CN114891761A - Tth DNA聚合酶突变体及其应用 - Google Patents

Tth DNA聚合酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及Tth DNA聚合酶突变体及其应用。本发明提供了具有如SEQ ID No.12所示氨基酸序列或如SEQ ID No.11所示核苷酸序列所编码的Tth DNA聚合酶、具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的重组质粒以及具有如SEQ ID No.11所示核苷酸序列的重组质粒的菌株。经过进化的Thermus thermophilus热稳定DNA聚合酶在利用碱基类似物底物的DNA片段生物法合成方面具有潜在应用价值，为DNA纳米结构药物载体提供了新的构建方法和实验思路。

Description

Tth DNA聚合酶突变体及其应用
本申请要求于2022年03月25日提交中国专利局、申请号为202210300630.5、发明名称为“Tth DNA聚合酶突变体及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及Tth DNA聚合酶突变体及其应用。
背景技术
Tth DNA聚合酶是来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的一种分子量为94000道尔顿的单亚基聚合酶，它具有以下两个显著特点：一是耐高温，因为来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus，该酶在70℃条件下能够保持数小时酶活不下降；二是它除了常规的以DNA为模板的DNA聚合酶功能，还有以RNA为模板合成cDNA的反转录酶功能。
Tth DNA聚合酶最先是从嗜热栖热菌Thermus thermophilus中分离到，它与由水栖嗜热菌Thermus aquaticus产生的TaqDNA聚合酶在氨基酸序列上具有88％的同源性。TthDNA聚合酶最初是通过天然菌株发酵培养提取，但由于该菌生长的最适温度太高(75℃)，设备负担重而且生长速度极慢，生长密度低，所以有人已采用制备基因文库的办法克隆出该基因，并导入中温性微生物大肠杆菌中进行表达，产酶活力比天然菌株高12倍以上。
氟尿嘧啶，又名5-氟尿嘧啶，化学式为C4H3FN2O2(如式I所示)，是一种嘧啶类似物，属于抗代谢药的一种，主要用于治疗肿瘤。本品为最常用的尿嘧啶抗代谢药，在体内先经过一系列反应变成氟尿嘧啶脱氧核苷酸，然后发挥效应(影响DNA合成)；尚能在体内转化为氟尿嘧啶核苷掺入RNA，从而干扰蛋白质合成。主要作用在S期，但对其他各期细胞也有一定作用。易透过血脑屏障，易进入脑组织及肿瘤转移灶。约10％～30％原型由尿中排出，约60％～80％在肝内灭活变为CO2和尿素，分别由呼吸道和尿排出。本品抗瘤谱广。
Figure BDA0003610192050000021
普通实验中碱基类似物需要经过化学合成引入核酸，因此提供一种通过生物法引入碱基类似物的工具具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了Tth DNA聚合酶突变体及其应用。
本发明的目的在于提供一种热稳定性优良、符合工业应用的需求、具有较大的应用潜力的来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶及其定点突变改进的编码基因，并通过定点突变提高DNA聚合酶的热稳定性及利用碱基类似物(5-氟尿嘧啶)作为底物的能力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了DNA聚合酶突变体，包括：
第310位的甘氨酸突变为亮氨酸；和/或
第427位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或
第507位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或
第637位的甘氨酸突变为丙氨酸；和/或
第638位的赖氨酸突变为精氨酸。
在本发明的一些具体实施方案中，上述DNA聚合酶突变体，包括：
(I)、具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；和/或
(II)、具有如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或
(III)、具有与(I)或(II)任意所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个和/或100个。
在本发明的一些具体实施方案中，编码上述DNA聚合酶突变体的核酸分子包括：
(IV)、具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和/或
(V)、具有如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似；和/或
(VI)、具有与(IV)或(V)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个和/或100个。
本发明还提供了重组载体，包括上述的核酸分子。
在本发明的一些具体实施方案中，上述重组载体的骨架载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体和/或哺乳动物表达载体；
所述酵母表达载体包括pPIC9K。
本发明还提供了宿主，转染或转化上述的重组载体；
所述宿主，包括菌株和/或细胞株。
在本发明的一些具体实施方案中，上述菌株包括毕赤酵母菌。
在本发明的一些具体实施方案中，上述菌株包括细菌、酵母菌和/或霉菌；所述细菌包括大肠杆菌和/或芽孢杆菌。
在本发明的一些具体实施方案中，上述细胞株包括BHK细胞、CHO细胞和/或HEK293细胞。
本发明还提供了上述DNA聚合酶突变体在引入碱基类似物中的应用；
所述碱基类似物包括5-氟尿嘧啶。
本发明还提供了上述DNA聚合酶突变体在构建DNA纳米结构药物载体中的应用。
本发明还提供了上述DNA聚合酶突变体在制备引入碱基类似物的食品和/或药物中的应用。
本发明还提供了食品、药物和/或试剂，包括上述DNA聚合酶突变体、上述重组载体，和/或上述宿主，以及可接受的辅料和/或助剂。
本发明还提供了将碱基类似物引入核酸的方法，以碱基类似物为反应体系成分之一，加入所述DNA聚合酶突变体，进行PCR，获得含有碱基类似物的核酸产物。
为了实现上述发明目的，本发明的热稳定的DNA聚合酶的编码基因，及其定点突变基因序列的异源表达具体如下：
本发明提供了一种来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶突变序列，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，记为M1-Tth-DNApolymerase。
所述的Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶基因与SEQ ID No.11所示核苷酸序列具有80％以上的一致性、更优的是具有85％以上的一致性或与所述SEQ ID No.11所示序列具有90％以上的一致性。
本发明提供了一种根据所述的Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶编码基因，所述的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示或其无义突变序列，记为M1-Tth-DNA polymerase。
所述热稳定的DNA聚合酶基因编码的蛋白序列与所述氨基酸序列具有80％以上的一致性，更优的是具有90％以上的一致性。
本发明提供了一种含有编码所述的氨基酸片段的核苷酸序列的重组质粒，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pPIC9K的多克隆位点而获得，记为pPIC9K-M1-Tth-DNApolymerase。
本发明提供了上述热稳定的DNA聚合酶的编码基因的突变序列，主要突变包括5个，第310位的甘氨酸突变为亮氨酸。第427位的赖氨酸突变为精氨酸，第507位的赖氨酸突变为精氨酸，第637位的甘氨酸突变为丙氨酸，第638位的赖氨酸突变为精氨酸。
本发明提供了以上重组表达所述的具有热稳定的DNA聚合酶活性的氨基酸片段(M1-Tth-DNA polymerase)的载体，所述的载体是细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体或哺乳动物表达载体。
其中所述细菌表达载体是大肠杆菌表达载体或芽孢杆菌表达载体。
本发明提供了根据所述的重组表达的具有DNA聚合酶活性的氨基酸片段(M1-Tth-DNA polymerase)在碱基类似物合成、食品、或医药中的应用。
本发明提供了一种来自嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶基因和氨基酸序列。成功构建了含M1-Tth-DNA polymerase突变序列的重组质粒，本发明得到的毕赤酵母重组细胞，适于上述DNA聚合酶基因的表达，利用1％甲醇诱导得到的重组表达蛋白。
本发明的Tth DNA聚合酶突变体及其应用有如下效果：
本发明涉及一种来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶及其定点突变改进。
本发明成功构建了含Tth DNA聚合酶Tth-DNA polymerase的重组质粒，以及含突变后的M1-Tth-DNA polymerase的重组质粒。从而获得多种高表达菌株，包括大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌及霉菌。本发明得到的重组宿主细胞，适于上述Tth DNA聚合酶基因的表达。
本发明突变的Tth DNA聚合酶能够在普通PCR中引入碱基类似物5-氟尿嘧啶。普通实验中碱基类似物需要经过化学合成引入，通过对嗜热栖热菌Thermus thermophilus聚合酶的改造，可用通过PCR程序引入碱基类似物。
上述基因生产的重组酶M1-Tth-DNA polymerase能够用于碱基类似物(包括但不限于5-氟尿嘧啶)的PCR程序引入PCR产物，并可用于DNA纳米结构药物载体的生物法构建。
经过进化的Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶，在利用碱基类似物底物的DNA片段生物法合成方面具有潜在应用价值，为DNA纳米结构药物载体提供了新的构建方法和实验思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示Thermus thermophilus聚合酶基因PCR图；其中，M为Marker；泳道1、2为Thermus thermophilus聚合酶基因；
图2示pPIC9K表达载体图谱；
图3示第310位的甘氨酸突变为亮氨酸蛋白三维结构分析；
图4示第427位的赖氨酸突变为精氨酸蛋白三维结构分析；
图5示第507位的赖氨酸突变为精氨酸蛋白三维结构分析；
图6示第637位的甘氨酸突变为丙氨酸蛋白三维结构分析；
图7示第638位的赖氨酸突变为精氨酸蛋白三维结构分析；
图8示嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶毕赤酵母GS115重组菌在1％甲醇下诱导表达的蛋白电泳图；其中，M为蛋白Marker；1～3依次为具有DNA聚合酶活性的氨基酸片段(M1-Tth-DNA polymerase)诱导第三天至第五天；
图9示M1-Tth-DNA polymerase与普通TaqDNA polymerase基因扩增结果；其中，M为Marker；泳道2和泳道3为本专利进化改造的M1-Tth-DNA polymerase；泳道4为普通TaqDNA polymerase；
图10示添加5-氟尿嘧啶三磷酸(5-Fluoro-dUTP)、dATP、dCTP、dGTP作为底物PCR片段分子量；
图11示添加5-氟尿嘧啶三磷酸(5-Fluoro-dUTP)、dATP、dCTP、dGTP作为底物PCR片段液相图；
图12示添加5-氟尿嘧啶三磷酸(5-Fluoro-dUTP)、dATP、dCTP、dGTP作为底物PCR片段质谱图；
图13示正常PCR片段(添加dTTP、dATP、dCTP、dGTP作为底物)分子量；
图14示正常PCR片段(添加dTTP、dATP、dCTP、dGTP作为底物)分子量液相图；
图15示正常PCR片段(添加dTTP、dATP、dCTP、dGTP作为底物)分子量质谱图。
具体实施方式
本发明公开了涉及Tth DNA聚合酶突变体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明旨在提供：
a、一种点突变改造的来源于嗜热栖热菌Thermus thermophilus的热稳定的DNA聚合酶，其特征在于，所述的热稳定的DNA聚合酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，记为M1-Tth-DNA polymerase。
b、根据“a”中所述的热稳定的DNA聚合酶，其特征在于，所述的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示，记为M1-Tth-DNA polymerase。
c、含有编码“a”中所述的热稳定的DNA聚合酶的核苷酸序列的重组质粒，其特征在于，通过将所述的核苷酸序列克隆至载体pPIC9K的多克隆位点而获得。
d、一种包括宿主菌和“c”所述的重组质粒的重组菌，所述的载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体或哺乳动物表达载体；所述的细菌表达载体包括大肠杆菌表达载体或芽孢杆菌表达载体。
e、上述基因生产的重组酶M1-Tth-DNA polymerase能够用于碱基类似物(包括但不限于5-氟尿嘧啶)的PCR程序引入PCR产物，并可用于DNA纳米结构药物载体的生物法构建。
下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂或者耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：Thermus thermophilus聚合酶基因的扩增及进化
1.1菌株及其培养
本发明所述的聚合酶基因克隆自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)。
本发明所述的嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(DSMZ579)可以从德国微生物菌种保藏中心直接购买，菌种编号为DSMZ579。因此，本发明所述的嗜热栖热菌可通过商购途径获得，也可以通过野外采集和其他途径获得。
接种甘油菌至1号培养基，70℃培养2～3天收集菌体，用于基因组提取。
1.2基因组提取
参照Generay细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明书。
1.3嗜热栖热菌DNA聚合酶基因的扩增
在NCBI上找到嗜热栖热菌DNA聚合酶相近种属基因序列，设计引物：
579-AU(SEQ ID No.1)：
5'gtagaattccctagggcggccgcgaATGGAGGCGATGCTTCCGCTCTTTGAAC3'
579-AD(SEQ ID No.2)：
5'aaggcgaattaattcgcggccgcCTAACCCTTGGCGGAAAGCCAGTCC3'
进行PCR扩增，PCR体系为(表1)：
表1
Figure BDA0003610192050000081
反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，30个循环；72℃延伸10min；保存在4℃。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，进行后续表达载体的构建。
1.4Thermus thermophilus聚合酶基因定点突变进化
以Tth DNA聚合酶Tth-DNA polymerase为模板，使用购自南京诺唯赞生物科技的Fast MutagenesisKitV2进行定点突变。主要突变包括5个，第310位的甘氨酸突变为亮氨酸。第427位的赖氨酸突变为精氨酸，第507位的赖氨酸突变为精氨酸，第637位的甘氨酸突变为丙氨酸，第638位的赖氨酸突变为精氨酸。具体步骤如下：
1.4.1使用设计的引物对Tth-DNA polymerase进行扩增。
反应体系如下(表2)：
表2
Figure BDA0003610192050000091
310位点突变上游引物(SEQ ID No.3)：
5'-gaaggggccttcgtgctattcgtcctctcccgc-3'
310位点突变下游引物(SEQ ID No.4)：
5'-gcgggagaggacgaatagcacgaaggccccttc-3'
427位点突变上游引物(SEQ ID No.5)：
5'-ctcgagggggaggagaggctcctttgg-3'
427位点突变下游引物(SEQ ID No.6)：
5'-ccaaaggagcctctcctccccctcgag-3'
507位点突变上游引物(SEQ ID No.7)：
5'-tcccgccttggggaggacgcaaaagacag-3'
507位点突变下游引物(SEQ ID No.8)：
5'-ctgtcttttgcgtcctccccaaggcggga-3'
637-638位点上游引物(SEQ ID No.9)：
5'-ggtcttccaggaggcgagggacatccacaccc-3'
637-638位点下游引物(SEQ ID No.10)：
5'-gggtgtggatgtccctcgcctcctggaagacc-3'
精确配置完毕的PCR反应液并混匀后，使用表3的PCR程序进行PCR扩增。
表3
Figure BDA0003610192050000101
1.4.2扩增产物消化
PCR扩增产物取部分加入核酸染料经过琼脂糖凝胶电泳验证有产物后，直接加入1μL的DpnI进行甲基化质粒的消化，使用移液枪将反应体系混匀，置于37℃水浴锅消化1.5小时。
1.4.3连接
对于单碱基(或连续多碱基)定点突变，于冰上配制以下连接体系(表4)：
表4
Figure BDA0003610192050000102
使用移液枪轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。
1.4.4转化
连接结束后将产物放置在冰上进行转化，挑菌进行菌落PCR及测序验证。
图1为Thermus thermophilus聚合酶基因PCR图，泳道1、2为Thermusthermophilus聚合酶基因。测序结果见SEQ ID No.11。
实施例2：含有DNA聚合酶的毕赤酵母重组表达载体的构建及表达
2.1重组表达载体pPIC9K-M1-Tth-DNA polymerase的构建
含pPIC9K(图2)的大肠杆菌DH5α宿主菌用AxyPrep质粒DNA提取试剂盒提取质粒(操作步骤参照说明书)，用NotI(购自Themo公司)进行单酶切，切胶回收线性载体片段，然后用ClonExpress Ultra One Step CloningKit试剂盒(操作步骤参照说明书)连接载体与目的基因(实施例1中获得)，转化至大肠杆菌DH5α(购自天根生化科技(北京)有限公司)，PCR验证阳性克隆并测序，将测序结果在NCBI上进行比对并分析表明，所获得的DNA聚合酶基因DNA由2505个核苷酸组成，序列如SEQ ID No.11所示(突变碱基加粗并加下划线)：
Figure BDA0003610192050000111
Figure BDA0003610192050000121
该DNA编码834个氨基酸，突变残基的三维结构分析依次如图3～7所示，其序列如SEQ ID No.12所示(突变残基加粗并加下划线)：
Figure BDA0003610192050000122
2.2毕赤酵母系统表达
用SacI对pPIC9K-M1-Tth-DNA polymerase进行单酶切，运用电转化方法将线性化的重组质粒转入毕赤酵母感受态细胞中，用含不同浓度梯度的G418平板进行筛选。挑取在高浓度G418(4mg/mL)平板中生长出的转化子，接种至含有25mL液体BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃，220r/min培养24h；6000rpm离心约10min后，收集菌体，用含有25mL液体BMMY培养基，将菌体重悬于250mL三角瓶中，30℃，220r/min，在培养的过程中，每隔24h补加一次甲醇，每次补加都要使其终浓度为1％(v/v)；在甲醇诱导表达的同时，每隔24h取一次样，将发酵液于6000rpm离心10min，收集上清液和菌体，存于-40℃。
图8为Thermus thermophilus聚合酶毕赤酵母GS115重组菌在1％甲醇下诱导表达的蛋白电泳图，其中M为蛋白Marker，1～3为pPIC9K-M1-Tth-DNA polymerase诱导第三天至第五天。
实施例3：Thermus thermophilus聚合酶引入碱基类似物实验
设计如下PCR条带序列，利用上述Thermus thermophilus聚合酶进行PCR反应，实验中用5-Fluoro-dUTP代替普通PCR反应中的dTTP。
反应体系如下(表5)：
表5
Figure BDA0003610192050000131
模板DNA：
TTGACCTGTGAATTACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA(SEQ ID No.13)
上游引物：5’-TTGACCTGTGAA-3’(SEQ ID No.14)
下游引物：5’-/DMT/-TACTATGGCGGC-3’(SEQ ID No.15)
反应程序如下(表6)：
表6
Figure BDA0003610192050000132
电泳结果如图9。其中，2、3号条带为本专利进化改造的M1-Tth-DNA polymerase，可以得到符合预期的条带；4号条带为普通TaqDNA polymerase，不能将5-Fluoro-dUTP引入PCR产物。图10～图15为上述PCR产物的质谱分析结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海威高医疗技术发展有限公司
<120> Tth DNA聚合酶突变体及其应用
<130> MP22011511
<150> 202210300630.5
<151> 2022-03-25
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtagaattcc ctagggcggc cgcgaatgga ggcgatgctt ccgctctttg aac 53
<210> 2
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggcgaatt aattcgcggc cgcctaaccc ttggcggaaa gccagtcc 48
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggggcct tcgtgctatt cgtcctctcc cgc 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgggagagg acgaatagca cgaaggcccc ttc 33
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgaggggg aggagaggct cctttgg 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaaaggagc ctctcctccc cctcgag 27
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcccgccttg gggaggacgc aaaagacag 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgtcttttg cgtcctcccc aaggcggga 29
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtcttccag gaggcgaggg acatccacac cc 32
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gggtgtggat gtccctcgcc tcctggaaga cc 32
<210> 11
<211> 2505
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atggaggcga tgcttccgct ctttgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120
gtgcaggcgg tctacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180
aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccctcct tccgccacga ggcctacgag 240
gcctacaagg cggggagggc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300
aaggagctgg tggacctcct ggggtttacc cgcctcgagg tccccggcta cgaggcggac 360
gacgttctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaaaggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420
accgccgacc gcgacctcta ccaactcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480
ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gcctcaggcc ggagcagtgg 540
gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600
ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa cctcctcaag 660
aacctggacc gggtaaagcc agaaaacgtc cgggagaaga tcaaggccca cctggaagac 720
ctcaggctct ccttggagct ctcccgggtg cgcaccgacc tccccctgga ggtggacctc 780
gcccaggggc gggagcccga ccgggagggg cttagggcct tcctggagag gctggagttc 840
ggcagcctcc tccacgagtt cggcctcctg gaggcccccg cccccctgga ggaggccccc 900
tggcccccgc cggaaggggc cttcgtgctc ttcgtcctct cccgccccga gcccatgtgg 960
gcggagctta aagccctggc cgcctgcagg gacggccggg tgcaccgggc agcagacccc 1020
ttggcggggc taaaggacct caaggaggtc cggggcctcc tcgccaagga cctcgccgtc 1080
ttggcctcga gggaggggct agacctcgtg cccggggacg accccatgct cctcgcctac 1140
ctcctggacc cctccaacac cacccccgag ggggtggcgc ggcgctacgg gggggagtgg 1200
acggaggacg ccgcccaccg ggccctcctc tcggagaggc tccatcggaa cctccttaag 1260
cgcctcgagg gggaggagcg gctcctttgg ctctaccacg aggtggaaaa gcccctctcc 1320
cgggtcctgg cccacatgga ggccaccggg gtacggcggg acgtggccta ccttcaggcc 1380
ctttccctgg agcttgcgga ggagatccgc cgcctcgagg aggaggtctt ccgcttggcg 1440
ggccacccct tcaacctcaa ctcccgggac cagctggaaa gggtgctctt tgacgagctt 1500
aggcttcccg ccttggggcg gacgcaaaag acaggcaagc gctccaccag cgccgcggtg 1560
ctggaggccc tacgggaggc ccaccccatc gtggagaaga tcctccagca ccgggagctc 1620
accaagctca agaacaccta cgtggacccc ctcccaagcc tcgtccaccc gaggacgggc 1680
cgcctccaca cccgcttcaa ccagacggcc acggccacgg ggaggcttag tagctccgac 1740
cccaacctgc agaacatccc cgtccgcacc cccttgggcc agaggatccg ccgggccttc 1800
gtggccgagg cgggttgggc gttggtggcc ctggactata gccagataga gctccgcgtc 1860
ctcgcccacc tctccgggga cgaaaacctg atcagggtct tccaggaggc gcgggacatc 1920
cacacccaga ccgcaagctg gatgttcggc gtccccccgg aggccgtgga ccccctgatg 1980
cgccgggcgg ccaagacggt gaacttcggc gtcctctacg gcatgtccgc ccataggctc 2040
tcccaggagc ttgccatccc ctacgaggag gcggtggcct ttatagagcg ctacttccaa 2100
agcttcccca aggtgcgggc ctggatagaa aagaccctgg aggaggggag gaagcggggc 2160
tacgtggaaa ccctcttcgg aagaaggcgc tacgtgcccg acctcaacgc ccgggtgaag 2220
agcgtcaggg aggccgcgga gcgcatggcc ttcaacatgc ccgtccaggg caccgccgcc 2280
gacctcatga agctcgccat ggtgaagctc ttcccccgcc tccgggagat gggggcccgc 2340
atgctcctcc aggtccacga cgagctcctc ctggaggccc cccaagcgcg ggccgaggag 2400
gtggcggctt tggccaagga ggccatggag aaggcctatc ccctcgccgt gcccctggag 2460
gtggaggtgg ggatggggga ggactggctt tccgccaagg gttag 2505
<210> 12
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Glu Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1 5 10 15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
20 25 30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
35 40 45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
50 55 60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65 70 75 80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
85 90 95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
100 105 110
Glu Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
115 120 125
Lys Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
130 135 140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145 150 155 160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg
165 170 175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
180 185 190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
195 200 205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg
210 215 220
Val Lys Pro Glu Asn Val Arg Glu Lys Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225 230 235 240
Leu Arg Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Glu Val Asp Leu Ala Gln Gly Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
260 265 270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
275 280 285
Leu Leu Glu Ala Pro Ala Pro Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro
290 295 300
Glu Gly Ala Phe Val Leu Phe Val Leu Ser Arg Pro Glu Pro Met Trp
305 310 315 320
Ala Glu Leu Lys Ala Leu Ala Ala Cys Arg Asp Gly Arg Val His Arg
325 330 335
Ala Ala Asp Pro Leu Ala Gly Leu Lys Asp Leu Lys Glu Val Arg Gly
340 345 350
Leu Leu Ala Lys Asp Leu Ala Val Leu Ala Ser Arg Glu Gly Leu Asp
355 360 365
Leu Val Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro
370 375 380
Ser Asn Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp
385 390 395 400
Thr Glu Asp Ala Ala His Arg Ala Leu Leu Ser Glu Arg Leu His Arg
405 410 415
Asn Leu Leu Lys Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr
420 425 430
His Glu Val Glu Lys Pro Leu Ser Arg Val Leu Ala His Met Glu Ala
435 440 445
Thr Gly Val Arg Arg Asp Val Ala Tyr Leu Gln Ala Leu Ser Leu Glu
450 455 460
Leu Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Glu Glu Glu Val Phe Arg Leu Ala
465 470 475 480
Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu
485 490 495
Phe Asp Glu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Gly Arg Thr Gln Lys Thr Gly
500 505 510
Lys Arg Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His
515 520 525
Pro Ile Val Glu Lys Ile Leu Gln His Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys
530 535 540
Asn Thr Tyr Val Asp Pro Leu Pro Ser Leu Val His Pro Arg Thr Gly
545 550 555 560
Arg Leu His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu
565 570 575
Ser Ser Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu
580 585 590
Gly Gln Arg Ile Arg Arg Ala Phe Val Ala Glu Ala Gly Trp Ala Leu
595 600 605
Val Ala Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu
610 615 620
Ser Gly Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Ala Arg Asp Ile
625 630 635 640
His Thr Gln Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Pro Glu Ala Val
645 650 655
Asp Pro Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Val Asn Phe Gly Val Leu
660 665 670
Tyr Gly Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr
675 680 685
Glu Glu Ala Val Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys
690 695 700
Val Arg Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Lys Arg Gly
705 710 715 720
Tyr Val Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Asn
725 730 735
Ala Arg Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn
740 745 750
Met Pro Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val
755 760 765
Lys Leu Phe Pro Arg Leu Arg Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln
770 775 780
Val His Asp Glu Leu Leu Leu Glu Ala Pro Gln Ala Arg Ala Glu Glu
785 790 795 800
Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Met Glu Lys Ala Tyr Pro Leu Ala
805 810 815
Val Pro Leu Glu Val Glu Val Gly Met Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala
820 825 830
Lys Gly
<210> 13
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgacctgtg aattacattc ctaagtctga aacattacag cttgctacac gagaagagcc 60
gccatagta 69
<210> 14
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttgacctgtg aa 12
<210> 15
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> t是由DMT修饰的
<400> 15
tactatggcg gc 12

Claims (10)

1.DNA聚合酶突变体，其特征在于，包括：
第310位的甘氨酸突变为亮氨酸；和/或
第427位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或
第507位的赖氨酸突变为精氨酸；和/或
第637位的甘氨酸突变为丙氨酸；和/或
第638位的赖氨酸突变为精氨酸。
2.如权利要求1所述的DNA聚合酶突变体，其特征在于，包括：
(I)、具有如SEQ ID No.12所示的氨基酸序列；和/或
(II)、具有如(I)所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与(I)所示的氨基酸序列功能相同或相似；和/或
(III)、具有与(I)或(II)任意所示的氨基酸序列至少有80％同源性的氨基酸序列；
所述多个为2个～100个。
3.如权利要求1或2所述的DNA聚合酶突变体，其特征在于，编码所述DNA聚合酶突变体的核酸分子包括：
(IV)、具有如SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；和/或
(V)、具有如(IV)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(IV)所示的核苷酸序列功能相同或相似；和/或
(VI)、具有与(IV)或(V)任意所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列；
所述多个为2个～100个。
4.重组载体，其特征在于，包括如权利要求3所述的核酸分子。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于，骨架载体包括细菌表达载体、酵母表达载体、霉菌表达载体和/或哺乳动物表达载体；
所述酵母表达载体包括pPIC9K。
6.宿主，其特征在于，转染或转化如权利要求4或5所述的重组载体；
所述宿主，包括菌株和/或细胞株。
7.如权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶突变体在引入碱基类似物中的应用；
所述碱基类似物包括5-氟尿嘧啶。
8.如权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶突变体在构建DNA纳米结构药物载体中的应用。
9.如权利要求1至3任一项所述的DNA聚合酶突变体在制备引入碱基类似物的食品和/或药物中的应用。
10.食品、药物和/或试剂，其特征在于，包括如权利要求1至3任意所述的DNA聚合酶突变体、如权利要求4或5所述的重组载体，和/或如权利要求6所述的宿主，以及可接受的辅料和/或助剂。
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