CN104531852A - 一种锁核酸增敏的检测mthfr基因c677t突变的探针及引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针及引物、试剂盒和检测方法。本发明利用锁核酸能灵活修饰TaqMan探针的特点，在检测MTHFR基因C677T突变的探针的合适的位置上进行锁核酸修饰，以增加探针的特异性。采用上述锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针和引物对步骤(1)得到的样本基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值；设定Ct值在小于35个循环数为检出阳性；则只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC；只有突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT；而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为CT杂合子。

Description

一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针及引物、试剂盒和检测方法

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针及引物、试剂盒和检测方法，适用于人体MTHFR基因C677T多态性位点的定性检测。

背景技术：

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶之一，可将还原型辅酶I(NADPH)相关的5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸。而5-甲基四氢叶酸是体内转移“碳基团”，包括甲基(-CH3)，甲酰基(-CHO)、次甲基(-CH)等过程中起辅酶作用。MTHFR基因中C677T(SNP ID:rs1801133)为该基因影响功能的重要突变位点。研究表明，C677T位点C变为T后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，纯合突变TT型MTHFR酶活性只有正常的30％，杂合突变CT型有正常酶活性的60％。由于MTHFR酶活性的降低，导致了血液中5-甲基四氢叶酸的降低和同型半胱氨酸的堆积，使得作为甲基供体的蛋氨酸合成障碍，最终引起DNA的甲基化水平异常，并会造成DNA链断裂、染色体重组改变和染色体分离异常。因此MTHFR基因C677T位点的突变与一些妊娠并发症有关，如胎儿神经管缺陷(NTD)，复发性流产，先兆子痫，胎盘剥离等有关。通过分析个体MTHFR基因C677T位点的多态性，对提前采取预防措施，防止妊娠并发症具有指导意义。

国家卫生计生委在2013年8月印发的《医疗机构临床检验项目目录(2013年版)》中就明确了MTHFR(C677T)基因检测的医学意义。

目前检测MTHFR基因C677T位点多态性的方法分为三类：传统Sanger测序法，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、荧光定量PCR法(qPCR)，这三种方法都是基于PCR技术。

测序法：先进行PCR扩增，PCR扩增引物设计时使得待检的基因位点位于PCR产物内，然后纯化PCR产物，再对其进行测序，根据测序峰图判读基因型。优点：结果准确，测序法是基因多态性位点检测的金标准；缺点：成本较高，操作繁琐，需要凑齐一批样本才适合开机检测。

PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，得到含有目的SNP位点的PCR产物，然后对PCR产物进行酶切，电泳检测酶切条带，根据酶切条带进行判读。优点：成本低，结果比较直观；缺点：电泳检测操作繁琐，污染的风险大。

qPCR法：qPCR的优点是操作简单，试验周期短，PCR产物无需进行后续分析即可判断结果，因全过程在封闭的管内进行，减少了交叉污染。但是为了在一管qPCR中能同时区分野生型、突变型和杂合型的基因多态性，在qPCR方法的引物和探针设计上衍生出不同的策略；例如ARMS-PCR法：ARMS-PCR(amplification refractory mutation system)又叫等位基因特异PCR，TaqDNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，在一定条件下PCR引物3’末端的错配导致产物的急剧减少，针对不同的已知突变，分别设计突变引物、野生引物，2个引物主要是3’末端碱基不同，通过qPCR方法直接达到区分突变型和野生型基因的目的。缺点：区分基因不同等位位点只能通过引物序列3’末端的错配设计，特异性并不能保证，容易出现假阳性。

TaqMan-MGB双探针法：常规的TaqMan探针一般长度在25个碱基，对于错配的区分能力不强。MGB(Minor groove binder)分子能结合到杂交双链DNA的小沟中，在降低探针长度的同时，仍然保证了DNA杂交双链较高的退火温度，因此3’端MGB分子修饰的探针检测点突变的特异性会增加。MGB探针较一般TaqMan探针Tm值高10℃以上，长度只需12-15碱基即可。但是MGB分子只能修饰在探针的3’端。一条探针只能修饰一个MGB探针，在检测复杂的位点时，特异性还达不到完全区分突变和野生型的要求。

而锁核酸(LNA-Locked Nucleic Acid，简称LNA)是一种类寡核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2’-O,4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2’-O位和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。和MGB探针的作用类似，锁核酸修饰的TaqMan探针在降低了探针的长度时，还能保持探针和DNA模板形成的杂交体保持较高的融解温度(Tm值)，并且由于LNA碱基可以在探针的任何位置进行修饰，因此在特异性方面具有很大的灵活性。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针。本发明的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针在合适的位置上进行锁核酸修饰，以增加探针的特异性。

本发明的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针，其特征在于，所述的探针序列如下：

突变探针MTHFR 677T：5’-荧光基团-CGGG+AG+T+CGATTT-淬灭基团；

野生探针MTHFR 677C：5’-荧光基团-CGGG+AG+C+CGATTT-淬灭基团；

其中“+”表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。

LNA修饰碱基不局限于上述三个碱基位置，但必须包括针对突变检测的碱基。

所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示。

所述的锁核酸修饰，核苷酸中核糖2'位置的氧原子和4’位置的碳原子之间形成亚甲基键锁住了3'位置磷酸骨架的移动随着碱基不同，可以形成A/T/C/G锁核酸碱基。

所述的荧光基团，优选为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种；所述的淬灭基团，优选为能与荧光基团配套的TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3基团中的一种。

本发明的第二个目的是提供一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的引物，其特征在于，所述的引物其序列如下：

上游引物MTHFR 677F:5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3’；

下游引物MTHFR 677R:5’-CGGTGCATGCCTTCACAA-3’。

本发明的第三个目的是提供一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测试剂盒，包括含Mg2⁺的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶、ddH₂O、探针和引物，其特征在于，所述的探针为：突变探针MTHFR 677T：5’-荧光基团-CGGG+AG+T+CGATTT-淬灭基团，野生探针MTHFR 677C：5’-荧光基团-CGGG+AG+C+CGATTT-淬灭基团，其中“+”表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基；所述的引物为：上游引物MTHFR 677F:5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3’，下游引物MTHFR 677R:5’-CGGTGCATGCCTTCACAA-3’。

本发明的第四个目的是提供一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取待测的样本基因组DNA；

(2)、采用上述锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针和引物对步骤(1)得到的样本基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值；设定Ct值在小于35个循环数为检出阳性；则只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC；只有突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT；而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为CT杂合子。

所述的荧光PCR扩增，其扩增反应体系优选为：10×PCR反应缓冲液(含Mg2⁺)2.0μL、2.4μL 25mM MgCl₂溶液、2.5mM的dNTP混合液1.6μL、5U/ul Taq酶0.1μL、DNA模板1μL(10～100ng)、20μM锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的上下游引物各0.5μL、10μM锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的突变和野生探针各0.5μL，ddH2O 12.7μL，共计20μL。

所述的荧光PCR扩增，其扩增反应条件优选为：94℃3分钟变性和酶激活，94℃30秒变性，60℃30秒退火，72℃30分钟延长，循环45次。

本发明利用锁核酸能灵活修饰TaqMan探针的特点，在检测MTHFR基因C677T突变的探针的合适的位置上进行锁核酸修饰，以增加探针的特异性。本发明适用于一般荧光PCR仪，操作简单、区分MTHFR基因C677T位点野生型、突变型和杂合型的特异性和敏感性好，能够快速灵敏地检测待测位点基因类型，从而准确对人MTHFR基因多态性进行基因分型。

本发明克服现有技术的不足和缺点，其有益效果包括以下三个方面：

一.本发明的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针及引物、试剂盒和检测方法，由于LNA增敏的探针特异性强，结果容易判读。不需根据Ct值的差异来判读，而只需要根据野生型探针和突变型探针分别是阳性检出还是阴性未检出来判读，较MGB修饰的TaqMan探针检测结果更判读容易。MGB修饰的TaqMan探针法往往会出现，即使是野生型样本，突变型探针也会出现检测阳性；反之亦然，即使是突变型样本，野生型探针也会出现检测阳性信号；因此MGB修饰的TaqMan探针法只能根据野生型探针和突变型探针的Ct值的差异来进行判读，容易受到实验条件的影响导致Ct值的差异发生变化而导致检测结果不准确。

二、本发明技术方案检测方便、检测成本较低。由于一般荧光定量PCR仪都具有两个以上的荧光检测通路，通过把LNA修饰的野生型探针和突变型探针分别带上不同的荧光素修饰，因此在一管中就能完成对两个探针的检测，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率。

三、本发明技术方案中的检测引物与LNA修饰的TaqMan探针，采用实时荧光PCR技术平台，相对测序法、PCR-RFLP更容易实现高通量检测，同时由于是闭管检测，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。

附图说明：

图1是1、2、3号个不同样本MTHFR基因C677T位点突变探针荧光定量PCR曲线图，其中，a为1号样本曲线图：蓝色曲线(突变型探针，677-677-N)是针对野生型样本的探针荧光定量PCR曲线图，该样本只有蓝色曲线出现明显反应，说明1号样本是野生型样本；b为2号样本曲线图：绿色曲线(野生型探针，677-677-N)是针对野生型样本的探针荧光定量PCR曲线图，该样本只有旅色曲线出现明显反应，说明2号样本是突变型样本；c为3号样本曲线图：蓝色和绿色曲线都有明显反应，说明3号样本是是野生位点和突变位点都包含的杂合型样本；

图2是没有锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针检测突变型样本的荧光定量PCR曲线图；

图3是对本发明的1、2、3号样本进行测序后的图谱，其中，a为1号样本的测序图谱，b为2号样本的测序图谱，c为3号样本的测序图谱。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、荧光定量PCR反应液的配制

分别配置检测人MTHFR基因C677T突变的荧光定量PCR反应液，该反应液包含本发明的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针及引物、Taq酶、dNTP混合液、25mMMgCl₂溶液、10×荧光定量PCR反应缓冲液、ddH₂O。

每个荧光定量PCR扩增的反应体系(荧光定量PCR反应液)为20μL，包含10×荧光定量PCR反应缓冲液2.0μL、2.4μL 25mM MgCl₂溶液、2.5mM的dNTP混合液1.6μL、5U/ulTaq酶0.1μL、DNA模板1μL(10～100ng)、20μM锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的上下游引物各0.5μL、10μM锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的突变和野生探针各0.5μL，ddH₂O 12.7μL。

锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针和引物如下：

上游引物MTHFR 677F:5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3’；

下游引物MTHFR 677R:5’-CGGTGCATGCCTTCACAA-3’；

突变探针MTHFR 677T：5’-FAM-CGGG+AG+T+CGATTT-TAMRA；

野生探针MTHFR 677C：5’-VIC-CGGG+AG+C+CGATTT-TAMRA。

二、样本基因组DNA的制备

分别提取人MTHFR基因C677T野生型、突变型和杂合型的人血液样本基因组DNA，标号为1、2、3号，采用中山大学达安基因公司全血DNA提取试剂盒，从血液中提取基因组DNA。

三、荧光定量PCR反应体系的配制

使用上述步骤一中配置的配置检测人MTHFR基因C677T突变的荧光定量PCR反应液对上述步骤二中的1、2、3号样本进行检测，每个样本进行1管荧光定量PCR检测。分别取19μL荧光定量PCR反应液到3个PCR反应管中，然后分别向该管PCR反应管中加入上述步骤二中所提取的1、2、3号人血液样本基因组DNA 1μL(10～100ng)。

四、荧光定量PCR检测

将上述步骤三种配置好的荧光定量PCR反应体系放入实时荧光定量PCR仪(LifeTechnologies公司的ABI7500 Fast型)中，进行荧光定量PCR扩增检测；反应条件为：94℃3分钟变性和酶激活，94℃30秒变性，60℃30秒退火，72℃30分钟延长，循环45次。

五、基因分型

通过实时荧光定量PCR仪上显示的FAM和VIC探针的Ct值，确定所检测的C677T位点的基因型。设定Ct值在小于35个Ct值为检出阳性；则只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC；只有突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT；而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为杂合型CT。

1号样本只有野生型探针检测阳性(Ct值＝26，小于定义阳性Ct值35)，蓝色曲线(野生型探针，677-677-N)是针对野生型样本的探针荧光定量PCR曲线图，该样本只有蓝色曲线出现明显反应，说明1号样本是野生型样本CC(如图1a所示)；

2号样本只有突变型探针(677-677-M)检测阳性(Ct值＝26.5)，因此2号样本的677位点为纯合突变型TT(如图1b所示)；

3号样本突变型和野生型探针都检测为阳性(突变型探针Ct值＝27，野生型探针Ct值＝28)，因此3号样本的677位点为杂合型CT(如图1c所示)。

附图2是采用没有锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针检测突变型样本时，本来只应该有绿色曲线(突变型探针，677-677-M)出现明显反应，但由于探针上的突变位点没有用锁核酸进行修饰，因此蓝色曲线也出现明显的非特异性反应。

经过本发明的方法检测出的1、2、3号样本，经过测序验证确实分别为野生型CC、突变型TT、杂合型CT(如图3)，证明本发明的方法是可行、准确、可靠的。

Claims (8)

1.一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针，其特征在于，所述的探针序列如下：

突变探针MTHFR 677T：5’-荧光基团-CGGG+AG+T+CGATTT-淬灭基团；

野生探针MTHFR 677C：5’-荧光基团-CGGG+AG+C+CGATTT-淬灭基团；

其中“+”表示3’端的碱基为锁核酸修饰碱基。

2.根据权利要求1所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针，其特征在于，所述的锁核酸修饰，其化学结构式如式I所示：

3.根据权利要求1所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的探针，其特征在于，所述的荧光基团为FAM、TET、VIC、HEX或ROX中的一种；所述的淬灭基团为能与荧光基团配套的TAMRA、BHQ1、BHQ2或BHQ3基团中的一种。

4.一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的引物，其特征在于，所述的引物其序列如下：

上游引物MTHFR 677F:5’-CCGAAGCAGGGAGCTTTG-3’；

下游引物MTHFR 677R:5’-CGGTGCATGCCTTCACAA-3’。

5.一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测试剂盒，包括含Mg2⁺的PCR反应缓冲液、dNTP混合物、Taq酶、ddH₂O、探针和引物，其特征在于，所述的探针为权利要求1中所列的探针，所述的引物为权利要求4中所列的引物。

6.一种锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取待测的样本基因组DNA；

(2)、采用权利要求1所列的探针和权利要求4所列的引物对步骤(1)得到的样本基因组DNA进行荧光定量PCR扩增，测出野生型探针的Ct值和突变型探针的Ct值；设定Ct值在小于35个循环数为检出阳性；则只有野生型探针检出阳性的样本为野生纯合型CC；只有突变型探针检出阳性的为突变纯合型TT；而野生型探针和突变型探针都检出阳性的为CT杂合子。

7.根据权利要求6所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测方法，其特征在于，所述的荧光PCR扩增，其扩增反应体系为：含Mg2⁺的10×PCR反应缓冲液2.0μL、2.4μL 25mM MgCl₂溶液、2.5mM的dNTP混合液1.6μL、5U/ul Taq酶0.1μL、10～100ng的DNA模板1μL、20μM权利要求3所列的引物各0.5μL、10μM权利要求1所列的探针各0.5μL，ddH2O 12.7μL，共计20μL。

8.根据权利要求6所述的锁核酸增敏的检测MTHFR基因C677T突变的检测方法，其特征在于，所述的荧光PCR扩增，其扩增反应条件优选为：94℃3分钟变性和酶激活，94℃30秒变性，60℃30秒退火，72℃30分钟延长，循环45次。