CN106755489A - 高灵敏度基因突变检测方法及所用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高灵敏度基因突变检测试剂盒，包括PCR缓冲液、无外切酶活性的DNA聚合酶、一条LNA修饰的类ARMS引物、一条常规引物、dNTP混合液、核酸染料和参比染料。LNA修饰的类ARMS引物3’末端是核酸类似物，核酸类似物的碳环2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此LNA化学极大地增强了寡核苷酸的识别能力。本发明还同时提供了利用试剂盒进行的高灵敏度基因突变检测方法，当PCR反应的结果有扩增曲线时，判定待测样品属于突变样品；反之，当PCR反应的结果无扩增曲线时，判定待测样品属于野生型样品。

Description

高灵敏度基因突变检测方法及所用试剂盒

技术领域

本发明属于临床分子诊断技术领域，具体涉及一种点突变检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(简称为SNP)是个体中最常见的遗传变异类型，占所有已知多态性的90％以上。SNP研究已成为现在最热门的课题，可以进行性状基因的精细定位、分子辅助育种、种子资源鉴定等。在医学领域，SNP与癌症易感性以及个体化治疗的关系愈发受到关注。

众所周知，疾病的部分风险为遗传，而SNP可能与个体的癌症发病风险有关。近年来，关于SNP与常见癌症易感性关系的研究层出不穷。例如：BRCA1和BRCA2基因突变与女性罹患乳腺癌风险休戚相关；TGFB1-509C/T多态性可能导致转录调控改变从而影响TGFB1基因相关疾病，如结直肠癌的发展和严重程度；另外，XRCC3基因第7个外显子中的18067位核苷酸处C到T的替换与胃癌发病风险的关系也有大量报道。

除此之外，近年来，研究人员发现，同一种药物对不同病人的治疗效果有时差异显著。此类差异大多是由于药物在不同的个体内活化、代谢和清除等方面的基因差异所决定的，而这种基因差异主要是SNP。研究SNP与药物的个体敏感性或耐受性之间的关联，可以阐明与药物治疗以及毒副作用相关的SNP基因型，从而为针对性地使用药物提供依据。比如，欧洲药监局和美国FDA明确规定在使用靶向药物爱必妥(Erbitux)和维克替比(Vectibix)治疗转移性大肠癌前必须检测K-ras基因；另外，进行EGFR基因突变检测用于指导非小细胞肺癌患者EGFR-TKIs治疗已在全球形成共识，成为标准的临床实践。

因此，人们期待准确且短时间、低成本地测定基因突变或进行基因分型的方法，通过该类检测预测各类疾病发生频率和/或耐药性。

目前，针对基因突变的检测方法主要有测序法、高分辨率熔解曲线法、探针荧光定量法。但是，上述方法均存在着一定的缺陷。例如：测序法灵敏度低，一般需要基因丰度达到10％以上才能准确检测；高分辨率熔解曲线法对荧光定量仪器的要求较高；探针荧光定量法探针合成的成本较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏度基因点突变检测方法及所用试剂盒，旨在解决现有技术中检测周期长、灵敏度低且检测结果不够准确的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种高灵敏度基因突变检测试剂盒，包括：PCR缓冲液、无外切酶活性的DNA聚合酶、一条LNA修饰的类ARMS引物、一条常规引物(常规的无修饰引物)、dNTP混合液、核酸染料和参比染料。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测试剂盒的改进：所述无外切酶活性的DNA聚合酶，既无3’-5’外切酶活性，亦无5’-3’外切酶活性。

备注：一般PCR反应所用的为具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测试剂盒的进一步改进：所述无外切酶活性的DNA聚合酶为Platinum GenoType Tsp DNA Polymerase(Invitrogen，美国)。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测试剂盒的进一步改进：

所述LNA修饰的类ARMS引物3’末端是核酸类似物，核酸类似物的碳环2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此LNA化学极大地增强了寡核苷酸的识别能力。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测试剂盒的进一步改进：

LNA修饰的类ARMS引物，其3’端的一个碱基进行锁核酸修饰，引物序列与突变型序列互补，3’末端与野生型序列有一个碱基的差异。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测试剂盒的进一步改进：

针对野生型/突变型MINA(突变类型C/T)，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ IDNO:1；常规引物序列为SEQ ID NO:2；

针对野生型/突变型B-raf(突变类型T/A)，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ IDNO:4，常规引物序列为SEQ ID NO:5；

针对野生型/突变型K-ras(突变类型G/A)，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ IDNO:6，常规引物序列为SEQ ID NO:7；

针对野生型/突变型EGFR(突变类型G/C)，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ IDNO:8，常规引物序列为SEQ ID NO:9；

针对野生型/突变型EGFR(突变类型G/A)，LNA修饰的类ARMS引物为SEQ ID NO:10，常规引物为SEQ ID NO:11。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测试剂盒的进一步改进：

所述dNTP混合液浓度为2.5mM，包含等量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP；

所述核酸染料为SYBR Green I；

所述参比染料为ROX。

本发明还同时提供了利用上述试剂盒进行的高灵敏度基因突变检测方法，包括以下步骤：

在检测管中加入PCR缓冲液、无外切酶活性的DNA聚合酶、LNA修饰的类ARMS引物、常规引物、dNTP混合液、核酸染料、参比染料，以及加入待测样品，从而组成PCR反应体系，然后进行PCR反应；

当PCR反应的结果有扩增曲线时，判定待测样品属于突变样品；

反之，当PCR反应的结果无扩增曲线时，判定待测样品属于野生型样品。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测方法的改进：

25μl的PCR反应体系为(反应体系中各组分浓度及含量)：

10×PCR缓冲液：2.5μl

LNA修饰的类ARMS引物(10μM)：0.5μl

常规引物(10μM)：0.5μl

无外切酶活性的DNA聚合酶：1U

dNTP(2.5mM)：1.5μl

SYBR Green I(20×)：1μl

参比染料ROX(25μM)：0.5μl

待测样品：1.5ng

加水补足至25μl。

作为本发明的高灵敏度基因突变检测方法的进一步改进：

PCR反应条件为：95℃2分钟，1个循环；95℃15秒，60℃1秒，35个循环。

在本发明中，质粒起始量小于1.5ng下，有突变的样品有扩增曲线，野生型样品无扩增曲线。

所述无外切酶活性的DNA聚合酶，可以对引物3’端一个碱基是否与模板匹配进行较好的区分。

所述的一条3’端LNA修饰的引物与一条反向正常引物，可以在使用普通Taq DNA聚合酶的情况下较好的检出突变。

在本发明中，普通酶+LNA修饰引物，或者无外切酶活性的聚合酶+普通引物，都有将突变型和野生型进行区分的能力，只是LNA修饰引物+无外切酶活性的聚合酶这组合效果更佳。

本发明属于体外诊断技术，适用于一般的点突变检测；本发明的突变检测方法采用染料法，建立了针对单碱基突变的实时PCR检测方法。本发明引入了无外切酶活性的DNA聚合酶及锁核酸引物用于区分突变型和野生型基因，即，本发明包含一类无外切酶活性的DNA聚合酶以及一条锁核酸(locked Nucleic Acid，LNA)修饰的类ARMS引物。

本检测方法具有如下技术优势：

1、灵敏度高，可以在(1.5ng)野生型质粒DNA背景下准确检出1‰的突变DNA；

2、检测过程为闭管反应，显著降低了污染，确保结果真实可信；

3、操作简单快速，能在2h内完成检测，结果判读简单客观，便于分析。

4、按照本发明给出的设计规则能方便设计引物，可用于临床上各类基因点突变的筛查。

5、相较测序法，本发明检测费用低，耗时短，灵敏度高(测序法灵敏度低，一般需要基因丰度达到10％以上才能准确检测)，判读简单。相较熔解曲线法与探针法，本发明在维持高灵敏度、短周期与低成本的同时，具有引物易于设计(不用引入错配)，以及稍加改进就可进行基因分型的特点。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为用普通Taq DNA聚合酶与普通ARMS引物检测野生型与突变型MINA质粒的扩增曲线图；

图2为用无核酸外切酶活性的DNA聚合酶及普通ARMS引物检测野生型与突变型MINA质粒的扩增曲线图；

图3为用普通Taq DNA聚合酶与LNA修饰的ARMS引物检测野生与突变型MINA质粒的扩增曲线图；

图4为用无核酸外切酶活性的DNA聚合酶及LNA修饰的ARMS引物检测野生与突变型MINA质粒的扩增曲线图；

图5为用无核酸外切酶活性的DNA聚合酶及LNA修饰的ARMS引物检测不同比例的突变型/野生型MINA质粒的扩增曲线图；

图6为对B-raf基因15号外显子突变进行检测的扩增曲线图；

图7为对K-ras基因2号外显子第12密码子突变进行检测的扩增曲线图；

图8为对EGFR基因18号外显子第12密码子G719A突变进行检测的扩增曲线图；

图9为对EGFR基因18号外显子第12密码子G719S突变进行检测的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1、

1)、LNA修饰的类ARMS引物的设计方式：

野生型/突变型MINA质粒的序列(部分)如下：

突变类型(C/T)

aaagattttgatcagaaaagggcaacgattcagtttcaccaacctcagagatttaaggatgagctttggaggatccaggagaagctggaatgttactttggctccttggttggctcgaatgtgtacataactcccgcaggatctcagggcctgccgccccattatgatgatgtcgaggttttcatcctgcagctggagggagagaaacactggcgcctctaccaccccactgtgcccctggcacgagagtacagcgtggaggccgaggaaaggatcggcaggccggtgcatgagtttatgctgaagccgggtgatttgttgtactttcccagaggaaccattC(T)atcaagcggacactcctgcggggctggcccactcgactcacgtgaccatcagcacctaccagaacaattcatggggagatttccttttggataccatctcggggcttgtatttgatactgcaaaggaagacgtggagttacggaccggcataccccggcagctgctcctgcaggtggaatccacaactgttgctacaagacgattaagtggcttcctgaggacacttgcagaccggctggagggcaccaaagaactgctttcctcagacatgaagaaggattttattatgcacagactccccccttactctgc。

LNA修饰的类ARMS引物的设计规则为：其3’端的一个碱基进行锁核酸修饰，引物序列与突变型序列互补，3’末端与野生型序列有一个碱基的差异。

即，LNA修饰的类ARMS引物3’末端碱基落在突变的位置上，并与突变型互补而与野生型不匹配。

所设计的LNA修饰的类ARMS引物如下表中的SEQ ID NO:1所述；

所设计的普通反向引物如下表中的SEQ ID NO:2所述。

编号	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO:1	TGTACTTTCCCAGAGGAACCATTT
SEQ ID NO:2	CCGCAGGAGTGTCCGCTTGAT

2)、25μl的PCR反应体系的设置(反应体系中各组分终浓度及含量)：

10×PCR缓冲液：2.5μl

LNA修饰的类ARMS引物(10μM)：0.5μl

普通反向引物(即，常规引物10μM)：0.5μl

DNA聚合酶(Platinum GenoType Tsp DNA Polymerase)：1U

dNTP(2.5mM，each)：1.5μl

SYBR Green I(20×)：1μl

参比染料ROX(25μM)：0.5μl

待测样品：1.5ng

加水补足至25μl。

PCR反应条件为：95℃2分钟，1个循环；95℃15秒，60℃1秒，35个循环。

上述待测样品为野生型MINA质粒/突变型MINA质粒。

3)、按上所述体系进行荧光定量PCR，所得结果如下：

当正向引物为LNA修饰的类ARMS引物(SEQ ID NO:1)时，所得结果如图4所述，根据图4，我们得知此时突变型质粒Ct值约为16，野生型质粒无扩增曲线。

对比例1、将实施例1中的LNA修饰的类ARMS引物改成未经LNA修饰的类ARMS引物(SEQ ID NO:3)，其余等同于实施例1。

编号	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO:3	TGTACTTTCCCAGAGGAACCATTT

所得结果如图2所述，根据图2，我们得知此时突变型质粒Ct值约为16，野生型质粒Ct值约为19.5。

对比例2、将实施例1中的无外切酶活性的DNA聚合酶(Platinum GenoType TspDNA Polymerase，Invitrogen，美国)改成普通的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase，诺唯赞，中国)，其余等同于实施例1。

所得结果如图3所述，根据图3，我们得知此时突变型质粒Ct值约为18，野生型质粒Ct值约为29。

对比例3、将实施例1中的LNA修饰的类ARMS引物改成未经LNA修饰的类ARMS引物(SEQ ID NO:3)；将实施例1中的无外切酶活性的DNA聚合酶改成普通的DNA聚合酶，其余等同于实施例1。

所得结果如图1所述，根据图1，我们得知此时突变型质粒与野生型质粒Ct值基本无差别，均约为18。

实验一(灵敏性实验)、

将实施例1中的待测样品由1.5ng分别改成1.5×10^-2ng，其中突变型质粒/(突变型质粒+野生型质粒)为100％、50％、10％、1％和1‰；其余等同于实施例1。

所得结果如图5所述，根据图5，我们得知此质粒模板浓度下，1‰的突变型质粒模板Ct值约为35。

实施例2、对B-raf基因15号外显子突变进行检测

野生型/突变型B-raf序列(部分)如下：

突变类型(T/A)

aatcattgttttagacatacttattgactctaagaggaaagatgaagtactatgttttaaagaatattatattacagaattatagaaattagatctcttacctaaactcttcataatgcttgctctgataggaaaatgagatctactgttttcctttacttactacacctcagatatatttcttcatgaagacctcacagtaaaaataggtgattttggtctagctacagT(A)gaaatctcgatggagtgggtcccatcagtttgaacagttgtctggatccattttgtggatggtaagaattgaggctatttttccactgattaaatttttggccctgagatgctgctgagttactagaaagtcattgaaggtctcaactatagtattttcatagttcccagt。

因此，所设计的LNA修饰的类ARMS引物为：SEQ ID NO:4，另一条常规引物为SEQ IDNO:5。

编号	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO:4	GGTGATTTTGGTCTAGCTACAGA
SEQ ID NO:5	CTGATGGGACCCACTCCATCGA

其余等同于实施例1。

所得结果如图6所示，根据图6，我们得知突变型样本Ct值约为21，野生型样本无扩增。

实施例3、对K-ras基因2号外显子第12密码子突变进行检测

野生型/突变型K-ras序列(部分)如下：

突变类型(G/A)

attgaattttgtaaggtattttgaaataatttttcatataaaggtgagtttgtattaaaaggtactggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattatttttattataaggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagctgG(A)tggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggtaaatcttgttttaatatgcatattactggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattac。

因此，所设计的LNA修饰的类ARMS引物为：SEQ ID NO:6，另一条常规引物为SEQ IDNO:7。

编号	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO:6	ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA
SEQ ID NO:7	TCGTCAAGGCACTCTTGCCTACG

其余等同于实施例1。

所得结果如图7所示，根据图7，我们得知突变型样本Ct值约为20，野生型样本无扩增。

实施例4、对EGFE基因18号外显子G719A突变进行检测

野生型/突变型EGFR序列(部分)如下：

突变类型(G/C)

gccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctggG(C)ctccggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgt。

因此，所设计的LNA修饰的类ARMS引物为：SEQ ID NO:8，另一条常规引物为SEQ IDNO:9。

编号	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO:8	CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC
SEQ ID NO:9	CTCACCTTCTGGGATCCAGAGTC

其余等同于实施例1。

所得结果如图8所示，根据图8，我们得知突变型样本Ct值约为24，野生型样本无扩增。

实施例5、对EGFE基因18号外显子G719S突变进行检测

野生型/突变型EGFR序列(部分)如下：

突变类型(G/A)

gccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcggcctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcaggagagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgaggatcttgaaggaaactgaattcaaaaagatcaaagtgctgG(A)gctccggtgcgttcggcacggtgtataagggactctggatcccagaaggtgagaaagttaaaattcccgtcgctatcaaggaattaagagaagcaacatctccgaaagccaacaaggaaatcctcgatgaagcctacgtgatggccagcgtggacaacccccacgt。

因此，所设计的LNA修饰的类ARMS引物为：SEQ ID NO:10，另一条常规引物为SEQID NO:11。

编号	引物序列(5’-3’)
		SEQ ID NO:10	CAAAAAGATCAAAGTGCTGA
SEQ ID NO:11	CTCACCTTCTGGGATCCAGAGT

其余等同于实施例1。

所得结果如图9所示，根据图9，我们得知突变型样本Ct值约为27，野生型样本无扩增。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 杭州金溪生物技术有限公司

<120> 高灵敏度基因突变检测方法及所用试剂盒

<160> 11

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LNA修饰的类ARMS引物

<400> 1

tgtactttcc cagaggaacc attt 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 常规引物

<400> 2

ccgcaggagt gtccgcttga t 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 未经LNA修饰的类ARMS引物

<400> 3

tgtactttcc cagaggaacc attt 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LNA修饰的类ARMS引物

<400> 4

ggtgattttg gtctagctac aga 23

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 常规引物

<400> 5

ctgatgggac ccactccatc ga 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LNA修饰的类ARMS引物

<400> 6

acttgtggta gttggagctg a 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 常规引物

<400> 7

tcgtcaaggc actcttgcct acg 23

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LNA修饰的类ARMS引物

<400> 8

caaaaagatc aaagtgctgg c 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 常规引物

<400> 9

ctcaccttct gggatccaga gtc 23

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LNA修饰的类ARMS引物

<400> 10

caaaaagatc aaagtgctga 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 常规引物

<400> 11

ctcaccttct gggatccaga gt 22

Claims (10)

1.高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于包括：PCR缓冲液、无外切酶活性的DNA聚合酶、一条LNA修饰的类ARMS引物、一条常规引物、dNTP混合液、核酸染料和参比染料。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述无外切酶活性的DNA聚合酶，既无3’-5’外切酶活性，亦无5’-3’外切酶活性。

3.根据权利要求2所述的高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于：所述无外切酶活性的DNA聚合酶为Platinum GenoType Tsp DNA Polymerase。

4.根据权利要求1所述的高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于：

所述LNA修饰的类ARMS引物3’末端是核酸类似物，核酸类似物的碳环2’氧原子和4’碳原子位置引入亚甲基桥形成锁状结构，因此LNA化学极大地增强了寡核苷酸的识别能力。

5.根据权利要求4所述的高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于：

LNA修饰的类ARMS引物，其3’端的一个碱基进行锁核酸修饰，引物序列与突变型序列互补，3’末端与野生型序列有一个碱基的差异。

6.根据权利要求1～5任一所述的高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于：

针对野生型/突变型MINA，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ ID NO:1；常规引物序列为SEQ ID NO:2；

针对野生型/突变型B-raf，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ ID NO:4，常规引物序列为SEQ ID NO:5；

针对野生型/突变型K-ras，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ ID NO:6，常规引物序列为SEQ ID NO:7；

针对野生型/突变型EGFR，LNA修饰的类ARMS引物序列为SEQ ID NO:8，常规引物序列为SEQ ID NO:9；

针对野生型/突变型EGFR，LNA修饰的类ARMS引物为SEQ ID NO:10，常规引物为SEQ IDNO:11。

7.根据权利要求1～5任一所述的高灵敏度基因突变检测试剂盒，其特征在于：

所述dNTP混合液浓度为2.5mM，包含等量的dATP、dTTP、dCTP、dGTP；

所述核酸染料为SYBR Green I；

所述参比染料为ROX。

8.利用如权利要求1～7任一所述的试剂盒进行的高灵敏度基因突变检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

在检测管中加入PCR缓冲液、无外切酶活性的DNA聚合酶、LNA修饰的类ARMS引物、常规引物、dNTP混合液、核酸染料、参比染料，以及加入待测样品，从而组成PCR反应体系，然后进行PCR反应；

当PCR反应的结果有扩增曲线时，判定待测样品属于突变样品；

反之，当PCR反应的结果无扩增曲线时，判定待测样品属于野生型样品。

9.根据权利要求8所述的高灵敏度基因突变检测方法，其特征在于：

25μl的PCR反应体系为：

10×PCR缓冲液：2.5μl

LNA修饰的类ARMS引物(10μM)：0.5μl

常规引物(10μM)：0.5μl

无外切酶活性的DNA聚合酶：1U

dNTP(2.5mM)：1.5μl

SYBR Green I(20×)：1μl

参比染料ROX(25μM)：0.5μl

待测样品：1.5ng

加水补足至25μl。

10.根据权利要求9所述的高灵敏度基因突变检测方法，其特征在于：

PCR反应条件为：95℃2分钟，1个循环；95℃15秒，60℃1秒，35个循环。