CN107058549A - 一种用于酒量评估的基因检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于酒量评估的基因检测试剂盒，试剂盒包括3个基因，即内参基因GAPDH、基因ADH1B和基因ALDH2的6条扩增引物，5条Taq‑man探针引物，1条位于GAPDH，用FAM荧光标记；2条位于ADH1B基因的SNP探针；分别用VIC和ROX标记；2条位于ALDH2基因的SNP探针；分别用Cy5和Quasar705标记，淬灭基团为BHQ，计算△ct值。本发明从基因方面为健康人评估自己的酒量，认识自身对酒精耐受的优劣势科学饮酒，从事与酒文化相关的派对、聚会、宴席等场合。

Description

一种用于酒量评估的基因检测试剂盒

技术领域

本发明涉属于分子生物学和检验医学领域，主要应用于健康体检，与饮酒相关的职业，比如品酒师，还与日常生活、节假日聚会等饮酒活动等领域息息相关，评价个人对酒精的耐受能力。

背景技术

酒文化作为中华民族悠久的传统，具有深厚的内涵和底蕴。饮酒是每一个人在日常生活和工作中、人际交往中都无法避开的。有的人似乎天生就具有饮酒的体质，千杯不醉，令人咋舌；而有的人一杯就倒，且脸红耳赤，甚至发生酒精中毒。目前关于饮酒能力的评价和高低鲜有报道，或是只停留在如何保证一定的饮酒数量减少酒精对身体的危害，然而随着生物学的发展，尤其是分子生物学的发展，基因作为生物的遗传物质，甚至影响生物的表现和行为，发病概率等已经逐渐被认识。

通过对降解酒中主要成分乙醇的关键酶的认识不断深入，发现体内对酒精代谢起关键性因素的2种酶，即乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶逐渐浮出水面。乙醇脱氢酶的主要功能是将体内的乙醇降解为乙醛，乙醛脱氢酶的主要功能是将体内的乙醛降解为乙酸，进而通过三羧酸循环变成二氧化碳和水排出体外。现在分子生物学测序技术的发展已经将这两种酶的基因序列完全暴露在公众面前，使得从基因的先天遗传水平来判断这两种酶的活性成为可能。每个人基因的区别、突变和表达能力导致了其对酒精降解能力的高低，进而影响到酒量的大小。

目前基因检测风生水起，其中对酒精代谢的检测取得了一定的进展，主要集中在2个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点，分别是ADH1B基因的rs1229984(His48Arg)和ALDH2的rs671(Glu457Lys)，ADH1B：又被称为“杜康基因”。编码乙醇脱氢酶，要负责将小肠吸收的乙醇(酒精)脱氢氧化为乙醛。该突变会使得ADH活性增加，酒精进入体内后就会立即氧化为乙醛，易造成乙醛不能及时降解而在体内堆积，引起脸红、醛中毒等症状。ALDH2：编码乙醛脱氢酶，负责催化人体的乙醇分解代谢，ALDH2最为重要，突变型基因能导致ALDH2活力缺失，导致乙醛在体内大量堆积，酒精代谢变慢。

但是，关于通过检测这2个SNP位点联合起来对饮酒能力高低的系统评价鲜有报道，测序成本较高，大多数PCR的方法需要分别对2个位点进行扩增，费时费力，且仅从这2突变位点来对降解乙醇的能力盖棺定论缺乏科学严谨性，基因的变化与日常生活的酒量高低更是没有很好地进行研究和联系，对人们的饮酒量没有实质性、科学性的指导建议。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种应用多重PCR方法、使检测操作方便、省时高效的用于酒量评估的基因检测试剂盒。

本发明采用如下技术方案来实现：

一种用于酒量评估的基因检测试剂盒，试剂盒包括3个内参基因GAPDH、基因ADH1B和基因ALDH2的6条扩增引物，5条Taq-man探针引物，1条位于GAPDH，用FAM荧光标记；2条位于ADH1B基因的SNP探针；分别用VIC和ROX标记；2条位于ALDH2基因的SNP探针；分别用Cy5和Quasar705标记，淬灭基团为BHQ，计算△ct2值，△ct1值。

而且，六条引物序列和浓度如下：

而且，乙醇的体积计算公式：

V＝K·P·△ct1/△ct2

V代表酒量ml：酒中乙醇的含量；

K为酒量常数：38.2；

P代表基因型组合的分数；

△ct2代表ALDH2基因的△ct值；

△ct1代表ADH1B基因的△ct值。

本申请的优点和积极效果如下：

1、本发明首次采用基因表达量与SNP的结合分析的方法，更加全面、科学。

2、本发明将检测结果与实际酒量相关联，使得检测结果更加直观，更容易理解。

3、本发明从基因方面为健康人评估自己的酒量，认识自身对酒精耐受的优劣势科学饮酒，从事与酒文化相关的派对、聚会、宴席等场合。

附图说明

图1为GAPDH引物的溶解曲线；

图2为ADH1B引物的溶解曲线；

图3为ALDH2引物的溶解曲线；

图4为1号受检测者的3个基因的扩增曲线，从左至右依次是GAPDH、ADH1B、ALDH2；

图5为2号受检测者的3个基因的扩增曲线，从左至右依次是GAPDH、ADH1B、ALDH2；

图6为3号受检测者的3个基因的扩增曲线，从左至右依次是GAPDH、ADH1B、ALDH2；

图7为4号受检测者的3个基因的扩增曲线，从左至右依次是GAPDH、ADH1B、ALDH2；

图8为1-4号受检测者ADH1B的SNP分型结果；1号为GG型(近Y轴)，2号为AG型(中间)，3号为AG型(中间)，4号为AA型(近X轴)。

图9为1-4号受检测者ALDH2的SNP分型结果；1号为GG型(近Y轴)，2号为AG型(中间)，3号为AA型(近X轴)，4号为AA型(近X轴)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

本发明是基于RNA水平上的，使用“五重”荧光定量PCR技术对ADH1B基因和ALDH2基因进行表达量(△Ct值)以及RS编号为2个SNP突变，即rs1229984和rs671的同时检测。由于rs1229984和rs671的突变均属于基因CDS区(蛋白质编码区)的突变，因此mRNA的SNP位点会保留DNA水平上的碱基种类，这就为在RNA水平同时检测内参进行基因定量，和ADH1B基因和ALDH2基因的SNP分型打下坚实理论基础。

1.试剂盒组成及使用

1.1.引物

使3个基因(包括：内参基因GAPDH、ADH1B基因和ALDH2基因)的6条扩增引物，5条Taq-man探针引物(包括：1条位于GAPDH，用FAM荧光标记；2条位于ADH1B基因的SNP探针；分别用VIC和ROX标记；2条位于ALDH2基因的SNP探针；分别用Cy5和Quasar705标记)，淬灭基团为BHQ。具体信息如表1

表1基因对应的探针荧光基团以及等位基因、频率

以上引物的设计均按照目前流行的引物黄金法则相关参数要求进行并通过实验进行特异性验证，保证扩增结果的准确性。采用这样的目的是可以提高检测效率，在尽量短的、简洁的步骤之内就可以完成3个基因的检测。在设计引物时，需要针对位点所在的序列分别设计一条上游引物和下游引物，另外，还需要针对SNP的位点分别设计一条针对野生型的引物探针和一条针对变异型的引物探针，那么对于一个位点就会有4条引物，当使用在单管内同时对2个位点进行多重扩增时，就会有11条引物在同一个扩增体系中。引物相关信息如下表2：

表2引物和探针的序列和浓度

1.2.阳性对照品

阳性对照是由包含5种探针序列的质粒组成。即1种质粒为检测GAPDH的阳性质粒，2种质粒验证检测ADH1B基因，2种质粒验证检测ALDH2基因。阳性标准品的制备可以根据已经公开的SNP序列采用常规的T-A克隆方法制备得到。每种质粒的分型及浓度如下表3。

表3各个质粒标准品的浓度(单位：拷贝数/μL)

1.3. 2×PCR反应Mix

反应Mix为整个PCR反应提供一个稳定的环境，包括PH，渗透压，离子浓度等。2×PCR反应Mix主要包括：热启动DNA聚合酶(2U/μL)，dNTP(2.5mM)，Tris-HCl(100mM)，KCl(100mM)，BSA(2.5mg/ml)，MgCl2为(4.2mM)，甜菜碱(1.8M)，Tween-20(5％)，水。

2.反应扩增程序

表4反应扩增程序

3.结果的分析与酒量评价

本试剂盒通过综合健康受检者体内的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶含量和影响乙醇脱氢酶活力的基因ADH1B以及乙醛脱氢酶活力的基因ALDH2，结合本公司体检大数据统计结果，得出受检者的基因与酒量之间的关系，并给与评价。

注：本发明仅适用于健康人群的检测评估。

3.1.首先根据结果扩增曲线的Ct值，得到ADH1B基因和ALDH2基因的△ct值，△ct值越大说明酶的表达量越低，因为酒量的大小与乙醇脱氢酶的活力成负相关，与乙醛脱氢酶的活力成正相关，所以酒量的大小与乙醇脱氢酶ADH1B基因的△ct1值成正相关，与乙醛脱氢酶基因的△ct2值成负相关。

3.2.其次根据ADH1B基因和ALDH2基因的SNP多态性对酶的活力高低做出相应的判断，在乙醇脱氢酶中，酶活力的高低依次为AA型>AG型>GG型；在乙醛脱氢酶中，酶活力的高低具体关系为GG型>AG型>AA型。因为酒量的大小与乙醇脱氢酶的活力成负相关，与乙醛脱氢酶的活力成正相关，所以将2种基因的6种分型的两两组合进行量化，如下表5进行赋值。

表5 2种酶活的两两配对分数(单位：分)

3.3.综合3.1和3.2得出酒量(乙醇的体积)计算公式：

V＝K·P·△ct1/△ct2

V代表酒量(ml)：酒中乙醇的含量；

K为酒量常数：38.2(本发明通过受检者的基因结果与调查问卷相结合的方法得出)；

P代表基因型组合的分数；

△ct2代表ALDH2基因的△ct值；

△ct1代表ADH1B基因的△ct值；

3.4.根据酒量区间对检测者进行科学指导，如表6。

表6根据V值对检测者的酒量基本评价

不拘泥于试剂盒的建议，也可根据受检者自身的状态和周围的环境，以及酒里是否含有其他精神性或刺激性物质的影响。

4.举例说明：

通过筛选调查问卷挑选4个身体良好的进行检测，每个人代表不同的酒量水平，具体情况如下表7。

表7受测者的调查酒量(mL)

4.1.准备试剂盒目的模板。通过RNA提取试剂盒(invitrogen)、反转录试剂盒(TAKARA)得到本试剂盒需要用到的cDNA；

4.2.加样

每个PCR反应管的加样量如下：2×PCR反应Mix液10μL，引物探针混合液4μL，cDNA模板/阳性对照品1μL，无菌水5μL。每个样本重复3管，阳性对照1管。

4.3.多重PCR的上机反应

按照表4的反应程序进行PCR扩增，荧光通道选择FAM、VIC、ROX、Cy5、Quasar705。

4.4.结果。

测试者1的各项参数值为P：6分，△ct1为6，△ct2为3，即根据公式V＝K·P·△ct1/△ct2得出1号的酒量为458.4mL，符合预计的区间量(250-500)mL，相当于近2斤50°白酒的体积。

测试者2的各项参数值为P：4分，△ct1为4，△ct2为3，即根据公式V＝K·P·△ct1/△ct2得出1号的酒量为203.7mL，符合预计的区间量(125-250)mL，相当于8两50°白酒的体积。

测试者3的各项参数值为P：3分，△ct1为3，△ct2为4，即根据公式V＝K·P·△ct1/△ct2得出1号的酒量为86mL，符合预计的区间量(50-125)mL，相当于3两50°白酒的体积。

测试者4的各项参数值为P：1分，△ct1为5，△ct2为4，即根据公式V＝K·P·△ct1/△ct2得出1号的酒量为47.8mL，符合预计的区间量(0-50)mL，相当于不到2两50°白酒的体积。

4.5.根据结果给出合理建议。

Claims (3)

1.一种用于酒量评估的基因检测试剂盒，其特征在于：试剂盒包括3个基因，即内参基因GAPDH、基因ADH1B和基因ALDH2的6条扩增引物，5条Taq-man探针引物，1条位于GAPDH，用FAM荧光标记；2条位于ADH1B基因的SNP探针；分别用VIC和ROX标记；2条位于ALDH2基因的SNP探针；分别用Cy5和Quasar705标记，淬灭基团为BHQ，计算△ct2值，△ct1值。

2.根据权利要求1所述的用于酒量评估的基因检测试剂盒，其特征在于：六条引物序列和浓度如下：

。

3.根据权利要求1所述的用于酒量评估的基因检测试剂盒，其特征在于：乙醇的体积计算公式：

V＝K·P·△ct1/△ct2

V代表酒量ml：酒中乙醇的含量；

K为酒量常数：38.2；

P代表基因型组合的分数；

△ct2代表ALDH2基因的△ct值；

△ct1代表ADH1B基因的△ct值。