CN104805207A

CN104805207A - 检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104805207A
Application number: CN201510212989.7A
Authority: CN
Inventors: 王弢; 李宗飞; 孙爱娟; 李�杰; 张丽
Original assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Current assignee: SUZHOU MICRO DIAG BIOMEDICINE CO Ltd
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2015-07-29

Abstract

本发明公开了检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法，试剂盒含有针对kras基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针，该特异探针能够与野生型DNA结合，能检出含0.01％Kras基因突变DNA的样本、最低检出限为2-5拷贝，本发明的检测方法对kras基因突变检测具有特异性强、灵敏度高、受污染小、操作简单快速、安全性等优点，特别适合从血浆，尿液，唾液等含有突变含量低的体液中检测基因突变，适合对肠癌进行早期筛查和诊断，为个体化用药提供指导。

Description

检测kras基因突变的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测kras基因突变的试剂盒，该涉及利用该试剂盒在非疾病诊断中检测kras基因突变的方法。

背景技术

Kras基因为Ras基因家族中的一员，编码的Ras蛋白P21具有GTP水解酶活性，是人类表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)依赖的下游信号转导通路Ras-Raf-MAPK途径中的重要成员。Kras基因突变导致P21蛋白与GTP牢固结合，持续激活传导通路的级联反应，刺激细胞生长、增殖、分化引起癌变。据报道，Kras基因的突变率约占结直肠癌总体患者的30％-60％。在这些突变中，80％-90％的突变热点主要位于KRAS基因的2号外显子的密码子12位和13位上，包括7中突变类型：G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C。

作为信号转导通路Ras-Raf-MAPK途径中的上游信号分子，EGFR在60-80％的结直肠癌中过度表达。以EGFR为靶点的药物，可阻断EGFR信号传导，从而抑制肿瘤新生血管形成、肿瘤的生长、侵袭和转移。但该类药物只能对Kras基因野生型的结直肠癌患者有效，使病人的预后得到改善。由于突变型的P21蛋白无需接收EGFR信号，能够自动活化该通路并启动下游信号的转导。因此，Kras基因野生型的患者能从抗EGFR的药物中获益，突变型患者则不行。Kras基因突变状态与预测肿瘤患者应用靶向药物的有效性以及更好的进行个体化治疗中起着重要作用。美国国家癌症综合治疗联盟(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)《结直肠癌临床实践指南》明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测Kras基因状态；(2)只有Kras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗。

因此，检测组织或血浆中Kras基因突变对于指导肠癌等癌症患者临床用药，具有重要的参考价值。

目前检测基因突变的方法主要有以下几种：

(1)直接测序法，其原理是：首先针对突变位点设计探针(每个基因设计一对探针，探针所对应的产物尽可能的包含突变位点所在的位置)，然后通过简单PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序并且对测序结果进行初步分析。初步分析完成后，对一些可能的突变样品的PCR产物，需要对目的条带进行切胶回收；回收后的PCR产物连接克隆载体；挑选阳性克隆测序并对测序结果进行分析。此过程比较繁琐、耗时长，而且由于测序方法本身的限制导致其灵敏度不高，只能对含量大于20％的基因突变进行检测。因此，此法不适合在临床中的应用与大量的临床样本分析。

(2)变性高效液相色谱法(denaturing high-performance liquid chromatograph，DHPLC)。该方法的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将他们分离开。由于杂合双链在突变位点处出现错配，更易于形成“Y”形结构，与固定相的结合能力降低，因此杂合DNA链要比纯合DNA链优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变存在。DHPLC可检测出含有单个检测的突变、插入或者缺失的异源双链片段。该法对已知和未知的突变位点均可以检测，敏感性在5％左右，但检测过程中需要打开反应管，容易造成污染，而且阳性结果不能确认其具体未知，最终还需测序确认。

(3)高分辨率溶解曲线(high resolution melting，HRM)。高分辨率溶解曲线是基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物熔解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终还需要通过测序加以确认。

(4)探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system，ARMS)。利用PCR探针的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增探针，在严格的条件下，只有在探针3’碱基与模板配对时PCR扩增反应才能正常进行，从而检测出突变。通过设计两个5’端探针，一个与正常DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯和性突变，分别加入两种探针及3’端探针进行两个平行的PCR，结合有与突变DNA完全互补的探针才可以延伸并得到PCR扩增产物。

(5)等位基因特异的Taqman聚合酶链式反应(competitive allele-specific TaqMan polymerase chain reaction，CAST-PCR)。CAST-PCR法采用优化TaqMan探针，通过一段特异设计的MGB探针来阻止探针与野生型DNA结合，选择性的优先扩增突变型DNA，该检测方法的灵敏度在1％左右。

因此，急需一种提高检测kras基因的灵敏度的方法和相应的检测试剂盒，为肠癌个体化用药提供指导。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供检测kras基因突变的试剂盒，该试剂盒特异性强且灵敏度高；本发明的目的之二在于提供检测kras基因突变方法，该方法检测周期短。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

检测kras基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有针对kras基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。

优选的，所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为GG+AGCT+G+GTG+GCGTAGGC-PO₄，其中“+”后的A或G为锁核酸修饰碱基。

优选的，所述试剂盒中还包含检测Kras基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8所示。

优选的，所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

优选的，所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVE GREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

2、所述检测kras基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测kras基因突变的方法，包括如下步骤：

a.设计检测kras基因突变的引物和针对kras基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针；

b.从待测样品中提取模板DNA，然后利用步骤a得到的引物和特异探针进行荧光定量PCR扩增反应；

c.根据熔解曲线法根据溶解曲线判读Ct值，然后根据Ct值判断待测样品中kras基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

本发明的检测原理如图1所示。

优选的，反应程序为92～97℃预变性5～15分钟；92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，进行35～55个循环；然后92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃溶解，每摄氏度采集荧光10～30次，每摄氏度收集20～30次荧光信号，最后40℃保存。

本发明的有益效果在于：(1)特异性强：加入能与野生型特异性结合的block；(2)灵敏度高，检测灵敏度达到0.01％；(3)检测过程为闭管反应，减少污染的可能性；(4)操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟；而直接测序法则需要2天的时间，且为开管操作，大大增加污染的可能性；(5)结果判读明确客观，只需根据扩增数据和熔解曲线即可完成对样本基因类型的判读；(6)安全性好，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1本发明的检测原理图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本项目由“江苏省科技成果转化专项资金资助”和“国家高技术研究发展计划(863计划)资助”，项目编号2014AA020803。

本发明中所使用的仪器如下：Lightcycler 480、nanodrop 1000、高速离心机、水浴锅、漩涡震荡仪、冰箱、烘箱、灭菌锅。

本发明中所使用的试剂：DNA聚合酶(罗氏公司)、10×PCR Buffer(罗氏公司)、MgCl₂(罗氏公司)、dNTP(TaKaRa)、纯化水。

本发明中所使用探针：所有探针纯度应达到电泳级(PAGE)或HPLC级，不含杂带。提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用PAGE或者HPLC纯化后应有明显单峰PAGE或者HPLC纯化图谱，浓度为10ng/μl备用。

实施例1

Kras基因阴性质控品为Kras基因未突变的人血基因组DNA，然后稀释至10ng/μl浓度(拷贝数约为10³)。Kras基因阳性质控品由Kras基因G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C突变位点的突变序列连接到pUC57-Amp载体，然后转化大肠杆菌后，经提取纯化，然后稀释成浓度为10³拷贝数(浓度约为10^-5ng/ul)。其中含Kras基因G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C突变位点的序列由苏州金唯智生物技术公司合成，具体序列如下：

G13D:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtgacgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt；

G12D:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgtt ctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctgatggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt；

G12A:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctgctggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt；

G12V:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctgttggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt；

G12S:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctagtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt；

G12R:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctcgtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt；

G12C:ttttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagcttgtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgtttt。

然后根据含突变位点的序列设计检测Kras基因G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C突变位点的引物和突变位点，具体引物如下：

表1、检测Kras基因突变的引物

名称	序列	长度
			G13D-F	5’-ttgtggtagttggagctggtga-3’(SEQ ID NO.1)	22
G12D-F	5’-gaatataaacttgtggtagttggagctga-3’(SEQ ID NO.2)	29
			G12A-F	5’-gaatataaacttgtggtagttggagctgc-3’(SEQ ID NO.3)	29
G12V-F	5’-gaatataaacttgtggtagttggagctgt-3’(SEQ ID NO.4)	29
			G12S-F	5’-gaatataaacttgtggtagttggagcta-3’(SEQ ID NO.5)	28
G12R-F	5’-gaatataaacttgtggtagttggagctc-3’(SEQ ID NO.6)	28
			G12C-F	5’-gaatataaacttgtggtagttggagctt-3’(SEQ ID NO.7)	28
Kras-R	5’-cctctattgttggatcatattcgtc-3’(SEQ ID NO.8)	25

Block是指一种寡核苷酸，其3’端做过以下修饰：磷酸化或者间臂，Spacer 3、Spacer 6 和Spacer 18处理中的一种或多种处理，在PCR反应过程中，没有探针延伸扩增的功能。Block以硫化修饰后的非突变DNA为模板，进行设计序列和合成具体为GG+AGCT+G+GTG+GCGTAGGC-PO₄，“+”后的A或G表示锁核酸修饰的碱基；Block和模板的特异结合的部位覆盖了探针的结合部位，当非突变DNA存在时，Block与之结合，提高了探针和突变DNA结合的特异性。

根据设计的引物和Block，对各组分在如下条件下进行优化：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1μM Kras正向探针、0.1～1μM Kras基因反向探针、0.1～2μM block、0.05～2ng/μl模版DNA、Eva Green染料0.5～2μl、1～5mM二氯化镁，反应程序为92～97℃预变性5～15分钟；92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，进行35～55个循环；然后92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃溶解，每秒钟升温0.06℃～0.02℃，每摄氏度采集荧光10～30次，最后40℃保存。考虑到实验过程中可能存在加样或人为因素导致的差异，故选择重复测定3次，并设置浓度梯度的样本和空白对照。

不同突变位点的Tm范围如表2所示。

表2、不同位点突变的Tm值范围

突变名称	突变的Tm值范围
		G13D	78.5-80.5
G12D	78.5-80.5
		G12A	78.5-80.5
G12V	78.5-80.5
		G12S	78.5-80.5
G12R	78.5-80.5
		G12C	78.5-80.5

荧光定量结束后根据CT值和熔解曲线进行结果判定，具体方法如下：

1、运行Abs Quant/2nd Derivative Max程序来判断扩增曲线有无，如有扩增曲线，计算Ct值(Cp值)。

2、运行Tm Calling程序来查看熔解曲线并计算Tm值，如果熔解曲线有2个或者2个以上的峰，以最高峰对应的Tm为准。

3、运行阳性质控品(STD)，阳性质控有扩增曲线且Ct值<40，每个位点熔解曲线峰的Tm值在其参考范围内。

4、运行Control，如果有扩增曲线，组织样本Ct值<32或血浆样本Ct值<39，且熔解峰型(Tm值)在参考范围内，则样本合格可继续分析。如无扩增曲线，或组织样本Ct值≥32或血浆样本Ct值≥39，或熔解峰型(Tm值)不在参考范围内说明样品DNA降解严重，不适合试验需要。

5、运行无模板对照(NTC)，应无扩增曲线；或有扩增曲线，但是Ct≥45；或是每个位点熔解峰Tm值不在参考范围内。

6、符合上述条件，运行待检样本，首先判读扩增曲线有无，如无扩增曲线，可直接判读为阴性。如有扩增曲线，但某个位点的Ct值大于或等于45，判断为阴性。如果有扩增曲线且该位点的Ct值小于45，且该位点的熔解峰型Tm值在参考范围内，判断为该位点突变；如果熔解峰型Tm值不在参考范围内判断为阴性。

7、在符合上述1-5条件下，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否存在突变。运行Tm calling程序，若样本溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：(1)无扩增；(2)有扩增，Ct≥45；(3)有扩增，Ct<45，但溶解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内。

不符合上述3，5项要求，重做本次实验；不符合第4项要求，重新从样本中提取DNA，再次检测。

对反应体系的优化结果显示，如表3所示的反应体系效果最佳。

表3、最优反应体系

原材料	体系(反应最终体系浓度)
		10×PCR buffer	1×
MgCl₂	2.5mM
		dNTP	250μM
引物(上下游)	250nM
		Block	500nM
EVE-GREEN	1×
		DNA聚合酶	1U
DNA模板	2-20ng
		总体系	20μL

最佳反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；95℃变性1min，40℃退火1min，65-95℃解链，(每秒钟升温0.02℃，每摄氏度收集荧光信号25次)，最后40℃保存。

实施例2

利用优化的检测体系和反应程序分析kras基因G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C突变位点的最低检测限度。

最低检测限度研究主要包括以下两方面：1)突变比例最低检测限的研究：在DNA浓度一定的条件下能检出的最低突变DNA的比例；2)DNA浓度的最低检测限的研究：在突变比例一定的情况下能检出的最低DNA浓度；3)最低拷贝数研究：在突变比例一定的情况下能检出的最低拷贝数。

1)突变比例最低检测限的研究

首先对kras基因G13D、G12D、G12A、G12V、G12S、G12R、G12C突变阳性质控品以及Control质控品进行准确稀释，统一稀释到10³拷贝数，稀释液为10ng/μl的野生型DNA。在将阳性质控品与10ng/ul的阴性基因组按照体积比为0:100、0.01:99.99、0.5:99.5、1:99和5:95进行混合，得突变率分别为0％、0.01％、0.5％、1％和5％，然后按照实施例1的最优体系和反应程序分析最低检测限度。考虑到实验过程中可能存在加样或个人因素导致的差异，故选择重复测定3次，每次将混合样本与0％的进行对比分析，检测其灵敏度，根据结果中的平局值分析对应的灵敏度区，结果如表4所示。根据最低检测限度实验结果，所有位点空白样本都没有发生扩增，实验可信。本实验检测样本时，最低检测限度必须是每个位点都必须达到，所以在选择设置最低检测限度时应该以7个位点中全部适用的结果。

表4、突变率最低检测限度结果

由表4可知，Kras基因7个位点的突变率最低检测限度为0.01％。

2)DNA浓度最低检测限研究

首先对突变阳性质控品以及Control质控品进行准确稀释，统一稀释到10³拷贝数，然后根据10:90(前为突变DNA，后为野生DNA)进行稀释，然后对背景DNA浓度进行调节，寻找一定突变比例(10％)DNA浓度的最低检测限。考虑到实验过程中可能存在加样或个人因素导致的差异，故选择重复测定3次，每次将其他梯度样本与0％的进行对比分析，检测其灵敏度，根据最终得的平局值分析对应的灵敏度区间，结果如表5所示。据最低检测限度实验结果，所有位点空白样本都没有发生扩增，实验可信。本实验检测样本时，最低检测限度必须是每个位点都必须达到，所以在选择设置最低检测限度时应该以7个位点中全部适用的结果。

表5、最低检测限度结果

由表5可知，Kras基因7个位点的最低DNA背景浓度为0.1ng/μl。

3)最低拷贝数研究

首先对突变阳性质控品进行准确稀释，稀释液为10ng/μl的野生型DNA。将阳性质控品梯度稀释至10拷贝～1拷贝，寻找体系的最低检测拷贝数，结果如表6所示。

表6、Kras最低拷贝数检测结果

结果显示，最低检测拷贝数研究结果表明其最低检测限度可达到2-5拷贝数。

体液最低检测限度，检测结果与组织参考品检测结果一致，具体数据未展示。

实施例3

采集10份肠癌患者组织样本及所配对的术前的的血浆样本。样本采集后，立即放入-80度冰箱中保存。组织样本中的DNA与血浆中游离的DNA(cf-DNA)，均采用Qiagen试剂盒进行抽提，并进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定。

然后使用实施例1的方法分别检测10例病人的组织样本和血浆样本中的突变位点，并且同时对组织样本进行测序，根据测序结果来确定突变的类型，结果表7所示。

表7、采用本发明的方法检测肠癌患者结果

注：“-”代表该样本在该位点检测结果未有扩增曲线

结果显示，使用本发明的方法检测组织样本与测序方法检组织样本的突变符合率为90％。本发明的方法检测血浆样本与测序方法检测配对的组织样本的突变符合率为90％。用本发明的方法检测血浆样本和配对的组织样本的符合率在100％，说明本方法可以用于组织，血浆中Kras突变的检测。

以上实施例对于体液的研究仅选用血浆样本进行研究。基于检测结直肠癌样本检测的可行性对于唾液，尿液等体液未进行研究。但对于应用本发明技术方案检测唾液尿液等突变含量低的体液的kras基因突变检测研究亦属于本发明范畴。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.检测kras基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有针对kras基因突变位点的LNA锁核酸修饰的特异探针。

2.根据权利要求1所述检测kras基因突变的试剂盒，其特征在于：所述锁核酸修饰的特异探针的核苷酸序列为GG+AGCT+G+GTG+GCGTAGGC-PO₄，其中“+”后的A或G为锁核酸修饰碱基。

3.根据权利要求1所述检测kras基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包含检测Kras基因突变的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1与SEQ ID NO.8、SEQID NO.2与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.5与SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.6与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求1所述检测kras基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR缓冲液、dNTPs、Eva Green和二氯化镁。

5.根据权利要求4所述检测kras基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中各组分的终浓度如下：1×PCR buffer、2.5mM MgCl₂、dNTP 250μM、引物250nM、探针500nM、1×EVEGREEN、DNA聚合酶1U和DNA模板2-20ng。

6.权利要求1-5任一项所述检测kras基因突变的试剂盒在非疾病诊断中检测kras基因突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

c.根据扩增曲线判读Ct值，再根据熔解曲线判读Tm值，然后根据Ct值及Tm值判断待测样品中kras基因突变情况，若溶解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct<45，表明扩增区段发生突变。

7.根据权利要求6所述检测kras基因突变的方法，其特征在于：所述荧光定量PCR扩增反应的条件如下：反应程序为92～97℃预变性5～15分钟；92～97℃变性10～20s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～35s，进行35～55个循环；然后92～97℃预变性0.2～5分钟，20～55℃退火0.2～5分钟，60～97℃溶解，每摄氏度采集荧光10～30次，每摄氏度收集20～30次荧光信号，最后40℃保存。