CN103757106B - 基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于遗传基因检测领域，特别涉及基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒和方法。本发明能同时检测C677T、A1298C两个SNP位点，结果容易判读。本发明中的MGB探针具有3’端淬灭基团不发光，背景较低，对单个碱基突变检测更敏感，且只需根据Ct值就可判读不同基因型，比传统的Taqman探针检测和HRM检测等方法结果判读更容易。与探针价格较低，检测成本较低，一个多态性位点只需要一管qPCR检测即可完成，操作简单。且本发明方法不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。
Description
技术领域
本发明属于遗传基因检测领域，特别涉及基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒和方法。
背景技术
5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（Methylenetetrahydrofolatereductase，MTHFR）是叶酸代谢系统中的关键酶，催化5,10-亚甲基四氢叶酸还原为甲基供体5-甲基四氢叶酸。5-甲基四氢叶酸一方面可以作为甲基的间接供体参与体内嘌呤、嘧啶的合成及DNA、RNA、蛋白质的甲基化；另一方面，在甲硫氨酸合成酶的催化下，以维生素B12为辅酶，使血液中同型半胱氨酸再发生甲基化生产甲硫氨酸，从而维持体内正常的同型半胱氨酸水平。MTHFR基因常见有C677T（SNPID:rs1801133）、A1296C（SNPID:rs1801131）两种多态性位点,其中C677T位点是最为常见的突变位点。研究表明，C677T位点C变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，纯合突变TT型MTHFR酶活性只有正常的30%，杂合突变CT型有正常酶活性的60%。A1298C纯合突变也会引起酶活性的下降，与C677T同时发生纯合突变的几率较小，二者同时发生杂合时对酶的活性影响很大，但单独杂合对酶的活性影响不大。MTHFR基因突变可导致其编码的叶酸代谢关键酶活性降低,引起叶酸代谢障碍,造成叶酸水平降低及高同型半胱氨酸血症。近年来发现高同型半胱氨酸水平与心脑血管疾病、出生缺陷、妊娠相关疾病等多种疾病密切相关。
MTHFR基因多态性位点目前的检测方法分为四类：测序法，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、芯片法、荧光定量PCR法(qPCR)，这四种方法都是基于PCR技术。
测序法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。优点：结果准确，测序法是基因多态性位点检测的金标准；缺点：成本较高，操作繁琐，试验周期长。
PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对PCR产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。优点：成本低，结果比较直观；缺点：有的多态性位点所在位置没有合适的限制性酶切位点，需要人工引入突变，另外操作繁琐，试验周期长。
芯片法：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后将PCR产物与突变探针、野生探针杂交，通过比较两个探针杂交的信号强度判断样品基因型。探针固定在尼龙膜、硝酸纤维素膜、玻璃上的称为固相芯片；探针固定在微小珠子上的为液相芯片，如luminex、biocade检测平台。缺点：PCR产物需要进行后续分析，操作繁琐；另外结果不好判读，容易出现假阳性。
qPCR法：又分为ARMS-PCR法、HRM法、Taqman探针法。qPCR的优点是操作简单，试验周期短，PCR产物无需进行后续分析即可判断结果，因全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。
ARMS-PCR法：ARMS-PCR(amplificationrefractorymutationsystem)又叫等位基因特异PCR，TaqDNA聚合酶缺少3′→5′外切酶活性，在一定条件下PCR引物3′末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计突变引物、野生引物，2个引物主要是3′末端碱基不同，通过qPCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。缺点：一个样品要分2管PCR检测，才能检测出一个SNP位点基因型检测，操作麻烦。
HRM法:高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolutionMelting，HRM)，有染料法和荧光共振能量转移（FRET）双探针法等。染料法对荧光染料、PCR仪器要求较高，临床检测比较少用。FRET（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）探针比较常用，罗氏专利的FRET探针又称为双杂交探针。在SNP位点设计两条FRET探针，当两条探针和模版互补、且相邻的特异探针组成，上游探针的3`端标记供体荧光基团，相邻下游探针的5`端标记Red640受体荧光基团。当复性时，两探针同时结合在模板上，供体基团和Red640受体基团紧密相邻，激发供体产生的荧光能量被Red640基团吸收，使得检测探头可以检测到Red640发出波长为640的荧光。当变性时，两探针游离，两基团距离远，不能检测到640波长的荧光。FRET探针检测的信号是退火时的实时信号，每次检测信号始终严格对应模版的数量，非累积信号，可以用于做Tm曲线进行SNP检测。优点：一个SNP位点基因型，只需要一管PCR完成检测；缺点：根据HRM溶解曲线Tm值差异不容易判读，不同基因型溶解曲线峰图差异不明显。
Taqman探针法：Taqman探针是一种经典的定量PCR技术，现阶段得到广泛应用，在PCR反应体系中加入一对引物的和一个特异性荧光探针，探针只与两条引物之间特异性模板结合，利用荧光信号积累实时监测整个PCR过程。探针的5′端连接报告荧光，3′端连接淬灭荧光，随后进行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列上5′端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，使得报告荧光发光。针对SNP位点分别设计两个不同荧光标记突变探针、野生探针，根据突变探针、野生探针荧光信号强度进行SNP位点基因型判读。优点：一个SNP位点，只需要一管PCR完成基因型检测。
目前Taqman探针法存在以下缺点：不同基因型结果差异不明显，每次做qPCR检测必须设置三个基因型对照，另外TaqMan探针荧光淬灭不彻底，背景较高。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足和缺点，提供一种基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒和方法，不仅可以对C677T、A1298C两个SNP位点同时检测，还适用于一般荧光PCR仪，操作简单、特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因类型，从而准确对人MTHFR基因多态性进行基因分型。
本发明所采取的技术方案是：基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，试剂盒中包括以下两对引物序列及其对应的探针序列：
（1）用于MTHFR基因C677TSNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR677F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’；
下游引物MTHFR677R:5’-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’；
突变探针MTHFR677T：5’-荧光基团-TCATGGCATTTCTCA-淬灭基团；
野生探针MTHFR677C：5’-荧光基团-TCATGGCAGTTCTCA-淬灭基团；
（2）用于MTHFR基因A1298CSNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR1298F:5’-AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’；
下游引物MTHFR1298R:5’-AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3’；
突变探针MTHFR1298C：5’-荧光基团-CCAGTGAAGCAAGTG-淬灭基团；
野生探针MTHFR1298A：5’-荧光基团-CCAGTGAAGAAAGTG-淬灭基团。
所述MTHFR基因遗传多态性检测剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O。
所述探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种，3’端的淬灭基团为NFQ。
基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测人的基因组DNA；
（2）将骤（1）得到的DNA加入到人MTHFR基因C677T多态性位点的PCR反应液中进行PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值，野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值，大于等于3为TT型纯合子，小于等于-3为CC野生型，在-1到+1之间为CT杂合子；
（3）将骤（1）得到的DNA加入到人MTHFR基因A286C多态性位点的PCR反应液中进行PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值，野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值，大于等于3为CC型纯合子，小于等于-3为AA野生型，在-1到+1之间为AC杂合子。
本发明的有益效果包括以下三个方面：
一．本发明能同时检测C677T、A1298C两个SNP位点，结果容易判读。本发明中的MGB探针具有3’端淬灭基团不发光，背景较低，对单个碱基突变检测更敏感，且只需根据Ct值就可判读不同基因型，比传统的Taqman探针检测和HRM检测等方法结果判读更容易。
二、本发明技术方案中的检测引物与探针价格较低，检测成本较低，一个多态性位点只需要一管qPCR检测即可完成，操作简单。且本发明方法不需要进行PCR产物的后续分析，不需PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交等，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。
三、本发明技术方案中的检测引物与TaqmanMGB探针，采用实时荧光PCR技术平台，相对测序法、PCR-RFLP、芯片法更容易实现高通量检测。
附图说明
附图1是3个样品MTHFR基因C677T位点突变探针荧光定量PCR曲线图；
附图2是3个样品MTHFR基因C677T位点野生探针荧光定量PCR曲线图；
附图3是1号野生型样品MTHFR基因C677T位点测序图；
附图4是2号纯合突变样品MTHFR基因C677T位点测序图；
附图5是3号杂合突变样品MTHFR基因C677T位点测序图；
附图6是3个样品MTHFR基因A1298C位点突变探针荧光定量PCR曲线图；
附图7是3个样品MTHFR基因A1298C位点野生探针荧光定量PCR曲线图；
附图8是4号野生型样品MTHFR基因A1298C位点测序图；
附图9是5号纯合突变样品MTHFR基因A1298C位点测序图；
附图10是6号杂合突变样品MTHFR基因A1298C位点测序图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，试剂盒中包括以下两对引物序列及其对应的探针序列：
（1）用于MTHFR基因C677TSNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR677F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’；
下游引物MTHFR677R:5’-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’；
突变探针MTHFR677T：5’-荧光基团-TCATGGCATTTCTCA-淬灭基团；
野生探针MTHFR677C：5’-荧光基团-TCATGGCAGTTCTCA-淬灭基团；
（2）用于MTHFR基因A1298CSNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR1298F:5’-AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’；
下游引物MTHFR1298R:5’-AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3’；
突变探针MTHFR1298C：5’-荧光基团-CCAGTGAAGCAAGTG-淬灭基团；
野生探针MTHFR1298A：5’-荧光基团-CCAGTGAAGAAAGTG-淬灭基团。
所述MTHFR基因遗传多态性检测剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O。
所述探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种，3’端的淬灭基团为NFQ。
基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取待测人的基因组DNA；
（2）将骤（1）得到的DNA加入到人MTHFR基因C677T多态性位点的PCR反应液中进行PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值，野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值，大于等于3为TT型纯合子，小于等于-3为CC野生型，在-1到+1之间为CT杂合子；
（3）将骤（1）得到的DNA加入到人MTHFR基因A286C多态性位点的PCR反应液中进行PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值，野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值，大于等于3为CC型纯合子，小于等于-3为AA野生型，在-1到+1之间为AC杂合子。
实施例1：试剂盒中的PCR反应液配置
分别配置检测人MTHFR基因C677T、A286C多态性位点的PCR反应液，其中PCR反应液包含引物及其对应的Taqman-MGB探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、ddH2O。
每个PCR扩增的反应体系为20ul，包含10×PCR反应缓冲液2.0μl、2.4μl25mMMgCl2溶液、2.5mM的dNTP混合液1.6μl、5U/ulTaq酶0.1μl、DNA模板1μl(50ng左右)、20uM上下游引物各0.5μl、10uM突变野生探针各0.5μl，ddH2O12.7μl
MTHFRC677T反应液中的引物、Taqman-MGB探针：
上游引物MTHFR677F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’；
下游引物MTHFR677R:5’-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’；
突变探针MTHFR677T：5’-FAM-TCATGGCATTTCTCA-NFQ；
野生探针MTHFR677C：5’-VIC-TCATGGCAGTTCTCA-NFQ；
MTHFRA1298C反应液中的引物、Taqman-MGB探针：
上游引物MTHFR1298F:5’-AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’；
下游引物MTHFR1298R:5’-AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3’；
突变探针MTHFR1298C：5’-FAM-CCAGTGAAGCAAGTG-NFQ；
野生探针MTHFR1298A：5’-VIC-CCAGTGAAGAAAGTG-NFQ；
实施例2：检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
人血液DNA提取，采用天根生化生物技术公司全血DNA提取试剂盒，从血液中提取基因组DNA。
2、PCR反应体系配置
使用实施例1中配置PCR反应液进行检测，一个样品，同时进行2管PCR检测。取19ulMTHFRC677TPCR反应液到一个PCR反应管中、取19ulMTHFRA286CPCR反应液到另外一个PCR反应管中，分别向2个PCR反应管中加入同一个步骤1中提取的DNA1ul（10~100ng）。
3、荧光PCR检测
将配置好的PCR体系放入荧光PCR仪器中，进行荧光PCR扩增检测；反应条件为：94℃3分钟变性和酶激活，94℃30秒变性，62℃30秒退火，72℃30分钟延长，循环45次。
荧光PCR仪器：罗氏LightCycler480型实时荧光定量PCR仪。
4、基因分型
本领域技术人员通过荧光定量PCR仪上显示的FAM和VIC探针的Ct值，确定所检测的SNP位点的基因型。C677T位点基因型判读，为其的野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值，如果大于等于3为TT型纯合突变，小于等于-3为CC野生型，如果在-1到+1之间为CT杂合突变；A1298C位点基因型判读同C677T。
附图1是3个样品MTHFR基因C677T位点突变探针荧光定量PCR曲线图，附图2是与附图1相同的3个样品MTHFR基因C677T位点野生探针荧光定量PCR曲线图，这3个样品的野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值分别为：-5.02、7.87、-0.53，说明1号样品为野生型、2号样品为纯合突变，3号样品为杂合突变，如下表所示：
| 样品编号 | M（Ct） | N （Ct） | N- M | 样品类型 |
| 1 | 27.89 | 22.87 | -5.02 | CC |
| 2 | 23.76 | 31.63 | 7.87 | TT |
| 3 | 24.26 | 23.73 | -0.53 | CT |
附图3为1号样品MTHFR基因C677T位点测序图，测序结果显示该样品为CC野生型，与qPCR结果一致。附图4为2号样品MTHFR基因C677T位点测序图，测序结果显示该样品为TT纯合突变，与qPCR结果一致。附图5为3号样品MTHFR基因C677T位点测序图，测序结果显示该样品为CT杂合突变，与qPCR结果一致。
附图6是3个样品MTHFR基因A1298C位点突变探针荧光定量PCR曲线图，附图7是与附图6相同的3个样品MTHFR基因A1298C位点野生探针荧光定量PCR曲线图。这3个样品的野生型探针的Ct值减去突变型探针的Ct值分别为：-4.68、4.16、-0.60，说明4号样品为野生型、5号样品为纯合突变，6号样品为杂合突变，如下表所示：
| 样品编号 | M（Ct） | N （Ct） | N- M | 样品类型 |
| 4 | 26.86 | 22.18 | -4.68 | AA |
| 5 | 22.97 | 27.13 | 4.16 | CC |
| 6 | 23.31 | 22.71 | -0.60 | AC |
附图8为4号样品MTHFR基因A1298C位点测序图，测序结果显示该样品为AA野生型，与qPCR结果一致。附图9为5号样品MTHFR基因A1298C位点测序图，测序结果显示该样品为CC纯合突变，与qPCR结果一致。附图10为6号样品MTHFR基因A1298C位点测序图，测序结果显示该样品为AC杂合突变，与qPCR结果一致。
qPCR检测结果均经过DNA测序验证，测序结果与本发明方法检测结果一致；MTHFR基因C677T位点野生型为CC，杂合突变为CT，纯合型为TT；A1298C位点野生型为AA，杂合突变为AC，纯合型为CC，证明本发明方法检测的结果准确可靠。
SEQUENCELISTING
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Claims (1)
1.基于Taqman-MGB探针的人MTHFR基因多态性检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中包括两对引物及其对应的探针，引物及探针的序列如下：
（1）用于MTHFR基因C677TSNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR677F:5’-TGTGCTGTGCTGTTGGAAGGTG-3’；
下游引物MTHFR677R:5’-TCAGAGCCCCCAAAGCAGAGGACTC-3’；
突变探针MTHFR677T：5’-荧光基团-TCATGGCATTTCTCA-淬灭基团；
野生探针MTHFR677C：5’-荧光基团-TCATGGCAGTTCTCA-淬灭基团；
（2）用于MTHFR基因A1298CSNP位点检测的引物和探针：
上游引物MTHFR1298F:5’-AGCTGAAGGACTACTACCTCTTCTACC-3’；
下游引物MTHFR1298R:5’-AGCATCACTCACTTTGTGACCATT-3’；
突变探针MTHFR1298C：5’-荧光基团-CCAGTGAAGCAAGTG-淬灭基团；
野生探针MTHFR1298A：5’-荧光基团-CCAGTGAAGAAAGTG-淬灭基团；
所述MTHFR基因多态性检测剂盒还包括含Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶和ddH2O；
所述各探针5’端的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种，3’端的淬灭基团为NFQ。
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