CN104873984B

CN104873984B - microRNA‑548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中的用途

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Publication number: CN104873984B
Application number: CN201410068887.8A
Authority: CN
Inventors: 詹启敏; 李林; 宋咏梅; 高志博; 欧云尉; 王俊
Original assignee: BGI Shenzhen Co Ltd; Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: BGI Shenzhen Co Ltd; Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2014-02-27
Filing date: 2014-02-27
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2034-02-27
Also published as: CN104873984A

Abstract

本发明涉及microRNA‑548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中的用途。另一方面，本发明涉及microRNA‑548k作为分子标记物用于诊断食管鳞状细胞癌。

Description

microRNA-548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌中的用途

技术领域

本发明涉及microRNA-548k抑制剂在治疗和/或预防食管鳞状细胞癌的技术领域。另一方面，本发明涉及microRNA-548k作为分子标记物用于诊断食管鳞状细胞癌的技术领域。

背景技术

食管癌是常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌，其是全世界癌症死亡的第六大原因，参见Kamangar,F.,G.M.Dores,等人(2006)."Patterns of cancerincidence,mortality,and prevalence across five continents:defining prioritiesto reduce cancer disparities in different geographic regions of the world."JClin Oncol24(14):2137-2150。全球大约70%的食管癌发生在中国，而在中国90%的食管癌的为食管鳞状细胞癌。到目前为止，对食管鳞状细胞癌的发生发展机制了解甚少，因此针对食管鳞状细胞癌早期诊断及治疗的手段和方法非常有限，食管鳞状细胞癌患者的5年生存率只有10%，参见Xu,Y.,X.Yu,等人(2012)."Neoadjuvant versus adjuvant treatment:which one is better for resectable esophageal squamous cell carcinoma?"WorldJ Surg Oncol10:173；Zhang,S.W.,M.Zhang,et al.(2012)."An Analysis of Incidenceand Mortality of Esophageal Cancer in China,2003～2007."China Cancer21(4):241-247。分子靶向治疗为近年来研究热点，并在部分恶性肿瘤治疗中取得突破性进展。如吉非替尼（Irresa）治疗非小细胞肺癌，尤其女性、不吸烟、腺癌患者预后更佳；伊马替尼治疗胃肠道间质瘤,特别是对于有Kit外显子11突变者可获得更好的疗效，参见Nilsson B,S.K.,Kindblom LG,等人(2007)."Adjuvant imatinib treatment improves recurrence-free survival in patients with high-risk gastrointestinal stromal tumours(GIST)."Br J Cancer96:1656-1658(Nilsson B2007)；C225联合放疗治疗局部晚期头颈部癌，较单纯放疗，生存率提高近1倍，参见Bonner JA,H.P.,Giralt J,等人(2006)."Radiotherapy plus cetuximab for squamous-cell carcinoma of the head andneck."N Engl J Med354:567-578。因此，阐明食管鳞状细胞癌发生发展的分子机制是人类攻克食管鳞状细胞癌的前提。

MicroRNA由18-25个核苷酸组成，系非编码RNA分子，可以通过和mRNA结合抑制mRNA功能，调节翻译过程。MicroRNA在肿瘤中的发生和发展中均发挥了重要作用，并且有些MicroRNA还与肿瘤的预后相关，如在慢性淋巴瘤，急性髓细胞样白血病，非小细胞肺癌，胰腺癌，神经母细胞瘤，结肠癌，小细胞肺癌中得到证实：miRNA对预后影响显著。

microRNA-548k定位于11号染色体，含有22个核苷酸，其genbank登录号为：GeneID:100313770，在文献中未见报道对其相关功能的研究。

本发明人运用高通量测序和比较基因组杂交技术对我国食管鳞状细胞癌的基因组进行了研究，出人意料的发现，11q13.3-13.4这个区域在48.1%的样本中存在扩增，且与淋巴结转移相关，此外，在这个区域中存在microRNA-548k的同步高表达。随后我们的功能实验表明，microRNA-548k在食管鳞状细胞瘤细胞系中普遍存在高表达，并且microRNA-548k能正性调节食管鳞状细胞瘤细胞的恶性表型。因此，microRNA-548k有望可以作为食管鳞状细胞癌诊断的分子标志物和治疗的靶点。

发明内容

本发明提供了microRNA-548k抑制剂用于制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌的药物中的用途。

优选地，根据本发明的microRNA-548k抑制剂是核酸抑制剂；进一步优选地，本发明的核酸抑制剂是与microRNA-548k序列互补的反义核酸分子。

另一方面，本发明提供了一种或多种特异地检测microRNA-548k表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞状细胞癌患者的试剂中的用途。

更进一步地，根据本发明所述引物和/或探针包含与microRNA-548k序列互补的核苷酸序列，或由与microRNA-548k序列互补的核苷酸序列组成。

优选地，根据本发明的诊断食管鳞状细胞癌患者的用途中其进一步包括：

a）提供来自个体的食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织的样品；和

b）确定样品中如microRNA-548k的表达水平；

c）比较癌组织和癌旁组织的样品中microRNA-548k的表达水平。优选地，在上述用途中，其中在所述步骤b)中使用选自宏阵列筛选、微阵列筛选、纳米阵列筛选、逆转录PCR、实时PCR或原位PCR的方法进行。

优选地，根据本发明所述的用途，其中所述食管鳞状细胞癌指哺乳动物中的食管鳞状细胞癌。

进一步优选地，根据本发明所述的用途，其中所述哺乳动物是人。

另一方面，本发明提供了一种治疗和/或预防哺乳动物食管鳞状细胞癌的方法，包括向遭受所述癌症的患者给药治疗有效量的microRNA-548k抑制剂。

附图说明

图1表明人食管鳞状细胞癌的肿瘤组织分析的电泳结果。

图2表明改变microRNA-548k表达后对细胞生长的影响情况。其中，miR-NC指microRNA阴性对照。

图3A-3F表明改变microRNA-548k表达后对细胞克隆形成的影响情况。图3A和3B表明在KYSE30细胞系中microRNA-548k表达的改变对细胞克隆形成的影响；图3C和3D表明在KYSE150细胞系中microRNA-548k表达的改变对细胞克隆形成的影响；图3E和3F表明在KYSE410细胞系中microRNA-548k表达的改变对细胞克隆形成的影响。

图4A-4I表明改变microRNA-548k表达后对细胞迁移及侵袭的影响情况。图4A-4C表明microRNA-548k表达的改变对KYSE30细胞系迁移及侵袭的影响；图4D-4F表明microRNA-548k表达的改变对KYSE150细胞系迁移及侵袭的影响；图4G-4I表明microRNA-548k表达的改变对KYSE410细胞系迁移及侵袭的影响。

具体实施方式

本发明涉及一重要基因microRNA-548k用于研究食管鳞状细胞癌发生发展的研究。具体的，基因microRNA-548k在食管鳞状细胞癌发生发展中发挥重要作用。基因microRNA-548k在食管鳞状细胞癌中普遍高表达。高表达基因microRNA-548k可以促进食管鳞状细胞癌细胞系的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力，而抑制基因microRNA-548k表达后则能明显的下调食管鳞状细胞癌细胞系的生长、克隆形成、迁移及侵袭能力。因此，基因microRNA-548k在食管癌的诊断及治疗中都将有重要的作用。

本发明涉及的检测方法包括DNA提取、二代全基因组测序、比较基因组杂交、RNA提取、qRT-PCR、生长曲线、克隆形成及transwell等。鉴于发明人已经找到和验证了基因microRNA-548k在食管鳞状细胞癌发生和发展中的作用，在今后科研研究及临床应用中，microRNA提取及qRT-PCR两种技术运用的较为普遍。这两种方法对于本领域的技术人员为常规操作。因此，该成果在在科研和临床中容易被运用。

本发明的具体实施方案中，检测待测样品中microRNA-548k表达情况的大致方法如下：

1）提取患者新鲜食管鳞状细胞癌组织及匹配血液中的全DNA；

2）二代全基因组测序技术及比较基因组杂交芯片检测肿瘤组织及匹配血液标本；

3）二代全基因组测序数据及芯片数据处理：对二代全基因组测序数据及芯片数据根据hg19数据库进行注释，然后全基因组测序数据用SegSeq及DNAcopy方法处理而获得基因拷贝数改变情况(Venkatraman and Olshen2007;Chiang,Getz et al.2009).，比较基因组杂交芯片数据用SegMNT及DNAcopy方法处理而获得基因拷贝数改变情况(Olshen,Venkatraman et al.2004;Venkatraman and Olshen2007)；将肿瘤组织样本中基因拷贝数改变情况比对匹配的血液样本中基因拷贝数改变情况，最终获得肿瘤组织样本中基因拷贝数改变的真实情况。

4）基因扩增验证：利用根据microRNA-548k基因序列设计的引物行qRT-PCR扩增。

5）功能实验验证：提取食管鳞状细胞癌细胞系及永生化正常食管细胞RNA,根据microRNA-548k基因序列设计的引物行qRT-PCR扩增，比较食管鳞状细胞癌细胞系及永生化正常食管细胞中microRNA-548k基因扩增情况。根据qRT-PCR结果挑选合适细胞系分别高表达及抑制microRNA-548k基因表达，通过生长曲线、克隆形成、迁移及侵袭实验研究microRNA-548k基因在食管鳞状细胞癌发生发展中的作用。

本发明将在下面的实施例中进一步描述，但本发明并不局限于这些实施例。

实施例1：检测microRNA-548k基因表达情况的方法

1.样本Total RNA提取–Trizol法提取组织、细胞总RNA

（1）样本处理（细菌、细胞不用研磨）；

在铝箔中将1cm2大小左右的组织样本敲碎，移至已加入钢珠的Eppendorf管中，使用研磨仪（301/s，8min）进行研磨

注：此步操作应尽可能在低温液氮环境下操作，细菌、细胞样本不用研磨。

（2）在研磨后的Eppendorf管中加入1ml Trizol，振荡混匀；

（3）将混匀后溶液移至一新Eppendorf管中，加入200μl氯仿，振荡混匀；

（4）离心：4℃，12000rpm，15min；

（5）将离心后上清液移至一新Eppendorf管中，加入500μl异丙醇，轻轻混匀，室温静置15min；

（6）离心：4℃，12000rpm，15min；

（7）倒掉上清液，加入1ml75%乙醇，振荡混匀；

（8）离心：4℃，7500rpm，5min；

（9）倒掉上清液，并在超净台中将乙醇挥发干净；

（10）加入40～60μl DEPC H2O，65℃5min助溶；

（11）-20℃冷冻保存。

2.Total RNA质量检测

（1）NanoDrop测定Total RNA浓度（2μl Total RNA上样）

（2）1.5%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量

甲醛变性琼脂糖凝胶：30ml1×TBE Buffer中加入0.45g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至60℃左右时加入600μl甲醛，混匀，倒入RNA专用的制胶器中（7.5×5.5cm），室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：120～130V，15～20min。

3.miRNA逆转录：

（1）逆转录反应体系

（2）逆转录程序：16℃30min，37℃30min，70℃10min，4℃for ever。

4.miRNA RealTime PCR反应

（1）miRNA RealTime PCR反应体系

（2）miRNA RealTime PCR程序

（3）miRNA RealTime PCR产物1.5%非变性（不加甲醛）琼脂糖凝胶电泳检测

miRNA RealTime PCR产物 2～4μl

2×Loading Buffer 4μl

总体积约为6～8μl

非变性琼脂糖凝胶：80ml1×TBE Buffer中加入1.2g琼脂糖，微波炉中加热溶化，轻轻摇动使琼脂糖充分混匀（肉眼观察无颗粒状悬浮物），冷却至60℃左右时加入2μl EB（原液）混匀，倒入制胶器中（15×15cm），室温静置30min左右即可使用。

电泳条件：100V，25～30min。

5.数据收集及处理：采用U6RNA作为内标，进行归一化处理。

实施例2：microRNA-548k在人食管癌细胞系中的表达水平

利用实时PCR方法测得microRNA-548k在食管鳞状细胞癌细胞系和正常食管细胞中的表达情况（参见图1）。其中，横坐标代表正常细胞系（NE2及H5E973）和人类食管癌细胞系。与正常细胞系相比，人食管癌细胞系中microRNA-548k的表达水平增加。

实施例3：改变microRNA-548k表达后对细胞生长的影响情况

在本实施例中，microRNA-548k序列互补的反义核酸作为抑制剂使用;在“拟态”的情况中，通过转染与microRNA-548k同样的序列而导致细胞内microRNA-548k的表达水平上升。在使用抑制剂及拟态的情况下，细胞中microRNA-548k的表达水平分别下调了约2-11倍，或上调了约5万倍。在miR-NC阴性对照的情况中，采用转染入线虫的microRNA序列，因为它与人的不是同源的而人也没有相关的mircroRNA，所以可以作为阴性对照。

在KYSE30、KYSE150和KYSE410细胞系中检测了microRNA-548k水平的上调对下调对该细胞系生长曲线的影响。分别计数2000个细胞接种于96E-Plate上，并将接种细胞的E-Plate放入RTCA-MP仪器中进行培养，仪器将自动每15分钟计数一次细胞数，最终获得细胞的生长曲线。该实验结果表明，microRNA-548k水平的上调促进了食管癌细胞的生长，相反地，microRNA-548k水平的下调抑制了食管癌细胞的生长（参见图2）

实施例4：改变microRNA-548k表达后对细胞克隆形成的影响

在KYSE30、KYSE150和KYSE410细胞系中检测了microRNA-548k水平的上调对下调对该细胞系细胞克隆形成的影响。具体实施如下：计数2000个细胞接种于大皿上，置于5%CO2恒温培养箱中，37°C培养，培养5天，形成肉眼可见的细胞集落。中止培养，PBS漂洗2次，甲醇固定10min，用0.5%结晶紫染色20min，流水冲洗，空气干燥。照相并计数克隆数。结果运用t-test进行统计。P<0.05为有统计学差异。该实验结果表明，microRNA-548k水平的上调显著地促进了食管癌细胞的克隆形成，相反地，microRNA-548k水平的下调显著地抑制了食管癌细胞的克隆形成（参见图3A-3F）（请确认此处是否正确。

实施例5：改变microRNA-548k表达后对细胞迁移及侵袭的影响

在KYSE30、KYSE150和KYSE410细胞系中检测了microRNA-548k水平的上调对下调对该细胞系细胞迁移和侵袭的影响。具体实施如下：

在侵袭实验中，用无血清培养基配制2%浓度的matrigel（将matrigel在4℃中融解，同时将无血清的培养基、EP管、枪头预冷处理）；将配好的2%matrigel培养基加入Transwell的上室（各100ul），之后放入孵箱中孵育1小时以上；将预处理的细胞（饥饿处理6小时后）用胰酶消化后，用无血清培养基重悬细胞，吹打均匀，细胞计数；在Transwell的下室中加入含20%血清的培养基600-800ul，将计数好的细胞加入上室中，并将上室的体积用无血清培养基定容于100-200ul；将Transwell板放入孵箱中孵育6-10小时后，取出Transwell板，并将上室上面没有穿过的细胞刮去；将上室放入70%的甲醇中固定约20分钟，1xPBS洗涤5分钟；0.25%的结晶紫染色40分钟，去离子水洗涤小室。正置显微镜观察穿透过的细胞，并进行拍照，计数细胞。

在迁移实验中，细胞计数后，在Transwell的下室中加入含20%血清的培养基600-800ul，将计数好的细胞加入上室中，并将上室的体积用无血清培养基定容于100-200ul；将Transwell板放入孵箱中孵育6-10小时后，取出Transwell板，并将上室上面没有穿过的细胞刮去；将上室放入70%的甲醇中固定约20分钟，1xPBS洗涤5分钟；0.25%的结晶紫染色40分钟，去离子水洗涤小室。正置显微镜观察穿透过的细胞，并进行拍照，计数细胞。结果运用t-test进行统计。P<0.05为有统计学差异。

该实验结果表明，microRNA-548k水平的上调显著地促进了食管癌细胞的迁移和侵袭，相反地，microRNA-548k水平的下调显著地抑制了食管癌细胞的迁移和侵袭（参见图4A-4I）。

Claims

1.microRNA-548k抑制剂用于制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述的microRNA-548k抑制剂是核酸抑制剂。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述的microRNA-548k抑制剂是与microRNA-548k序列互补的反义核酸分子。

4.一种或多种特异地检测microRNA-548k表达水平的引物和/或探针在制备用于诊断食管鳞状细胞癌患者的试剂中的用途。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其中所述食管鳞状细胞癌指哺乳动物中的食管鳞状细胞癌。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述哺乳动物是人。