CN112029862A - 一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用 - Google Patents

一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用，所述试剂盒包括结直肠癌分子标志物的引物组合物，所述引物组合物包括AKT1基因的引物对、BRAF基因的引物对、KRAS基因的引物对、NRAS基因的引物对、PIK3CA基因的引物对、PTEN基因的引物对和SMAD4基因的引物对，文库构建方法基于多重PCR，针对结直肠癌患者进行特定肿瘤细胞定位后，实现了无需核酸抽提而直接进行扩增的技术效果。

Description

一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂 盒、方法及其应用
技术领域
本发明属于高通量测序技术领域，涉及一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是人类高发恶性肿瘤，结肠癌的发生与饮食、环境和遗传等因素密切相关，是多种癌基因协同作用的结果。结直肠癌的形态大体分为三种：息肉样型、狭窄型和溃疡型，各型癌肿的好发部位和临床表现也不相同。息肉样型大肠癌好发于盲肠和升结肠等右半结肠，癌体较大，外形似菜花样，向肠腔突出，表面容易溃烂、出血、坏死。狭窄型大肠癌好发于直肠、乙状结肠和降结肠等左半结肠，癌体不大，但质地硬，常围绕肠壁浸润而导致肠腔呈环型狭窄，容易引起肠梗阻。溃疡型大肠癌好发于左半结肠，癌体较小，早期形成凹陷性溃疡，容易引起出血、穿透肠壁侵入邻近器官和组织。
目前，结直肠癌的诊断和治疗主要依据病理活检报告。活检诊断为浸润性癌的病例接受规范性结直肠癌治疗。然而由于活检取材的限制，活检病理不能确定是否发生黏膜下浸润，诊断为高级别上皮内瘤变的病例，临床医师需要综合其他临床信息确定治疗方案。低位直肠肿瘤涉及是否保肛决策时，需要确认活检组织有无达到“癌变”程度，目前主要通过检测肿瘤组织K-ras及N-ras基因、BRAF基因、错配修复蛋白表达或微卫星状态及其他相关基因状态确定是否发生复发或转移性结直肠癌。但是直肠癌很容易误诊，据有关资料统计，直肠癌的误诊率为30％，主要是对30岁以下的直肠癌病人警惕性不够，仅限于部分检查结果，或检查到“痔”就不再作进一步检查，对直肠内发生的癌前病变，如息肉、溃疡等未能及时治疗，而发展成癌症。直肠指诊初步诊断是早期发现直肠癌最重要的方法，80％以上的直肠癌可以在直肠指诊时触及。
目前，肠癌的根治性治疗方法首推外科手术，但是大肠癌的手术治愈率、5年生存率始终徘徊在50％左右，治疗失败的主要原因在于局部复发率较高，因此有必要采用综合治疗方法提高大肠癌的治疗效果。目前研究较多、效果较好的是外科和放射综合疗法，包括术前放射、术中放射、术后放射、“三明治”放疗等，各种不同的综合治疗方法有不同的特点。对于晚期直肠癌患者，尤其是局部肿瘤浸润到附近组织(直肠旁、直肠前组织、腹腔淋巴结、膀胱、尿道、耻骨支)以及有外科禁忌证的患者，主要采用姑息性放射法。对于不适合放化疗的患者，主要在多学科讨论下决定是否进行单纯的新辅助化疗。
近年来，分子靶向治疗逐渐受到人们的关注并广泛应用于临床。分子靶向治疗是针对已经明确的致癌基因使用药物，特异地杀死肿瘤细胞，该方法副作用小、特异性高，为直肠癌患者提供了新的治疗手段。在临床上选择适宜的靶向药物前，需要对肿瘤进行分子靶点检测，例如KRAS突变会影响西妥昔单抗和帕尼单抗的药物疗效，西妥昔单抗或帕尼单抗联合化疗对野生型KRAS基因结直肠癌的有效率为41％～61％，而对KRAS基因突变结直肠癌的有效率为零。检测KRAS基因型是预测结直肠癌靶向药物疗效的有效手段。除此之外，其他基因发生突变也会导致结直肠癌靶向治疗药物出现耐药。合适的用药是肿瘤治疗的重要环节，目前的抗肿瘤药物对70％以上的患者疗效有限，据美国癌症协会估计，90％以上的患者死于不同程度的肿瘤细胞耐药性。美国《NCCN指南》以及《中国结直肠癌诊疗规范》规定：在结直肠癌治疗前必须明确RAS基因状态，并且在确定为复发或转移性结直肠癌时，推荐进行KRAS、NRAS、BRAF基因检测。西妥昔单抗、帕尼单抗等EGFR单抗类药物的使用，与RAS及RAF等基因状态密切相关，基因检测对结直肠癌的指导用药非常关键。约1/4的结直肠癌具有家族聚集倾向，遗传性结直肠癌中研究较多的有遗传性非息肉病性结直肠癌(Lynch综合征)和家族性腺瘤性息肉病(FAP)。Lynch综合征是一种常染色体显性遗传病，其发生的主要分子基础是DNA错配修复系统(MMR)基因突变，从而导致大范围微卫星不稳定。FAP也是一种常染色体显性遗传病，以青少年发病为主要特征，APC基因突变与之密切相关。对于具有家族遗传倾向的结直肠癌高风险人群，《NCCN指南》推荐进行多基因检测，筛查遗传易感基因，从而预防或指导治疗。
高通量测序技术是一项国际先进的新型测序技术，通过多基因、多位点的集成式检测，可一次性检测与肿瘤靶向治疗密切相关的基因位点。该技术对核酸样本要求不高，是应用于肿瘤基因检测的一个很好的选择。此外，肿瘤是基因组疾病，单一基因的检测结果不能准确指导个体化治疗。以高通量测序和大数据分析为基础，对结直肠癌患者进行多基因突变检测，能够精确地提供基因突变信息，从而指导医生制定个性化靶向治疗方案。同时，也可用于结直肠癌病人的早期诊断和筛查，最大化患者获益的可能性。传统治疗模式下，每种方案或药物只对25％～35％的结直肠癌患者有效，结直肠癌整体治疗效果不佳。而且RAS、BRAF基因的状态与西妥昔单抗、帕尼单抗等药物的使用密切相关，因此，需要根据结直肠癌相关基因的状态来制定个体化的治疗方案，实现个体化的精准用药。
目前，市场上针对结直肠癌靶向用药的基因检测主要停留在几个位点的检测水平，检测方法一般使用荧光定量PCR、一代测序、ddPCR等方法，但都存在一定的缺陷，例如假阳性、假阴性多，检测基因位点少，用药指导信息不全等，而现有的一些基于高通量测序技术检测结直肠癌的方法，存在对样品的要求较高，目的性不强，操作繁琐，检测费用高等缺点，因此急需一种新的检测方法以满足市场和医疗的需求。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用，不仅实现了对肿瘤细胞的富集，而且实现了不经核酸提取步骤直接对肿瘤细胞进行PCR检测，简化了实验流程。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种结直肠癌分子标志物的引物组合物，所述引物组合物包括AKT1基因的引物对、BRAF基因的引物对、KRAS基因的引物对、NRAS基因的引物对、PIK3CA基因的引物对、PTEN基因的引物对和SMAD4基因的引物对。
本发明中，针对结直肠癌相关的7个分子标志物AKT1、BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4的1820个突变位点，进行引物设计，共设计42对引物。
优选地，所述引物对的上游引物从5’到3’包括第一通用序列、随机标签序列和特异上游引物序列；
所述引物对的下游引物从5’到3’包括第二通用序列和特异下游引物序列。
本发明中，上游引物的第一通用序列和下游引物的第二通用序列为测序接头，随机标签序列用于标记样本，有利于追踪样本每一条模板DNA的信息，区分真实突变和PCR扩增引入的突变或测序仪器本身的错误，提高检测的准确性，而特异上游引物和特异下游引物根据结直肠癌分子标志物的检测位点进行设计。
优选地，所述随机标签序列的长度为5～10nt，例如可以是5nt、6nt、7nt、8nt、9nt或10nt。
优选地，所述引物组合物包括SEQ ID NO:1～84所示的核酸序列；
SEQ ID NO:1：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNCTGGTCTTGGCTGAGGTTTC；
SEQ ID NO:2：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGTGATTTGCCAACAAGGACA；
SEQ ID NO:3：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNGATGGCAAATACACAGAGGAA；
SEQ ID NO:4：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACATACTGGATACAGCTGG；
SEQ ID NO:5：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNGACATACTGGATACAGCTGG；
SEQ ID NO:6：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTTTGTAGATGAATATGAT；
SEQ ID NO:7：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNGGTTCTGGATTAGCTGGA；
SEQ ID NO:8：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGAGCAGGTGGTGTTGGGAA；
SEQ ID NO:9：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTTACTACCAAATGGAATGA；
SEQ ID NO:10：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGCTTCTTTAAATAGTTCATGC；
SEQ ID NO:11：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTTACTACCAAATGGAATGATA；
SEQ ID NO:12：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGATCTTTTCTTCACGGTTG；
SEQ ID NO:13：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTCATGCTGTGTATGTAATA；
SEQ ID NO:14：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCATGCCGATAGCAAAACCTT；
SEQ ID NO:15：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNATGAATGGAGAAACATCTAC；
SEQ ID NO:16：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGAGTGCACTATTTATAACCC；
SEQ ID NO:17：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNAATAAAAATTCTTTGTGCA；
SEQ ID NO:18：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGATCAATGTCTCGAATATTTA；
SEQ ID NO:19：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNGCTCGACTTTGCCTTTCCAT；
SEQ ID NO:20：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTTTAAAGGTAAACATAAT；
SEQ ID NO:21：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTTTTAAAGGTAAACATAAT；
SEQ ID NO:22：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCAATGGACAGTGTTCCTT；
SEQ ID NO:23：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNATCTTTGGCCAGTACCTCA；
SEQ ID NO:24：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTGATCCAGTAACACCA；
SEQ ID NO:25：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNATCCTCTCTCTGAAATCACT；
SEQ ID NO:26：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTTCTGTAATAAAGAAAAAGA；
SEQ ID NO:27：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNCCTGCTTTTGGAGTCCTATT；
SEQ ID NO:28：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTTGCCTATTCAGGTGCT；
SEQ ID NO:29：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNACCTGTTTACACGTTCATGT；
SEQ ID NO:30：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCTTTCACCATGATGTTA；
SEQ ID NO:31：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTGATGACATTGCATACA；
SEQ ID NO:32：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGCCACCATGATGTGCAT；
SEQ ID NO:33：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTGATGACATTGCATACA；
SEQ ID NO:34：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGCAATCGGTCTTTGCCTGC；
SEQ ID NO:35：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNGACCCACTCCATCGAGATTT；
SEQ ID NO:36：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGT；
SEQ ID NO:37：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTCTTCATGAAGAAATATAT；
SEQ ID NO:38：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGATCTACTGTTTTCCTTTA；
SEQ ID NO:39：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTCCAAATGATCCAGATCC；
SEQ ID NO:40：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCTGATGGGCAGATTACA；
SEQ ID NO:41：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNAATCATCACTCGAGTCCCGT；
SEQ ID NO:42：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTACTGTTTTTATCAAG；
SEQ ID NO:43：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTGTTGCAGCAATTCACTG；
SEQ ID NO:44：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGCCTTTAAAAATTTGCCCCG；
SEQ ID NO:45：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTCCCAGTCAGAGGCGCTATG；
SEQ ID NO:46：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCAAACATCATCTTGTGAAA；
SEQ ID NO:47：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNACCCACACGACGGGAAGA；
SEQ ID NO:48：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACGGCTGAGGGAACTCAAAG；
SEQ ID NO:49：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTGATATCAAAGTAGAGTTCT；
SEQ ID NO:50：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCTTTTTTAGCATCTTGTTC；
SEQ ID NO:51：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNAATATCTAGTACTTACTTTAA；
SEQ ID NO:52：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAACTGACCTTAAAATTTGGA；
SEQ ID NO:53：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTTGCTGATGTTTCAATA；
SEQ ID NO:54：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGGACTTAGCAAGAAGTTAT；
SEQ ID NO:55：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNCCTGTTTTGTGTCTACTGT；
SEQ ID NO:56：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGTAGGAAATAAATGTGAT；
SEQ ID NO:57：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTGCACTGTACTCCTCTTGACC；
SEQ ID NO:58：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCAGGATTCCTACAGGAA；
SEQ ID NO:59：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNAAAATGATTCTGAATTAGCT；
SEQ ID NO:60：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTGAATATAAACTTGTGGTA；
SEQ ID NO:61：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNCCATCATTCTTGAGGAGGAAG；
SEQ ID NO:62：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCGTGGCTCTCACCACCCG；
SEQ ID NO:63：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTAAAACATGTTAAATATTGTC；
SEQ ID NO:64：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTGATACAACTCGTTCGTA；
SEQ ID NO:65：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTTAAGATCTCTCAGGATTAA；
SEQ ID NO:66：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTCAACAAAAAAACAGAGA；
SEQ ID NO:67：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGNNNNNNNNGGACAGCCATCGTTGTC；
SEQ ID NO:68：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCTGGGGTGCTGTATGTCTCT；
SEQ ID NO:69：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGNNNNNNNNGGCCTCAGCCAGGACAGC；
SEQ ID NO:70：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGTAGCTGGCTGACCAGTAAA；
SEQ ID NO:71：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNACCATCATAGTATGTACATAC；
SEQ ID NO:72：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTTCTCAACTATTTAAAA；
SEQ ID NO:73：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNACCATCATAGTATGTACA；
SEQ ID NO:74：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGTTTCAATCACCACTAAAT；
SEQ ID NO:75：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNACTTTGAAATGGATGTTCA；
SEQ ID NO:76：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCGATCTCCTCCAGAAGGGT；
SEQ ID NO:77：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNCAAAGGTGTGCAGTTGGAAT；
SEQ ID NO:78：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGCACCTGACCCAAACATCACCT；
SEQ ID NO:79：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNTGACCACGCGGTCTTTGTACA；
SEQ ID NO:80：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCACGCCCAGCTTCTCTGTCT；
SEQ ID NO:81：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNGTGTCATCGACAGATGCAGCA；
SEQ ID NO:82：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCTGGGCCAGGGATGTTTCCT；
SEQ ID NO:83：
GGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGNNNNNNNNAAAGGCTGGGGACCGGATT；
SEQ ID NO:84：
GTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCGTCTAGGAGCTGGAGGGCC。
本发明中，通过分析结直肠癌分子标志物的检测位点，指导引物组合物的设计，通过对引物序列进行优化，使得引物组合物稳定存在于同一反应体系中，扩增效率一致，且可以避免引物间的交叉影响，采用SEQ ID NO:1～84所示的引物组合物扩增获得的扩增子的长度均一化为80～100bp，较现有多重PCR方法获得的扩增子短，有利于实现PE75/PE150测序模式上机。
第二方面，本发明提供了一种文库构建试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组合物。
优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶，例如可以是兼容粗样本(如石蜡细胞/悬浮细胞/血液细胞/组织裂解液细胞)扩增的热启动酶，优选为Ultra HIFI DNA聚合酶。
本发明中，通过对现有的DNA聚合酶进行筛选，得到的DNA聚合酶可以直接对肿瘤细胞进行目标基因的扩增，显著简化了实验流程。
优选地，所述试剂盒还包括尿嘧啶DNA糖基酶(UDG酶)、核酸外切酶I(exonucleaseI)、PCR缓冲液、测序接头引物或纯化磁珠中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，尿嘧啶DNA糖基酶(UDG酶)水解含dUTP的DNA链，用于防止PCR扩增污染，核酸外切酶I(exonuclease I)用于消化PCR产物中未反应的引物。
第三方面，本发明提供了一种文库构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对切片样本进行HE染色，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；
(2)将获取的肿瘤细胞采用第一方面所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR，磁珠纯化后得到添加有测序接头的PCR产物；
(3)采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR，磁珠纯化后得到测序文库。
优选地，步骤(1)所述划线法包括在切片上划至少两组交叉的平行线，将切片划分为多个区域，收集区域内的肿瘤细胞的步骤。
本发明中，当切片样本的病理鉴定结果肿瘤细胞的比例在20％以上，采用划线法收集肿瘤细胞，具体为显微镜下观察定位肿瘤细胞，使用移液枪针对定位到的肿瘤细胞，采用划线法将尽可能多的肿瘤细胞收集到1.5mL EP管中，示意图如图1A所示。
优选地，步骤(1)所述激光捕获显微切割法包括激光切割肿瘤细胞，去除与肿瘤细胞黏连的间质细胞的步骤。
本发明中，当切片样本的病理鉴定结果肿瘤细胞的比例小于20％，采用激光捕获显微切割法收集肿瘤细胞，示意图如图1B所示。
优选地，步骤(2)所述第一轮线性PCR的条件包括92～98℃预变性5～15s；92～98℃变性5～15s、55～65℃退火5～15min，10～20个循环。
优选地，步骤(2)所述第二轮指数PCR的条件包括92～98℃预变性10～20min；92～98℃变性0.5～2min，58～64℃梯度退火0.5～2min，70～75℃延伸0.5～2min，3～6个循环；92～98℃变性20～40s，65～70℃退火1～5min，10～20个循环。
本发明中，对肿瘤细胞样本首先进行第一轮线性PCR，对肿瘤细胞来源的模板进行初步扩增并添加随机标签序列，再进行第二轮指数PCR，实现对样本的富集，有利于减少PCR扩增引入的突变或测序仪器本身的错误，提高检测的准确性。
优选地，步骤(2)所述第二轮指数PCR进行预变性之前还包括35～40℃孵育5～15min的步骤，用于活化UDG酶。
优选地，步骤(3)所述第三轮PCR的条件包括92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性20～40s，65～70℃退火20～40s，70～75℃延伸0.5～2min，3～6个循环；70～75℃延伸3～5min。
优选地，所述方法在步骤(2)所述第二轮指数PCR之后还包括对PCR产物进行核酸外切酶I处理的步骤。
优选地，所述核酸外切酶I处理的条件为35～40℃孵育10～30min，75～90℃孵育5～15min。
作为优选技术方案，本发明提供了一种文库构建方法，流程图如图2所示，所述方法包括以下步骤：
(1)对切片样本进行HE染色，病理鉴定确定肿瘤细胞比例，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；
(2)将获取的肿瘤细胞采用第一方面所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR，对PCR扩增产物进行引物消化和磁珠纯化，得到添加有测序接头的PCR产物；
(3)采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR，磁珠纯化后得到测序文库。
第四方面，本发明提供了一种文库构建装置，所述装置包括：
肿瘤细胞获取单元，包括HE染色模块和肿瘤细胞获取模块，用于对切片样本进行HE染色，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；
PCR扩增单元：包括第一轮线性PCR模块和第二轮指数PCR模块，用于对获取的肿瘤细胞采用第一方面所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR；
文库获取单元：用于采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR。
第五方面，本发明提供了一种第一方面所述的引物组合物、第二方面所述的试剂盒或第四方面所述的装置在制备结直肠癌分子标志物检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明针对结直肠癌相关的7个分子标志物AKT1、BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4的1820个突变位点，进行引物设计，共设计42对引物，引物组合物扩增获得的扩增子的长度均一化为80～100bp，较现有多重PCR方法获得的扩增子短，有利于实现PE75/PE150测序模式上机；
(2)本发明的文库构建试剂盒通过对现有的DNA聚合酶进行筛选，得到的DNA聚合酶可以直接对肿瘤细胞进行目标基因的扩增，显著简化了实验流程，尿嘧啶DNA糖基酶和核酸外切酶I的使用则避免了非特异性扩增产物或引物对PCR产物的污染，提高了目的PCR产物的纯度；
(3)本发明的文库构建方法对肿瘤细胞样本的扩增分两轮进行，实现对样本的富集，有利于减少PCR扩增引入的突变或测序仪器本身的错误，提高检测的准确性；
(4)本发明的引物组合物、试剂盒及方法在结直肠癌诊断和/或治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1A为当切片样本的病理鉴定结果肿瘤细胞的比例在20％以上，采用划线法收集肿瘤细胞，图1B为当切片样本的病理鉴定结果肿瘤细胞的比例小于20％，采用激光捕获显微切割法收集肿瘤细胞；
图2为流程示意图；
图3为切片样本的HE染色图；
图4为样本6(sample 6)的PCR产物和样本7(sample 7)进行核酸外切酶I消化后的PCR产物的分析结果图；
图5为BT2003060116LNCTX TTCamp文库质控分析结果图；
图6为BT2003060116LNCTS TTCamp-seq无核酸抽提突变位点结果图；
图7为BT2003060116LNCTS抽提DNA Target panel突变位点结果图；
图8为ddPCR验证KRAS G12C定性突变二维图；
图9为ddPCR验证KRAS G12C定量突变率为25.9％。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例首先对结直肠癌切片样本进行HE染色，步骤如下：
(1)向切片中加入一次二甲苯，振荡处理5min；
(2)去除二甲苯后，重使用二甲苯脱蜡一次，处理5min，保证样本脱蜡完全；
(3)洗涤表面的二甲苯，依次采用95％乙醇、95％乙醇和80％乙醇处理样本1min；
(4)清水洗涤2min后尽量甩干或擦掉水分；
(5)加入苏木素染液，孵育5min，随后用清水冲洗，显微镜下观察；
(6)加入1％盐酸酒精溶液，分化处理3～5s，随后立即用清水冲洗，显微镜下观察；
(7)加入0.5％伊红水溶液，孵育1min，随后用清水冲洗并尽量甩干或擦掉水分，显微镜下观察；
(8)依次采用80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇和95％乙醇处理样本10s，随后用无水乙醇处理样本2min，重复一次；
(9)加入二甲苯，处理样本2min，重复一次，风干5～30s；
(10)中性树脂封片后置于37℃烘箱中烘干，得到HE染色切片。
HE染色结果图如图3所示，肿瘤细胞的比例约19％。
本实施例进一步采用激光捕获显微切割方法从HE染色切片中获取肿瘤细胞，步骤如下：
(11)将切片固定于倒置显微镜的载物台中，调节显微镜，定位目标区域；
(12)显微切割定位的肿瘤细胞，去除周围的间质细胞，将获得的肿瘤细胞收集至1.5mL离心管中。
实施例2
(1)本实施例将实施例1获得的肿瘤细胞直接作为样本进行第一轮线性PCR，对肿瘤细胞来源的模板进行初步扩增并添加随机标签序列，体系如表1所示，程序如表2所示。
表1
Figure BDA0002674342360000081
表2
Figure BDA0002674342360000082
(2)将获得的第一轮线性PCR产物进行磁珠纯化，步骤如下：
从4℃冰箱取出AMPure磁珠，涡旋混匀，室温放置30min，随后加入20μL无酶水，将体系补齐至50μL；
向第一轮线性PCR产物中加入60μL(1.2倍)AMPure磁珠，吹打混匀约10次，室温孵育5min，随后将离心管置于磁力架上，待液体澄清，吸弃上清液(避免吸到磁珠)；
加入150μL新鲜配置的70％乙醇清洗磁珠，孵育30s，小心吸弃乙醇溶液(避免碰到磁珠)，重复一次，吸弃残留乙醇；
将离心管置于磁力架上，室温晾干2～5min；
加入64μL无酶水重选磁珠，吹打混匀约10次，室温孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，上清液中含有纯化的第一轮线性PCR产物。
(3)对纯化的第一轮线性PCR产物进行第二轮指数PCR，体系如表3所示，程序如表4所示。
表3
Figure BDA0002674342360000091
表4
Figure BDA0002674342360000092
(4)向扩增产物中加入5μL稀释的核酸外切酶I(exonuclease I)，吹打混匀，置于PCR仪上孵育，去除扩增产物中的未消化引物，程序如表5所示，结果如图4所示，可以看出，经核酸外切酶I消化后，7号样本(sample 7)中的引物被去除。
表5
Figure BDA0002674342360000093
Figure BDA0002674342360000101
(5)将获得的产物进行磁珠纯化，步骤如下：
从4℃冰箱取出AMPure磁珠，涡旋混匀，室温放置30min，随后加入20μL无酶水，将体系补齐至50μL；
向样本中加入60μL(1.2倍)AMPure磁珠，吹打混匀约10次，室温孵育5min，随后将装有样本的离心管置于磁力架上，待液体澄清，吸弃上清液(避免吸到磁珠)；
加入150μL新鲜配置的70％乙醇清洗磁珠，孵育30s，小心吸弃乙醇溶液(避免碰到磁珠)，重复一次，吸弃残留乙醇；
将装有样本的PCR管置于磁力架上，室温晾干2～5min；
加入64μL无酶水重选磁珠，吹打混匀约10次，室温孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，上清液中含有纯化的PCR产物。
实施例3
(1)本实施例对实施例2获得的纯化的PCR产物采用接头引物进行扩增，体系如表6所示，程序如表7所示，得到添加有测序接头的文库。
表6
试剂 体积(μL)
PCR缓冲液(2×Indexing PCR Master Mix) 25
接头A700TruSeq Amplicon Index(Illumina#FC-130-1003) 4
接头A500TruSeq Amplicon Index(Illumina#FC-130-1003) 4
无酶水 11
实施例2的纯化的PCR产物 6
总量 50
表7
Figure BDA0002674342360000102
(2)将获得的文库进行磁珠纯化，步骤如下：
向PCR管中加入50μL AMPure磁珠，吹打混匀约10次，室温孵育5min，随后将装有样本的离心管置于磁力架上，待液体澄清，吸弃上清液(避免吸到磁珠)；
加入150μL新鲜配置的70％乙醇清洗磁珠，孵育30s，小心吸弃乙醇溶液(避免碰到磁珠)，重复一次，吸弃残留乙醇；
将装有样本的PCR管置于磁力架上，室温晾干2～5min；
加入32μL无酶水重选磁珠，吹打混匀约10次，室温孵育5min，置于磁力架上至液体澄清，上清液中含有纯化的文库。
(3)纯化的文库采用Qubit测定浓度，文库的浓度≥0.5ng/μL，Agilent 2100片段大小分析约130～150bp。
(4)对纯化的文库在illumina Nextseq500测序仪上进行测序，PE75模式上机。
(5)对测序结果进行质控分析和突变分析，质控结果如图5所示。
突变检测结果如表8和图6、图7、图8和图9所示，可以看出，本发明的方法在检测KRAS突变时较抽提DNA方法和ddPCR法均具有更高的检出率，在检测PIK3CA突变和SMAD4突变时与抽提DNA方法的检出率相当，然而PIK3CA突变和SMAD4突变不能被ddPCR检出。
表8
Figure BDA0002674342360000111
综上所述，本发明的试剂盒直接对肿瘤细胞进行目标基因的扩增，显著简化了实验流程，文库构建方法对肿瘤细胞样本的扩增分两轮进行，实现对样本的富集，有利于减少PCR扩增引入的突变或测序仪器本身的错误，提高检测的准确性，在结直肠癌诊断和/或治疗领域具有重要意义。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 上海宝藤生物医药科技股份有限公司；上海宝藤医学检验所有限公司；上海张江医学创新研究院
<120> 一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用
<130> 20200811
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
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ggcagcgtca gatgtgtata agagacagnn nnnnnntgat atcaaagtag agttct 56
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ggcagcgtca gatgtgtata agagacagnn nnnnnngtgt catcgacaga tgcagca 57
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Claims (10)

1.一种结直肠癌分子标志物的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括AKT1基因的引物对、BRAF基因的引物对、KRAS基因的引物对、NRAS基因的引物对、PIK3CA基因的引物对、PTEN基因的引物对和SMAD4基因的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物对的上游引物从5’到3’包括第一通用序列、随机标签序列和特异上游引物序列；
所述引物对的下游引物从5’到3’包括第二通用序列和特异下游引物序列；
优选地，所述随机标签序列的长度为5～10nt；
优选地，所述引物组合物包括SEQ ID NO:1～84所示的核酸序列。
3.一种文库构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组合物；
优选地，所述试剂盒还包括Ultra HIFIDNA聚合酶；
优选地，所述试剂盒还包括尿嘧啶DNA糖基酶、核酸外切酶I、PCR缓冲液、测序接头引物或纯化磁珠中的任意一种或至少两种的组合。
4.一种文库构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对切片样本进行HE染色，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；
(2)将获取的肿瘤细胞采用权利要求1或2所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR，磁珠纯化后得到添加有测序接头的PCR产物；
(3)采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR，磁珠纯化后得到测序文库。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述划线法包括在切片上划至少两组交叉的平行线，将切片划分为多个区域，收集区域内的肿瘤细胞的步骤；
优选地，步骤(1)所述激光捕获显微切割法包括激光切割肿瘤细胞，去除与肿瘤细胞黏连的间质细胞的步骤。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述第一轮线性PCR的条件包括92～98℃预变性5～15s；92～98℃变性5～15s、55～65℃退火5～15min，10～20个循环；
优选地，步骤(2)所述第二轮指数PCR的条件包括92～98℃预变性10～20min；92～98℃变性0.5～2min，58～64℃梯度退火0.5～2min，70～75℃延伸0.5～2min，3～6个循环；92～98℃变性20～40s，65～70℃退火1～5min，10～20个循环；
优选地，步骤(2)所述第二轮指数PCR进行预变性之前还包括35～40℃孵育5～15min的步骤。
7.根据权利要求4-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述第三轮PCR的条件包括92～98℃预变性1～5min；92～98℃变性20～40s，65～70℃退火20～40s，70～75℃延伸0.5～2min，3～6个循环；70～75℃延伸3～5min。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤(2)所述第二轮指数PCR之后还包括对PCR产物进行核酸外切酶I处理的步骤；
优选地，所述核酸外切酶I处理的条件为35～40℃孵育10～30min，75～90℃孵育5～15min。
9.一种文库构建装置，其特征在于，所述装置包括：
肿瘤细胞获取单元，包括HE染色模块和肿瘤细胞获取模块，用于对切片样本进行HE染色，根据肿瘤细胞比例利用划线法或激光捕获显微切割法获取肿瘤细胞；
PCR扩增单元：包括第一轮线性PCR模块和第二轮指数PCR模块，用于对获取的肿瘤细胞采用权利要求1或2所述的引物组合物进行第一轮线性PCR和第二轮指数PCR；
文库获取单元：用于采用测序接头引物对添加有测序接头的PCR产物进行第三轮PCR。
10.一种权利要求1或2所述的引物组合物、权利要求3所述的试剂盒或权利要求9所述的装置在制备结直肠癌分子标志物检测试剂中的应用。
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