CN111100924B - 一种用于检测fmr1基因cgg重复数的质控品及其应用和含有该质控品的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品，其包括如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA以及如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示序列的引物，其中，所述单链DNA为SEQ ID NO:4、部分AluY序列与SEQ ID NO:5反向互补DNA序列组成的人工合成单链DNA。本发明还涉及采用上述质控品检测X染色体倍型和判断DNA模板量是否足量的方法以及含有该质控品的试剂盒。本发明在引入X染色体倍型监控系统的同时，采用非特异性探针杂交技术开发了一种针对TP‑PCR扩增体系中X染色体拷贝数和起始DNA模板量是否适宜的质控系统，以确保TP‑PCR检测阴性结果的可靠性，实现了对FMR1基因CGG重复数的准确检测。

Description

一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品及其应用和含有 该质控品的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品及其应用和含有该质控品的试剂盒，所述应用为采用该质控品检测X染色体倍型和判断DNA模板量是否足量的方法。
背景技术
脆性X综合征(fragile X syndrome，Fra X，OMIM#300624)是最常见的X连锁隐性遗传疾病之一，发病率仅次于唐氏综合征(Down syndrome)，其致病基因是X染色体长臂脆性X智力低下1(FMR1)基因。典型的特征为中度到重度的智力障碍、巨睾丸、大耳朵、语言障碍、智商低下。据统计，在高加索人群中Fra X的男性发病率约1：4000，女性发病率约1：5000-8000。国内尚无大规模的流行病学调查。
99％以上的脆性X综合征患者是由于FMR1的5'非翻译区的CGG重复序列扩增导致FMRP表达沉默所致。CGG重复在人群中具有高度的多态性，在正常人中约在45拷贝以内。46-54为灰区，可扩增为前突变。当CGG重复数增多到55～200拷贝时，称为前突变(premutation)。前突变者无或只有轻微的症状，但40％男性前突变携带者有患FXTAS的风险，21％女性前突变携带者有患FXPOI的风险。女性前突变携带者的CGG区不稳定，可扩增为全突变。当CGG重复数＞100时，其扩增成全突变(full mutation)的概率高达98％以上。全突变CGG重复数达到200个拷贝以上，相邻的CpG岛异常甲基化，导致FMR1基因的沉默，从而出现临床症状。
脆性X综合征目前尚无有效的治疗方法，临床主要采用对症治疗及康复理疗等策略。降低脆性X综合征发病率的有效策略通过产前筛查与诊断阻断患儿的出生，产前筛查和诊断是本病预防的主要手段。目前实验室常用的分子诊断技术有Southern Blot、甲基化特异性PCR(MS-PCR)、长片段PCR扩增以及三核苷酸重复序列PCR(triplet-repeat primed-PCR)等。
相对于Southern Blot、MS-PCR以及长片段扩增PCR等技术，TP-PCR技术在检测灵敏度和准确性均具有显著的优势。三核苷酸重复序列的上游引物与扩增模板的CGG序列随机互补，配合与目的扩增序列互补的下游引物，形成(CGG)4-5～(CGG)n的PCR。该扩增技术不受扩增模板CGG重复数的影响，可有效检测＞1300的CGG重复序列：对于小于200CGG重复，可以算出精确重复数，理论上可区分1个CGG的差异；对于大于200CGG重复，为定性分析，标注为“＞200”。
需要指出的是，依据TP-PCR扩增的原理，随着扩增产物的片段大小的增加，其相应的扩增峰高逐渐衰减，在电泳谱图中表现为扩增峰高(Rfu值)逐渐降低，且间隔为一个CGG重复(即3个bp)的一系列扩增峰信号。理想情况下，最后一个峰即为最长扩增片段的峰，检测值与实际值一致。
但是当DNA模板起始量不足、X染色体倍型不同、毛细管电泳进样量不足时均有可能出现长片段扩增信号的消失或者低于系统的荧光信号检测限，即检测值低于实际值。特别是在45重复、55重复、200重复等区分正常、灰区、前突变、全突变的关键区域，如缺乏有效的质量控制，则可能出现假阴性的结果。如，当TP-PCR检出CGG重复数为190时，会否是由于所加入的基因组DNA起始量不足或X染色体倍型不同)导致CGG扩增峰的过度衰减而至190后的CGG峰未检出。
常规PCR质控策略通过控制DNA模板上样量、添加对照样本的方式来进行质量控制。如Abbott公司的FMR1TP-PCR Kit中对反应中DNA模板的使用表述为：“添加3uL的提取DNA样本(10-25ng/μL)。”这种通过操作标准的控制来实现对检测系统的质量控制，可以避免整体试验的误差，但无法有效避免因单个未知样本差异而造成的检测结果的判断困难。
影响未知样本检测结果判断的最为重要的一个因素是X染色体的倍型。这也是《EMQN关于脆性X综合征及相关疾病的分子遗传学检测和报告的最佳实践指南》中要求在进行CGG重复数检测时需要对X染色体倍型进行判断的原因之一。一个PCR检测试剂盒，检测灵敏度是一个关键参数，并通常以所加入的模板DNA的最低起始量作为衡量标准，如模板DNA起始量不低于50ng。然而，由于FMR1基因是位于X染色体上，不同的X染色体倍型意味着相同的起始DNA质量却是不同的X染色体拷贝数。100ng男性样本(XY)中X染色体的拷贝数仅为同等质量女性DNA样本中的一半。100ng超雌综合征(XXX)中X染色体拷贝数为同等质量男性DNA样本(XY)的三倍。
而在当前关于采用TP-PCR技术进行CGG重复检测的一些现有技术中，均未能提供在检测CGG重复数的同时，对反应体系中X染色体拷贝数是否适量进行监控的技术方案，这使得在对依据这些技术方案的检测结果进行评价时，阳性结果具有临床意义(如已检出CGG重复数超过200)，但阴性结果(如CGG重复数接近前突变界值或接近全突变界值)就难以下结论是不是假阴性结果。这也是该技术未能有效应用于产前诊断及产前筛查所需要考虑的关键问题之一。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品，还涉及相关的质控方法和含有该质控品的试剂盒，本发明为了实现对FMR1基因TR-PCR检测技术的结果控制，在引入X染色体倍型监控系统的同时，采用非特异性探针杂交技术开发了一种针对TP-PCR扩增体系中起始模板DNA量是否适宜的质控系统，以确保TP-PCR检测阴性结果的可靠性，并利用上述的质量控制体系，采用TP-PCR的技术，实现对FMR1基因CGG重复数的检测，精确区分正常样本(5-45)、灰区(46-54)、前突变(55-200)及全突变(＞200)。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案包括：
本发明的第一个目的是提供一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品，其包括如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA以及如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:5所示序列的引物；上述质控品用于在FMR1基因CGG重复数检测时，监控PCR体系中所加入的起始DNA模板量是否足量的。SEQ ID NO:6所示序列的人工合成的单链DNA是以人基因组DNA中的AluY序列中的部分高度保守序列为骨架，在5'端连接如SEQ ID NO:4所示引物序列，3'端接连如SEQ IDNO:5所示引物序列的反向互补序列，优选3'端最后一个碱基为双脱氧胸腺嘧啶(Tdd)。其中SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列为依据人3号染色体与X染色体一同源片段所设计的PCR引物。由于这一特别设计，在PCR反应中，当未加入人基因组DNA时，SEQ ID NO:5所示引物首先与SEQ ID NO:6所示人工合成DNA单链的3'端互补结合并在DNA聚合酶的作用下形成双链DNA，这一双链DNA片段将成为SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5所示引物的PCR扩增模板，并在毛细管电泳时在100bp处出现特异性质控点扩增信号(图2的a部分所示)。
当PCR反应体系中加入足量的人基因组DNA模板时，由于SEQ ID NO:6所示人工合成DNA单链中来自于AluY序列的骨架序列在人基因组DNA超过数万个拷贝，且其退火温度远高于SEQ ID NO:5所示PCR引物的退火温度，因此，在PCR首轮退火时，SEQ ID NO:6所示人工合成的单链DNA将与所加入的人基因组DNA发生广泛的非特异性杂交，从而阻止SEQ ID NO:5所引发的SEQ ID NO:6互补链的形成(图2的b部分所示)。同时，由于加入了人基因组DNA，SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5所示的PCR引物也将与3号染色体与X染色体的特异性结合部位结合，从而对二者对SEQ ID NO:6所示人工合成单链DNA的扩增形成竞争性抑制。
因此，SEQ ID NO:6所示人工合成的单链DNA质控品，将成为FMR1基因CGG重复数检测时对反应体系中所加入的基因组模板DNA是否足量的有效监控手段。
本发明的第二个目的是提供了上述质控品对FMR1基因CGG重复数PCR检测体系中，DNA模板量是否足量的判断方法。监控DNA模板量的方法包括：
步骤一：常规配制PCR反应体系，加入人基因组DNA模板，以及包含SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5所示PCR引物以及SEQ ID NO:6所示单链DNA质控品的引物组进行PCR扩增；
步骤二：对步骤一获得的扩增产物进行毛细管电泳并通过分析软件得到电泳图谱和数据，所述数据为质控片段扩增产物荧光信号强度(Hc)、3号染色体扩增片段荧光信号强度(Hchr3)和X染色体扩增片段荧光信号强度(HchrX)；
步骤三：依据步骤二所获得的数据对PCR反应体系中所加入的基因组DNA量是否足量按如下标准进行判断：
其中，当DNA模板加入量不足时，质控位点单链DNA在毛细管电泳100bp处出现显著的扩增峰，且Hc与Hchr3比值大于0.5；
当DNA模板加入量足量时，单链DNA在毛细管电泳100bp处无扩增峰，或Hc与Hchr3比值低于0.5。
本发明的第三个目的是提供一种采用上述质控品的X染色体倍型判断方法，包括以下步骤：
步骤A、采用如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物与DNA模板、进行反应，实现3号染色体片段、X染色体片段的扩增；
步骤B、步骤A获得的扩增产物进行毛细管电泳并通过分析软件得到电泳图谱和数据，所述数据包括3号染色体的扩增产物峰高Hchr3、X染色体的扩增产物峰高HchrX；
步骤C、根据步骤B获得的Hchr3与HchrX的比值对X染色体的倍型进行判定；
其中，当Hchr3/HchrX＞1.5时，提示只有1条X染色体；
当Hchr3/HchrX＝0.7～1.5时，提示有2条X染色体；
当Hchr3/HchrX＜0.7时，提示有3条或者3条以上的X染色体。
由于SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5所示引物即可以扩增3号染色体上的一个片段，也能够扩增X染色体上的一个片段，且3号染色体上的扩增片段长度较X染色体上的扩增片段长度短3bp。换言之，3号染色体片段与X染色体片段扩增效率是相同的、但扩增长度不同，在这种情况下，两个片段的扩增信号强度将与3号染色体与X染色体的倍型相关。由于人为二倍体生物，在一个细胞中总是有2条3号染色体，而X染色体可以是1条(如XY型正常男性)或2条(如XX型正常女性)。
在上述FMR1基因CGG重复数PCR检测体系中，DNA模板量是否足量的判断方法中，也可同时进行X染色体倍型的判定。
上述的人工合成DNA单链中的来自于AluY序列的骨架序列可替换为任一合适的在人基因组DNA超过数万个拷贝的序列。
本发明的第四个目的是提供一种含有如上所述的质控品的试剂盒。
为了进一步优化上述试剂盒，本发明采取的技术措施还包括：
进一步地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3所示序列的引物，其用于CGG重复区域的扩增。
进一步地，所述SEQ ID NO：3所示序列的引物和所述SEQ ID NO:4所示序列的引物的3'端均设置荧光基团，所述荧光基团选自以下组中的一种：FAM、HEX、TET、JOE、NED、VIC、ROX、TAMRA等，两者的荧光基团相同。优选地，所述SEQ ID NO:3所示序列的引物3'端设置FAM荧光基团，所述SEQ ID NO：4所示序列的引物3'端设置FAM荧光基团。
本发明采用的引物及单链DNA的序列及其修饰如下表所所示：
表1引物及单链DNA的序列及其修饰
进一步地，所述试剂盒包括用于储存单链DNA和引物的引物组合物容器，其中引物组合物容器的储存浓度为工作浓度的10～15倍；
其中，如SEQ ID NO:1所示序列的引物的工作浓度为：300～600nmol/L；
如SEQ ID NO:2所示序列的引物的工作浓度为：30～300pmol/L；
如SEQ ID NO:3所示序列的引物的工作浓度为：300～600nmol/L；
如SEQ ID NO:4所示序列的引物的工作浓度为：1～20nmol/L；
如SEQ ID NO:5所示序列的引物的工作浓度为：1～20nmol/L；
如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA的工作浓度为：5～50fmol/L。
进一步地，所述试剂盒还包括用于储存HotstarTaq DNA酶、普通PCR buffer、Mg2+、dATP、dTTP、dCTP、dGTP的PCR主反应液贮存液的容器，所述PCR主反应液贮存液的储存浓度为工作浓度的2倍；其中各组份的工作浓度为：HotstarTaq DNA酶1～5U/反应；常规PCRbuffer的工作浓度为1×；Mg2+为2.5-3mmol/L；dATP为0.2-0.6mmol/L；dTTP为0.2～0.6mmol/L；dCTP为0.8-1.6mmol/L；dGTP为0.8-1.6mmol/L。
进一步地，所述试剂盒包括用于储存高GC含量PCR扩增增强剂贮存液的容器，所述高GC含量PCR扩增增强剂包括DMSO、甜菜碱和7-deaza-dGTP，各组份贮存液浓度为工作液浓度的5倍，其中各组份的工作浓度为：DMSO为0.2％；甜菜碱为0.8-1.6mol/L,7-deaza-dGTP为dGTP的10％。
进一步地，PCR反应体系为15μL，其包括引物组合物1μL、PCR主反应液7.5μL,高GC含量PCR扩增增强剂3.0μL、DNA模板1～3.5μL，不足以ddH2O补足反应体系总体积；其中，PCR反应的扩增程序为：95℃15min，1个循环；99℃45s，55℃45s，70℃8min(+15s)，40个循环；72℃10min，1个循环。
本发明通过竞争性PCR产物峰来判断DNA模板的量是否足够，同时在模板量适当的情况，对X染色体的倍型进行分析，在质量控制合格的情况下，统计CGG重复数。本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
1)通过人工合成的单链DNA质控品实现了对起始DNA模板量的有效监控，使质控位点的检测信号与起始DNA模板量成反比，加入的起始DNA模板量越低，单链DNA的扩增信号越强。同时，通过特别的设计，用于扩增单链DNA质控品的引物可同时扩增3号染色体和X染色体上的片段，通过一对PCR引物扩增质控品的同时，通过对3号与X染色体片段的扩增，实现了对样本中X染色体倍型的监控。
2)建立多重PCR扩增系统，随着所检测位点的增加，各对引物间的相互干扰也会增加，本发明通过优化设计，各引物组之间相互不干扰，图谱良好。
3)引入X染色体倍型监控系统，发明符合《EMQN关于脆性X综合征及相关疾病的分子遗传学检测和报告的最佳实践指南》的要求。
4)内对照质控系统无需额外添加对照试验，在提高检测结果可靠性的同时，减少了人力成本与试剂成本。
附图说明
图1本发明一实施例中含有质控体系的检测方案扩增图谱模式图。
图2本发明一实施例中人工合成单链DNA质控品作用原理示意图。
图3采用本发明一实施例中试剂盒检测FMR1基因CGG重复数大于200的脆性X患者不同起始量样本的结果的图谱。
具体实施方式
本发明涉及一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品，其包括如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA以及如SEQ ID NO:4～SEQ ID NO:5所示序列的引物；其中，所述单链DNA的5'端为SEQ ID NO:4所示序列，3'端为如SEQ ID NO:5所示序列的反向互补序列，中间部分来自于AluY序列；其中，所述引物用于扩增3号染色体片段、X染色体片段以及所述单链DNA，实现对FMR1基因CGG扩增系统中模板质量及X倍型监控。本发明还涉及采用上述质控品判断DNA模板量是否足量和检测X染色体倍型的方法以及含有该质控品的试剂盒。本发明在引入X染色体倍型监控系统的同时，采用非特异性探针杂交技术开发了一种针对TP-PCR扩增体系中DNA起始模板量是否适宜的质控系统，实现了对FMR1基因CGG重复数的准确检测，从而确保了TP-PCR检测阴性结果的可靠性。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1
本实施例提供一种引入X染色体倍型和DNA起始模板量是否适宜的质控体系，其检测方案扩增图谱模式如图1所示。
本实施例所述的质控体系包括一套扩增引物组，其用于质控位点、CHR3、CHRX片段的扩增，其中该扩增引物为P4、P5，其序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示，该质控位点为单链DNA P6，其序列如SEQ ID NO:6所示；其中P4和P5引物为P6、ChrX及Chr3的共用引物。
该质控体系能够实现X染色体倍型的检测和DNA模板加入量是否充足的判断，具体如下：
(1)X染色体倍型检测；
3号染色体与X染色体同源片段长度多态性的引物P4及P5。
通过3号染色体的扩增产物峰高(Hchr3)与X染色体的扩增产物峰高(HchrX)的比值对X染色体的倍型进行判定。
当Hchr3/HchrX＞1.5时，提示只有1条X染色体。
当Hchr3/HchrX＝0.7～1.5时，提示有2条X染色体。
当Hchr3/HchrX＜0.7时，提示有3条或者3条以上的X染色体。
(2)DNA模板加入量是否足量的判断；
本实施例所述的人工合成单链DNA质控品的作用原理如图2所示，如图2的a部分所示：当未加入人基因组DNA或加入量不足时，人工合成的单链DNA模板将得到扩增从而在质控位点出现显著的扩增峰；如图2的b部分所示：当加入足量的人基因组DNA时，人工合成单链DNA片段因基因组DNA对其的非特异性结果而使其扩增受到明显抑制，质控位点的不出现或仅出现低水平的扩增峰
DNA模板加入量是否足量的判断的具体方式如下：
当基因组DNA加入量不足时，质控位点(毛细管电泳100bp处)出现显著的扩增峰，且扩增峰高(Hc)与3号染色体的扩增峰高(Hchr3)比值大于0.5，此时检测结果将无法准确判断；当基因组DNA加入量足够时，质控位点无扩增峰，或扩增峰高(Hc)与3号染色体的扩增峰高(Hchr3)比值低于0.5，此时检测结果可进行常规判断。
实施例2
本实施例为含有实施例1所述的质控体系的试剂盒，其包含包括两套不同的扩增引物，一套用于质控位点、CHR3、CHRX片段的扩增，另一套用于CGG重复区域的扩增；其中，质控位点、CHR3与CRHX扩增引物组包括如SEQ ID NO：6所示的质控位点单链DNA P6和分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5所示的引物P4、P5；TP-PCR扩增引物组包括分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的引物P1、P2及P3。各引物及单链DNA的序列及其修饰详见上表1。
本实施例所述的试剂盒的具体组分如下所示：
a)引物组合物容器，其储存浓度为工作浓度的10～15倍，包含序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示序列。
序列名称 序列编号 工作浓度
P1 SEQ ID NO:1 300～600nmol/L
P2 SEQ ID NO:2 30～300pmol/L
P3 SEQ ID NO:3 300～600nmol/L
P4 SEQ ID NO:4 1～20nmol/L
P5 SEQ ID NO:5 1～20nmol/L
P6 SEQ ID NO:6 5～50fmol/L
b)用于储存PCR主反应液贮存液的容器，其储存浓度为工作浓度的2倍，包括HotstarTaq DNA酶、普通PCR buffer、Mg2+、dATP、dTTP、dCTP、dGTP，工作浓度如下：
名称 浓度
HotstarTaq DNA酶 1～5U
普通PCR buffer 1×
Mg2+ 2.5-3mmol/L
dATP 0.2～0.6mmol/L
dTTP 0.2～0.6mmol/L
dCTP 0.8～1.6mmol/L
dGTP 0.8～1.6mmol/L
c)用于储存高GC含量PCR扩增增强剂贮存液的容器，其储存浓度为为工作液浓度的5倍，包括DMSO、甜菜碱和7-deaza-dGTP，工作浓度如下：
名称 浓度
DMSO 0.2％
甜菜碱 0.8-1.6mol/L
7-deaza-dGTP dGTP的10％
d)本实施例所述试剂盒在配制时，其PCR反应体系为15μL，反应体系组成如下：
应用实施例1
本应用实施例为采用实施例2所述试剂盒的实际应用实施例。在本实施例中采用商品化的人基因组DNA提取试剂盒或其它化学试剂从人全血样本中提取人基因组DNA用于后续检测，该DNA提取并不包含在本发明的权利要求中，但作为人基因组DNA的检测的常规流程或先前步骤，这一人基因组DNA提取过程也不应成为本发明的应用限制。因此，本实施例始于人基因组DNA提取完成之后。
本应用实施例的具体步骤如下：
(1)DNA提取。男性全突变样本1例，在获得其监护人知情同意条件下，采集其外周血。采用Qiagen公司的基因组DNA提取试剂盒提取，分别配制以下样本浓度：编号a(100ng/μL)，编号b(50ng/μL)及编号c(25ng/μL)。
(2)反应体系的配置。总反应体系为15μL，反应体系组成如下：
(3)PCR反应。PCR反应在普通PCR仪上进行，PCR反应条件如下：
(4)PCR产物取1μL，按常规操作在遗传分析仪上进行毛细管电泳。
(5)对电泳后的数据利用专用数据分析软件(如GeneMapper等)分析，得到电泳图谱，其结果见图3。
(6)结果分析：
由上述应用实施例可知，当DNA质控提示DNA模板量足够时，如图3的a部分和图3的b部分所示，TP-PCR检测的结果显示CGG重复数＞200，为全突变，结果与样本信息一致；而当DNA质控提示模板量不足时，如图3c所示，TP-PCR检测的结果显示CGG重复数为156，为前突变，造成假阴性的误判。进一步地，X染色体倍型均提示为1条X染色体，X染色体倍型与样本信息一致。进一步地，上述患者样本通过本实施例中所建立的质控体系，无需额外添加对照试验，能够有效地保证CGG重复数检测终点的可靠性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
序列表
<110> 上海晶准生物医药有限公司
<120> 一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品及其应用和含有该质控品的试剂盒
<130> IPI183899
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物P1(Artificial Sequence)
<400> 1
agccccgcac ttccaccacc agctcctcca 30
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 引物P2(Artificial Sequence)
<400> 2
tgctctggac cctgaagtgt gccgttgata cggcggcggc ggcgg 45
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 引物P3(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctctggac cctgaagtgt gccgttgata 30
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物P4(Artificial Sequence)
<400> 4
cctgtgaggt aggcagggta ggtgt 25
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 引物P5(Artificial Sequence)
<400> 5
attgcctagg ttctagtcct agctccatc 29
<210> 6
<211> 100
<212> DNA
<213> 单链DNA(Artificial Sequence)
<400> 6
cctgtgaggt aggcagggta ggtgtgtaat cccagcactt tgggaggccg aggcgggcgg 60
atcatgaggt cgatggagct aggactagaa cctaggcaat 100

Claims (9)

1. 一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品，其特征在于，包括如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA以及如SEQ ID NO:4~SEQ ID NO:5所示序列的引物；
其中，所述单链DNA的5'端为SEQ ID NO:4所示序列，3'端为如SEQ ID NO:5所示序列的反向互补序列，中间部分来自于AluY序列；
其中，所述引物用于扩增3号染色体片段、X染色体片段以及所述单链DNA，实现对FMR1基因CGG扩增系统中模板质量及X染色体倍型监控。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测FMR1基因CGG重复数的质控品，其特征在于，所述单链DNA的3'端最后一个碱基为双脱氧胸腺嘧啶。
3.一种采用如权利要求1或2所述的质控品判断DNA模板量是否足量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示序列的引物与DNA模板、如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA进行反应，实现单链DNA、3号染色体片段、X染色体片段的扩增；
步骤二、步骤一获得的扩增产物进行毛细管电泳并通过分析软件得到电泳图谱和数据，所述数据包括单链DNA的扩增产物峰高Hc、3号染色体的扩增产物峰高Hchr3、X染色体的扩增产物峰高HchrX ；
步骤三、根据步骤二获得的Hc及其与Hchr3的比值对DNA模板量进行判断；
其中，当DNA模板加入量不足时，质控位点单链DNA在毛细管电泳100bp处出现显著的扩增峰，且Hc与Hchr3比值大于0.5；
当DNA模板加入量足量时，单链DNA在毛细管电泳100bp处无扩增峰，或Hc与Hchr3比值低于0.5。
4.一种用于检测FMR1基因CGG重复数的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的质控品。
5. 根据权利要求4所述的用于检测FMR1基因CGG重复数的试剂盒，其特征在于，还包括SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:3所示序列的引物，其用于CGG重复区域的扩增。
6.根据权利要求4所述的用于检测FMR1基因CGG重复数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于储存单链DNA和引物的引物组合物容器，其中引物组合物容器的储存浓度为工作浓度的10~15倍；
其中，如SEQ ID NO:1所示序列的引物的工作浓度为：300~600 nmol/L；
如SEQ ID NO:2所示序列的引物的工作浓度为：30~300 pmol/L；
如SEQ ID NO:3所示序列的引物的工作浓度为：300~600 nmol/L；
如SEQ ID NO:4所示序列的引物的工作浓度为：1~20 nmol/L；
如SEQ ID NO:5所示序列的引物的工作浓度为：1~20 nmol/L；
如SEQ ID NO:6所示序列的单链DNA的工作浓度为：5~50 fmol/L。
7. 根据权利要求4所述的用于检测FMR1基因CGG重复数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于储存PCR主反应液贮存液的容器，其中，所述PCR主反应液贮存液的储存浓度为工作浓度的2倍；所述PCR主反应液包括HotstarTaq DNA酶、普通PCR buffer、Mg2+、dATP、dTTP、dCTP、dGTP；
其中，各组份的工作浓度为：HotstarTaq DNA酶1~5 U/反应；普通PCR buffer的工作浓度为1 ×；Mg2+为2.5-3mmol/L；dATP为0.2-0.6mmol/L；dTTP为0.2~0.6 mmol/L；dCTP为0.8-1.6 mmol/L；dGTP为0.8-1.6 mmol/L。
8.根据权利要求4所述的用于检测FMR1基因CGG重复数的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于储存高GC含量PCR扩增增强剂贮存液的容器，所述高GC含量PCR扩增增强剂包括DMSO、甜菜碱和7-deaza-dGTP，各组份贮存液浓度为工作液浓度的5倍；
其中，各组份的工作浓度为：DMSO为0.2%；甜菜碱为0.8-1.6mol/L，7-deaza-dGTP为dGTP的10%。
9. 根据权利要求4所述的用于检测FMR1基因CGG重复数的试剂盒，其特征在于，PCR反应体系为15μL，其包括引物组合物1μL、PCR主反应液7.5μL、高GC含量PCR扩增增强剂3.0μL、DNA模板 1~3.5μL，不足以ddH2O补足反应体系总体积；其中，PCR反应的扩增程序为：95℃15 min，1个循环；99℃ 45 s，55℃ 45 s，70℃ 8 min+15 s，40个循环；72℃ 10 min，1个循环。
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