CN110904228B

CN110904228B - 一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN110904228B
Application number: CN201911165620.XA
Authority: CN
Inventors: 王益民; 周巧; 高堂杰; 戴应; 何庆; 杨婷; 曹叶
Original assignee: Genetalks Bio Tech Changsha Co ltd
Current assignee: Genetalks Bio Tech Changsha Co ltd
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110904228A

Abstract

本发明公开了一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法，所述试剂盒包括：KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、DNA亚硫酸盐转化试剂以及Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂；所述使用方法为采集粪便样本后使用试剂盒中试剂完成样本的DNA纯化、KRAS基因突变检测、具核梭杆菌丰度检测以及Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测，所得数据通过逻辑回归模型计算后进行结果评估及分析。本发明检测结直肠癌的灵敏度达到89％以上，特异性达到94％左右，能够实现结直肠癌高灵敏度和高特异性的检测，能够帮助医生指导病人后续治疗用药。

Description

一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法。

背景技术

结直肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，全球结直肠癌每年新发病例数约120万，年病死人数超过60万，发病率居第3位，病死率居第4位。近年来，结直肠癌的发病率呈明显上升趋势。据全国肿瘤登记中心发布的最新《中国肿瘤登记年报》，在全国范围内，结直肠癌等消化道癌症的发病和死亡人数逐年攀升，新发病人数约为40万人/年，死亡人数约为19.5万人/年。结直肠癌从最初的癌前发展至晚期有一个比较长的时间，但直到晚期才有明显症状显现(如腹痛，便血等)。由于大多数患者没有进行癌症早筛查的意识，发现症状后才到医院检查，至结直肠癌确诊时，癌细胞已经扩散，后期疗效不明显，致使中国近半数肠癌患者生存期不超过五年。结直肠癌早期治愈率高，通过手术可以很好地移除没有扩散的癌细胞，预后良好。因此，提高全民早期筛查意识以及提高早期肿瘤的筛查效率可以提高结直肠癌的整体生存率以及早期治愈率。

目前临床上对于结直肠癌的早期诊断一般采用直肠指诊、X射线钡剂灌肠、乙状结肠镜或纤维结肠镜检查。目前结直肠癌相关的临床或实验室诊断方法有：1)粪便隐血检测(Fecal occult blood test,FOBT)、粪便免疫化学测试(Fecal immunochemical test,FIT)；FOBT是简单、方便、低成本的非侵入性结直肠癌筛查方法，但是存在特异性不高、试验种类(定性、定量)不统一等问题。2)内镜检查；结肠镜检查具有最高的灵敏度和特异性，是目前最普遍的筛查方法和金标准。然而，结肠镜检查是一种侵入性检查，具有穿孔、出血风险，且需要肠道准备，导致患者依从性差，不利于其推广。肠镜检查需要有丰富的临床经验，且不同的医生其判断标准有出入，误诊的情况并不少见。3)基因检测；2016年，美国食品药品监督管理局通过了Epi proColon的首个基于血液的结直肠癌筛选检测产品。该产品用于体外定性检测人外周血血浆中Septin9基因甲基化。目前，该产品已在美国、欧洲、中国以及其他地区上市。该产品在中国获得医疗器械注册证书之后，陆续有3款基于人外周血的Septin9基因甲基化检测产品上市。但是，公共甲基化检测数据库显示上皮来源的其他的良性病变以及其他组织来源的癌症都会释放Septin9基因片段到外周血，因此，导致该方法的特异性不高。4)粪便基因检测；2014年，美国食品药品监督管理局批准了首个非侵入性结直肠癌筛查试剂盒-Cologuard。该产品定性检测人类粪便样本中KRAS基因突变、BMP3基因与NDRG4基因甲基化以及血红蛋白水平。粪便基因检测相对于其他方法具有采样方便、最大程度降低病人不适等优点，但是，现有技术的检测试剂盒灵敏度和特异性都不高，在应用上具有一定的局限性。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，能够解决现有技术在粪便基因检测结直肠癌病变方面灵敏度和特异性低等缺点。

本发明还提出了上述试剂盒的使用方法。

根据本发明的第一方面实施例的一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，所述试剂盒包括：KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂。

根据本发明实施例的结直肠癌辅助诊断试剂盒，至少具有如下有益效果：该结直肠癌辅助诊断试剂盒相对于现有技术，具有灵敏度和特异性更高、用药指导评价效果更好的效果。

根据本发明的一些实施例，所述KRAS基因突变检测试剂中包含用于检测KRAS基因7种突变型的上下游引物和荧光探针；所述KRAS基因7种突变型为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式。

作为优选的，检测KRAS基因7种突变型的上游引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的7种引物，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的7种引物依次对应用于检测G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

根据本发明的一些实施例，所述KRAS基因突变检测试剂中还包括用于KRAS基因突变检测的内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针；所述内参基因ACTB的上下游引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

根据本发明的一些实施例，所述检测具核梭杆菌检测试剂包括检测具核梭杆菌丰度的上下游引物，所述检测具核梭杆菌丰度的上下游引物包括两个引物组。

作为优选的，检测具核梭杆菌丰度的两个引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组和核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组。

根据本发明的一些实施例，所述具核梭杆菌检测试剂还包括PCR预混液和水；优选地，所述PCR预混液为High Rox。

根据本发明的一些实施例，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中包括检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针。

作为优选的，检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针分别为：

检测Septin9基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.19所示的荧光探针；

检测SDC2基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.22所示的荧光探针；

检测HOXA11基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.25所示的荧光探针；

检测NDRG4基因甲基化水平的核苷酸序列如SEQ ID No.26和SEQ ID No.27所示的上下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.28所示的荧光探针。

根据本发明的一些实施例，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中还包括内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针。

作为优选的，所述内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针包括核苷酸序列如SEQID No.29所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.30所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示。

所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中还包括DNA亚硫酸盐转化试剂。

根据本发明的第二方面实施例的使用方法，包括以下步骤：

S1、采集粪便样品；

S2、提取样本DNA，使用所述核酸提取分离试剂通过磁珠法分离样本中的DNA；

S3、将分离纯化后的DNA分别进行如下处理和检测：使用所述KRAS基因突变检测试剂检测KRAS基因突变情况；使用所述具核梭杆菌检测试剂检测具核梭杆菌丰度；使用所述DNA亚硫酸盐转化试剂对DNA进行处理后使用所述甲基化检测试剂检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平；所述检测均使用荧光定量PCR检测方法。

根据本发明实施例的使用方法，至少具有如下有益效果：本发明提供的结直肠癌辅助诊断试剂盒，通过联合检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化，KRAS热点突变和具核梭杆菌检测，能够有效地判断结直肠癌良恶性，为临床医生提供辅助诊断证据。

根据本发明的一些实施例，所述使用方法还包括采用逻辑回归模型进行结果评估的步骤，逻辑运算公式为：

y＝11.985515+0.036600*KT-0.021866*KR-0.066378*S9-0.050985*N4-0.170725*S2-0.002165*H11+0.005135*MR-0.104279*BT+0.082819*BA

式中，KT、KR、S9、N4、S2、MR、BA和BT均为常数；KT为KRAS基因Ct值；KR为KRAS内参Ct值；S9为Septin9基因Ct值；N4为NDRG4基因Ct值；S2为SDC2基因Ct值；H11为HOXA11基因Ct值；MR为内参基因ACTB的Ct值；BA为样本中总体微生物菌群的Ct值；BT为具核梭杆菌的Ct值。

根据本发明的一些实施例，所述方法还包括对评估结果进行分析的步骤，分析标准为当运算值y>0.1842614判为模型判断为阳性，反之判为模型判断为阴性。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。

实施一：采样

使用本公司拥有自主专利权的粪便样本保存液(公开号：CN107980763A，实施例中制备的粪便保存试剂)15mL采集5-8g粪便样本后，使用粪便样本保存液进行样本处理。

实施二：提取

采用本公司自行研发的磁珠法提取试剂盒(核酸提取或纯化试剂，型号G1201)进行提取，具体步骤如下：

1、将收到的样本(约20mL)充分振荡混匀，使样本溶液呈匀浆状态，3000g离心15min，转移10mL上清至另一50mL离心管中，剩余样本保存备用；

2、加入10mL Lysis Buffer，颠倒混匀，55℃水浴孵育20min；

3、加入2mL 10％PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)，垂直混匀仪混匀30min；

4、3000g离心8min，将上清液转入新的50mL离心管中；

5、加入30μL Acryl Carrier(核酸助沉剂)，240μL蛋白酶K，60μL磁珠，垂直混匀仪混匀30min；

6、3000g离心3min，将上清倒入废液缸，余留约1.8mL上清；

7、将剩余溶液及磁珠充分混匀后，转移至另一2mL低吸附管中，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；

8、加入800μL wash buffer 1，充分振荡混匀，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；

9、加入500μL wash buffer 2，充分振荡混匀，置于磁力架上吸附至澄清，吸弃上清；

10、重复步骤7，吸弃残液；

11、加入60μL elution buffer，55℃水浴15min，间隔2-3min混匀1次；

12、高速瞬时离心，置于磁力架上吸附至溶液澄清，吸取上清至新的1.5mL离心管中，所得即为提取的DNA。

实施三：KRAS突变检测

1、PCR反应体系：

将实施二提取获得的核酸取2μL进行荧光定量PCR检测，检测体系总体积为25μL，具体如下表1所示：

表1.KRAS检测体系

KRAS检测体系(七联检)	1人份
		2x PCR Buffer	12.5μL
KRAS-G12D-F	0.08μM
		KRAS-G12A-F	0.06μM
KRAS-G12V-F	0.06μM
		KRAS-G12S-F	0.08μM
KRAS-G12R-F	0.06μM
		KRAS-G12C-F	0.08μM
KRAS-G13D-F	0.06μM
		KRAS-P	0.08μM
KRAS-R	0.16μM
		ACT-M-F	0.06μM
ACT-M-P	0.06μM
		ACT-M-R	0.06μM
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	0.06μM
		DNA模板	2μL

其中，上述检测所采用的引物序列为：

KRAS-G12D-F(SEQ ID No.1)：5’-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGA-3’；

KRAS-G12A-F(SEQ ID No.2)：5’-GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAGC-3’；

KRAS-G12V-F(SEQ ID No.3)：5’-GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGGTGT-3’；

KRAS-G12S-F(SEQ ID No.4)：5’-ATAAACTTGTGGTAGTTGGTGCTA-3’；

KRAS-G12R-F(SEQ ID No.5)：5’-AAACTTGTGGTAGTTGGGGCTC-3’；

KRAS-G12C-F(SEQ ID No.6)：5’-AAACTTGTGGTAGTTGGGGCTT-3’；

KRAS-G13D-F(SEQ ID No.7)：5’-TGTGGTAGTTGGAGCTGGGGA-3’；

KRAS-R(SEQ ID No.8)5’-TGGAGCTGGTGGACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3’；

KRAS-P(SEQ ID No.9)：5’-AGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA-3’，其中，5’端为荧光基团6FAM，3’端为荧光淬灭基团BHQ1，荧光探针具体为：6FAM-AGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGA-BHQ1；

ACT-M-F(SEQ ID No.10)：5’-GATGACCCAGGTGAGTGGCCCGCTACCTC-3’；

ACT-M-R(SEQ ID No.11)：5’-GAGAGAACCAGTGAGAAAGGGCGCAG-3’；

ACT-M-P(SEQ ID No.12)：5’-TCTGGTGGCCGCCTCCCTCCTTCCTGGCCTC-3’，其中，5’端为荧光基团HEX，3’端为荧光淬灭基团BHQ1，荧光探针具体为：HEX-TCTGGTGGCCGCCTCCCTCCTTCCTGGCCTC-BHQ1。

2、PCR扩增程序：

a.50℃2min；

b.95℃10min；

c.95℃15s，60℃30s，荧光采集，45cycles；

d.20℃2min。

采用ACTB管家基因作为内参基因，在不同个体和组织细胞中均稳定表达、稳定性高，是合适的内参基因，能够准确检测KRAS基因突变位点的表达水平。

KRAS基因为原癌基因，分为野生型和突变型。在正常人群基因组中，KRAS基因通过EGFR/RAS/RAF/MAPK信号通路来调控细胞的生长、分化和凋亡。在各种内外诱因的诱导下发生突变时，不受上级EGFR(表皮生长因子受体)信号的调控，保持该信号通路的持续活化状态，从而使得细胞过度的增殖，血管生成，最后导致肿瘤的发生与转移。在结直肠癌患者中约30％～55％伴有KRAS基因突变。KRAS的热点突变通常可以提示结直肠癌的风险以及受检者对靶向药的耐药性以及敏感性。通过检测KRAS的热点突变，可以一定程度上提示受检者是否患有结直肠癌。若确诊为结直肠癌，通过检测的结果可以进一步指导患者的靶向用药治疗。采用数学模型作为结直肠癌辅助诊断工具，KRAS突变指导癌症患者靶向用药。检测的KRAS突变位点只要有一个突变阳性，则提示患者可能对西妥昔单抗或帕尼单抗不敏感，不建议采用这两种药物进行治疗。

实施四：具核梭杆菌检测

1、PCR反应体系：

将实施二提取获得的DNA取2μL稀释到10ng/μL，取2μL稀释后DNA进行荧光定量PCR检测，检测体系总体积为10μL，采用的天根化生科技(北京)有限公司的suiperreal荧光定量预混试剂盒(FP215)进行检测，具体如下表2所示：

表2.具核梭杆菌检测体系

BA体系	1人份	BT体系	1人份
				buffer	5μL	buffer	5μL
BA-F	0.3μM	BT-F	0.3μM
				BA-R	0.3μM	BT-R	0.3μM
rox high	1x	rox high	1x
				去离子水	2.2μL	去离子水	2.2μL
DNA模板	2μL	DNA模板	2μL

其中，上述检测所采用的引物序列为：

BA-F(SEQ ID No.13)：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

BA-R(SEQ ID No.14)：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

BT-F(SEQ ID No.15)：5’-CGTAAAGAACTTGCCTCACAGCTAG-3’；

BT-R(SEQ ID No.16)：5’-CTTGGTGAGCCGTTACCTCTC-3’。

BA体系检测的是测定样本中的总体微生物群，BT体系检测的是样本中的具核梭杆菌。

2、PCR扩增程序：

a.50℃2min；

b.95℃10min；

c.95℃15s，60℃30s荧光采集，30cycles；

d.溶解段：95℃15s，60℃1min，95℃30s，60℃15s；

e.20℃2min。

具核梭杆菌(Fn菌)是重要的结直肠癌致病的细菌，与炎性肠病及结肠腺瘤密切相关，该菌在肠道中数量的变化可以预测肿瘤由良性向恶性转化的发展趋势；粪便或肠道组织中Fn菌的数量增多可以作为肿瘤微生物标志物对结直肠癌患者进行辅助诊断。检测病人粪便中的具核梭杆菌含量可以提示受检者结直肠癌的风险或者结直肠相关疾病的良恶性程度。

本发明采用SYBR Green嵌合荧光法进行Real-Time PCR(实时荧光定量PCR)同时检测人粪便DNA中总菌含量与具核梭杆菌含量，对比得到人体中具核梭杆菌相对含量。具核梭杆菌可反映受检者的结直肠癌的发展状态以及复发风险。

实施五：转化

采用重盐转化试剂盒(EZ DNA Methylation-Gold^TM Kit)对提取的粪便DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化。

1、试剂准备：

1)亚硫酸盐干粉：在亚硫酸盐干粉瓶子中加入9mL去离子水、500μL溶液A、3mL溶液B，充分震荡溶解，室温放置15min。

储存条件：1夜：室温放置；1周：4℃保存；1个月：-20℃保存；配制完的试剂有效期为1个月。再次使用：37℃后涡旋混匀。

2)Wash Buffer缓冲液：72mL Wash Buffer浓缩液中加入288mL无水乙醇。

2、转化步骤：

1)准备200μL PCR管，加入20μL DNA(不足20μL用水补足)和130μL亚硫酸盐干粉溶液，涡旋混匀离心；

2)将PCR管置于PCR仪，程序设置如下：

a.98℃10min；

b.64℃3h；

c.4℃20h。

3)打开金属浴，设置温度：55℃；

4)准备1.5ml PE管，加入600μL Binding Buffer和10μL磁珠(加入前摇匀)，然后转入PCR产物(核对样本编码)，涡旋30s；

5)室温放置5min，瞬离，磁力架吸附5min直到磁珠和悬液分离，弃上清悬液；

6)加入400μL Wash Buffer涡旋30s，瞬离，磁力架吸附3min，弃上清悬液；

7)加入200μL溶液C涡旋30s，室温放置15-20min(每隔2-3min颠倒混匀，保持磁珠悬浮)，瞬离，磁力架吸附3min，弃上清悬液；

8)加入400μL Wash Buffer涡旋30s，瞬离，磁力架吸附3min，弃上清悬液；

9)重复步骤8，弃上清后，瞬离，磁力架吸附，吸弃残液；

10)将PE管置于55℃干浴8-10min，干燥磁珠及除去残余液体(注意观察，防止干燥时间过长，磁珠开裂)；

11)加入25μL洗脱液涡旋悬浮磁珠，55℃干浴4min，瞬离，磁力架吸附1min，转移25μL洗脱液至干净的EP管中。

实施六：甲基化检测

1、PCR反应体系：

将实施五转化后的核酸取5μL进行荧光定量PCR检测，检测体系总体积为30μL，具体如下表3所示：

表3.甲基化检测体系

甲基化体系	1人份
		2x PCR Buffer	15μL
BS-S9-F	0.13μM
		BS-S9-R	0.13μM
BS-S9-P	0.1μM
		BS-H11-F	0.14μM
BS-H11-R	0.14μM
		BS-H11-P	0.1μM
BS-SDC2-F	0.16μM
		BS-SDC2-R	0.16μM
BS-SDC2-P	0.13μM
		BS-NDRG4-F	0.13μM
BS-NDRG4-R	0.13μM
		BS-NDRG4-P	0.1μM
BS-ACT-F	0.16μM
		BS-ACT-R	0.16μM
BS-ACT-P	0.13μM
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	5μL
重盐转化后DNA模板	5μL

其中，上述检测所采用的引物序列为：

BS-S9-F(SEQ ID No.17)：5’-GTCGGATTTCGCGGTTAACGC-3’；

BS-S9-R(SEQ ID No.18)：5’-CAAAATCCTCTCCAACACGTCCG-3’；

BS-S9-P(SEQ ID No.19)：5’-TAGTTGGATGGGATTATTTCGGATTTCG-3’，其中，5’端为荧光基团6FAM，3’端为荧光淬灭基团BHQ1，荧光探针具体为：6FAM-TAGTTGGATGGGATTATTTCGGATTTCG-BHQ1；

BS-SDC2-F(SEQ ID No.20)：5’-AGAAATTAATAAGTGAGAGGGCGTCGC-3’；

BS-SDC2-R(SEQ ID No.21)：5’-AACGCTCGCTTCCTCCTCCTACG-3’；

BS-SDC2-P(SEQ ID No.22)：5’-TTTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGG-3’，其中，5’端为荧光基团CY5，3’端为荧光淬灭基团BHQ2，荧光探针具体为：CY5-TTTTCGGGGCGTAGTTGCGGGCGG-BHQ2；

BS-HOXA11-F(SEQ ID No.23)：5’-GCAGCAGAGCGAGAAAGAGGG-3’；

BS-HOXA11-R(SEQ ID No.24)：5’-GTGGATTTGCTGAGTAGTACTG-3’；

BS-HOXA11-P(SEQ ID No.25)：5’-CCCATCACCATATTCCAGGAGCTTCTCCA-3’其中，5’端为荧光基团HEX，3’端为荧光淬灭基团BHQ1，荧光探针具体为：HEX-CCCATCACCATATTCCAGGAGCTTCTCCA-BHQ1；

BS-NDRG4-F(SEQ ID No.26)：5’-GTTTCGCGTCGCGGTTTTCGTTC-3’；

BS-NDRG4-R(SEQ ID No.27)：5’-CGTAACTTCCGCCTTCTACGCG-3’；

BS-NDRG4-P(SEQ ID No.28)：5’-GTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCG-3’其中，5’端为荧光基团ROX，3’端为荧光淬灭基团BHQ2，荧光探针具体为：ROX-GTTTTTTCGTTCGTTTATCGGGTATTTTAGTCG-BHQ2；

BS-ACT-F(SEQ ID No.29)：5’-GAAAGGGTGTAGTTTTGGGAGGTTAG-3’；

BS-ACT-R(SEQ ID No.30)：5’-CCCAAAACCAACCACAAAAAAAT-3’；

BS-ACT-P(SEQ ID No.31)：5’-CCTCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTTCCTAAC-3’，其中，5’端为荧光基团HEX，3’端为荧光淬灭基团BHQ1，荧光探针具体为：HEX-CCTCTTCTAATAACCACCTCCCTCCTTCCTAAC-BHQ1。

2、PCR扩增程序：

a.50℃2min；

b.95℃10min；

c.95℃15s，60℃30s荧光采集，45cycles；

d.20℃2min。

SDC2基因位于人类8号染色体上，有研究表明该基因在大肠癌肿瘤组织中的表达显著异常，相较于正常组织，SDC2基因的表达显著上升，且其启动子区域的CpG岛同时存在高度的甲基化。NDRG4基因位于人类16号染色体上，是NDRG抑癌基因家族成员之一，该基因家族在人体多种器官正常组织中高表达，在某些肿瘤组织中不表达或低表达。研究发现，在结直肠癌患者肿瘤组织中，NDRG4基因启动子区域的CpG岛呈现高度甲基化，进一步研究表明该抑癌基因的沉默会促进肿瘤的形成和发展。HOXA11基因是一个受表观遗传调控的基因，异常甲基化导致基因表达的下调，影响肿瘤的发生、发展以及预后。研究证实，该基因的甲基化将导致卵巢癌的预后不良，同时，甲基化也是恶性胶质瘤化疗抵抗的因素。有研究报道，在结直肠癌组织中该基因有普遍的甲基化变化，可作为肿瘤组织区分正常组织的一个标志物。因此，本发明使用SDC2、HOXA11和NDRG4基因作为结直肠癌辅助诊断的检测标志物，进而提高检测特异性。

实施七：构建模型

本发明检测Septin9、NDRG4、SDC2和HOXA11基因的甲基化以及KRAS突变，具核梭杆菌的丰度，这些指标来建立综合模型，更为准确全面的判定结直肠癌结果。采用逻辑斯特回归模型，结合sigmoid函数，作为结直肠癌辅助诊断工具。逻辑斯特模型如下：

KT:KRAS基因Ct值；KR:KRAS内参Ct值；S9:Septin9基因Ct值；N4:NDRG4基因Ct值；H11为HOXA11基因Ct值；S2:SDC2基因Ct值；MR:内参基因ACTB的Ct值；BA:样本中总体微生物菌群的Ct值；BT:Fn菌的Ct值；

Simoid函数如下：

f(y)＝1/(1+e^(-y))；

收取受检者粪便样本，对实验数据结果中实验失败的的样本(MR>42或KR>42)进行过滤，最终得到构建模型的样本，其中癌症样本137例，阴性样本745例。

对样本数据建立逻辑斯特模型，结合sigmoid函数，从ROC曲线的最佳位置得出模型阈值0.1842614。也即f(y)>0.1842614判为模型诊断阳性，反之判为模型诊断阴性。

实施八：验证模型

另收取了部分腺瘤粪便样本57例，用来测试模型的腺瘤灵敏度。样本模型结果的性能如下表4所示：

表4.灵敏度检测

结直肠腺瘤是肠道良性肿瘤，从模型验证结果可以看出，腺瘤检出的灵敏度低，癌症灵敏度高达88.8％，癌症特异性高达94.8％，因此，该模型具有良好的灵敏度和特异性。

实施九：临床样本验证性能

从湖南省某医院肠镜室收取受检者粪便样本，经过结肠内窥镜检测，选取结论为癌症、疑似癌症、息肉、炎症、内痔的样本进行本试剂盒的检测。同时，收集这些受检者的病理检测结果作为金标准对照。内参基因ACTB基因甲基化CT值不大于42，检测的样本合格。共收集有效检测结果的结直肠癌阳性以及阴性样本共1763例，其中结直肠癌阳性样本312例，非结直肠癌样本共1451例(腺瘤样本120例，息肉样本326例，炎症样本360例，内痔样本413例，正常样本232例)。

通过检测甲基化、突变以及Fn菌的丰度，用数学模型进行判断，模型自动判断为阳性的样本标记为模型诊断阳性，其余的标记为模型诊断阴性。采用病理检测结果作为金标准对照，病理检测为阳性的，标记为临床诊断阳性，病理检测为阴性的样本标记为临床诊断阴性。本试剂盒检测结果和金标准检测结果对比如下表5所示：

表5.试剂盒检测结果和金标准检测结果对照实验

敏感性＝A/(A+B)×100％＝89.42％；

特异性＝D/(C+D)×100％＝94.07％；

总符合率＝(A+D)/(A+B+C+D)×100％＝93.25％。

结直肠癌各分期检出率如下表6所示：

表6.结直肠癌各分期检出率

结直肠相关的良性疾病的检测情况如下表7所示：

表7.结直肠相关的良性疾病的检测情况

良性疾病	结直肠腺瘤	结直肠息肉	结直肠炎症及内痔
				入组数	120	326	773
检测阳性数	41	6	1
				灵敏度	34.17％	1.84％	0.13％
特异性	65.83％	98.16％	99.87％

从上表6可以看出，本试剂盒的检测灵敏度达到89.42％，特异性达到94.0％，采用试剂盒检测后用模型进行诊断的结果与临床金标准检测结果的总体符合度达到93.25％。其中，对结直肠癌病人各分期的检出率都在85％以上，同时，对于息肉以及验证和内痔的检测特异性都在98％以上。说明该检测试剂盒能够很灵敏地检测出癌症病人，同时不会误判息肉以及炎症等良性病人。

61例结直肠癌IV期病人中有39例病人检测出KRAS突变，其中有2例病人采取了靶向治疗，治疗方案为西妥昔单抗治疗。KRAS突变野生型的IV期病人为22例，其中10例采取了西妥昔单抗治疗。2个月之后随访，发现KRAS突变的2例病人靶向治疗不耐受，产生了副反应，而野生型的10例病人其中9例病人获得了较好的治疗反馈，生活质量得到了提高。说明该检测试剂盒很好地对靶向用药的病人进行了分类，并且精准地预测了用药疗效。

通过联合检测以上三类指标，结合真实的临床样本进行数学模型的构建，综合判断结直肠癌的风险，给医生提供辅助诊断依据。检测结果如果为阳性的样本，继续采用肠镜或者病理检测验证，确诊为病理阳性的病人通过检测结果可以预测其对靶向药西妥昔单抗和帕尼单抗的耐药性，野生型获益较好。

综上所述，本发明提供的结直肠癌辅助诊断试剂盒，通过联合检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化，KRAS热点突变和具核梭杆菌检测，能够有效地判断结直肠癌良恶性，为临床医生提供辅助诊断证据。同时也证明了KRAS突变可以进一步指导癌症病人的靶向个体化治疗。与目前市面上的产品相比，本发明的联合检测检测灵敏度高，特异性好，总体性能接近临床金标准等优点。本发明相较于肠镜检查或者血液检查，实现了真正的无创检测，并且采样灵活，不局限在医院环境。本试剂盒适用于需要做肠镜筛查结直肠癌的人以及已经患癌需采用靶向治疗的病人。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 人和未来生物科技（长沙）有限公司

<120> 一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒及其使用方法

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaacttgtgg tagttggagc aga 23

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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cctcttctaa taaccacctc cctccttcct aac 33

Claims

1.一种用于粪便核酸检测的结直肠癌辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

KRAS基因突变检测试剂、具核梭杆菌检测试剂、Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂，所述KRAS基因突变检测试剂检测的KRAS基因突变型为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述KRAS基因突变检测试剂中包含用于检测KRAS基因7种突变型的上下游引物和荧光探针；所述KRAS基因7种突变型为G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述用于检测KRAS基因7种突变型的上游引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的7种引物，所述核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的7种引物依次对应用于检测G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C和G13D的7种突变形式；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.9所示。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述KRAS基因突变检测试剂中还包括用于KRAS基因突变检测的内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针；所述内参基因ACTB的上下游引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQID No.12所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述具核梭杆菌检测试剂包括检测具核梭杆菌丰度的上下游引物；所述检测具核梭杆菌丰度的上下游引物包括两个引物组，所述两个引物组包括核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示的引物组和核苷酸序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示的引物组。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中包括检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述检测Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化水平的上下游引物和荧光探针分别为：

8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述Septin9、SDC2、HOXA11和NDRG4基因甲基化检测试剂中还包括内参基因ACTB的上下游引物和荧光探针。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ACTB的检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID No.29所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.30所示的下游引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.31所示。