CN104099422B - 一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，所述组合物包括SEQ？NO：1至SEQ？NO：17的引物序列，还包括SEQ？NO：18至SEQ？NO：21的block序列。本发明对肠癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肠癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肠癌患者进行诊断，复发监控和疗效评估，具有重要的价值。

Description

一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，特别是涉及检测肠癌驱动基因热点突变的组合物。

背景技术

肠癌是结直肠癌和直肠癌的总称，大肠癌的发病率从高到低依次为直肠、乙状结肠、盲肠、升结肠、降结肠及横结肠，近年有向近端(右半结肠)发展的趋势。肠癌的发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切。

研究发现，肠癌的发生与KRAS、BRAF、PIK3CA热点基因的突变有很大的关系。K-ras基因位于12号染色体短臂上，35kb，属于Ras基因家族的一员。在Ras基因中，K-Ras对人类癌症影响最大，它好像分子开关：正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，当K-ras基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的ras蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。K-ras基因检测是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。看K-ras基因有没有突变，可以筛选出抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。BRAF基因基因编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。在结直肠癌患者中，BRAF基因突变率为15％，美国国家癌症综合治疗联盟《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)建议，在使用爱必妥或帕尼单抗等靶向药物时，须检测肿瘤组织KRAS基因状态，如果KRAS无突变，应考虑检测BRAF基因状态。磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是EGFR下游信号分子，可被生长因子受体酪氨酸激酶(如EGFR)激活，使丝/苏氨酸激酶(AKT)磷酸化产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。研究发现PIK3CA基因产生突变与结肠癌等多种癌症发病存在相关性，32％的结肠癌患者体内基因PIK3CA存在突变而在成胶质细胞瘤、胃癌、乳腺癌和肺癌患者中，该基因存在突变的比例分别为27％、25％、8％和4％。NRAS基因是RAS基因家族中的一员，参与细胞内的信号传递。目前，应用于肠癌靶向治疗的药物主要有爱必妥(默克公司)和帕尼单抗(安进公司)，然而靶向药物在不同患者中有不同的疗效，有效率约为20～50％。通过对肠癌患者进行靶基因突变检测，能够科学的判断该病人能否适应靶向药物治疗，指导病人用药，实现病人的个体化医疗。

目前检测基因突变的方法主要有以下几种：

(1)直接测序法。直接测序法是运用探针进行PCR扩增并对扩增产物进行测序和TA克隆并再次测序以最终确定突变的碱基位置。该方法比较繁琐、耗时长，而且由于自身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

(2)变性高效液相色谱法(DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。

(3)高分辨率熔解曲线(HRM)。高分辨率熔解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。

(4)探针扩增阻滞突变法(ARMS)。利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端引物，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种引物及3’端引物进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的引物才可以延伸并得到PCR扩增产物，该检测方法的灵敏度在1％左右。

(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止引物与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在0.1～1％左右。

但这些技术的灵敏度都不高，检测的特异性差，误诊率高，不能满足对肠癌检测的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种肠癌热点基因无创检测的组合物，该组合物及其使用方法特异性强且灵敏度高。

为达上述目的，本发明的技术方案是：一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，所述组合物包括SEQNO：1至SEQNO：17的引物序列，还包括SEQNO：18至SEQNO：21的block序列。

其中，所述组合物在用于PCR扩增时的反应体系为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1uM正向引物、0.1～1μM反向引物、0.1～2μMblock、0.05～2ng/μL模版DNA、EvaGreen染料0.5～2μL、0.01～0.10U/μlTaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。

其中，所述block序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配的可偏向性扩增突变DNA序列的突变型特异性引物。

其中，所述模板DNA浓度可以低至0.1～1ng/μL。

其中，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变型。

其中，所述KRAS、BRAF、PIK3CA基因包含G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。

本发明还提供了一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，所述使用方法的步骤为：

第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应，其中所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时加入LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应；

第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的基因的突变情况。

其中，通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。

其中，所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况，其具体步骤为：

1).运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增强；当Ct值≥45.0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试验情况；

2).运行内控，一般Ct值＜40.0，可以继续分析，如果Ct值≥40.0，则说明样品DNA降解严重，不适合试验需要；

3).运行阳性质控品，阳性质控的Ct值＜45.0，熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果；

4).符合上述条件，运行Tmcalling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否存在突变：运行Tmcalling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct＜45，表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无扩增；b，有扩增，Ct≥45；c，有扩增，Ct＜45，但是运行Tmcalling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内；

5).如果不符合上述第1、3项要求，建议重做本次实验；如果不符合第2项要求，建议重新从样本中提取DNA，再次检测。

其中，所述待测样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒。

其中，所述待测DNA样品为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。

其中，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变型。

其中，所述KRAS、BRAF、PIK3CA基因包含G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。

其中，所述样品的DNA浓度可以低至0.1～1ng/μL。

其中，所述PCR扩增反应的具体过程分为2个阶段：

(1)扩增反应，92～97℃预变性5～15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，并进行35～55个循环；

(2)做熔解曲线，92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃采集荧光，每秒采集荧光10～30次。

本发明所用引物序列和block序列如表1和表2所示。

表1KRAS、BRAF、PIK3CA热点基因检测引物序列

表2KRAS、BRAF、PIK3CA热点基因检测block

所述block是指一种寡核苷酸，其3′端做过以下修饰：磷酸化或者间臂：Spacer3、Spacer6和Spacer18处理中的一种或多种处理，在PCR反应过程中，没有引物延伸扩增的功能。block以锁核酸(LNA)修饰后的野生型DNA为模板，进行设计序列和合成。block和模板的特异结合的部位覆盖了引物的结合部位，当非突变DNA存在时，block特异性与之结合，进一步提高了突变特异性引物和突变DNA结合的特异性。所述检测基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变型，待检测位点可能含有的突变位点为：G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、V600E、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047。

本发明的使用步骤和条件如下：

材料：待检血浆样本、阳性质控品、阴性质控品。

仪器：Lightcycler480、nanodrop1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCRBuffer(罗氏公司)、MgCl₂(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

引物：所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。

(1)PCR反应的体系和反应条件

所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1μM引物、0.1～2μMblock、0.05～2ng/μl模版DNA、0.1～1μMTaqman水解探针、0.01～0.10U/μlTaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。

(2)PCR反应的加样布局

待测DNA样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照均进行3个复孔检测。

实验结束以后，按以下步骤进行检测结果的分析、判定(以RocheLightCyclerTM480仪器为例进行说明)：

1.运行CT值的计算，无模板对照(NTC)应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增强(运行Tmcalling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内)。当Ct值≥45.0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试验情况；

2.运行内控，一般Ct值＜40.0，可以继续分析，如果Ct值≥40.0，则说明样品DNA降解严重，不适合试验需要；

3.运行阳性质控品(STD)，阳性质控的Ct值＜45.0，熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果；

4.符合上述条件，运行Tmcalling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否存在突变。运行Tmcalling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内(具体见表3)，并且Ct＜45，表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无扩增；b，有扩增，Ct≥45；c，有扩增，Ct＜45，但是运行Tmcalling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内；

5.如果不符合上述第1、3项要求，建议重做本次实验；如果不符合第2项要求，建议重新从样本中提取DNA，再次检测。

表3不同位点突变的Tm值范围

本发明针对与肠癌发生相关的热点基因设计专用引物和block序列，特异性强、灵敏度高，能够覆盖肠癌热点突变基因类型，一次性检测出可能的突变点，准确高效。

本发明基于实时荧光定量PCR平台，利用偏向扩增PCR技术(AsymmetricPCR)和熔解曲线分析技术(Meltingcurveanalysis)结合的技术检测DNA特定突变。PCR体系中，与野生型DNA匹配block序列特异遏制野生型DNA扩增，偏向扩增引物高特异性扩增特定突变模板，通过扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。本发明能检出含检测的基因包含KRAS、BRAF、PIK3CA基因，最低检出限为2～5拷贝突变序列。本发明对肠癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肠癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肠癌患者进行诊断、复发监控和疗效评估。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：(1)特异性强：加入能与野生型特异性结合的block；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.005％；(3)检测过程为闭管反应，减少污染的可能性；(4)操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟；而直接测序法则需要2天的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；(5)结果判读明确客观，只需根据扩增数据和熔解曲线即可完成对样本基因类型的判读；(6)安全，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

附图说明

图1是肠癌热点基因突变检测扩增曲线图。1是阳性曲线，2是阴性曲线。

图2是肠癌热点基因突变检测熔解曲线图。3是阳性曲线，4是阴性曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1，肠癌病人热点基因突变筛选

一、实验材料

1.收集20例病理已经诊断为肠癌患者的组织样本和配套的血浆样本。血浆样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。

2.所有引物纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。

3.所有试剂购买正规厂家：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCRBuffer(罗氏公司)、MgCl2(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

二、主要仪器：RocheLightCyclerTM480、nanodrop1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱。

三、实验设计

用本发明分别检测20例病人组织样本和配套的术前血液样本，然后对组织样本进行测序，根据组织样本测序结果来确定突变的类型。

四、反应体系及程序

1.根据实验室现有实验基础和经验研究，及参考分子克隆实验指南第三版第八章聚合酶链式反应体外扩增DNA内容及各种原材料的使用要求确定基础研究体系。

确定的研究体系如下：

2.根据以上反应体系进行上机，实验完成后，对实验结果进行数据处理与分析，反应程序：95℃预变性5分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，并进行50个循环；(2)做熔解曲线，95℃预变性1分钟，40℃退火1分钟，65～95℃采集荧光，每秒采集荧光30次。

五、实验结果与分析

图1是肠癌热点基因突变检测时得到的扩增曲线，其中的1，即左向曲线是阳性样本，2即右向曲线是阴性样本，可见运用本发明可以十分有效地扩增得到特异性的扩增曲线。

图2是肠癌热点基因突变检测时得到的熔解曲线，其中的3，即单一高峰值曲线是阳性样本，4即多峰值曲线是阴性曲线，该曲线说明运用本发明能够得到峰值单一的熔解曲线，能够很好的区分阴性和阳性样品。

20例临床样本血浆突变检测结果如表4所示，说明本发明能够有效地检测到肠癌患者体内存在的突变。

根据采集的样本检测情况，血浆中KRAS、BRAF、PIK3CA基因13个突变位点的总突变率约为60％。

表420例临床样本血浆突变检测结果

本方法检测的组织样本与测序方法检测组织样本的突变符合率是100％。本方法检测的血浆样本与测序方法检测的组织样本，符合率90％以上。说明本方法可以用于组织，尤其是血浆中肠癌驱动基因Kras，PIK3CA，Braf热点突变的检测。

肠癌患者组织样本和血浆样本检测比较结果见表5所示。由表5可见，运用本发明进行血浆突变检测与肿瘤组织进行突变检测的结果一致。虽然人的血浆更容易获得，但是人体外周血内的血浆DNA含量非常少，检测更困难，但是本发明却能够十分有效的检测到血浆DNA的突变情况。

表5肠癌患者组织样本和血浆样本检测比较

本发明针对与肠癌发生相关的热点基因设计专用引物和block序列，特异性强、灵敏度高，能够覆盖热点肠癌突变基因类型，一次性检测出可能的突变点，准确高效。

本发明基于实时荧光定量PCR平台，利用偏向扩增PCR技术(AsymmetricPCR)和熔解曲线分析技术(Meltingcurveanalysis)结合的技术检测DNA特定突变。PCR体系中，与野生型DNA匹配block序列特异遏制野生型DNA扩增，偏向扩增引物高特异性扩增特定突变模板，通过扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。本发明能检出含检测的基因包含KRAS、BRAF、PIK3CA基因，最低检出限为2～5拷贝突变序列。本发明对肠癌相关突变的检测方法具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，检测结果具有较好的准确性和重复性，尤其适合从血浆等体液中检测肠癌驱动基因的热点突变，可以实时、无创地对肠癌患者进行诊断、复发监控和疗效评估。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述组合物包括SEQNO：1至SEQNO：17的引物序列，还包括SEQNO：18至SEQNO：21的block序列。

2.如权利要求1所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述组合物在用于PCR扩增时的反应体系为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1uM正向引物、0.1～1μM反向引物、0.1～2μMblock、0.05～2ng/μL模板DNA、EvaGreen染料0.5～2μL、0.01～0.10U/μlTaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。

3.根据权利要求1或2所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变型。

4.根据权利要求2所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述模板DNA浓度可以低至0.1～1ng/μL。

5.根据权利要求2所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述PCR扩增的具体过程分为2个阶段：

(1)扩增反应，92～97℃预变性5～15分钟，聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，并进行35～55个循环；

(2)做熔解曲线，92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃采集荧光，每秒采集荧光10～30次。