CN116287267B - 一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用 - Google Patents

一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116287267B
CN116287267B CN202310249166.6A CN202310249166A CN116287267B CN 116287267 B CN116287267 B CN 116287267B CN 202310249166 A CN202310249166 A CN 202310249166A CN 116287267 B CN116287267 B CN 116287267B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nxn
ovarian cancer
grade serous
serous ovarian
tissue
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310249166.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116287267A (zh
Inventor
许君芬
任妍
吕卫国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202310249166.6A priority Critical patent/CN116287267B/zh
Publication of CN116287267A publication Critical patent/CN116287267A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116287267B publication Critical patent/CN116287267B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种分子标志物NXNcircle725435‑725781及其应用，NXNcircle725435‑725781为一种染色体外的环状DNA(chr17circle725435‑725781)，其序列包含在基因NXN的外显子部分。本发明发现与正常卵巢组织和正常输卵管组织相比，高级别浆液性卵巢癌组织中NXNcircle725435‑725781的表达水平明显增高，并证实了NXNcircle725435‑725781表达水平可有效预测诊断高级别浆液性卵巢癌。另外本发明发现NXNcircle725435‑725781的表达水平与高级别浆液性卵巢癌患者的预后相关，以及其在不同FIGO分期的患者之间具有显著差异。本发明的检测方法敏感性高，特异性强，有利于解决早期卵巢癌易漏诊的问题，另外通过检测本发明NXNcircle725435‑725781的表达水平可以用于协助诊断及评估高级别浆液性卵巢癌患者的预后，从而对疾病进行更好的后续管理与治疗，在临床上有巨大的应用价值。

Description

一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用
技术领域
本发明属于诊断与治疗领域，尤其涉及一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用。
背景技术
卵巢癌的致死率居妇科恶性肿瘤之首，以上皮性卵巢肿瘤为最常见的组织类型。其中，高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)是上皮性卵巢癌中最常见和最致命的亚型，占卵巢癌死亡的近70％。早期HGSOC患者的5年生存率可达90％，而晚期伴有广泛转移性的患者5年生存率仅为30％。由于卵巢位于盆腔深部，卵巢癌早期缺乏特异性症状，隐匿性极强，发现时多为晚期，易产生耐药且具有高复发风险，预后差。数据显示大多数浆液性癌在III期(51％)或IV期(29％)确诊，患者5年特异性生存期分别为42％和26％。如果肿瘤在早期诊断时仍局限于单个卵巢，即FIGO分期I期，5年生存率超过80％。因此，为了提高高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)的诊断水平和改善高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)患者的生活质量，寻找早期诊断和不良预后预测的生物标志物与有效的治疗靶点和干预措施显得格外重要，成为研究者迫切需要探索的重心。
染色体外环状DNA(eccDNAs)是位于染色体外的一组新的环状DNA，在DNA损伤修复、色裂病和其他DNA代谢过程中产生。eccDNAs在半个多世纪前首次被发现，并与基因组的不稳定性有关，随着技术发展，越来越多的研究表明eccDNAs存在于大多数组织中，并可以促进肿瘤异质性及其进展,与多种癌症的致癌基因扩增和不良预后等相关。但到目前为止，eccDNAs在癌症中的作用和机制仍然没有清楚的阐述。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种分子标志物NXNcircle725435-725781，为一种染色体外环状DNA，序列如SEQ IDNO.1所示。
一种检测所述的分子标志物NXNcircle725435-725781的物质的应用，包括下列应用之一：
(1)在制备用于高级别浆液性卵巢癌诊断的产品中的应用；
(2)在制备用于高级别浆液性卵巢癌预后评估的产品中的应用。
进一步地，检测的物质为用于检测分子标志物NXNcircle725435-725781表达水平的试剂。
进一步地，所述试剂基于实时定量反转录PCR、荧光原位杂交、芯片或高通量测序进行检测。
进一步地，通过实时定量反转录PCR检测分子标志物NXNcircle725435-725781的表达水平的试剂至少包括一对特异性的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
进一步地，通过荧光原位杂交、芯片或高通量测序检测分子标志物NXNcircle725435 -725781表达水平的试剂包括与NXNcircle725435-725781的核酸序列杂交的特异性探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，检测的分子标志物NXNcircle725435-725781源自输卵管。
本发明的有益效果是：本发明提供高级别浆液性卵巢癌分子标志物NXNcircle725435 -725781在诊断与预后评估中的应用。通过对20例正常卵巢组织，20例正常输卵管组织与20例高级别浆液性卵巢癌组织的qRT-PCR验证NXNcircle725435-725781确在高级别浆液性卵巢癌组织中上调。另外还通过对40例正常卵巢组织，40例正常输卵管组织与80例高级别浆液性卵巢癌组织的荧光原位杂交实验(FISH)验证NXNcircle725435-725781在高级别浆液性卵巢癌组织中上调，且分析了NXNcircle725435-725781表达水平与临床高级别浆液性卵巢癌患者预后的相关性以及NXNcircle725435-725781表达水平与临床高级别卵巢癌患者各病理因素的相关性。以上结果表明NXNcircle725435-725781在高级别浆液性卵巢癌中是一个重要的致癌因子，可作为诊断和预后评估的分子标志物。
附图说明
图1为Sanger测序结果，以验证目标环状分子NXNcircle725435-725781的存在。
图2为来自IOSE-80，CAOV3，HEY三种细胞的基因组DNA和eccDNAs进行qPCR后产物的DNA电泳图(图2.A)，以验证NXNcircle725435-725781的存在及其引物的特异性。图2.B所示为引物序列所在位置的示意图。
图3为利用qPCR检测NXNcircle725435-725781在正常卵巢组织，正常输卵管组织和高级别浆液性卵巢癌组织中的表达差异统计图；
图4为利用荧光原位杂交实验(FISH)检测NXNcircle725435-725781在正常卵巢组织，正常输卵管组织和高级别浆液性卵巢癌组织中的表达差异，其中图4.A所示为NXNcircle725435 -725781在正常卵巢组织，正常输卵管组织和高级别浆液性卵巢癌组织中表达差异的荧光代表图，图4.B和图4.C分别表示NXNcircle725435-725781在正常卵巢组织，正常输卵管组织和高级别浆液性卵巢癌组织中的表达差异统计图。
图5为NXNcircle725435-725781的表达水平预测高级别浆液性卵巢癌的ROC曲线图。
图6为利用荧光原位杂交实验(FISH)检测NXNcircle725435-725781在高级别浆液性卵巢癌组织中低表达水平组和高表达水平组的表达差异，其中图6.A为荧光代表图，图6.B为统计图。
图7为NXNcircle725435-725781低水平表达组和高水平表达组HGSOC患者的Kaplan–Meier生存分析曲线图；
图8为80例高级别浆液性卵巢癌患者中NXNcircle725435-725781表达与临床病理因素的相关性总结；
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明提供一种诊断高级别浆液性卵巢癌的分子标志物，为染色体外环状DNA(Extrachromosomal circles of DNA，eccDNA)NXNcircle725435-725781(chr17circle725435-725781)，其序列如SEQ ID NO.1所示。NXNcircle725435-725781来源包括但不限于组织和存在核酸的体内液体成分，包括血液、腹水等。
本发明还提供一种上述分子标志物NXNcircle725435-725781在制备诊断高级别浆液性卵巢癌试剂盒中的应用。所述试剂盒通过定量检测NXNcircle725435-725781的表达水平来诊断高级别浆液性卵巢癌；试剂盒可以基于实时定量反转录PCR、原位杂交、芯片或高通量测序等。其中，通过实时定量反转录PCR检测NXNcircle725435-725781的表达水平以诊断高级别浆液性卵巢癌的试剂盒，至少包括一对特异性扩增NXNcircle725435-725781的引物，正向引物如SEQ IDNO.2所示，反向引物如SEQ ID NO.3所示；通过原位杂交检测NXNcircle725435-725781表达水平以诊断高级别浆液性卵巢癌的试剂盒，包括与NXNcircle725435-725781的核酸序列杂交的特异性DNA探针如SEQ ID NO.4所示。
实验所用试剂及设备如下表1和表2所示：
表1：所用试剂
表2：所用设备
实施例1Sanger测序验证目的环状分子的存在。
结果如图1所示，基因chr17：725435-725781搜索到相应剪切位点且碱基序列与理论相同，故为目标环状。
实施例2DNA琼脂糖凝胶电泳验证目的环状分子的存在及其引物的特异性。
1.细胞复苏
将存放在-80℃冰箱或液氮中的细胞取出，置于37℃电热水浴锅中摇晃使其迅速融化，随后将细胞悬液吸至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟后，弃上清，再加入1ml新鲜的完全培养基，轻轻吹打，混匀后吸至培养瓶中，再根据培养瓶的大小加入相应足够的培养基的量，在瓶中混合均匀后，平置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中，次日换液。
2.常规细胞培养
人正常卵巢细胞株IOSE-80培养在含10％FBS的RPMI-1640培养液中，人卵巢癌细胞株CAOV3和HEY培养在含10％FBS的DMEM培养液中，置于5％ CO2、37℃细胞培养箱中常规培养，每2-3天换液一次，每当细胞融合度达到90％时候传代，并取对数生长期细胞用于后续实验。
3.基因组DNA的提取
根据基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit,TIANGEN BIOTECH)提取基因组DNA，方案如下：
(1)在装有组织/细胞的EP管(无核酸酶)中加入200μl GA溶液和20μl蛋白酶K，在56℃的摇床振荡裂解；
(2)裂解完全后，在(1)中加入200μl GB溶液，70℃水浴，10min。
(3)在(2)中加入200μl 100％乙醇，混匀15s。
(4)将CB3放入2ml EP管，将(3)中混合物加入CB3，12000rpm离心30s，弃去液体。
(5)在CB3中加入500μlGD，12000rpm离心30s，弃去液体。
(6)在CB3中加入600μlPW，12000rpm离心30s，弃去液体。
(7)重复(6)中操作。
(8)12000rpm离心2min。
(9)将CB3放入新的1.5mlEP管(无核酸酶)，加入50～200μl TE缓冲液，室温孵育2～5min。
(10)12000rpm离心2min，保存。
4.eccDNA的提取
根据eccDNA提取试剂盒(Plasmid Mini AX,A&A BIOTECHNOLOGY)提取eccDNA，方案如下：
1)先在组织/细胞中加入600μlL1重悬液后转入2mlEP管中(无核酸酶)。
若样品为细胞则忽略第(2)步。
2)再向(1)中加入15μl蛋白酶K，在50℃，700rpm摇床上振荡过夜。
3)在(2)中加入600μlL2，轻轻倒置5-6次，室温孵育3min(溶液完全透明和均匀为完全裂解，若未透明，则继续室温孵育3min)。
4)在(3)中加入600μl L3T中和，轻轻混合，至颜色变黄后，10000-15000RPM离心5min。
5)将试剂盒中Plasmid 20Column与tube组合，加入1mlK1平衡液至液体全部通过Column。
6)将(4)中上清置于(5)中的Column，直至液体全部通过Column。
7)在(6)中加入4mlK2P洗涤液，直至液体全部通过。
8)在(7)中加入300μlK3洗脱液，直至液体全部通过。
9)将Plasmid 20Column转移至新的2ml precipitation tube，然后加入1ml K3洗脱液，直至液体全部通过。
10)移除Plasmid 20Column，在2ml precipitation tube中加入800μl PM液(PM液使用前需要振荡均匀)，轻轻混匀，离心10000RPM 10min。
11)小心弃去(10)中的上清，加入500μl 70％乙醇，颠倒几次，然后10000RPM离心5min。淡蓝色DNA沉淀可见于管底。
12)小心弃去(11)中的上清，室温下空气干燥5min。
13)干燥DNA沉淀(淡蓝色)溶于50～150μl TE溶液或者无菌水。
5.eccDNA的纯化
(1)消化线粒体环状DNA：用FastDigest Units MssI(Thermo Scientific)处理已提取的DNA样品，在37℃恒温箱中孵育16h，消化完成后灭活内切酶(65℃，10min)。
(2)消化线性DNA：用特异性外切酶(Plasmid-Safe ATP-dependent DNase,Epicentre)处理(1)中样品,其酶切反应在37℃持续一周(144h)，每24h添加相应ATP和Dnase，消化完成后灭活外切酶(70℃，30min)。
(3)将(2)中样品进行24h冻干。
(4)将(3)中样品作为phi29聚合酶反应(REPLI-g Midi Kit)的模板，在30℃下扩增48h，扩增完成后灭活聚合酶(65℃，3min)。。
6.qPCR
以20μL PCR体系为例。反应条件：95℃10sec，[95℃×5sec+60℃×30sec]×40个循环，4℃forever
试剂 反应量(μL)
2XChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10
Forward primer 0.4
Reverse primer 0.4
DNA样本 2
ddH2O 7.2
Total 20
引物序列见表4。引物序列位置如图2.B所示。
表4
用qPCR反应产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳实验。
7.DNA琼脂糖凝胶电泳
(1)安装电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，放在水平的工作台上，插上样品梳。
(2)琼脂糖凝胶的制备：称取0.4g琼脂糖溶解在40ml0.5X TBE缓冲液中，置微波炉中加热至完全溶化(不要加热至沸腾)，取出摇匀。
(3)灌胶：将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。
(4)待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入0.5X TBE缓冲液，然后拔出梳子。
(5)加样：将各样品与上样缓冲液5X Loading Buffer(#GR0205，GENEray)按4：1混匀后，用微量移液器将混合液加到样品槽中，每槽加5μl，记录样品的点样次序和加样量。DNA marker使用的是AccurateRUN prestained 100bp-ⅡDNA ladder(#GsDL1002-50,GENEray)
(6)电泳：安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳30min，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。
(7)染色和观察：取出凝胶，在紫外灯下照相记录电泳图谱。
结果如图2.A所示,表明在IOSE-80，CAOV3，HEY中NXNcircle725435-725781存在且引物特异。
实施例3qPCR验证NXNcircle725435-725781在正常卵巢组织，正常输卵管组织和高级别浆液性卵巢癌组织中的差异表达
1.标本来源
标本选自医院手术切除的20例正常卵巢组织，20例正常输卵管组织和20例高级别浆液性卵巢癌组织。
2.病例筛选
所有高级别浆液性卵巢癌患者均为初诊，均已签署知情同意书，术前均未接受过化疗、放疗或其他治疗。没有其他部位的恶性肿瘤或者重大疾病个人史。
3.eccDNA的提取同实施例2中的操作4，最后在样品中加入等量pGEX-5X-2质粒(作为之后qPCR结果的内参)并于4℃～8℃保存。
4.eccDNA的纯化同实施例2中的操作5。
5.qPCR
以20μL PCR体系为例。反应条件：95℃10sec，[95℃×5sec+60℃×30sec]×40个循环，4℃forever
试剂 反应量(μL)
2XChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10
Forward primer 0.4
Reverse primer 0.4
DNA样本 2
ddH2O 7.2
Total 20
结果：获得每个样品的CT值后以pGEX-5X-2为内参，根据2-ΔΔCT方法计算目的分子的相对表达量。引物序列见表3。
表3：RT-PCR检测片段引物序列
6、统计分析
采用IBM SPSS Statistics 27软件进行统计学分析。结果以Mean±SEM表示。正态分布且方差齐的数据比较采用独立样本t检验，非正态分布的数据比较采用Mann-Whitney检验。P<0.05为差异有统计学意义。
7.结果
结果如图3所示，与正常卵巢组织和正常输卵管组织相比，HGSOC组织中NXNcircle725435-725781平均表达水平明显上调，差异具有统计学意义。
实施例4荧光原位杂交实验验证NXNcircle725435-725781在正常卵巢组织，正常输卵管组织和高级别浆液性卵巢癌组织中的差异表达
1、标本来源
标本选自医院手术切除的40例正常卵巢组织，40例正常输卵管组织和80例高级别浆液性卵巢癌组织(卵巢组织)。
2、病例筛选
所有高级别浆液性卵巢癌患者均为初诊，均已签署知情同意书，术前均未接受过化疗、放疗或其他治疗。没有其他部位的恶性肿瘤或者重大疾病个人史。
3.组织切片的荧光原位杂交实验
(1)脱蜡(由浙江大学医学院附属妇产科医院病理科实施操作)
(2)根据荧光原位杂交实验试剂盒(Ribo Fluorescent In Situ HybridizationKit，锐博)的说明方法进行实验，操作如下：A.将脱蜡后的组织切片进行通透液(含0.5％TritonX-100的PBS)处理，4℃静置5min。B.弃去通透液后，用1XPBS清洗细胞5min，3次。C.预热预杂交液30min，弃去组织切片上的PBS，在切片上组织部分的周围用疏水笔描绘一圈后加入适量预杂交液，37℃封闭30min。E.预杂交的同时，将杂交液在37℃中预热30min。F.避光条件下，将适量的探针溶液加入到杂交液中。G.预杂交完成后弃去预杂交液，加入适量探针杂交液，避光，37℃杂交过夜。H.避光，42℃，杂交洗液Ⅰ清洗3次，每次5min，以降低背景信号。I.避光，42℃，杂交洗液Ⅱ清洗一次。J.避光，42℃，杂交洗液Ⅲ清洗一次。K.避光，1XPBS清洗，室温5min。L.DNA染色和封片：将适量Mounting Medium With DAPI-Aqueous,Fluoroshield(Abcam)滴在组织部分，盖上显微镜盖玻片(世泰)，待封片剂固定住后，用激光共聚焦显微镜(TCS SP2 AOBS)在60×的放大倍数下进行荧光检测。图4.A所示为NXNcircle725435-725781分别在正常输卵管组织，正常卵巢组织和高级别浆液性卵巢癌组织中表达水平的荧光代表图(注：NXNcircle725435-725781特异性探针由Cy3标记，序列如SEQ ID NO.4所示)。
(3)NXNcircle725435-725781表达水平的评估方法：
各例患者NXNcircle725435-725781的表达水平根据其特异荧光信号的强度及范围进行评分，方法如下：
总分＝特异荧光信号的平均强度×阳性染色细胞的平均百分比。
其中，特异荧光信号的平均强度由ImageJ中的Process-Batch-Macro分析获得，分析程序如下：run("8-bit")；
setAutoThreshold("Intermodes dark")；
//run("Threshold...")；
run("Smooth")；
run("Set Measurements...","area mean standard modal min integratedarea_fraction limit display redirect＝None decimal＝3")；
run("Measure")；
特异荧光信号的平均强度即为同一切片不同视野总荧光强度(integrateddensity，IntDen)的平均值。阳性染色细胞的平均百分比即为同一切片不同视野中染色细胞数与总细胞数比值的平均值。
(4).统计分析
采用IBM SPSS Statistics 27软件进行统计学分析。结果以Mean±SEM表示。正态分布且方差齐的数据比较采用独立样本t检验，非正态分布的数据比较采用Mann-Whitney检验。P<0.05为差异有统计学意义。
(5).结果：
图4.B和图4.C分别表明与正常卵巢组(N＝40)和正常输卵管组(N＝40)相比，高级别浆液性卵巢癌组(N＝80)中NXNcircle725435-725781平均表达水平明显上调，差异具有统计学意义。
实施例5针对实施例4各临床样本的数据进行统计学分析，探索NXNcircle725435-725781表达水平对高级别浆液性卵巢癌的预测诊断价值。
(1)结果：以正常卵巢为对照，ROC曲线分析NXNcircle725435-725781表达水平对高级别浆液性卵巢癌阳性的预测价值，如图5.A所示，结果提示ROC曲线下面积为0.773,根据约登指数计算，总分最佳临界值(Cut off值)为47.5163,灵敏度(SE)为0.5，特异性(SP)为1.0，P<0.0001。以正常输卵管为对照，ROC曲线分析NXNcircle725435-725781表达水平对高级别浆液性卵巢癌阳性的预测价值，如图5.B所示，结果提示ROC曲线下面积为0.923,P<0.0001，根据约登指数计算，总分最佳临界值(Cut off值)为10.8870,灵敏度(SE)为0.925，特异性(SP)为0.8。
因此，NXNcircle725435-725781表达水平可有效预测诊断高级别浆液性卵巢癌。其中，正常输卵管为对照较正常卵巢对照更具诊断价值，实际检测时优选检测输卵管中的NXNcircle725435-725781表达水平。
实施例6NXNcircle725435-725781表达对高级别浆液性卵巢癌患者预后情况的影响
1.NXNcircle725435-725781低表达组与高表达组的划分：将80例高级别浆液性卵巢癌患者组织的NXNcircle725435-725781表达水平从低到高进行排序，前40例为低表达组，后40例为高表达组。图6.A所示为高级别浆液性卵巢癌组织中NXNcircle725435-725781低表达组与高表达组的荧光代表图。如图6.B所示，表明在高级别浆液性卵巢癌组织中，与NXNcircle725435-725781低表达组相比，高表达组的NXNcircle725435-725781平均水平上调，差异具有统计学意义。
2.生存分析：以NXNcircle725435-725781低表达组和高表达组中各患者术后的肿瘤复发，死亡以及患者5年生存期作为观察终点，进行Kaplan–Meier生存分析。
3.统计分析
采用IBM SPSS Statistics 27软件进行统计学分析。结果以Mean±SEM表示。正态分布且方差齐的数据比较采用独立样本t检验，非正态分布的数据比较采用Mann-Whitney检验。P<0.05为差异有统计学意义。
6.结果如图7.A和图7.B所示，分别表示低表达组和高表达组之间无疾病生存率和总体生存率的差异，表明高级别浆液性卵巢癌中NXNcircle725435-725781低表达水平与较低的无疾病生存率和较低的总体生存率相关，NXNcircle725435-725781高表达水平与较高的无疾病生存率和较高的总体生存率相关。
实施例7NXNcircle725435-725781表达与高级别浆液性卵巢癌患者临床病理因素的相关性
1.统计分析:
采用IBM SPSS Statistics 27软件进行统计学分析。正态分布且方差齐的数据比较采用独立样本t检验，非正态分布的数据比较采用Mann-Whitney检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果：
结果如图8所示，NXNcircle725435-725781的表达与高级别浆液性卵巢癌的FIGO分期显著相关。上述实例的说明只是用于理解本发明的方法及思想。本领域的技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下，对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (1)

1.一种检测分子标志物NXNcircle725435-725781的物质的应用，其特征在于，包括下列应用之一：
(1)在制备用于高级别浆液性卵巢癌诊断的产品中的应用；
(2)在制备用于高级别浆液性卵巢癌预后评估的产品中的应用；
所述分子标志物NXNcircle725435-725781为一种染色体外环状DNA，序列如SEQ ID NO.1所示；检测的物质为用于检测分子标志物NXNcircle725435-725781表达水平的试剂；所述试剂基于实时定量反转录PCR、荧光原位杂交、芯片或高通量测序进行检测；通过实时定量反转录PCR检测分子标志物NXNcircle725435-725781的表达水平的试剂至少包括一对特异性的引物，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；通过荧光原位杂交、芯片或高通量测序检测分子标志物NXNcircle725435-725781表达水平的试剂包括与NXNcircle725435-725781的核酸序列杂交的特异性探针，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
CN202310249166.6A 2023-03-15 2023-03-15 一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用 Active CN116287267B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310249166.6A CN116287267B (zh) 2023-03-15 2023-03-15 一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310249166.6A CN116287267B (zh) 2023-03-15 2023-03-15 一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116287267A CN116287267A (zh) 2023-06-23
CN116287267B true CN116287267B (zh) 2024-03-01

Family

ID=86777493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310249166.6A Active CN116287267B (zh) 2023-03-15 2023-03-15 一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116287267B (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631876A (zh) * 2006-11-30 2010-01-20 解码遗传学私营有限责任公司 2型糖尿病的遗传易感性变体
CN104204222A (zh) * 2011-08-30 2014-12-10 Dcb-美国有限责任公司 预测易罹患卵巢赘瘤或卵巢癌预后的生物标记
CN106771248A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 山东大学齐鲁医院 高级别浆液性卵巢癌诊断和/或预后判断的标志物
WO2020210802A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 University Of Virginia Patent Foundation Tagmentation to open up circles of dna and detect extrachromosomal circles of dna for diagnosis
CN113215242A (zh) * 2021-04-23 2021-08-06 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种2型糖尿病的分子标志物及其应用
CN114231531A (zh) * 2022-02-10 2022-03-25 苏州大学附属第二医院 心肌梗死相关染色体外环状dna及其筛选方法与应用
CN115011695A (zh) * 2022-06-10 2022-09-06 杭州瀚因生命科技有限公司 基于游离环状dna基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用
WO2023288307A1 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Childern's Medical Center Corporation Extrachromosomal circular dna as an immunostimulant and biomarker for disease

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101631876A (zh) * 2006-11-30 2010-01-20 解码遗传学私营有限责任公司 2型糖尿病的遗传易感性变体
CN104204222A (zh) * 2011-08-30 2014-12-10 Dcb-美国有限责任公司 预测易罹患卵巢赘瘤或卵巢癌预后的生物标记
CN106771248A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 山东大学齐鲁医院 高级别浆液性卵巢癌诊断和/或预后判断的标志物
WO2020210802A1 (en) * 2019-04-11 2020-10-15 University Of Virginia Patent Foundation Tagmentation to open up circles of dna and detect extrachromosomal circles of dna for diagnosis
CN113215242A (zh) * 2021-04-23 2021-08-06 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种2型糖尿病的分子标志物及其应用
WO2023288307A1 (en) * 2021-07-15 2023-01-19 Childern's Medical Center Corporation Extrachromosomal circular dna as an immunostimulant and biomarker for disease
CN114231531A (zh) * 2022-02-10 2022-03-25 苏州大学附属第二医院 心肌梗死相关染色体外环状dna及其筛选方法与应用
CN115011695A (zh) * 2022-06-10 2022-09-06 杭州瀚因生命科技有限公司 基于游离环状dna基因的多癌种识别标志物、试剂盒及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer;Yixuan Cen et al.;Cell Death Dis .;第13卷(第4期);文献号：342，第1-10页 *
卵巢浆液性癌中受体酪氨酸激酶EphB3蛋白表达及临床意义;孙岳军 等;临床肿瘤学杂志;第22卷(第05期);第412-416页 *
孙岳军 等.卵巢浆液性癌中受体酪氨酸激酶EphB3蛋白表达及临床意义.临床肿瘤学杂志.2017,第22卷(第05期),第412-416页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116287267A (zh) 2023-06-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2691404T3 (es) Diagnóstico no invasivo del cáncer
US20190136330A1 (en) Method for screening cancer
EP3828273A1 (en) Methylation modification-based tumor marker stamp-ep2
CN116287267B (zh) 一种分子标志物NXNcircle725435-725781及其应用
CN106119361B (zh) 用于胃癌早期诊断及预后评估的ndrg4基因甲基化检测的试剂盒及其应用
CN116334223B (zh) 可变剪接功能性位点rs61746794的检测试剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂盒中的应用
CN112359118A (zh) 长链非编码rna ac073352.1作为乳腺癌诊断标志物和治疗靶点的应用
CN110205386B (zh) 一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-33a-5p及其应用
CN110714073B (zh) 一种用于癌症预后检测试剂盒
CN108796078B (zh) 一种用于消化道癌诊断、检测或筛查的引物和探针组
CN104873984B (zh) microRNA‑548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中的用途
CN116496988A (zh) 一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用
CN112029862A (zh) 一种基于无核酸提取的文库构建检测结直肠癌标志物的试剂盒、方法及其应用
US20120190024A1 (en) Method for determining presence or absence of epithelial cancer-origin cell in biological sample, and molecular marker and kit therefor
CN111304305A (zh) 一种用于检测egfr基因甲基化的试剂盒及方法
US20110207123A1 (en) Method for detecting chromosomal abnormalities
CN104726589A (zh) 可用于检测与大肠癌相关的cmtm3基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
US9771620B2 (en) Biomarkers of high-grade serous ovarian carcinomas
CN110093419B (zh) 环状rna的应用、试剂盒和药物组合物及其应用
CN115094139B (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
CN110628909B (zh) 一种与子宫内膜癌相关的miRNA分子miR-4500及其应用
CN110714072B (zh) 一种基于检测LncRNA的癌症预后评估试剂盒
CN108611421B (zh) 检测食管鳞癌标记物microRNA-10b-3p及在试剂盒中的应用
RU2688169C1 (ru) Количественная оценка has-miR-16-5p, has-miR-425-5p, has-miR-17-5p, has-miR-20a-5p, has-miR-101-3p, has-miR-30d-5p и has-miR-93-5p в плазме периферической крови женщин как способ неинвазивной диагностики серозных пограничных цистаденом и цистаденокарценом яичника
CN114107345A (zh) 子宫内膜样腺癌相关融合基因检测及其临床应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant