CN108504649B - 编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法 - Google Patents

编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108504649B
CN108504649B CN201710102701.XA CN201710102701A CN108504649B CN 108504649 B CN108504649 B CN 108504649B CN 201710102701 A CN201710102701 A CN 201710102701A CN 108504649 B CN108504649 B CN 108504649B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
primer
dna
sequencing
random
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710102701.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108504649A (zh
Inventor
黄新华
戴慧清
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiaxing Jinfukang Medical Laboratory Co Ltd
Original Assignee
Jin Fu Kang Biotechnology Shanghai Ltd By Share Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jin Fu Kang Biotechnology Shanghai Ltd By Share Ltd filed Critical Jin Fu Kang Biotechnology Shanghai Ltd By Share Ltd
Priority to CN201710102701.XA priority Critical patent/CN108504649B/zh
Publication of CN108504649A publication Critical patent/CN108504649A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108504649B publication Critical patent/CN108504649B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)

Abstract

本发明公开了一种编码PCR二代测序建库方法，步骤包括：1)提取DNA；2)用带随机分子编码序列的单端特异引物进行正向单链线性扩增反应；3)用对侧单端特异引物与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应；4)用测序双端公共接头引物对进行指数扩增反应；5)定量质检，获得DNA文库。本发明还公开了用上述DNA文库进行测序检测的方法，及包含该DNA文库的编码PCR二代测序建库试剂盒。本发明通过将样品原始DNA模板序列在初始互补合成中进行编码，使测序结果可以根据编码溯源检出初始DNA模板的真实序列和真实检出分子数，从而显著降低了突变假阳性和假阴性。

Description

编码PCR二代测序建库方法、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及DNA深度测序检测技术领域，特别是涉及组织、血浆或血清中0.03％～1％低比例的靶序列变异位点不确定的DNA片段的高保真深度测序检测。
背景技术
基因科学是生命科学的一个重要领域，生命体的基因密码序列及其变异会影响生命体的多种生物功能，导致功能变异，通过检测生命体的基因变异可以了解和预估生命的功能变异，通过定量检测生命体的基因变异情况，也可以精确了解患病生命体的疾病进展和预后，例如肿瘤的进展、复发的有无或早中晚期和治疗效果。当前，检测基因变异已成为分析判断遗传疾病、肿瘤疾病、个体化药物反应特征的重要手段，用于预测和预防出生缺陷，定期监控肿瘤复发，监控肿瘤个体化用药和化疗的治疗效果。
目前，基因变异的检测方法主要有一代测序法、二代测序法和三代测序法。一代测序，能可靠地检测变异在20％以上比例的样品，低于20％，检测的可靠性明显降低，所以不能检测低比例(0.05％～1％)基因变异型。当前二代测序法(包括基因建库和上机测序两大环节)的高深度测序(大于5000乘)可以检测基因变异型比例低于10％的样品。因为当前的测序建库方法主要有两种，一种是全基因测序建库，将片段化的DNA样品，进行非特异接头连接而建库，建库连接效率低于30％，造成约70％的原始模板序列信息丢失，对10000个基因组拷贝的DNA样品中5个突变可能因丢失阳性而致假阴性。因此，不可能准确检测到5/10000的突变。因为一般抽血8～10ml，得到血浆4～5ml以下，抽提到的DNA在30～40ng，按3.3pg为一个基因组拷贝，30～40ngDNA约有10000～12000个拷贝。经过建库的丢失，只能剩2000～3000个拷贝，实现有效的10000乘高深度测序很困难。而且，即使5000乘深度的测序，全基因测序的费用也高得惊人，无法普及应用。
高深度测序，适合用于靶基因靶区测序，虽然深度很深，但测序靶序列有限，费用不高，可以普及应用，解决肿瘤外周血突变基因检测(又称CT-DNA检测)。靶基因靶区测序，当前的方法有特异捕获法和PCR特异扩增法。特异捕获法应用特异序列探针杂交捕获靶基因靶区片段，首先进行接头连接(效率约30％)，而后进行连接产物纯化，再进行接头扩增，扩增后进行探针杂交捕获，再进行捕获产物扩增。经过连接、捕获，归于原始模板的实际得率约20％。这样10000个原始拷贝，约得到2000个源自初始模板的DNA分子，虽然通过PCR扩增能达到足够的序列，进行5000乘、10000乘测序，但归结于原始模板的序列数没有提高，虽然深度很深，但不能代表10000个原始模板的深度。30多个循环的PCR也会产生不可忽视的错配误差，严重影响测序的保真性和灵敏性。
当前方法中，还有采用靶向特异扩增方法获得靶序列，一般特异扩增10～20个循环，然后进行接头再扩增，10～15个循环，总扩增20～35个循环。这同样带来较严重的PCR错配误差问题，增加了检测噪声，降低了检测的信噪比。因为基因扩增的反应中避免不了碱基错配延伸导致突变假阳误差，高保真聚合酶的错配延伸小于普通聚合酶，但仍不可避免。如此扩增，带来的误差性突变达0.5％～2％，这就严重影响了深度测序的保真性，也就影响了深度测序在ct-DNA检测上的应用(ct-DNA测序检测的精度要能达到1/1000突变的净检出能力，才有较高的价值)。
中国贝瑞和康公司发明了C-smart法对ct-DNA进行深度测序。其方法的特点是，第一步对原始模板进行分子条码接头连接，然后进行20～30个循环的扩增，再对扩增产物环化，再进行环状DNA特异性扩增，实现靶向建库测序。多个循环的扩增带来的错配假阳性误差，能通过分子条码的计算扣除来降低，提高信噪比。其缺点是，连接效率不高(一般不高于30％)，将导致原始模板信息丢失，高度循环的PCR指数扩增，导致低比例的突变比例更低甚至丢失。
低比例突变基因多数是来自肿瘤患者外周循环血浆的游离DNA或癌前病变和早期病变的肿瘤组织释放出的DNA的提取物，DNA样品多是片段化的短片段(160～200bp)，为获得更多的含突变位点的扩增产物，一般扩增区域长度设计为70～100bp，突变位点多预设在PCR产物的中间区段。当前检测突变基因低于1％的检测方法主要是数字PCR方法，有的称为微滴数字PCR，也有微孔数字PCR，效果差别较大。这种方法国内外文献报道很多。数字PCR最大的限制是只能进行已知明确突变位点的样品的定量检测，而对常见突变片段，但位点不固定的突变，则无法明确检测。
数字PCR方法(包括微滴PCR、微孔PCR)，是低比例变异基因检测的可靠方法。能够检测1/100到1/10000的低比例变异基因。该方法的明显的局限性在于：1)数字PCR，一个反应只能检测1-2个已知确定位点突变基因，不能可靠地对同一样品同时检测多个位点不确定的突变。因为肿瘤变异复杂，多基因多位点突变是肿瘤的重要特征，故检测多基因多位点十分重要，所以当前的数字PCR不能很好满足血浆多位点突变检测的需要。2)数字PCR需要的DNA量较大，一般常规的一次抽血10ML，只够做一个反应，测1～2个位点，要测更多位点则样品量不够。3)仅检测1～2个位点，对肿瘤来说，检测覆盖度太低，应用面太窄。例如，Kras基因是多种肿瘤需要检测的突变基因，最常见的突变是12密码子和13密码子，这里就涉及6个基因碱基位点，一个位点可有3种变异，而且哪个位点突变不固定，且未知。这样，数字PCR就不适合。在肿瘤组织和肿瘤患者外周血检测中，类似的多位点热区突变情况最多，而某单一位点突变比例较低，所以数字PCR的适用性窄，至今未能得到普及应用。4)数字PCR成本太高，检测一个位点，仅材料成本就需要200元到400元。因此，数字PCR至今仅在科学研究领域应用，尚不能用于实际的医学检测。当前市场供应的数字PCR有四家公司，分别是：美国的raindance、美国的伯乐、美国的life、新加坡的clari。前两个是油包水的液滴PCR，后两个是微孔PCR。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种编码PCR的二代测序建库方法，用该方法构建的DNA文库可用于测序检测多个基因靶区的多位点和位点未知的突变片段，且可以溯源计算样品原始DNA分子的检出数和样品原始DNA突变检出数，达到高灵敏度和保真度。
为解决上述技术问题，本发明的第一种编码PCR二代测序建库方法，步骤包括：
1)提取样本DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列、中部带有随机分子编码序列的正向或反向引物进行单链特异线性扩增反应，并对扩增产物进行纯化；
3)以步骤2)所得纯化产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列的反向或正向引物，与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述公共接头引物的序列与本步骤所述模板的5’端的公共接头序列相同或互补；
4)以步骤3)所得纯化产物为模板，用测序双端公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述测序双端公共接头引物对的序列分别与步骤2)所述正向引物中的公共接头序列和步骤3)所述反向引物中的公共接头序列相同或互补；
5)定量，质检，获得DNA测序文库。
步骤1)所述样本DNA通常为150～500bp的短片段。
步骤2)所述随机分子编码序列由两段随机序列中间插入一段非随机序列构成，其中，每段随机序列的碱基数为4bp以上(优选4～5bp)，非随机序列的碱基数为4～6bp。例如，4N-A4TA-4N、4N-T4AT-4N、4N-AGCT-4N、4N-CTAG-4N、4N-TACTGT-4N、5N-A4TA-4N、5N-A4TA-5N、4N-T4AT-5N、5N-T4AT-5N、4N-AGCT-5N、5N-AGCT-5N等，其中N代表随机碱基(即dATP、dCTP、dGTP、dTTP中的任何一种)。在引物合成时，随机序列各位点上的碱基(A、C、G、T)是通过随机连接得到的，非随机序列各位点上的碱基则是按照引物设计时所设定的碱基类型固定分配得到的。通过在随机序列中间插入非随机序列，隔断随机碱基，形成一个隔离区，可以提高随机编码引物的单链线性扩增反应的特异性，减少非特异产物的形成。
步骤2)所述引物的长度为50～65bp，所述正向或反向单链特异线性扩增反应的反应体系为：5×PCR缓冲液2μL，10mM dNTP 0.5μL，DNA模板1μL，5μM引物1μL，5U/μl KOD DNA聚合酶0.2μL，H2O 5.8μL，总体积10μL；反应条件为(慢降温三步法循环)：95℃5分钟变性；95℃30秒，64℃退火1分钟，63℃退火1分钟，62℃退火1分钟，61℃退火1分钟，60℃退火1分钟，59℃退火1分钟，58℃退火1分钟，68℃～72℃30秒延伸，2～10个热循环；16℃保持。除KOD酶外，反应所用高保真聚合酶还可以选择Pfu酶、vent酶、kapa高保真酶等。本步采用多循环线性扩增，可以提高抽样率，确保达到初始DNA分子数非重复检出率大于30％的要求(ctDNA是cfDNA中的低频分子，如果对cfDNA的初始分子检出数不足，例如，在样品含有10000个DNA拷贝条件下，检出率小于10％，则检出0.1％的ctDNA的概率就不够，容易造成假阴性；如果检出率能大于30％，则检出0.1％的ctDNA为阳性的把握度就是10％检出率的3倍以上，就不容易造成假阴性)。此外，本步骤为单链线性扩增，亦即本发明的突变检测只检测DNA双链中的其中一条链，就能等效于互补双链突变检测，且同等检出效果条件下，可以节省一半的测序量。
步骤3)所述单端特异指数扩增反应先采用慢降温三步法循环，条件同步骤2)，热循环数为4～6个；再采用两步法循环，95℃变性，68～72℃退火延伸，热循环数为15～20个。此反应条件有利于降低非特异产物的比例。
步骤4)所述双端非特异指数扩增反应的反应体系和反应条件按常规三步法循环(95℃变性，58℃退火，68℃延伸)，热循环数为15～20个，引物浓度为5μM。扩增产物的纯化是用磁珠(磁珠与扩增产物的体积比为1.5:1)纯化220bp以上长片段，有利于去除180bp以下非目标产物。步骤4)中所述的测序双端公共接头引物对，当使用illumina二代测序仪测序时，为P5接头引物(SEQ ID NO:3)和P7接头引物(SEQ ID NO:4)；当使用life公司的半导体芯片测序仪测序时，为PGM/A接头引物和PGM/B接头引物，序列如下：
PGM/A接头引物：CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG(SEQ ID NO:5)
PGM/B接头引物：CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT(SEQ ID NO:6)
本发明要解决的技术问题之二是提供一种用于基因突变检测的编码PCR二代测序检测方法，该方法按照上述建库方法制备DNA测序文库，进行高通量测序检测，并对测序结果数据进行溯源分析。所述溯源分析包括误差识别、真实性判别、突变判别、突变比例计算，具体包括以下步骤：
1)分选不同靶标基因数据，形成多个子数据；
2)分别对子数据进行分子编码排序，一个独立分子编码定义为一个分子族，统计分子族数，计算分子族内的reads；
3)判别分子族有效性：一个分子族内的reads数小于预设数，将该分子族判别为无效；大于或等于预设数，将该分子族判别为有效；所述预设数为大于5的自然数；
4)分别将分子族内reads与参考序列进行比对分析、记录，统计错配reads和非错配reads，如果非错配reads数大于0，则将该分子族判别为野生型分子族；如果非错配reads数等于0，则继续进行步骤5)突变型分子族的判别；
5)突变型分子族的判别：如果突变位点和基因型的一致性大于90％，则将该分子族判别为突变型分子族，否则将该分子族判别为野生型分子族；
6)溯源统计，并按下式计算突变比例：溯源分子突变比例＝突变型分子族数/(突变型分子族数+野生型分子族数)。
本发明要解决的技术问题之三是提供一种编码PCR二代测序建库试剂盒，该试剂盒包含有用上述建库方法制备的DNA测序文库，可用于0.03％～1％低频突变基因的高通量测序。
本发明要解决的技术问题之四是提供用于上述建库方法的引物对。其中，正向或反向引物具有如SEQ ID NO:1所示的序列，反向或正向引物具有如SEQ ID NO:2所示的序列；或者，正向或反向引物具有如SEQ ID NO:7～9所示序列中的一条或多条序列，反向或正向引物具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10～11所示序列中的一条或多条序列。其中，序列中的N为A、C、G、T中的任意一种。
本发明以靶区突变位点未知的基因片段为模板，先进行随机分子编码的单端特异引物引导的线性单链合成反应，将原始模板上系列位点的碱基转化为分子编码标记的互补序列，纯化后再进行对侧单端特异引物引导的单端特异指数扩增合成反应，以减少靶标基因序列的编码丢失，增加产物的特异性，然后进行公共接头引物的多循环非特异指数扩增，获得高通量测序所需的足量完整待测序列。与现有建库及测序分析方法相比，本发明的方法具有以下优点和有益效果：
1.检测的特异性高，假阳性可达到0.01％以下，特异性比常规双链PCR扩增法的2％分辨率高200倍。这是因为通过单分子编码溯源分析(一个编码为一族，族内有多个序列结果，必须突变位点一致性达到90％以上，才判别为突变)，可以消除PCR扩增产生的随机错配误差。
2.由于本发明抽检的是DNA双链中的一条链，而不是两条链，1个分子族代表一条DNA双链，检出2个分子族相同位点突变型代表2个DNA分子的相同突变，因此，本发明的检测方法灵敏度很高，检测限可达到0.03％突变水平，比双链PCR扩增法和接头连接建库法(这两种方法的检测限均为0.1％)高3倍；初始DNA分子数检出率可以达到30％～70％，突变分子检出限可以达到0.03％～0.1％。此外，本发明的单分子编码标记特异引物的线性扩增，即使在样本DNA分子数一定的情况下，也可以通过增加循环数，提高样本DNA分子的抽检率，亦即提高了突变检出的灵敏度，因此，本发明的方法的灵敏度是可调整、可控制的。
3.可以根据分子编码溯源分析，进行初始DNA分子的数字化定量测序，计算出初始DNA分子的检出数，因此可以准确进行分子数定量和突变比例定量，解决稀有低比例突变基因不能定量的问题。
4.当前常用的二代测序建库方法，都难以检测突变基因比例低于1％的样品，而本发明通过单端分子编码PCR建库，经二代测序，可以检测0.03％～1％的低比例突变基因，可应用于设计制备低频突变DNA二代测序建库试剂盒。
5.可以进行多重突变检测。一个常规取样量的血样可以同时检测多个基因、多个靶区、多个位点，并能检测发现未知突变位点。
6.可以避免C-smart等原始模板连接法的连接低效率、高丢失，以及PCR方法的扩增偏态使低比例突变更低甚至丢失的问题。
7.可以大大降低低比例突变基因检测的成本。
附图说明
图1是本发明实施例1的正向单链特异线性扩增反应原理示意图。
图2是本发明实施例1的反向单端特异指数扩增反应原理示意图。
图3是本发明实施例1的双端公共接头引物指数扩增反应示意图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1外周血血浆基因EGFR EXON20突变检测
1.样本DNA提取
取适量的受检者外周血血浆3～5ml，用游离DNA提取试剂盒(DK607-01，由上海莱枫生物科技有限公司提供)提取其游离基因组DNA。
2.正向单链特异线性扩增反应
正向引物EGFR EXON20-55bp-F：
TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNATTTTANNNNTAGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQ ID NO:1)
正向单链特异线性扩增反应体系为：5×PCR缓冲液2μL，10mM dNTP 0.5μL，DNA模板1μL(含24.75ng DNA)，5μM引物1μL，5U/μl KOD DNA聚合酶0.2μL，H2O 5.8μL，总体积10μL。
反应条件如表1所示，采用慢降温三步法热循环。
表1正向单链特异线性扩增反应条件
Figure BDA0001232223130000061
Figure BDA0001232223130000071
3.正向单链特异线性扩增产物纯化
在正向单链特异线性扩增产物的反应管中加入常用建库纯化磁珠，按常规二代测序建库纯化说明书操作，对正向单链特异线性扩增产物进行纯化。
4.反向单端特异指数扩增反应
对上述经磁珠纯化后的产物进行反向单端特异指数扩增反应，反应所用引物对如下：
反向引物EGFR EXON20-49bp-R：
GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-GCAGCCGAAGGGCATGAG(SEQ ID NO:2)
P5公共接头引物：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCC-TACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:3)
扩增反应体系同步骤2。反应条件为：先采用慢降温三步法热循环，见表1，其中循环数为5～6个；再采用两步法热循环，95℃变性，68℃退火延伸，20个循环。
5.反向单端特异指数扩增产物纯化
使用常用建库纯化磁珠，按常规二代测序建库纯化说明书操作，对步骤4所得单端特异指数扩增产物进行纯化。
6.双端非特异指数扩增反应
以步骤5所得纯化产物为模板，用illumina二代测序体系的双端公共接头引物对(5μM，各1μl)进行指数扩增反应。其中，
P5公共接头引物的序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCC-TACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:3)
P7公共接头引物的序列为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAGACGGTGACTG-GAGTTCCTTGGCACCCGAGA(SEQ IDNO:4)
扩增反应体系同步骤2，反应条件为常规三步法循环(95℃变性，58℃退火，68℃延伸)，循环数为20个。
7.双端非特异指数扩增纯化、定量质检、测序
对上述步骤6的双端非特异指数扩增产物按常规方法进行磁珠纯化，磁珠与扩增产物的体积比为1.5:1。然后进行定量质检(使用常规QBIT检测仪定量，按仪器和定量检测试剂的说明书进行操作)，定量超过10ng即为合格，送illumina NEXT SEQ500测序仪进行二代测序。
8.结果分析
二代测序获得200000reads。对所得数据进行溯源分析，判断突变基因的有无、类型和数量。
具体分析步骤为：1)用常规方法进行不同靶标基因数据分选，形成多个子数据。2)分别对子数据进行随机8位分子编码排序，设每个独立分子编码为一个分子族，并统计分子族数，计算分子族内的reads。3)分子族有效性判别：一个分子族内的reads数小于预设数(预设数>5，本实施例将预设数设定为6)，判为无效；大于或等于预设数，判别为有效。4)分别对分子族内reads进行参考序列的比对分析，记录，统计错配reads和非错配reads，然后判别分子族是否为野生型，如果非错配reads数>0，则判为野生型族；如果非错配reads数为0，则继续进行突变型分子族的判别。5)突变型分子族的判别：如果分子族内reads与参比序列比对，突变位点和基因型的一致性〉90％，判别为真实突变型；否则判别为野生型。6)溯源统计，按下式计算突变比例：溯源分子突变比例＝突变型分子族数/(突变型分子族数+野生型分子族数)。
表2为采用随机分子编码PCR建库(本发明实施例1)与不采用分子编码PCR建库(即采用常规的扩增子建库)，在EGFR EXON20基因的二代测序结果上的差异比较。
表2两种建库方法EGFR EXON20基因二代测序结果比较
Figure BDA0001232223130000081
Figure BDA0001232223130000091
由表2可见，对于一个完全正常的DNA样品，不采用编码PCR建库，即使用常规的扩增子建库，二代测序结果中，突变比例多数在1％水平以上。而本发明实施例编码PCR建库二代测序的结果，突变比例极少在0.5％水平，绝大多数在0.02％水平以下；按60个位点计，除20、26、35、41位外，其他位点的突变比例为0，即90％以上位点正常基因的突变为零，显示了本发明的随机分子编码PCR建库二代测序方法比普通扩增子建库二代测序方法有更强的误差消除作用。此外，从表2可以估算出本实施例采用随机分子编码PCR建库二代测序的初始DNA分子数检出占比约为48％。
上述初始DNA分子数检出占比的计算，已经考虑了线性多循环扩增中的重复检出(以下简称重检)问题。具体估算方法如下：
1、样品初始DNA分子数＝DNA质量(ng)×1000/3.3。(1个人类DNA拷贝数＝3.3pg)
2、线性扩增单个循环合成的分子数＝线性扩增累计循环合成的总分子族数/线性循环数；
3、每轮循环的累计非重检分子数＝上一循环的累计非重检分子数+本轮循环线性扩增合成的分子数×(1-本轮循环的重复检出占比)
4、每轮循环的累计非重检分子占比＝本轮循环的累计非重检分子数/样品初始DNA分子数
5、每轮循环的重复检出占比＝上一循环的累计非重检分子占比
以本实施例为例，
样品初始DNA分子数＝24.75×1000/3.3＝7500个人类DNA拷贝；
8个线性扩增累计循环合成的总分子族数为4784(代表检测的溯源分子数)，则线性扩增单个循环合成的分子数＝4784/8＝598；
每轮循环的累计非重检分子数、累计非重检分子占比、重复检出占比的计算参见表3所示，经过8个循环线性扩增之后，累计非重检分子占比为48.56％(即第8轮循环的累计非重检分子占比，亦即估算的初始DNA分子数检出占比)
表3
Figure BDA0001232223130000092
Figure BDA0001232223130000101
实施例2肿瘤患者样品外周血血浆基因EGFR EXON18、EGFR EXON19、EGFR EXON20多重突变检测
1.样本DNA提取
取适量的受检者外周血血浆3～5ml，用游离DNA提取试剂盒(DK607-01，由上海莱枫生物科技有限公司提供)提取其游离基因组DNA。
2.正向单链特异线性扩增反应
正向引物序列如下：
EGFR EXON20-55bp-F：
TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNTAAAATNNNNTAGGAAGCCTACGTGATGGC(SEQ ID NO:7)
EGFR EXON18-59bp-F：
TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNTAAAATNNNNGAGATCTTGAAGGAAACTGAATTC(SEQ IDNO:8)
EGFR EXON19-58bp-F：
TACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNTAAAATNNNNGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTA(SEQ ID NO:9)
正向单链特异线性扩增反应体系为：5×PCR缓冲液2μL，10mM dNTP 0.5μL，DNA模板1μL(含33ng DNA)，5μM引物1μL，5U/μl KOD DNA聚合酶0.2μL，H2O 5.8μL，总体积10μL。
反应条件同实施例1。
3.正向单链特异线性扩增产物纯化
在正向单链特异线性扩增产物的反应管中加入常用建库纯化磁珠，按常规二代测序建库纯化说明书操作，对正向单链特异线性扩增产物进行纯化。
4.反向单端特异指数扩增反应
对上述经磁珠纯化后的产物进行反向单端特异指数扩增反应，反应所用引物组如下：
反向引物：
EGFR EXON20-49bp-R：
GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-GCAGCCGAAGGGCATGAG(SEQ ID NO:2)
EGFR EXON18-55bp-R：
GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-CAGGGACCTTACCTTATACACCGT(SEQ ID NO:10)
EGFR EXON19-54bp-R：
GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-CAGCAAAGCAGAAACTCACATCG(SEQ ID NO:11)
P5公共接头引物：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCC-TACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:3)
扩增反应体系和反应条件同实施例1。
5.单端特异指数扩增产物纯化
使用常用建库纯化磁珠，按常规二代测序建库纯化说明书操作，对步骤4所得单端特异指数扩增产物进行纯化。
6.双端非特异指数扩增反应
以步骤5所得纯化产物为模板，用illumina二代测序体系的双端公共接头引物对(5μM，各1μl)进行指数扩增反应。其中，
P5公共接头引物的序列为：
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCC-TACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ IDNO:3)
P7公共接头引物的序列为：
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAGACGGTGACTG-GAGTTCCTTGGCACCCGAGA(SEQ IDNO:4)
扩增反应体系和反应条件同实施例1，循环数为15个。
7.双端非特异指数扩增纯化、定量质检、测序
对上述步骤6的双端非特异指数扩增产物按常规方法进行磁珠纯化，并进行定量质检(使用常规QBIT检测仪定量，按仪器和定量检测试剂的说明书进行操作)，定量超过10ng即为合格，送illumina NEXT SEQ500测序仪进行二代测序。
8.结果分析
二代测序获得1695790reads。对所得数据进行溯源分析，判断突变基因的有无、类型和数量。具体分析步骤同实施例1。
表4为本发明实施例2采用分子编码PCR建库对EGFR EXON18、EGFR EXON19、EGFREXON20基因的二代测序结果。
表4血浆ctDNA实测结果
Figure BDA0001232223130000111
Figure BDA0001232223130000121
由表4可见，对于一个肿瘤患者的DNA样品，应用本发明实施例2的编码PCR二代测序建库方法，能检出0.1％水平以上的突变型。DNA分子非重复检出占比的估算方法同实施例1。
序列表
<110> 上海基致生物医药科技有限公司
<120> 编码PCR二代测序建库方法、试剂盒及检测方法
<130> CPC-NP-16-100362
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
tacacgacgc tcttccgatc tnnnnatttt annnntagga agcctacgtg atggc 55
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
gactggagtt ccttggcacc cgagaattcc agcagccgaa gggcatgag 49
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 4
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agattacaga cggtgactgg agttccttgg cacccgaga 59
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
cctctctatg ggcagtcggt gat 23
<210> 7
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
tacacgacgc tcttccgatc tnnnntaaaa tnnnntagga agcctacgtg atggc 55
<210> 8
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
tacacgacgc tcttccgatc tnnnntaaaa tnnnngagat cttgaaggaa actgaattc 59
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 9
tacacgacgc tcttccgatc tnnnntaaaa tnnnngaaag ttaaaattcc cgtcgcta 58
<210> 10
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 10
gactggagtt ccttggcacc cgagaattcc acagggacct taccttatac accgt 55
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 11
gactggagtt ccttggcacc cgagaattcc acagcaaagc agaaactcac atcg 54

Claims (8)

1.编码PCR二代测序建库方法，其特征在于，步骤包括：
1)提取样本DNA；
2)以步骤1)提取的DNA为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列、中部带有随机分子编码序列的正向或反向引物进行单链特异线性扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述随机分子编码序列包括两段随机序列和一段非随机序列；所述非随机序列位于两段随机序列之间，用于间隔两段随机序列；
3)以步骤2)所得纯化产物为模板，用3’端带有与模板互补的特异序列、5’端带有公共接头序列的反向或正向引物，与公共接头引物构成引物对，进行单端特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述公共接头引物的序列与本步骤所述模板的5’端的公共接头序列相同或互补；
4)以步骤3)所得纯化产物为模板，用测序双端公共接头引物对进行双端非特异指数扩增反应，并对扩增产物进行纯化；所述测序双端公共接头引物对的序列分别与步骤2)所述正向引物中的公共接头序列和步骤3)所述反向引物中的公共接头序列相同或互补；
5)定量，质检，获得DNA测序文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)，每段随机序列的碱基数为4bp以上，非随机序列的碱基数为4～6bp；在引物合成时，随机序列各位点上的碱基为合成时随机连接而得，非随机序列各位点上的碱基按照引物设计时所设定的碱基类型固定分配。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述正向或反向单链特异线性扩增反应采用变性、退火、延伸三步法，其中退火阶段采用缓慢降温的退火方式，热循环数为2～10个。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述单端特异指数扩增反应，先采用变性、退火、延伸三步法，其中退火阶段采用缓慢降温的退火方式，热循环数为4～6个；再采用变性、退火延伸两步法，热循环数为15～25个。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述双端非特异指数扩增反应的热循环数为15～20个。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述正向或反向引物具有如SEQ IDNO:1所示的序列，步骤3)所述反向或正向引物具有如SEQ ID NO:2所示的序列，其中，序列中的N为A、C、G、T中的任意一种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述正向或反向引物具有如SEQ IDNO:7～9所示序列中的一条或多条序列，步骤3)所述反向或正向引物具有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10～11所示序列中的一条或多条序列，其中，序列中的N为A、C、G、T中的任意一种。
8.编码PCR二代测序建库试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含有用权利要求1～7任一项所述建库方法制备的DNA测序文库。
CN201710102701.XA 2017-02-24 2017-02-24 编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法 Active CN108504649B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710102701.XA CN108504649B (zh) 2017-02-24 2017-02-24 编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710102701.XA CN108504649B (zh) 2017-02-24 2017-02-24 编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108504649A CN108504649A (zh) 2018-09-07
CN108504649B true CN108504649B (zh) 2021-03-05

Family

ID=63373651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710102701.XA Active CN108504649B (zh) 2017-02-24 2017-02-24 编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108504649B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110835783B (zh) * 2018-08-17 2023-06-20 深圳华大生命科学研究院 用于长读长高质量测序的核酸文库的构建方法、测序方法及试剂
CN111020005B (zh) * 2019-12-10 2023-06-30 上海臻迪基因科技有限公司 提高下一代测序建库成功率的方法和系统
CN112029862A (zh) * 2020-09-09 2020-12-04 上海宝藤生物医药科技股份有限公司 一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用
CN112322704B (zh) * 2020-12-02 2021-07-20 武汉艾迪晶生物科技有限公司 一种批量快速检测dna序列突变的方法
CN112575388A (zh) * 2020-12-22 2021-03-30 深圳市睿法生物科技有限公司 一种单分子靶标基因建库方法及其试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1789417A (zh) * 2004-12-17 2006-06-21 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种快速分离目标染色体表达序列的方法
WO2011075083A1 (en) * 2009-12-15 2011-06-23 Agency For Science, Technology And Research Processing of amplified dna fragments for sequencing
CN103060924A (zh) * 2011-10-18 2013-04-24 深圳华大基因科技有限公司 微量核酸样本的文库制备方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1789417A (zh) * 2004-12-17 2006-06-21 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种快速分离目标染色体表达序列的方法
WO2011075083A1 (en) * 2009-12-15 2011-06-23 Agency For Science, Technology And Research Processing of amplified dna fragments for sequencing
CN103060924A (zh) * 2011-10-18 2013-04-24 深圳华大基因科技有限公司 微量核酸样本的文库制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108504649A (zh) 2018-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108504649B (zh) 编码pcr二代测序建库方法、试剂盒及检测方法
US20240102101A1 (en) Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
EP3440205B1 (en) Noninvasive diagnostics by sequencing 5-hydroxymethylated cell-free dna
KR102028375B1 (ko) 희귀 돌연변이 및 카피수 변이를 검출하기 위한 시스템 및 방법
AU2016256351B2 (en) Error suppression in sequenced DNA fragments using redundant reads with unique molecular indices (UMIs)
CN111032881B (zh) 核酸的精确和大规模平行定量
CN105658812B (zh) 用序列标签进行大规模生物分子分析
JP6968894B2 (ja) メチル化ｄｎａの多重検出方法
CN114574581A (zh) 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
CN111154754B (zh) 分析dna样品的探针集合和使用所述探针集合的方法
HUE030510T2 (hu) Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
CN105899680A (zh) 核酸探针和检测基因组片段的方法
CN115572760A (zh) 免疫组库正常性评估方法及其应用
CN111073961A (zh) 一种基因稀有突变的高通量检测方法
CN108070658B (zh) 检测msi的非诊断方法
WO2019076018A1 (zh) 一种用于检测目的基因低频突变的扩增子文库的构建方法
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN108359723B (zh) 一种降低深度测序错误的方法
CN111100924B (zh) 一种用于检测fmr1基因cgg重复数的质控品及其应用和含有该质控品的试剂盒
CN108676869B (zh) 一种检测遗传性耳聋基因突变位点的方法及试剂盒
CN106701949B (zh) 一种减少扩增偏倚的基因突变检测方法和试剂
CN107435061B (zh) 突变基因的定量检测方法
CN110546272B (zh) 将衔接子附接至样品核酸的方法
WO2024039272A1 (en) Nucleic acid amplification
CN115044671A (zh) 可用于胃癌her2伴随诊断的基因甲基化标记物或其组合和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20190225

Address after: 201114 1010, room 5, 1358 Heng Nan Road, Minhang District, Shanghai.

Applicant after: Jin Fu Kang Biotechnology (Shanghai) Limited by Share Ltd.

Address before: Room 504, 5th floor, 25 Lane 3399, Kangxin Road, Pudong New District, Shanghai, 201321

Applicant before: SHANGHAI JIZHI BIOLOGY MEDICINE TECHNOLOGY CO.,LTD.

TA01 Transfer of patent application right
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220818

Address after: Room 301, 3rd Floor, Building C, Innovation Medical Industrial Park, No. 1130, Yanbei West Road, Wuyuan Street, Haiyan County, Jiaxing City, Zhejiang Province 314399

Patentee after: Jiaxing Jinfukang Medical Laboratory Co., Ltd.

Address before: 201114 1010, room 5, 1358 Heng Nan Road, Minhang District, Shanghai.

Patentee before: Jin Fu Kang Biotechnology (Shanghai) Limited by Share Ltd.

TR01 Transfer of patent right