CN110004221A - 可同步检测3个酒精代谢基因4个snp位点的多重pcr检测方法 - Google Patents

可同步检测3个酒精代谢基因4个snp位点的多重pcr检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，所述4个SNP位点具体为ADH2基因的突变位点rs1229984，ALDH2基因的突变位点rs671，GABRA2基因的突变位点rs279858及rs279826；包括以下步骤：(1)根据4个SNP位点的上下游序列分别设计上游引物、下游引物；(2)配置多重PCR反应体系；(3)PCR扩增。本发明方法将PCR反应体系由4个体系/程序缩减至1个体系/程序，减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。可以同时检测4个位点，通过一次反应可以对4个位点进行SNP分型。可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。

Description

可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法。
背景技术
1、酒精代谢及相关基因
酒精中的主要成份为乙醇(CH3CH2OH)，饮酒后，乙醇在人体内的代谢主要依赖于乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶两种酶的催化。大部分乙醇通过乙醇脱氢酶作用生成乙醛，再通过乙醛脱氢酶作用生成乙酸，然后进入氧化循环反应，最终代谢成二氧化碳和水排出体外。
乙醇脱氢酶由ADH2基因编码，该基因位于4号染色体上，在3号外显子的第143号碱基处具有多态性位点。该位点GG型编码精氨酸，AA型编码组氨酸。研究显示，GG型表达产物乙醇脱氢酶活性较低，GA/AA型表达产物具有正常的乙醇脱氢酶活性，AA编码的乙醇脱氢酶酶活性最高可以达到GG型的40倍，见表1。GG型联合饮酒者和吸烟者因素能够显著增加上消化呼吸道肿瘤的风险。在中国人群中，ADH1B*1等位基因能增加食管癌患病风险，且饮酒可以增加这一风险。AG/GG基因型者罹患头颈癌的风险较携带AA基因型者增加34％，说明该基因的多态性与中国汉族人群头颈癌的易感性有关。
乙醛脱氢酶2(ALDH2)也是酒精代谢过程中关键酶之一，位于第12外显子的Glu504Lys多态性位点(又称rs671)，该位点发生碱基置换，即鸟嘌呤(G，野生型)被腺嘌呤(A，突变型)替代，导致该酶第504位氨基酸发生改变，即谷氨酸(glutamic acid，Glu)到赖氨酸(lysine，Lys)的替换。在人群中ALDH2基因型有3种情况，野生纯合型(GG型又称ALDH2*1/*1)，产生具有正常催化活性的酶；突变杂合型(GA型又称ALDH2*1/*2)，产生的酶催化活性下降，仅为野生型酶活性的10％-45％；突变纯合型(AA型又称ALDH2*2/*2)，产生的酶活性仅为正常的1％-5％，见表1。
2、酒精依赖及相关基因
GABA(γ-氨基丁酸)是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传达物质，约30％的中枢神经突触部位以GABA为递质。GABA的主要由两类受体调控，分别为GABAA和GABAB。在GABAA的编码基因GABRA2基因中，位于4号内含子的SNP位点(rs279826)和位于5号外显子的SNP位点(rs279858)与酒精引起的神经冲动密切相关。rs279858A和rs279826T的个体发生酒精依赖的风险低，而rs279858GG和rs279858CC基因型在嗜酒的人群中发现较多，与酒精依赖的病人的饮酒及酗酒的高风险相关，见表1。
表1酒精基因及其主要突变
3、普通PCR及多重PCR
聚合酶链式反应(PCR)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对及两对以上的引物，同时扩增多个核酸片段。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤药物基因组学有着重要的应用。
目前，多重PCR检测技术主要有：(1)多重PCR扩增后产生了不同长度的DNA片段，后用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分辨不同长度的片段；(2)对不同片段的DNA进行切胶回收，并进行序列的测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，所述4个SNP位点具体为ADH2基因的突变位点rs1229984，ALDH2基因的突变位点rs671，GABRA2基因的突变位点rs279858及rs279826。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体如下：
可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)根据4个SNP位点的上下游序列分别设计上游引物、下游引物；
(2)配置多重PCR反应体系；
(3)PCR扩增。
步骤(1)中的引物包括：
用于扩增乙醇脱氢酶ADH2基因的rs1229984基因位点检测的上下游引物目的片段长度为352bp，其序列分别为：
上游引物序列ADH2-F：GCCTGAGTGTGAATCCTGTACCTGGTTTG；
下游引物序列ADH2-R：CGGGAAGGTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATA；
用于扩增乙醛脱氢酶ALDH2基因的rs671基因位点检测的上下游引物目的片段长度为497bp，其序列分别为：
上游引物序列ALDH2-F：GGACAGAGCAGAGGCTGGGTCTTTAC；
下游引物序列ALDH2-R：TCAGGTCCTGGGAGTGTAACCCATAACC；
用于扩增酒精依赖GABRA2基因rs279826基因位点检测的上下游引物目的片段长度为289bp，其序列分别为：
上游引物序列GABRA2-826F：CGAGCTGCAGTGTTTGGATTAGCCCTATG；
下游引物序列GABRA2-826R：GGTCCAAGGCAATCACTTTGCTCAATACC；
用于扩增酒精依赖GABRA2基因rs279858基因位点检测的上下游引物目的片段长度为164bp，其序列分别为：
上游引物序列GABRA2-858F：CCATGGTATACAGCAGAGTCCCATCATC；
下游引物序列GABRA2-858R：GCCAGGTCCTATGAATATCCTTCGACTAAA；
如序列表中SEQ ID NO:1-8所示。
步骤(2)中多重PCR体系条件为：缓冲液为2×，4种dNTP的终浓度为400-500μM，DNA聚合酶的用量为1-5U，4对引物种每条引物的浓度为60-100nM。PCR试剂包括：PCR缓冲液、dNTPs的混合物、DNA聚合酶，4对引物混合物以及超纯水。多重PCR扩增使用4组多重引物混合物。
步骤(3)中多重PCR扩增的条件为94℃30s-5min；98℃5-30s，50-66℃40s，68℃5-180s，20-40个循环；68℃0-20min。
使用所述方法进行多重PCR扩增反应时，四个基因同时在一个扩增体系中进行，同时扩增ADH2：rs1229984；ALDH2：rs671；GABRA2：rs279858和rs279826共计4个酒精代谢基因SNP位点。
所检测的材料为人类基因组DNA，选用手工提取或试剂盒提取方法对来源的样本进行提取处理得到的DNA；所述的来源样本包括含有人类基因组DNA的人类的血液、组织、口腔拭子样本。
同现有技术相比，本发明的突出效果在于：
(1)降低成本：本方法将PCR反应体系由4个体系/程序缩减至1个体系/程序，减少了DNA聚合酶、dNTP等试剂和耗材的使用量，可大幅度降低检测成本。
(2)提高检测通量：普通PCR每个反应只针对一个位点，而多重PCR可以同时检测4个位点，通过一次反应可以对4个位点进行SNP分型。可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。
下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法作进一步说明。
附图说明
图1为琼脂糖凝胶电泳检测结果；
图2为PCR扩增产物测序结果。
具体实施方式
非特殊说明，本发明实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1
一种酒精代谢基因SNP位点待测DNA样本的制备方法，包括如下步骤：
用口腔拭子收集的口腔脱落细胞或收集的新鲜外周血样本采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(DP322)或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。
实施例2
可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
以实施例1所得基因组DNA为扩增模板，采用表2所示共4对引物。设计引物：采用Primer Quest和Primer Premier 5.0对引物进行设计及二聚体、茎环错配分析，在包含SNP位点的两端设计引物，4对引物的退火温度基本保持一致。
本发明的引物见表2，如序列表中SEQ ID NO:1-8所示：
表2多重PCR引物序列
序列编号 引物名称 5’-3’
1 ADH2-F GCCTGAGTGTGAATCCTGTACCTGGTTTG
2 ADH2-R CGGGAAGGTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATA
3 ALDH2-F GGACAGAGCAGAGGCTGGGTCTTTAC
4 ALDH2-R TCAGGTCCTGGGAGTGTAACCCATAACC
5 GABRA2-826F CGAGCTGCAGTGTTTGGATTAGCCCTATG
6 GABRA2-826R GGTCCAAGGCAATCACTTTGCTCAATACC
7 GABRA2-858F CCATGGTATACAGCAGAGTCCCATCATC
8 GABRA2-858R GCCAGGTCCTATGAATATCCTTCGACTAAA
本实施例所提供的引物组覆盖了ADH2基因的rs1229984基因位点、ALDH2基因的rs671基因位点、GABRA2基因的rs279826和rs279858位点。由于小的序列变化导致引物扩增效率显著降低、特异性变差，分别针对不同位点分别设计了多重PCR引物组，在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和位点包含情况，本发明选取了扩增效果最佳的引物组，如表2所示。
采用东洋纺(TOYOBO)公司KOD FX酶系(货号：KFX-101)中DNA聚合酶及缓冲液为基本原料，在酶系说明书中扩增体系的基础上，调整引物浓度、dNTP浓度、缓冲液浓度、酶用量配制多重PCR扩增体系，反应体系如表3所示。
表3多重PCR扩增反应体系
口腔拭子DNA 全血DNA
2×PCR buffer for FX 25μl 25μl
dNTP 5μl 5μl
Primer Mix 5μl 5μl
KOD FX 1μl 1μl
DNA 1μl 1μl
Total 13μl 13μl
各引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，模板量可调整，本实施例中口腔拭子基因组DNA采用25ng；全血基因组DNA采用50ng。
再按照下表4中的多重PCR反应条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：
表4多重PCR反应条件
PCR结束后，电泳检测，琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物片段的大小(见图1)，验证扩增片段大小正确后将PCR扩增产物送至测序公司(北京诺赛基因组研究中心有限公司)进行序列测定。测序结果是.ab1格式的数据，通过Chromas序列分析软件分析获得3个酒精代谢基因的4个SNP位点的基因突变情况。测序结果见图2。
采用上述实施例的方法，对30例口腔拭子DNA样本、11例全血基因组DNA样本分别进行多重PCR-Sanger测序分析，获得如下结果，部分结果如表5所示；
表5酒精代谢基因SNP检测结果
如表5所示，在21例样本中，均检测到了不同的突变类型。通过比较普通PCR和多重PCR测序方法，所获得的结果一致，证实所设计的目标序列在每种/个DNA样本中均得到有效的扩增，从而反映出所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 北京和合医学诊断技术股份有限公司
<120> 可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcctgagtgt gaatcctgta cctggtttg 29
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggaaggta gagaagggct ttagactgaa ta 32
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacagagca gaggctgggt ctttac 26
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaggtcctg ggagtgtaac ccataacc 28
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagctgcag tgtttggatt agccctatg 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtccaaggc aatcactttg ctcaatacc 29
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccatggtata cagcagagtc ccatcatc

Claims (7)

1.一种可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于，所述4个SNP位点具体为ADH2基因的突变位点rs1229984，ALDH2基因的突变位点rs671，GABRA2基因的突变位点rs279858及rs279826；包括以下步骤：
(1)根据4个SNP位点的上下游序列分别设计上游引物、下游引物；
(2)配置多重PCR反应体系；
(3)PCR扩增。
2.根据权利要求1所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中的引物包括：
上游引物序列ADH2-F：GCCTGAGTGTGAATCCTGTACCTGGTTTG；
下游引物序列ADH2-R：CGGGAAGGTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATA；
上游引物序列ALDH2-F：GGACAGAGCAGAGGCTGGGTCTTTAC；
下游引物序列ALDH2-R：TCAGGTCCTGGGAGTGTAACCCATAACC；
上游引物序列GABRA2-826F：CGAGCTGCAGTGTTTGGATTAGCCCTATG；
下游引物序列GABRA2-826R：GGTCCAAGGCAATCACTTTGCTCAATACC；
上游引物序列GABRA2-858F：CCATGGTATACAGCAGAGTCCCATCATC；
下游引物序列GABRA2-858R：GCCAGGTCCTATGAATATCCTTCGACTAAA；
如序列表中SEQ ID NO:1-8所示。
3.根据权利要求2所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤(2)中多重PCR体系条件为：缓冲液为2×，4种dNTP的终浓度为400-500μM，DNA聚合酶的用量为1-5U，4对引物种每条引物的浓度为60-100nM。
4.根据权利要求3所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于：步骤(3)中多重PCR扩增的条件为94℃30s-5min；98℃5-30s，50-66℃40s，68℃5-180s，20-40个循环；68℃0-20min。
5.根据权利要求1-4任一所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于：所检测的材料为人类基因组DNA，选用手工提取或试剂盒提取方法对来源的样本进行提取处理得到的DNA；所述的来源样本包括含有人类基因组DNA的人类的血液、组织、口腔拭子样本。
6.根据权利要求5所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于：待测DNA样本的制备方法包括如下步骤：用口腔拭子收集的口腔脱落细胞或收集的新鲜外周血样本采用天根口腔拭子基因组DNA提取试剂盒或血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并采用NP80-touch测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。
7.根据权利要求1-4任一所述的可同步检测3个酒精代谢基因4个SNP位点的多重PCR检测方法，其特征在于：进行多重PCR扩增反应时，四个基因同时在一个扩增体系中进行，同时扩增ADH2：rs1229984；ALDH2：rs671；GABRA2：rs279858和rs279826共计4个酒精代谢基因SNP位点。
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