CN104862382A - 检测酒精代谢基因的方法及套组 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测酒精代谢基因的方法及套组。本发明系关于检测酒精去氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH1B)及乙醛去氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)的方法及试剂，其具足够专一性及灵敏度，且可减省习知技术的繁复步骤，以及节省时间及人力。本发明另提供一种检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体的方法及套组。
Description
技术领域
本发明系关于酒精代谢基因的检测领域。特定言之，本发明系关于检测酒精去氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH1B)及乙醛去氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)的方法及试剂。
背景技术
已有众多先前本领域文献支持酒精去氢酶(alcoholdehydrogenase，ADH1B)基因及乙醛去氢酶(aldehydedehydrogenase，ALDH2)基因的多型性对消费酒精者(特别是亚洲人族群)在癌症具有增高的风险。具ADH1B*1/*1或ALDH2*1/*2基因型的人类个体，消费酒精会增加罹患上呼吸道、消化道及其他癌症的风险(Druesne-Pecollo N et al.,Lancet Oncol.2009；10(2):173-80；Yokoyama A et al.,Keio J Med.2010；59(4):115-30；Baan Ret al.,Lancet Oncol.2007Apr；8(4):292-30及Brooks PJ et al.,PLoSMed.2009Mar 24；6(3):e50)。ADH1B与ALDH2的单一核苷多型性(single nucleotide polymorphism；SNP)在酒精代谢上扮演重要角色。位于染色体4q22的等位基因ADH1B*1会减缓乙醇代谢，而ADH1B*2则会加快酒精代谢。位于染色体12q24的等位基因ALDH2*1会正常代谢乙醛，而ALDH2*2则会引起乙醛代谢缺陷(Edenberg HJ.,Alcohol Res Health.2007；30(1):5-13)。对台湾族群的研究显示约55％的人带有ADH1B*1/*1，表现型为减缓乙醇代谢；约38％的人带有ALDH2*1/*2，表现型为减缓乙醛代谢(Goedde,etal.,Hum Genet.1992；88(3):344-6)。
本领域中对于基因多型性的检测须逐一基因进行检测，大体上具有4个步骤：1.以聚合酶连锁反应(polymerase chainreaction，PCR)放大个体的目标基因；2.以DNA凝胶电泳确认PCR结果，检验适合大小的PCR片段；3.以管柱纯化PCR片段，去除过量的引物；及4.DNA定序(例如，引物延长方法)。然而，由于该方法每次仅能针对一个目标基因进行检测，因此必须对每一目标基因重复前述检测步骤以获得每一目标基因的多型性结果。习知方法对基因多型性的检测步骤繁复、耗时较长，无法有效率地进行检测，对大量筛检造成困难。
因此，本领域中仍有须要一次检测多个酒精代谢基因，不但具有类似的检测灵敏度与专一性，且可减省时间、人力及成本。
发明内容
本发明提供检测ADH1B与ALDH2的单一核苷多型性的方法及套组，其具足够专一性及灵敏度，且可减省习知技术的繁复步骤，以及节省时间及人力。
本发明提供一种引物组，其用于检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型，其包括下列：
(a)寡核苷酸1：包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及
(b)寡核苷酸2：包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
本发明亦提供一种引物组，其用于检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型，其包括下列：
(c)寡核苷酸3：包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及
(d)寡核苷酸4：包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
本发明另提供一种包含前述引物组的引物组合物。
本发明又提供一种方法，用于检测受测样品中ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型，包括下列步骤：
(a)以本发明的引物组合物放大受测样品中的ADH1B基因以及ALDH2基因于一管中以得到ADH1B基因的放大产物及ALDH2基因的放大产物；
(b)以定序引物GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO:5)定序所得ADH1B基因放大产物；及
(c)以定序引物AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQID NO:6)定序所得ALDH2基因放大产物；
藉此检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型。
本发明另提供一种检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体的方法及套组。
附图说明
图1为ADH1B 507碱基对的核苷酸序列(SEQ IDNO:7)。
图2为ALDH2405碱基对的核苷酸序列(SEQ IDNO:8)。
图3为本发明方法及套组的一具体实施例。
图4为PCR放大产物中含有目标PCR片段(ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)单一核苷多型性的片段)的凝胶电泳图。
图5为使用ADH1B定序引物(SEQ ID NO:5；即定序引物A)进行定序以检测含有ADH1B(R49H)单一核苷多型性的片段的结果。
图6为使用ALDH2定序引物(SEQ ID NO:6；即定序引物B)进行定序以检测含有ALDH2(E487K)单一核苷多型性的片段的结果。
具体实施方式
本发明惊讶地发现混合特定的数种引物于一管中进行PCR，再结合DNA定序可同时获得两个重要的酒精代谢基因，ADH1B与ALDH2，的单一核苷多型性提供准确的DNA信息，使个体获得消费酒精引起癌症风险的信息。据此，本发明提供检测ADH1B与ALDH2的单一核苷多型性的方法及套组，其具足够专一性及灵敏度，且可减省习知技术的繁复步骤，以及节省时间及人力。
如本文中所使用，用语"聚核苷酸"指含有长度大于100个核苷酸的序列的核酸。
如本文中所使用，用语"寡聚核苷酸"指短的聚核苷酸或聚核苷酸的一部分。寡核苷酸一般含有约2至100个核苷酸的序列。
如本文中所使用，用语"单一核苷酸多型性"(singlenucleotide polymorphism or SNP)为单个核苷酸—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变。
如本文中所使用，用语"引物"指长度约15至45的寡核苷酸。引物可在聚核苷酸上作为合成的起始点。引物完全或实质上互补于拟复制目标聚核苷酸序列的区域。如有需要，并入可藉光谱学，光化学，生物化学，免疫化学或化学方法检测的卷标，引物可被标记。例如，有用的标签包括32P、荧光染剂，电子-密度试剂，酶(如通常在ELISA中使用的)，生物素，或半抗原及可用于抗血清的蛋白质。标签也可用于“捕获”引物，以便于引物或引物延长产物，如放大的DNA，固定化于固相撑体。
如本文中所使用，用语"受测样品"是指人类细胞、血液或体液或萃取的DNA。
如本文中所使用，用语"目标核酸"指有兴趣的特定核酸序列。
如本文中所使用，用语"互补"用于指藉已知碱基配对规则(即A与T配对，C与G配对)的核酸。
如本文中所使用，用语"严格杂交条件"用于指具有至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％相同度的核苷酸序列彼此维持杂交的杂交及清洗条件；此种杂交及清洗条件系描述于，例如，但不限于，Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989)；Basic Methods inMolecular Biology,Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,N.Y.(1986)；及Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982),pp.387-389，且为本领域中已知者。严格杂交条件的一较佳的非限制性实例为：在50℃至70℃的温度，杂交溶液为6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)或其相等的盐浓度，杂交16小时并以1x SSC或其相等的盐浓度清洗。
如本文中所使用，用语"高度严格杂交条件"用于指用于指具有至少至少90％或至少95％相同度的核苷酸序列彼此维持杂交的杂交及清洗条件；此种杂交及清洗条件系描述于，例如，但不限于，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989)；Basic Methods in Molecular Biology,ElsevierScience Publishing Co.,Inc.,N.Y.(1986)；及Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982),pp.387-389，且为本领域中已知者。严格杂交条件的一较佳的非限制性实例为：在50％甲酰胺(formamide)，42℃至70℃(较佳为60℃至70℃)下杂交，接着以0.1％(SDS)于25℃至70℃，0.2-2x SSC下清洗。
在一方面，本发明提供新颖寡核苷酸引物、引物组及引物组合物。本文中描述的此等引物、引物组及引物组合物可用于检测方法以及组合于套组，用于检测受测样品中酒精代谢基因，ADH1B与ALDH2，的单一核苷多型性。
在一具体实施例，本发明提供一种引物组，其用于检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型，其包括下列：
(a)寡核苷酸1：包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及
(b)寡核苷酸2：包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
本发明检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型的引物组可得到约507碱基对的rs1229984核苷酸序列:该ADH1B 507碱基对的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)请参见图1。
在本发明的一具体实施例，寡核苷酸1为包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及寡核苷酸2包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
在另一具体实施例，本发明提供一种引物组，其用于检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型，其包括下列：
(a)寡核苷酸3：包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及
(b)寡核苷酸4：包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
本发明检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型的引物组可得到约405碱基对的rs671核苷酸序列；该ALDH2405碱基对的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)请参见图2。
在本发明的一具体实施例，寡核苷酸3为包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及寡核苷酸4为包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
在另一具体实施例，本发明提供一种引物组合物，包括本文中所述的检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型的引物组，以及检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型的引物组。
本发明的引物的制备可使用本领域中已知的方法，包括，但不限于，选殖及设计适合的序列及直接化学合成。
可用于制备本发明引物的化学合成方法包括，但不限于，描述于Narang et al.,Methods in Enzymology,68:90(1979)的磷酸三酯方法、描述于Brown et al.,Methods in Enzymology,68:109(1979)的磷酸二酯方法及描述于US 4,458,066的固相合成法；也可使用自动寡核苷酸合成仪。此外，如需要，可使用本领域中已知的技术标记引物。
前述本发明的寡核苷酸引物组可用于放大方法(如聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)及其修饰方法)以鉴定检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型(ADH1B*1/*1)或检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型(ALDH2*1/*2)。前述本发明的引物组合物可用于一管(one-tube)放大方法以同时检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型或检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型。
一般而言，在PCR中，目标序列藉由至少一个或一对引物放大。引物杂交至目标序列的互补区域，及DNA聚合酶延长引物以放大目标序列。重复放大循环以增加单一目标聚核苷酸序列的浓度。可使用本领域中已知的技术分离放大产物，如凝胶电泳、南方墨点分析或DNA定序。
以各种引物组合进行PCR的替代方法是本领域中已知的，例如彼等描述于Maniatis,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。这些方法包括不对称PCR、使用错误配对或退化引物的PCR、逆转录酶PCR、RAPD PCR、IMS-PCR(Islam et al.,J.Clin.Micro.,30:2801-2806(1992)及多孔盘PCR(multiwell PCR)。
在另一方面，本发明提供一种方法，用于检测受测样品中ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型，包括下列步骤：
(a)以本发明的引物组合物放大受测样品中的ADH1B基因以及ALDH2基因于一管中以得到ADH1B基因的放大产物及ALDH2基因的放大产物；
(b)以定序引物GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO:5)定序所得ADH1B基因放大产物；及
(c)以定序引物AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQID NO:6)定序所得ALDH2基因放大产物；
藉此检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型。
本发明检测方法进一步基于ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型将罹癌风险划分为0至21级分。较佳地，具ALDH2*1/*2基因型者的罹癌风险为13级分以上，而同时具有ADH1B*1/*1的基因型者罹癌风险增加。较佳地，ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型与罹癌风险的关系如下所示：
受测样品可为人类细胞、血液或体液或萃取的DNA。萃取DNA的方法可使用本领域中已知的任何方法。
当使用PCR放大受测样品中的ADH1B基因以及ALDH2基因时，使用有效量的DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)、有效量的脱氧核苷三磷酸(即，dATP,dCTP,dGTP,and dTTP)或核苷类似物(dNTPs)作为核苷来源及有效量的本发明引物组合物。或者，可使用PCR预混物，其含有缓冲液、dNTP及DNA聚合酶作为预混试剂。如使用此种预混物，须添加有效量的本发明引物组合物。
设定PCR反应的方法系本领域中已知者。特别是，制备反应混合物缓冲液，其含有拟放大的DNA基质、引物、Mg2+辅因子、dNTPs及DNA聚合酶。进行PCR循环前，通常先使DNA基质变性，此步骤通常在约90℃至约95℃下进行约2至约10分钟。变性步骤后，进行循环过程以放大目标序列。循环次数通常为25至40次之间，每一循环通常有2或3步骤。变性步骤后，引物与目标序列的互补区炼合，接着DNA聚合酶延长引物以合成目标核酸。进行PCR反应后，可得到ADH1B基因放大产物与ALDH2基因放大产物。
将前述放大产物分离后，使用定序引物GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO:5)定序所得ADH1B基因放大产物及以定序引物AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:6)定序所得ALDH2基因放大产物，以检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型。
习知本领域中已知具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者消耗酒精后具有较高的罹癌风险。因此，在另一方面，本发明提供一种检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体的方法，包括使用前述检测方法。
在另一方面，本发明也提供一种检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体的套组，包括本发明的引物组合物、PCR试剂或套组以及本发明的定序引物，分别包装于分开容器。本发明套组另包括说明书。
本发明套组中所使用的容器为任何习知的容器，包括，但不限于，玻璃、塑料、聚合物及硅胶等制成的容器。
PCR试剂或套组包括缓冲液、dNTPs(即dATP,dCTP,dGTP与dTTP)、逆转录酶、DNA聚合酶等。
本发明套组进一步包括基于ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型与罹癌风险的说明书，其中罹癌风险划分为0至21级分。较佳地，说明书指示具ALDH2*1/*2基因型者的罹癌风险为13级分以上，而同时具有ADH1B*1/*1的基因型者罹癌风险增加。较佳地，说明书指示ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型与罹癌风险的关系如上表所示。
本发明可一次同时得到ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2的放大产物，再使用DNA定序以具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者，并基于此而检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体。本发明可精确且直接鉴定具有两个酒精代谢基因，ADH1B及ALDH2，的SNP，节省人力、时间及成本。藉由鉴定该SNP，本发明亦提供迅速且方便筛检消耗酒精后具有较高罹癌风险的个体的方法及套组。本发明方法及套组的一具体实施例参见图3。
实例1人类ADH1B及ALDH2的基因型检测
自人类个体得到血液(200μl)、唾液(2ml)或细胞等受测样品。以DNA纯化套组(Qiagen DNeasy Blood&Tissue Kit.Cat.No.69504 or 69581))进行基因组DNA纯化及萃取。将下表的引物混合于1管中，使用TaKaRa Taq PCR放大套组进行PCR反应以得到ADH1B及ALDH2片段。PCR循环为：94℃，1分钟；(94℃，10秒；62℃，20秒；68℃，30秒)；进行35个循环；72℃，10分钟；及维持于4℃，。
接着以凝胶电泳确认放大产物中含有目标PCR片段(ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)单一核苷多型性的片段)(请参图4)，再以Qiagen QIA PCR纯化套组纯化目标PCR片段。
前述目标PCR片段、PCR引物组及片段大小如下表所示：
| 目标PCR片段 | PCR引物组 | 放大产物片段大小 |
| ADH1B(R49H),rs1229984 | 引物1/引物2 | 507碱基对 |
| ALDH2(E487K),rs671 | 引物3/引物4 | 405碱基对 |
使用ADH1B定序引物(GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC，SEQ ID NO:5)及ALDH2定序引物进行定序以检测含有ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)单一核苷多型性的片段。定序结果如图5(ADH1B)及图6(ALDH2)所示。图5中，A的单一尖峰代表ADH1B*2/*2基因型，A/G的重迭尖峰代表ADH1B*1/*2基因型及G的单一尖峰代表ADH1B*1/*1基因型。图6中，G的单一尖峰代表ALDH2*1/*1基因型，G/A的重迭尖峰代表ALDH2*1/*2基因型及A的单一尖峰代表ALDH2*2/*2基因型。
实例2ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)单一核苷多型性的基因型与罹癌风险的关系
根据PLoS Medicine,March 2009,Vol.6,Issue 3,pp.0258-0263及Yokoyama et al.Keio J Med 2010；59(4):115－130所发表的文献，本发明重新统计并整理ADH1B与ALDH2基因型，消费酒精后脸红与癌症风险间的关系如下表所示：
基于上表，可知具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者具较高罹癌风险。因此，本发明方法及套组可用于筛检消耗酒精后具有较高罹癌风险的个体。
Claims (20)
1.一种引物组，其用于检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型，其包括下列：
(a)寡核苷酸1：包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ IDNO:1)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:1的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及
(b)寡核苷酸2：包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ IDNO:2)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:2的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的引物组，其中寡核苷酸1的序列如SEQ IDNO:1所示，及寡核苷酸2的序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种引物组，其用于检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型，其包括下列：
(a)寡核苷酸3：包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:3的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列；及
(b)寡核苷酸4：包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:4的互补序列在严格或高度严格杂交条件下杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求2的引物组，其中寡核苷酸3的序列如SEQ IDNO:3所示，及寡核苷酸4的序列如SEQ ID NO:4所示。
5.一种引物组合物，其包括根据权利要求1及权利要求3的引物组。
6.根据权利要求5的引物组合物，其包括根据权利要求2及权利要求4的引物组。
7.一种方法，用于检测受测样品中ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型，包括下列步骤：
(a)以根据权利要求5的引物组合物放大受测样品中的ADH1B基因以及ALDH2基因于一管中以得到ADH1B基因的放大产物及ALDH2基因的放大产物；
(b)以定序引物GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ IDNO:5)定序所得ADH1B基因放大产物；及
(c)以定序引物AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQID NO:6)定序所得ALDH2基因放大产物；
藉此检测ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型。
8.根据权利要求7的方法，其中引物组合物包括根据权利要求2及权利要求4的引物组。
9.根据权利要求7的方法，其中受测样品为人类细胞、血液或体液或萃取的DNA。
10.一种检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体的方法，包括使用权利要求7的方法。
11.根据权利要求10的方法，其中引物组合物包括根据权利要求2及权利要求4的引物组。
12.根据权利要求10的方法，其进一步基于ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型将罹癌风险划分为0至21级分。
13.根据权利要求12的方法，其中具ALDH2*1/*2基因型者的罹癌风险为13级分以上，而同时具有ADH1B*1/*1的基因型者罹癌风险增加。
14.根据权利要求12的方法，其中ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型与罹癌风险的关系如下所示：
15.一种检测受测样品中ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及检测ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型的套组，包括根据权利要求5的引物组合物、PCR试剂或套组以及如SEQ ID NOs:5及6所示的定序引物，分别包装于分开容器。
16.根据权利要求15的套组，其中引物组合物包括根据权利要求2及权利要求4的引物组。
17.根据权利要求15的套组，其可用于检测消耗酒精后具有较高的罹癌风险的个体。
18.根据权利要求15的套组，其进一步包括基于ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型与罹癌风险的说明书，其中罹癌风险划分为0至21级分。
19.根据权利要求18的套组，其中说明书指示具ALDH2*1/*2基因型者的罹癌风险为13级分以上，而同时具有ADH1B*1/*1的基因型者罹癌风险增加。
20.根据权利要求18的套组，其中说明书指示ADH1B基因的单一核苷多型性R49H的基因型以及ALDH2基因的单一核苷多型性E487K的基因型与罹癌风险的关系如下所示：
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20150826 |