로, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm 해석을 행했다. PCR 반응액의 조성은 하기와 같다. 시료는, 이하의 전혈 또는 정제 인간 게놈을 사용했다. PCR 및 Tm 해석의 조건은, 95℃, 60초→(95℃, 1초→58℃, 30초)×50사이클→95℃, 1초→40℃, 60초→(40℃→85℃, 1℃/3초)이었다.

Tm 해석에 있어서의 여기 파장 및 검출 파장은, 각각 420～485㎚ 및 520～555㎚(BODIPY FL), 또는, 각각 520～555㎚ 및 585～700㎚(TAMRA)이었다.

[표 9]

[표 10]

[표 11]

[표 12]

<정제 DNA>

정제 DNA에 대해서는, 1test 부근 100카피가 되도록 PCR 반응액에 가해, 주형으로서 사용했다.

<전혈의 조제>

전혈 10㎕를 희석액(1) 70㎕에 가해, 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10㎕를 희석액(2) 70㎕에 첨가했다. 이 혼합액 17㎕를 95℃ 10분으로 가열하여 4㎕의 전처리된 전혈을 얻었다. 이것을 PCR 반응액에 가해, 상기 전처리된 전혈로부터 초래되는 DNA를 주형으로서 사용했다.

[표 13]

BODIPY FL의 형광에 의해 IL28B 유전자의 평가를 행한 결과, 정제 인간 게놈(도 6 왼쪽 도면) 및 혈액(도 7 왼쪽 도면)에 대하여, 야생형 및 변이형의 양쪽의 피크가 보여, 헤테로형(T/G)의 다형인 것을 알 수 있었다.

또한, TAMRA의 형광에 의해 ITPA 유전자의 평가를 행한 결과, 정제 인간 게놈(도 6 오른쪽 도면) 및 혈액(도 7 오른쪽 도면)에 대하여, 야생형의 피크만이 보여, 야생형(C/C)인 것을 알 수 있었다.

도 6, 7의 결과로부터, 서열번호3, 4로 나타내는 프로브를 사용했을 때, IL28B 유전자 다형 및 ITPA 유전자 다형에 대하여, Tm 해석에서 해석이 가능한 형광 강도의 변화가 인정되었다.

즉, IL28B 유전자 다형에 대해서는, 헤테로형의 T/G인 정제 인간 게놈 및 전혈은 2개의 피크(53℃ 및 62℃)를 갖는 것이며, 고유한 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다.

또한, ITPA 유전자 다형에 대해서도, 정제 인간 게놈 및 전혈은 1개의 피크(48℃)만을 갖는 것이며, 고유한 형광 강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다.

따라서, 서열번호3 및 4의 프로브를 동시에 사용하는 것에 의해, IL28B 유전자 다형과, ITPA 유전자 다형을 동시에 검출할 수 있다.

또한, 서열번호5의 프로브는, 서열번호4의 프로브와 같이, 3' 말단의 C가 형광 표지되어 있고, 실시예2에 있어서 그 효과가 나타나 있으므로, 서열번호5의 프로브와 서열번호3의 프로브를 동시에 사용하는 것에 의해서도, IL28B 유전자 다형과, ITPA 유전자 다형을 동시에 검출할 수 있다.

본 발명은 의료, 진단, 연구 등의 분야에서 호적하게 이용할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Arkray, Inc. <120> METHOD FOR DETECTING MUTATIONS AT IL28B(RS8099917) AND ITPA(RS1127354) <130> P-120859 <150> JP2011-202261 <151> 2011-09-15 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tgaaaaatac acaaaaacat aaaagaaaaa aaacatcacc tataacttca ccatcctcct 60 ctcatccctc atcccacttc tggaacaaat cgtcccaata cataggaatt ttccatgtgt 120 ttatttgtgc atatgttttc tgactaccaa agtaacactt gttccttgta aaagattcca 180 tccatacaaa aacatacaac atggagagtt aaagtaagtc ttgtatttca cctcctggag 240 gtaaatattt tttaacaatt tgtcactgtt cctccttttg ttttcctttc tgtgagcaat 300 ktcacccaaa ttggaaccat gctgtataca gtttggtagc tggcttttta tgtcttacca 360 ttatctctca tttgcattct cccacatctt taattatagc gtatcagtta gggcccagca 420 ggaaacagat ggcccgtcaa tttaggataa tttgaggtgg ggttgatacc agaagccttt 480 ataaagcgat tggatagtaa aggcaaatga caagagctag tgcaagctcc tggggccagc 540 atgggtgagg ggcctcatcc acaggcctaa aggaagggga gagggttgag ggtgtgcatg 600 t 601 <210> 2 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acaagcagag acctgacgta gaagagatag agaagcaagg agatggaagg ggctggcttg 60 ctggggtggg accctgaaag ccggggtgag gcccacaggc ctgagttggt aagctttagg 120 agatgggcag cagagttatc gatgagaaag gcggatgaca gctcacgtgc tcacatggag 180 aatcactaga tggtgataag tgttctcttt tctcttggaa caggtcgttc agattctagg 240 agataagttt vcatgcactt tggtggcaca gaaaattgac cgtatgtctc tgttttgttt 300 tatttttaaa agatggttgg atttctctgt cttcctgtga cctgactttc tgtgtgtctg 360 tttccctgat aagtgccgga gtaccagggg gagccggatg agatttccat acagaaatgt 420 caggaggcag ttcgccaggt gcttgccctg cccttgtccc acacttgctc ttcttgtcca 480 ggtagcttcc agggcctgcg c 501 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 ctgtgagcaa tgtcaccc 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 gcatgtaaac ttatctcc 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 tctaggagat aagtttccat gc 22 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caacatggag agttaaagta agtcttgtat ttcacc 36 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cagctaccaa actgtataca gcatggttc 29 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagtgttctc ttttctcttg gaacag 26 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 agagacatac ggtcaatttt ctgtg 25 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 tggttccaat ttgggtgaca ttgctcacag aaaggaa 37 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 tggttccaat ttgggtgaaa ttgctcacag aaaggaa 37 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 caatttgggt gacattgctc 20 <210> 13 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 ttcctttctg tgagcaatgt cacccaaatt ggaacca 37 <210> 14 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 14 ttcctttctg tgagcaattt cacccaaatt ggaacca 37 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 15 ggtcaatttt ctgtgccacc aaagtgcatg taaacttatc tcctagaatc tgaacgacct 60 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 16 ggtcaatttt ctgtgccacc aaagtgcatg gaaacttatc tcctagaatc tgaacgacct 60 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 17 cagattctag gagataagtt tcc 23 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 18 tggaaactta tctcctagaa tctga 25 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 19 tgtaaactta tctcctagaa tctga 25

Claims

IL28B 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는, 올리고뉴클레오티드.
(P1') 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서, 301～307번째의 염기를 포함하는 염기길이 7～28의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 307번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
ITPA 유전자의 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 P2～P3'에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P2) 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 239번째의 염기에 상보적인 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2') 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 239～251번째의 염기를 포함하는 염기길이 13～28의 염기서열에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 239번째의 염기에 상보적인 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3) 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P3') 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서, 251～256번째의 염기를 포함하는 염기길이 6～42의 염기서열의 상보쇄에 대하여 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 가지고, 256번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
제1항 또는 제2항에 있어서,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호307에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1～3번째의 위치에 가지고,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호239에 상보적인 염기를 3' 말단부터 세어 1～3번째 중 어느 위치에 가지고,
P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호256에 대응하는 염기를 3' 말단부터 세어 1～3번째 중 어느 위치에 갖는 프로브.
제1항 또는 제2항에 있어서,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호307에 대응하는 염기를 3' 말단에 가지고,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호239에 상보적인 염기를 3' 말단에 가지고,
P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드는, 형광 색소로 표지된 염기번호256에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖는 프로브.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하거나 또는 증가하는 프로브.
제5항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드가, 표적 서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 표적 서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광 강도가 감소하는 프로브.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 7～23이며,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 13～23이며,
P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 6～27인 프로브.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
P1 및 P1'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 7～18이며,
P2 및 P2'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 13～18이며,
P3 및 P3'의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 6～22인 프로브.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로브가, 융해 곡선 분석용의 프로브인, 프로브.
IL28B 유전자 또는 ITPA 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
IL28B 유전자와 ITPA 유전자에 있어서의 다형을 각각 혹은 1개의 반응계에서 동시에 검출하는 방법으로서,
하기 공정(Ⅰ)～(Ⅳ)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
(Ⅰ) DNA를 함유하는 시료에, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 첨가하여 상기 DNA에 상기 프로브를 하이브리다이즈시키는 공정,
(Ⅱ) 온도를 변화시켜서 상기 DNA와 상기 프로브의 하이브리드 형성체를 해리시켜, 하이브리드 형성체의 해리에 근거하는 시그널의 변동을 측정하는 공정,
(Ⅲ) 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값을 결정하는 공정, 및
(Ⅳ) 상기 Tm값으로부터 목적의 다형의 유무 또는 다형을 갖는 염기서열의 존재비를 결정하는 공정.
제11항에 있어서,
(Ⅰ)의 공정 전 또는 (Ⅰ)의 공정과 동시에 DNA를 증폭하는 것을 더 포함하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 IL28B 유전자와 ITPA 유전자에 있어서의 다형을 각각 혹은 1개의 반응계에서 동시에 검출하는 공정, 및 다형의 유무에 근거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는, C형 간염 바이러스 치료약의 약효의 판정 방법.
IL28B 유전자와 ITPA 유전자에 있어서의 다형을 각각 혹은 1개의 반응계에서 동시에 검출하기 위한 시약 키트로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 포함하는 키트.
제14항에 있어서,
P1 혹은 P1'의 올리고뉴클레오티드 및 P2 혹은 P2'의 올리고뉴클레오티드 또는 P3 혹은 P3'의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트.
제14항 또는 제15항에 있어서,
IL28B 유전자의 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 P1 또는 P1'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머, 및/또는
ITPA 유전자의 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 P2 혹은 P2' 또는 P3 혹은 P3'의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 더 포함하는 시약 키트.