KR20120122948A

KR20120122948A - 아세트알데히드 탈수소 효소2 및 알코올 탈수소 효소2의 유전자 변이를 동시에 검출하는 방법

Info

Publication number: KR20120122948A
Application number: KR1020120044377A
Authority: KR
Inventors: 미츠하루 히라이; 아키 이구치
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2012-11-07

Abstract

[과제] 본 발명은, 아세트알데히드 탈수소 효소2(ALDH2)의 유전자 다형의 rs671 및 알코올 탈수소 효소2(ADH2)의 유전자 다형의 rs1229984를 검출하기 위해서 유효한 프로브를 특정하고, 이들의 유전자 다형을 동시에 검출하는 방법, 및 그를 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
[해결 수단] ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (P1)~(P3')에서 선택되는 적어도 1종의 형광표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 241번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P1') 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 241번째에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P2) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 261번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P2') 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열의 상보쇄에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 261번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P3) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 212번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P3') 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열의 상보쇄에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 212번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

Description

아세트알데히드 탈수소 효소2 및 알코올 탈수소 효소2의 유전자 변이를 동시에 검출하는 방법{METHOD FOR SIMULTANEOUSLY DETECTING GENE MUTATIONS OF ACETALDEHYDE DEHYDROGENASE 2 AND ALCOHOL DEHYDROGENASE 2}

본 발명은, 아세트알데히드 탈수소 효소2(ALDH2) 및 알코올 탈수소 효소2(ADH2)의 유전자 변이를 검출하는 방법, 및 그를 위한 핵산 프로브 및 키트에 관한 것이다.

알코올 대사에 관련한 대표적인 효소로서, ADH (Alcohol dehydrogenase)와 ALDH (Aldehyde dehydrogenase)가 있다. ADH는 에탄올을 아세트알데히드로 대사하고, ALDH는 아세트알데히드를 아세트산으로 대사한다.

ADH에는, ADH1, ADH2 및 ADH3의 3종류가 존재하고, ADH2 유전자의 표현형에 관련한 유전자 다형에는, ADH2*1(WT), ADH2*2, ADH2*3이 존재한다(비특허문헌 1). 일본인에 있어서의 빈도는, *1/*1:8.4%, *1/*2:34.9%, *2/*2:56.7%로 되어 있고, *3은 거의 존재하지 않는다(비특허문헌 2).

ALDH2의 유전자의 표현형에 관련한 유전자 다형에는, *1(WT) 및 *2가 존재하며(비특허문헌 1), 일본인에 있어서의 빈도는, *1/*1:52.8%, *1/*2:40.9%, *2/*2:6.3%로 되어 있다(비특허문헌 2).

이들 유전자 다형 중에서도, ADH2*2 및 ALDH2는, 알코올 의존증이나, 간장병, 췌장암 등에 관여하고 있다고 보고되어 있다(비특허문헌 1,3).

또, CYP2E1에 대해서도 ADH2 및 ALDH2와 같은 기능을 갖는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1).

특허문헌 1에는, 알코올 대사 능력 및 내성에 관여하는 유전자(ALDH2, ADH2, 및 CYP2E1유전자) 변이를 하이브리다이제이션법으로 검출하기 위한 프라이머 세트 및 프로브 세트가 기재되어 있다. 그러나, (1) 알코올 대사 등에 관련한 변이 1변이에 대해 1반응계(1튜브)에서 검출할 필요가 있고, 수고와 비용, 시간을 요하고, (2) 타액·전혈로부터 정제한 DNA를 사용할 필요가 있고, 수고와 비용, 시간을 요하고, 간단하게 측정할 수 없고, (3)마이크로어레이를 행할 때, 증폭산물을 취급하기 때문에, 증폭산물이 다른 샘플에 컨태미네이션(contamination)할 위험이 있다는 등의 문제점이 있었다.

한편, 변이를 포함하는 영역을 PCR로 증폭한 후, 형광색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해곡선 분석을 행하여, 융해곡선 분석의 결과에 의거하여 변이를 해석하는 방법이 알려져 있다(특허문헌 2,3). 그러나, 이들 문헌에 있어서는, 프로브의 설계에 관하며, 말단부가 형광색소에 의해 표지된 소광 프로브가 표적핵산에 하이브리다이제이션했을 때, 말단 부분에 있어서 프로브-핵산 하이브리드의 복수 염기쌍이 적어도 하나의 G와 C의 페어를 형성하도록 설계한다는 교시가 있을 뿐이다. 또한, 이들 방법은, 실시하는 데에 모든 임의서열에서 실시 가능하지 않다는 문제가 있었다.

일본 특개2008-79604호 공보 일본 특개2001-286300호 공보 일본 특개2002-119291호 공보

Hepatrogy Volume 23, Issue 2, pages 234-239, February 1996, F Tanaka et al. 제15회 혈압관리연구회 연제3 에탄올 대사효소는 음주와 혈압과의 관련을 수식하는가? 사이토 교코 등 (http://www.healthcare.omron.co.jp/medical/study/pdf/past15_03.pdf) 우에하라 기념 생명과학재단 연구보고서, 23(2009) 췌장암 이환(罹患) 리스크에 관한 유전적 배경과 음주습관의 영향을 평가하는 분자역학 연구 마츠오 게이타로 등(http://ueharazaidan.yoshida-p.net/houkokushu/Vol.23/pdf/046_report.pdf)

본 발명은, 아세트알데히드 탈수소 효소2(ALDH2)의 유전자 다형의 rs671 및 알코올 탈수소 효소2(ADH2)의 유전자 다형의 rs1229984를 검출하기 위해서 유효한 프로브를 특정하고, 이들의 유전자 다형을 동시에 검출하는 방법, 및 그를 위한 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명자는, 아세트알데히드 탈수소 효소2(ALDH2)의 유전자 다형의 rs671 및 알코올 탈수소 효소2(ADH2)의 유전자 다형의 rs1229984를 포함하는 특정의 영역에 의거하여 프로브를 설계하고, 당해 프로브를 사용하는 융해곡선 분석을 행함으로써 당해 변이를 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (P1)~(P3)에서 선택되는 적어도 1종의 형광표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.

(P1) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 241번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(P1') 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 241번째에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(P2) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 261번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(P2') 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열의 상보쇄에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 261번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(P3) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 212번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(P3') 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열의 상보쇄에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 212번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

(2) (P1) 및 (P1')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호241에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 위치에 갖고,

(P2) 및 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호261에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 위치에 갖고,

(P3) 및 (P3')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호212에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 위치에 갖는

(1)에 기재된 프로브.

(3) (P1) 및 (P1')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호241에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,

(P2) 및 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호261에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,

(P3) 및 (P3')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호212에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖는

(1)에 기재된 프로브.

(4) 상기 올리고뉴클레오티드는, 표적서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광강도가 감소하거나 또는 증가하는, (1)~(3) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(5) 상기 올리고뉴클레오티드가, 표적서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광강도가 감소하는, (4)에 기재된 다형 검출용 프로브.

(6) 상기 (P1)~(P3')의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 12~30인, (1)~(5) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(7) 상기 (P1)~(P3')의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 15~30인, (1)~(5) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(8) 상기 (P1)~(P3')의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 18~30인, (1)~(5) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(9) 상기 프로브가, 융해곡선 분석용의 프로브인, (1)~(8) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브.

(10) (1)~(9) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 이상 사용하는 것을 특징으로 하는, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다형을 검출하기 위한 방법.

(11) (I) (1)~(9) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 상기 형광표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜 하이브리드 형성체를 얻는 것,

(Ⅱ) 상기 하이브리드 형성체를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드 형성체를 해리시켜, 상기 하이브리드 형성체의 해리에 의거한 형광 시그널의 변동을 측정하는 것,

(Ⅲ) 상기 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드 형성체의 해리 온도인 Tm값을 결정하는 것, 및

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형의 존재 또는 다형을 갖는 핵산의 존재비를 결정하는 것

을 포함하는, (10)에 기재된 다형 검출 방법.

(12) 상기 공정(I) 전 또는 공정(I)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, (11)에 기재된 다형 검출 방법.

(13) (10)~(12) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하는 공정, 및, 다형의 유무에 의거하여 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 공정을 포함하는, 방법.

(14) (1)~(9) 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 키트.

(15) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 상기 (P1), (P1'), (P2) 또는 (P2')의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 주형으로 하여 증폭 가능한 프라이머, 및 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 상기 (P3) 또는 (P3')의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 주형으로 하여 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하는, (14)에 기재된 다형 검출용 키트.

(16) ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서,

하기 (P4) 및 (P5) 및/또는 (P6) 및 (P7)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프라이머 및 (1)~(9) 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

(P4) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호89~109를 포함하는 염기길이 21~60염기길이의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

(P5) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호388~407을 포함하는 염기길이 20~60염기길이의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

(P6) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호93~138을 포함하는 염기길이 46~60염기길이의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

(P7) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호214~238을 포함하는 염기길이 25~60염기길이의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

(17) 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 방법으로서, (16)에 기재된 방법에 의해, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하는 공정, 및, 다형의 유무에 의거하여 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 공정을 포함하는, 방법.

(18) ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서, (1)~(9) 중 어느 한 항에 기재된 프로브 및 (16)에 기재된 (P4) 및 (P5) 및/또는 (P6) 및 (P7)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

본 발명의 프로브에 의해, 아세트알데히드 탈수소 효소2(ALDH2)의 유전자 다형의 rs671 및 알코올 탈수소 효소2(ADH2)의 유전자 다형의 rs1229984를 동시에 또한 명확하게 검출할 수 있다. 임상적으로도 ALDH2와 ADH2의 유전자 변이를 확인할 필요가 있으므로, 2변이를 동시에 검출할 수 있는 의의는 크다.

본 발명의 프로브를 첨가하여, 융해곡선 분석(Tm해석)을 행할 뿐으로, ALDH2 및 ADH2의 유전자 다형의 동시검출이 가능하게 된다.

본 발명의 방법을 사용함으로써, PCR를 행하는 경우이어도, 증폭산물을 취출(取出)할 필요가 없기 때문에, 컨태미네이션의 위험성이 거의 없다. 또한, 본 발명의 방법은, 조작이 간단하므로 자동화가 용이하다.

본 발명의 검출 방법에 있어서, 미정제의 타액·전혈에 원래 함유되어 있는 핵산을 주형으로 하여 사용할 수 있다.

[도 1] 실시예1의, 프로브에 3T-ALDH2*2-wt-R1-21을 사용하고, 주형으로 ALDH2*1F50(야생형) 및 ALDH2*2F50(변이형)을 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용한 경우의, Tm해석에 있어서의 단위시간당의 TAMRA의 형광강도의 변화량(d형광강도증가량/t)과 온도와의 관계를 나타낸다. 종축은, 단위시간당의 형광강도의 변화량(d형광강도증가량/t), 횡축은, 온도(℃)이다. 이하의 도면에 있어서는, 다른 주형과 형광색소의 조합으로 같은 실험이 이루어진 결과를 나타내고 있다.
[도 2] 실시예1의, 프로브에 3T-ALDH2*2-mt-F1-21을 사용하고, 주형으로 ALDH2*1R50(야생형) 및 ALDH2*2R50(변이형)을 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용하고 있다.
[도 3] 실시예1의, 프로브에 3T-ALDH2*2-wt-R3-20을 사용하고, 주형으로 ALDH2*1F50(야생형) 및 ALDH2*2F50(변이형)을 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용하고 있다.
[도 4] 비교예1의, 프로브에 5T-ALDH2*2-wt-R2-19를 사용하고, 주형으로 ALDH2*1F50(야생형) 및 ALDH2*2F50(변이형)을 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용하고 있다.
[도 5a] 실시예2의, 프로브에 3FL-ADH2-WT-F3을 사용하고, 주형으로 ADH2*1-R50(야생형) 및 ADH2*2-R50(변이형)을 사용하고, 형광색소는 BODIPY FL을 사용하고 있다.
[도 5b] 도 5a의 형광강도의 변화량의 축척을 확대한 도면이다.
[도 6a] 비교예2의, 프로브에 3FL-ADH2-mt-F1을 사용하고, 주형으로 ADH2*1-R50(야생형) 및 ADH2*2-R50(변이형)을 사용하고, 형광색소는 BODIPY FL을 사용하고 있다.
[도 6b] 도 6a의 형광강도의 변화량의 축척을 확대한 도면이다.
[도 7a] 비교예2의, 프로브에 3FL-ADH2-mt-F2를 사용하고, 주형으로 ADH2*1-R51(야생형) 및 ADH2*2-R51(변이형)을 사용하고, 형광색소는 BODIPY FL을 사용하고 있다.
[도 7b] 도 7a의 형광강도의 변화량의 축척을 확대한 도면이다.
[도 8a] 실시예3의, 프로브에 3T-ALDH2*2-mt-F1-21을 사용하고, 주형으로 구강 스와브(swab)를 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용하고 있다.
[도 8b] 실시예3의, 프로브에 3FL-ADH2-WT-F3을 사용하고, 시료로 구강 스와브를 사용하고, 형광색소는 BODIPY FL을 사용하고 있다.
[도 9a] 실시예3의, 프로브에 3T-ALDH2*2-mt-F1-21을 사용하고, 시료로 전혈을 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용하고 있다.
[도 9b] 실시예3의, 프로브에 3FL-ADH2-WT-F3을 사용하고, 시료로 전혈을 사용하고, 형광색소는 BODIPY FL을 사용하고 있다.
[도 10a] 실시예3의, 프로브에 3T-ALDH2*2-mt-F1-21을 사용하고, 시료로 정제 DNA를 사용하고, 형광색소는 TAMRA를 사용하고 있다.
[도 10b] 실시예3의, 프로브에 3FL-ADH2-WT-F3을 사용하고, 시료로 정제 DNA를 사용하고, 형광색소는 BODIPY FL을 사용하고 있다.

<1> 본 발명의 프로브 및 본 발명의 검출 방법

본 발명의 프로브는, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (P1)~(P3')에서 선택되는 적어도 1종의 형광표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브이다.

여기서, ALDH2 유전자 다형의 rs671은, 서열번호1, 2의 251번째의 염기이다. 또한, ADH2 유전자 다형의 rs1229984는, 서열번호13, 14의 201번째의 염기이다. 이들의 rs번호는, National Center for Biotechnology Information의 dbSNP 데이터베이스(//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)의 등록번호를 나타낸다.

본 발명의 프로브는, 서열번호1에 나타내는 염기서열(ALDH2 유전자의 야생형의 염기를 갖는 서열) 또는 서열번호2에 나타내는 염기서열(ALDH2 유전자의 변이형(다형)의 염기를 갖는 서열)에 있어서 상기 특정된 서열을 갖고, 서열번호13에 나타내는 염기서열(ADH2 유전자의 야생형의 염기를 갖는 서열)에 있어서 상기 특정된 서열을 갖는 외에는, 특허문헌 2, 3에 기재된 프로브와 같이 하여 제작할 수 있다.

본원에 있어서의 「상동인 서열」이란, 특정의 염기서열에 있어서, 염기서열의 상보쇄에 예를 들면, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 가지고 있는 염기서열을 가리킨다. 본원에 있어서는, 100%의 동일성을 가지고 있어도 된다.

본원에 있어서의 하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등에 따라 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.

스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM~약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM~약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH8.6), 25mM의 KCl, 및 1.5mM의 MgCl₂ 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있지만, 그것에 한정되는 것은 아니다. 기타, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염농도 등을 변화시킴으로써, 이와 같은 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

상기 형광표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의, 올리고뉴클레오티드로서는, 올리고뉴클레오티드 외에, 수식된 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

상기 올리고뉴클레오티드의 구성단위로서는, 리보뉴클레오티드, 디옥시리보뉴클레오티드, 인공핵산 등을 들 수 있다. 상기 인공핵산으로서는, DNA, RNA, RNA 아날로그인 LNA(Locked Nucleic Acid); 펩티드 핵산인 PNA(Peptide Nucleic Acid); 가교화 핵산인 BNA(Bridged Nucleic Acid) 등을 들 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는, 상기 구성단위 중, 1종류로 구성되어도 되고, 복수종류로 구성되어도 된다.

본 발명의 (P1) 및 (P1')의 프로브는, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 상보적인 서열이며, 서열번호1 또는 2에 상보적인 서열에 대해 상동성을 갖는 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 (P1) 및 (P1')의 프로브는, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 상보적이지만, 완전히 상보적이 아니어도 된다. 또한, 241번째에 대응하는 염기는, 시토신이며, 형광표지되어 있다.

본 발명의 (P2) 및 (P2')의 프로브는, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열이며, 서열번호1 또는 2에 대해 상동성을 갖는 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 (P2) 및 (P2')의 프로브는, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 상동적이지만, 완전히 동일하지 않아도 된다. 또한, 261번째에 대응하는 염기는, 시토신이며, 형광표지되어 있다.

본 발명의 (P3) 및 (P3')의 프로브는, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열이며, 서열번호13에 대해 상동성을 갖는 서열을 나타내고 있다. 즉, 본 발명의 (P3) 및 (P3')의 프로브는, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열에 상동적이지만, 완전히 동일하지 않아도 된다. 또한, 212번째에 대응하는 염기는, 시토신이며, 형광표지되어 있다.

본 발명의 프로브의 길이로서는, (P1)~(P3) 모두, 예를 들면, 11~50염기길이, 12~30염기길이, 15~30염기길이, 18~30염기길이이다.

본 발명에서 사용되는 ALDH2 유전자 다형의 rs671을 검출하기 위한 프로브의 염기서열의 예로서는, 5'-gttttcacttCagtgtatgcc-3'(서열번호3), 5'-ggcatacactAaagtgaaaac-3'(서열번호4), 5'-ttttcacttTagtgtatgcc-3'(서열번호5)를 들 수 있다. 또, 대문자의 염기는, 변이개소를 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 ADH2 유전자 다형의 rs1229984를 검출하기 위한 프로브의 염기서열의 예로서는, 5'-TCTGTCNCACGGATGACC-3'(서열번호15)를 들 수 있다. 서열 중, "N"은 a, t, g, 또는 c를 나타낸다. 보다 바람직하게는, 5'-TCTGTCGCACGGATGACC-3'(서열번호16)이다.

형광색소로서는, 특허문헌 2, 3에 기재된 것을 사용할 수 있지만, 구체예로서는, Pacific Blue(상표), FAM(상표), TAMRA(상표), BODIPY FL(상표) 등을 들 수 있다. 형광색소의 올리고뉴클레오티드에의 결합 방법은, 통상의 방법, 예를 들면 특허문헌 2, 3에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

본 발명의 프로브는, 예를 들면, 표적서열에 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광색소의 형광이 발광하고, 표적서열에 하이브리다이제이션했을 때에 형광색소의 형광이 감소 또는 증가하는 프로브이다. 예를 들면, 하이브리다이제이션하지 않을 때에 형광색소의 형광이 발광하고, 하이브리다이제이션했을 때에 형광색소의 형광이 소광하는, 소광 프로브이다.

또한, 본 발명의 프로브는, 예를 들면, 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 염기가 형광색소에 의해 표지화되어 있거나, 또는, 3' 말단이 형광색소에 의해 표지되어 있다.

또, 본 발명의 프로브에 있어서 형광색소에 의해 표지되어 있는 염기는, 서열번호1 또는 2에 있어서의 241번째 또는 261번째의 염기이다. 또한, 서열번호13 또는 14에 있어서는, 212번째의 염기이다.

본 발명의 검출 방법은, 본 발명의 프로브를 사용하고, 이하의 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

(I) 본 발명의 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 상기 형광표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜 하이브리드 형성체를 얻는 것,

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형의 존재 또는 다형을 갖는 핵산의 존재비를 결정하는 것.

본 발명의 검출 방법은, 본 발명의 프로브를 사용하는 것 외에는, 통상의 핵산증폭 및 융해곡선 분석(Tm해석)의 방법에 따라 행할 수 있다. 또한, 본 발명의 검출 방법은, 상기 공정(I) 전 또는 공정(I)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 포함하고 있어도 된다.

핵산증폭의 방법으로서는, 폴리머라제를 사용하는 방법이 바람직하고, 그 예로서는, PCR, ICAN, LAMP 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우는, 본 발명의 프로브의 존재 하에서 증폭을 행하는 것이 바람직하다. 사용하는 프로브에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자이면 용이하다. 이것에 의해, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석할 뿐이므로, 반응 종료 후, 증폭산물을 정제 등을 할 필요가 없다. 따라서, 증폭산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 동일한 기기에서 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요조차 없다. 따라서, 자동화도 용이하다.

본 발명에서, 시료 중의 DNA는, 1본쇄 DNA이어도 되고 2본쇄 DNA이어도 된다. 상기 DNA가 2본쇄 DNA의 경우는, 예를 들면, 상기 하이브리다이즈 공정에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 DNA를 해리시키는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 2본쇄 DNA를 1본쇄 DNA로 해리함으로써, 다음의 하이브리다이즈 공정에 있어서, 검출용 프로브와의 하이브리다이즈가 가능하게 된다.

본 발명에서, 상기 시료 중의 DNA에 대한, 본 발명의 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 제한되지 않지만, 검출 시그널을 충분하게 확보할 수 있으므로, 예를 들면, 시료 중의 DNA에 대해 1배 이하 또는, 0.1배 이하이다. 이때, 시료 중의 DNA란, 예를 들면, 검출목적의 다형이 발생하여 있는 검출대상 DNA와 상기 다형이 발생하여 있지 않는 비검출대상 DNA와의 합계이어도 되고, 검출목적의 다형이 발생하여 있는 검출대상 서열을 포함하는 증폭산물과 상기 다형이 발생하여 있지 않는 비검출대상 서열을 포함하는 증폭산물과의 합계이어도 된다. 또, 시료 중의 DNA에 있어서의 상기 검출대상 DNA의 비율은, 통상, 불명확하지만, 결과적으로, 상기 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 예를 들면, 검출대상 DNA(검출대상 서열을 포함하는 증폭산물)에 대해 10배 이하, 5배 이하, 또는, 3배 이하이다. 또한, 그 하한은 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.001배 이상, 0.01배 이상, 또는, 0.1배 이상이다. 상기 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 DNA에 대한 몰비이어도 되고, 1본쇄 DNA에 대한 몰비이어도 된다.

Tm값에 대해 설명한다. 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해가면, 260nm에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이것은, 2본쇄 DNA에 있어서의 양 쇄간의 수소 결합이 가열에 의해 풀려, 1본쇄 DNA로 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내며, 이것에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. 이 현상에 의거하여, 융해 온도Tm이란, 일반적으로, 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다.

본 발명에서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 수반하는 시그널 변동의 측정은, 상술한 바와 같은 원리로부터 260nm의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 본 발명의 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거한 시그널로서 DNA와 프로브와의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정하는 것이 바람직하다. 이 때문에, 본 발명의 프로브로서, 상술한 표지화 프로브를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 표지화 프로브로서는, 예를 들면, 표적서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광강도가 감소(소광)하는 형광표지 올리고뉴클레오티드 프로브, 또는 표적서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광강도가 증가하는 형광표지 올리고뉴클레오티드 프로브를 들 수 있다. 전자와 같은 프로브이면, 검출대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 시그널을 나타내지 않거나, 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 유리(遊離)하면 시그널을 나타내게 되거나, 시그널이 증가한다. 또한, 후자의 프로브이면, 검출대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성함으로써 시그널을 나타내며, 가열에 의해 프로브가 유리하면 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 표지에 의거한 시그널의 변화를 시그널 특유의 조건(흡광도 등)에서 검출함으로써, 상기 260nm의 흡광도 측정과 같이, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다. 표지화 프로브에 있어서의 표지화 물질은, 예를 들면, 상술한 대로이지만 형광색소 표지화 프로브가 바람직하다.

핵산증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산으로서는, 핵산을 함유하고 있으면 되고, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 혈액, 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매조직, 위액, 위세정액, 복막액, 양수, 세포배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것이다. 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 그대로 직접적으로, 또는 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해서 전처리한 후에 사용할 수 있다.

이하, PCR를 사용하는 경우를 예로서, 더 설명한다. PCR에 사용하는 프라이머쌍은, 본 발명의 프로브가 하이브리다이제이션할 수 있는 영역이 증폭되도록 하는 외에는, 통상의 PCR에 있어서의 프라이머쌍의 설정 방법과 같이 하여 설정할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm값은, 통상은, 12~40mer이고 40~70℃, 또는 16~30mer이고 55~65℃이다. 프라이머쌍의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 좋지만, 양 프라이머의 Tm은 거의 동일(통상은, 차이가 2℃ 이내)한 것이 바람직하다. 또, Tm값은 최근접 염기쌍(Nearest Neighbor)법에 의해 산출한 값이다. 프라이머쌍의 예로서는, 서열번호7, 8, 19, 20에 나타내는 염기서열을 갖는 프라이머로 이루어지는 것을 들 수 있다.

PCR는, 본 발명에서 사용되는 본 발명의 프로브의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 증폭 반응 종료 후에 증폭산물을 정제 등을 하지 않고 Tm해석을 행할 수 있다. 사용하는 프로브에 따라, 프라이머의 Tm값이나 PCR의 반응 조건(시약조성이나 사이클수)을 조정하는 것은 당업자이면 용이하다.

Tm해석은, 본 발명의 프로브의 형광색소의 형광을 측정하는 것 외에는 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 형광의 측정은, 형광색소에 따른 파장의 여기광을 사용하여 발광파장의 광을 측정하는 것으로 행할 수 있다. Tm해석에 있어서의 승온 속도는, 통상은, 0.1~1℃/초이다. Tm해석을 행할 때의 반응액의 조성은, 프로브와 그 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 핵산과의 하이브리다이제이션이 가능하면 특히 제한되지 않지만, 통상은, 1가의 양이온 농도가 1.5~5 mM, pH가 7~9이다. PCR 등의 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭 방법의 반응액은, 통상, 이 조건을 만족하므로, 증폭 후의 반응액을 그대로 Tm해석에 사용할 수 있다.

Tm해석의 결과에 의거한 ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984의 검출은 통상의 방법에 따라 행할 수 있다. 본 발명에서의 검출이란, 변이의 유무의 검출 및 다형을 갖는 핵산의 존재비의 결정을 포함한다.

또, 본 발명의 프로브 및 다형 검출 방법에 의해, ALDH2 유전자 및 ADH2 유전자에 있어서의 다형을 검출할 수 있고, 검출된 다형의 유무에 의거하여, 아세트알데히드 및 알코올에 대한 분해능을 예측할 수 있다. 구체적으로는, ALDH2 유전자 다형의 rs671의 염기가 G/G로 되어 있으면 야생형이며, 아세트알데히드에 대한 분해능이 높다고 판정되지만, 헤테로형의 G/A, 변이형의 염기의 호모형의 A/A로 되어 있으면, 아세트알데히드에 대한 분해능이 낮고, 또한, ADH2 유전자 다형의 rs1229984의 염기가 G/G로 되어 있으면 야생형이며, 알코올에 대한 분해능이 낮다고 판정되지만, 헤테로형의 G/A, 호모형의 A/A로 되어 있으면, 알코올에 대한 분해능이 높은 것이 시사된다.

아세트알데히드 및 알코올에 대한 분해능의 예측결과로부터, 알코올의 내성이나, 알코올 의존증, 간장병 및 췌장암 등의 알코올 대사에 관한 질환을 예측할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서는, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984를 동시에 검출하는 것이 가능하며, 예를 들면 ALDH2 유전자 및 ADH2 유전자가 함께 변이가 존재하면, 보다 알코올에 대한 내성이 낮은 것이 시사된다.

<2> 본 발명의 프라이머

본 발명의 프라이머는, 본 발명의 검출 방법에 있어서, 본 발명의 프로브와 함께 사용하기 위한 프라이머이다.

구체적으로는, 본 발명의 프라이머는, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서, 하기 (P4) 및 (P5) 및/또는 (P6) 및 (P7)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프라이머이다.

(P6) 서열번호13 또는 14에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호93~138을 포함하는 염기길이 46~60염기길이의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

(P7) 서열번호13 또는 14에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호214~238을 포함하는 염기길이 25~60염기길이의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.

본 발명의 (P4)~(P7)의 프라이머는, 상기 서열과 완전히 동일하지 않아도 좋고, 5염기, 4염기, 3염기, 2염기, 또는 1염기만 달라도 된다. 본 발명에서 사용되는 프라이머는, 예를 들면, 서열번호7, 8, 19, 20으로 표시되는 프라이머이다.

<3> 본 발명의 키트

본 발명의 키트는, 본 발명의 검출 방법에 사용하기 위한 키트이다. 이 키트는, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 포함하는 것을 특징으로 한다. 또, 본 발명의 키트는, 알코올에 대한 대사 능력 및 내성을 판단하기 위해서도 사용할 수 있다.

본 발명의 검출키트는, 프로브 이외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산증폭을 행하기 위해서 필요로 되는 시약류, 특히 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭을 위한, 상기 프라이머를 더 함유하고 있어도 된다.

본 발명의 검출키트에 있어서 프로브, 프라이머 및 그 밖의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다. 이하에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명한다. 단, 이들의 실시예는 예시이며, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 검출대상이 되는 시료중의 시료핵산, 다형 검출용 프로브 또는 프라이머의 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특별히 언급하지 않는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대해 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대해 상보적인 당해 서열에 대해 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에게 있어서의 기술상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

[실시예]

실시예1(ALDH2의 주형 올리고뉴클레오티드를 검출대상으로 하고, 단일 프로브를 사용하는 경우)

ALDH2 유전자 다형의 rs671의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호1(야생형))에 의거하여, 표 1에 나타내는, 3' 말단부에 C를 갖는 프로브(야생형(서열번호3,5) 및 변이형(서열번호4)에 대응) 및 5' 말단부에 C를 갖는 프로브(야생형(서열번호6)에 대응)를 설계했다. 표 1 중, 프로브의 위치는, 야생형에 대해서는 서열번호1, 변이형에 대해서는 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. 3' 말단의 P는, 인산화되어 있는 것을 나타낸다. TAMRA에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(야생형 센스(서열번호9), 야생형 안티센스(서열번호11), 변이형 센스(서열번호10), 변이형 안티센스(서열번호12))의 서열을 표 1에 나타낸다. 표 1 중, 올리고의 위치는, 서열번호2에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

[표 1]

Smart Cycler(Cephied사제)를 사용하여 Tm해석을 행했다. 프로브 용액의 조성은 하기와 같다. 샘플은, 이하의 조합의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용했다. Tm해석의 조건은, 95℃, 1초→47℃, 60초→(47℃→94℃, 1℃/1초)와 했다.

Tm해석에 있어서의 여기파장 및 검출파장은, 각각 520~555nm 및 585~700nm(TAMRA)이었다.

[표 2]

표 1의 프로브를 사용하여 Tm해석을 행한 결과, 3T-ALDH2*2-wt-R1-21(서열번호3), 3T-ALDH2*2-mt-F1-21(서열번호4), 및 3T-ALDH2*2-mt-R3-20(서열번호5)에 대해서는, TAMRA의 야생형의 피크 및 변이형의 피크의 2개의 명료한 피크가 보였지만(도 1~3), 5T-ALDH2*2-wt-R2-19(서열번호6)에 대해서는, TAMRA의 변이형의 피크는 보이지 않았다(도 4).

따라서, 프로브의 5' 또는 3' 말단의 C가 형광표지되어 있으면 어떤 프로브 서열이어도 된다는 것은 아니고, 서열번호3~5의 프로브와 같이, 241번째 또는 261번째의 C가 형광표지되어 있는 것이 중요함이 이해된다.

실시예2(ADH2의 주형 올리고뉴클레오티드를 검출대상으로 하고, 단일 프로브를 사용하는 경우)

ADH2 유전자 다형의 rs1229984의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호13(야생형))에 의거하여, 표 3에 나타내는, 말단부에 C를 갖는 프로브(야생형(서열번호16) 및 변이형(서열번호17,18)에 대응)를 설계했다. 표 3 중, 프로브의 위치는, 야생형에 대해서는 서열번호13, 변이형에 대해서는 서열번호14에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다. BODIPY FL에 의한 표지는, 통상의 방법에 따라 행했다.

또한, 검출대상으로서 사용한 주형 올리고뉴클레오티드(야생형(서열번호21, 23) 및 변이형(서열번호22, 24)에 대응)의 서열을 표 3에 나타낸다. 표 3 중, 올리고의 위치는, 서열번호13 또는 14에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

또, 서열번호13, 14에 있어서, w는 a 또는 t, k는 g 또는 t를 나타낸다.

[표 3]

전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 Tm해석을 행했다. PCR 반응액의 조성은 하기와 같다. 시료는, 이하의 조합의 주형 올리고뉴클레오티드를 사용했다. Tm해석의 조건은, 95℃, 1초→40℃, 60초→(40℃→66℃, 3℃/1초)이었다.

Tm해석에 있어서의 여기파장 및 검출파장은, 각각 420~485nm 및 520~555nm(BODIPY FL)이었다.

[표 4]

표 3의 프로브를 사용하여 Tm해석을 행한 결과, 3FL-ADH2-WT-F3(서열번호16)에 대해서는, BODIPY FL의 야생형의 피크 및 변이형의 피크의 2개의 명료한 피크가 보였지만(도 5), 3FL-ADH2-mt-F1(서열번호17) 및 3FL-ADH2-mt-F2(서열번호18)에 대해서는, BODIPY FL의 변이형의 피크는 보이지 않았다(도 6a,7a).

또, 도 6b를 참조하면, mt 그래프에는 50℃에 노이즈가 있고, 59℃에 피크가 있어, 헤테로형으로 오판정할 가능성이 있다. 또한, 도 7b를 참조하면, mt 그래프에는 51℃에 노이즈가 있고, 61℃에 피크가 있어, 헤테로형으로 오판정할 가능성이 있다.

따라서, 프로브의 3' 말단의 C가 형광표지되어 있으면 어떤 프로브 서열이어도 된다는 것은 아니고, 서열번호16의 프로브와 같이, 212번째의 C가 형광표지되어, 야생형의 서열을 갖고 있는 것이 중요함이 이해된다.

실시예3(구강 스와브, 전혈, 또는 정제 DNA를 검출대상으로 하고, 복수 프로브를 사용하는 경우)

이하와 같이, 하기의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 구강 스와브, 전혈, 또는 정제 DNA의 다형 영역을 증폭하고, 서열번호4, 16에 나타내는 프로브를 사용하여 Tm해석을 행했다.

우선, ALDH2 유전자 다형의 rs671의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호1(야생형))에 의거하여, 다형의 부위를 증폭할 수 있도록 표 5에 나타내는 프라이머를 설계했다. 표 5 중, 프라이머의 위치는, 서열번호1에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

또한, ADH2 유전자 다형의 rs1229984의 부위를 포함하는 염기서열(서열번호13(야생형))에 의거하여, 다형의 부위를 증폭할 수 있도록 표 5에 나타내는 프라이머를 설계했다. 표 5 중, 프라이머의 위치는, 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서의 염기번호를 나타낸다.

이어서, 전자동 SNPs 검사 장치(상품명 i-densy IS-5310, 아크레이사제)를 사용하여 PCR 및 Tm해석을 행했다. PCR 반응액의 조성은 하기와 같다. 시료는, 이하의 구강 스와브, 전혈, 또는 정제 DNA를 사용했다. PCR 및 Tm해석의 조건은, 95℃, 60초→(95℃, 1초→60℃, 30초)×50사이클→95℃, 1초→40℃, 60초→(40℃→75℃, 1℃/3초)이었다.

Tm해석에 있어서의 여기파장 및 검출파장은, 각각 420~485nm 및 520~555nm(BODIPY FL), 또는, 각각 520~555nm 및 585~700nm(TAMRA)이었다.

[표 5]

<구강 스와브의 제조>

구강 스와브 현탁액(1) 500μl에, 합계 20회 양협(兩頰)에 문질러 바른 것을 현탁했다. 희석액(2) 90μl에 대해 현탁액을 30μl 가하고 잘 혼합했다. 이 혼합액 10μl를 95℃, 5분으로 가열하여 4μl의 전처리 완료 구강 스와브액을 얻었다. 이것을 PCR 반응액에 가하고, 상기 전처리 완료 구강 스와브액으로부터 가져온 DNA를 주형으로 하여 사용했다.

[표 6]

<전혈의 제조>

전혈 10μl를 희석액(1) 90μl에 가하고, 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10μl를 희석액(2) 90μl에 가했다. 이 혼합액 17μl를 95℃, 10분으로 가열하여 4μl의 전처리 완료 전혈을 얻었다. 이것을 PCR 반응액에 가하고, 상기 전처리 완료 전혈로부터 가져온 DNA를 주형으로 하여 사용했다.

[표 7]

<정제 DNA>

정제 DNA에 대해서는, 25카피/μl를 1 test당 4μl 사용했다. 이것을 PCR 반응액에 가하고, 주형으로서 사용했다.

TAMRA의 형광에 의해 ALDH2 유전자의 평가를 행한 결과, 헤테로형의 구강 스와브에 대해서는, TAMRA의 야생형의 피크 및 변이형의 피크가 보여지고(도 8a), 호모형의 전혈 및 DNA에 대해서는, TAMRA의 변이형의 피크만이 보여졌다(도 9a, 10a).

또한, BODIPY FL의 형광에 의해 ADH2 유전자의 평가를 행한 결과, 야생형의 구강 스와브 및 DNA에 대해서는, BODIPY FL의 야생형의 피크만이 보여지고(도 8b, 10b), 헤테로형의 전혈에 대해서는, BODIPY FL의 야생형의 피크 및 변이형의 피크가 보여졌다(도 9b).

도 8~10의 결과로부터, 표 1에 있어서의 서열번호4로 나타내는 프로브 및 표 3에 있어서의 서열번호16으로 나타내는 프로브를 사용했을 때, ALDH2 유전자 다형 및 ADH2 유전자 다형에 대해, Tm해석에서 해석이 가능한 형광강도의 변화가 인정되었다.

즉, ALDH2 유전자 다형에 대해서는, 헤테로형의 G/A인 구강 스와브는 2개의 피크(48℃ 및 56℃)를 갖고, 호모형의 A/A인 전혈 및 DNA는 1개만 피크(48℃)를 갖는 것이며, 고유의 형광강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다.

또한, ADH2 유전자 다형에 대해서도, Tm해석에서 해석의 가능한 형광강도의 변화가 인정되었다. 즉, 헤테로형의 G/A인 전혈은 2개의 피크(50℃ 및 56℃)를 갖고, 야생형의 G/G인 구강 스와브 및 DNA는 1개의 피크(50℃)를 갖는 것이며, 고유의 형광강도의 변화량의 패턴의 변화가 존재한다.

따라서, 서열번호4 및 16의 프로브를 동시에 사용함으로써, ALDH2 유전자 다형과, ADH2 유전자 다형을 동시에 검출할 수 있다.

또한, 서열번호3 또는 5의 프로브는, 서열번호4의 프로브와 같이, 3' 말단의 C가 형광표지되어 있고, 실시예1에서 그 효과가 나타나 있으므로, 서열번호3 또는 5의 프로브와 서열번호16의 프로브를 동시에 사용함으로써도, ALDH2 유전자 다형과, ADH2 유전자 다형을 동시에 검출할 수 있다.

본 발명의 프로브를 사용함으로써, 피험자의 생물학적으로 알코올에 대한 분해능 및 내성을 예측할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY,INC. <120> METHOD FOR SIMULTANEOUSLY DETECTING GENE MUTATIONS OF ACETALDEHYDE DEHYDROGENASE 2 AND ALCOHOL DEHYDROGENASE 2 <130> P-110312 <150> JP 2011-102333 <151> 2011-04-28 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gggcaacaga gaaagattct atctcaaaaa aaaaaatttt tttttaagtt aaaaataaaa 60 taaagacttt ggggcaatac agggggtcct gggagtgtaa cccataaccc ccaagagtga 120 tttctgcaat ctcgtttcaa attacagggt caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc 180 accctttggt ggctacaaga tgtcggggag tggccgggag ttgggcgagt acgggctgca 240 ggcatacact gaagtgaaaa ctgtgagtgt gggacctgct gggggctcag ggcctgttgg 300 ggcttgaggg tctgctggtg gctcggagcc tgctggggga ttggggtctg ttgggggctc 360 ggggcctgcc agaggttcag gacctgccgg ggactcaggg cctgctggaa gttcaggacc 420 tgctggggat cagggcctgc cagggattta gggtctgctg ggcgggccac cttttggcct 480 ctccctcatg cttgaggcca t 501 <210> 2 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gggcaacaga gaaagattct atctcaaaaa aaaaaatttt tttttaagtt aaaaataaaa 60 taaagacttt ggggcaatac agggggtcct gggagtgtaa cccataaccc ccaagagtga 120 tttctgcaat ctcgtttcaa attacagggt caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc 180 accctttggt ggctacaaga tgtcggggag tggccgggag ttgggcgagt acgggctgca 240 ggcatacact aaagtgaaaa ctgtgagtgt gggacctgct gggggctcag ggcctgttgg 300 ggcttgaggg tctgctggtg gctcggagcc tgctggggga ttggggtctg ttgggggctc 360 ggggcctgcc agaggttcag gacctgccgg ggactcaggg cctgctggaa gttcaggacc 420 tgctggggat cagggcctgc cagggattta gggtctgctg ggcgggccac cttttggcct 480 ctccctcatg cttgaggcca t 501 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 gttttcactt cagtgtatgc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 4 ggcatacact aaagtgaaaa c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 ttttcacttt agtgtatgcc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 cttcagtgta tgcctgcag 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgggagtgt aacccataac c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cagcaggccc tgagtccccg 20 <210> 9 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 9 gggcgagtac gggctgcagg catacactga agtgaaaact gtgagtgtgg 50 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 10 gggcgagtac gggctgcagg catacactaa agtgaaaact gtgagtgtgg 50 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 ccacactcac agttttcact tcagtgtatg cctgcagccc gtactcgccc 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 ccacactcac agttttcact ttagtgtatg cctgcagccc gtactcgccc 50 <210> 13 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 agggctttag actgaataac cttggggata aactgaatct ttcatattta ggaatagtag 60 ggattagtag caaaaccctc aaatacattt tagaaacaca atttcaggaa tttgggtatg 120 ttaaattcat ctagttacaa tcttttctga atctgaacag cttctcttta ttctgtagat 180 ggtggctgta ggaatctgtc gcacagatga ccacgtggtt agtggcaakc tggtgwcccc 240 ccttcctgtg attttaggcc atgaggcagc cggcatcgtg gagagtgttg gagaaggggt 300 gactacagtc aaaccaggta caggattcac actcagggaa cacgtgtggt tcaccatcca 360 ggatttccca gcctggataa ggaaaccaag gcaatgagag acgaaagtgc ttgcacaagg 420 tcaccgcgca gccaggactt caggagtttc ctctttccct ctctgcctgc ctgacccaag 480 catgtatgca ttcaggcact c 501 <210> 14 <211> 501 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 agggctttag actgaataac cttggggata aactgaatct ttcatattta ggaatagtag 60 ggattagtag caaaaccctc aaatacattt tagaaacaca atttcaggaa tttgggtatg 120 ttaaattcat ctagttacaa tcttttctga atctgaacag cttctcttta ttctgtagat 180 ggtggctgta ggaatctgtc acacagatga ccacgtggtt agtggcaakc tggtgwcccc 240 ccttcctgtg attttaggcc atgaggcagc cggcatcgtg gagagtgttg gagaaggggt 300 gactacagtc aaaccaggta caggattcac actcagggaa cacgtgtggt tcaccatcca 360 ggatttccca gcctggataa ggaaaccaag gcaatgagag acgaaagtgc ttgcacaagg 420 tcaccgcgca gccaggactt caggagtttc ctctttccct ctctgcctgc ctgacccaag 480 catgtatgca ttcaggcact c 501 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <400> 15 tctgtcgcac ngatgacc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 tctgtcgcac ggatgacc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 17 tctgtcacac agatgacc 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 18 tgtcacacag atgaccac 18 <210> 19 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gaaacacaat ttcaggaatt tgggtatgtt aaattcatct agttac 46 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ggwcaccagk ttgccactaa ccacg 25 <210> 21 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 21 ggtggctgta ggaatctgtc gcacagatga ccacgtggtt agtggcaacc 50 <210> 22 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 22 ggtggctgta ggaatctgtc acacagatga ccacgtggtt agtggcaacc 50 <210> 23 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 23 ggttgccact aaccacgtgg tcatctgtgc gacagattcc tacagccacc 50 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 24 ggttgccact aaccacgtgg tcatctgtgt gacagattcc tacagccacc 50

Claims

ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 유전자 다형을 검출하기 위한 프로브로서, 하기 (P1)~(P3)에서 선택되는 적어도 1종의 형광표지 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 상보적인 서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 241번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P1') 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호241~251을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 241번째에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P2) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 261번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P2') 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호251~261을 포함하는 11~50염기길이의 염기서열의 상보쇄에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 261번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P3) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열 또는 그것에 상동인 서열을 갖고, 212번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
(P3') 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호201~212를 포함하는 12~50염기길이의 염기서열의 상보쇄에 대해 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 서열을 갖고, 212번째의 염기에 대응하는 염기가 시토신이며, 형광색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
(P1) 및 (P1')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호241에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 위치에 갖고,
(P2) 및 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호261에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 위치에 갖고,
(P3) 및 (P3')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호212에 대응하는 염기를 3' 말단으로부터 세어 1~3번째의 위치에 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
(P1) 및 (P1')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호241에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,
(P2) 및 (P2')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호261에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖고,
(P3) 및 (P3')의 올리고뉴클레오티드는, 형광색소로 표지된 염기번호212에 대응하는 염기를 3' 말단에 갖는 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드는, 표적서열에 하이브리다이즈하지 않을 때에 형광을 발하고, 또한 표적서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광강도가 감소하거나 또는 증가하는, 다형 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드가, 표적서열에 하이브리다이즈했을 때에 형광강도가 감소하는, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (P1)~(P3')의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 12~30인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (P1)~(P3')의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 15~30인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (P1)~(P3')의 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 18~30인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 프로브가, 융해곡선 분석용의 프로브인, 다형 검출용 프로브.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 적어도 1종 이상 사용하는 것을 특징으로 하는, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 다형을 검출하기 위한 다형 검출 방법.
제10항에 있어서,
(I) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 상기 형광표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜 하이브리드 형성체를 얻는 것,
(Ⅱ) 상기 하이브리드 형성체를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드 형성체를 해리시켜, 상기 하이브리드 형성체의 해리에 의거한 형광 시그널의 변동을 측정하는 것,
(Ⅲ) 상기 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드 형성체의 해리 온도인 Tm값을 결정하는 것, 및
(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형의 존재 또는 다형을 갖는 핵산의 존재비를 결정하는 것
을 포함하는, 다형 검출 방법.
제11항에 있어서,
상기 공정(I) 전 또는 공정(I)과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, 다형 검출 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하는 공정, 및, 다형의 유무에 의거하여 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 공정을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, ALDH2 유전자 다형 및 ADH2 유전자 다형으로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 다형 검출용 키트.
제14항에 있어서,
서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 상기 (P1), (P1'), (P2) 또는 (P2')의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 주형으로 하여 증폭 가능한 프라이머, 및 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 상기 (P3) 또는 (P3')의 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 주형으로 하여 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하는, 다형 검출용 키트.
ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서,
하기 (P4) 및 (P5) 및/또는 (P6) 및 (P7)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 다형 검출용 프라이머 및 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
(P4) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호89~109를 포함하는 염기길이 21~60염기길이의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
(P5) 서열번호1 또는 2에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호388~407을 포함하는 염기길이 20~60염기길이의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
(P6) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호93~138을 포함하는 염기길이 46~60염기길이의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
(P7) 서열번호13에 나타내는 염기서열에 있어서, 염기번호214~238을 포함하는 염기길이 25~60염기길이의 염기서열에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드.
다형의 유무에 의거하여 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 공정을 포함하는 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 방법으로서, 제16항에 기재된 방법에 의해, ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하는 공정, 및, 다형의 유무에 의거하여 알코올에 대한 대사 능력의 평가 및/또는 내성을 판정하는 공정을 포함하는, 방법.
ALDH2 유전자 다형의 rs671 및 ADH2 유전자 다형의 rs1229984로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 다형을 검출하기 위한 시약 키트로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 및 제16항에 기재된 (P4) 및 (P5) 및/또는 (P6) 및 (P7)의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.