JP3170229B2 - 変性された熱安定性ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、リボヌクレオシド
三リン酸を組込むための増強された効率を有する熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼに関する。本発明は、そのような
ポリメラーゼを単離するための方法及び手段を提供す
る。本発明の酵素は、多くの用途及び特に核酸配列決定
への適用のために有用である。従って、本発明はまた、
核酸配列の分析のための改良された方法も提供する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ配列決定は一般的に、１つの定義
された末端及び１つの可変末端を有する一本鎖ＤＮＡフ
ラグメントの４つの集団の生成を包含する。可変末端は
一般的に、特定のヌクレオチド塩基（グアニン（Ｇ）、
アデニン（Ａ）、チミジン（Ｔ）又はシトシン（Ｃ））
で終結する。４つの異なった組のフラグメントは、それ
らの長さに基づいて個々に分離される。１つのそのよう
な方法においては、高分離能ポリアクリルアミドゲルが
使用される。そのようなゲル上の個々のバンドは、ＤＮ
Ａ配列における特定のヌクレオチドに対応し、従って、
配列における位置を同定する。

【０００３】頻繁に使用されるＤＮＡ配列決定法は、Ｄ
ＮＡ鎖の酵素的合成を包含するジデオキシ又は鎖−終結
の配列決定法である（Ｓａｎｇｅｒなど．，１９７７，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７４：５４６
３）。４つの別々の合成が一般的に行なわれ、個々の反
応は適切な鎖−終結ヌクレオチド、たとえばジデオキシ
ヌクレオチドの組込みを通して特定の塩基（Ｇ，Ａ，Ｔ
又はＣ）での終結を引き起こされる。その反応生成物
は、個々のレーンがＧ，Ａ，Ｔ又はＣのいづれかのみに
対応するので、容易に解釈することができる。

【０００４】ジデオキシ鎖−終結法においては、短い一
本鎖プライマーが一本鎖鋳型にアニールされる。プライ
マーは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）が組込
まれるまで、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）の組込
みによりその３’端で伸長される。ｄｄＮＴＰが組込ま
れる場合、伸長はその塩基で停止する。しかしながら、
ＤＮＡ複製の再現性を確保するため、ＤＮＡポリメラー
ゼは、それらの正常な基質、すなわちｄＮＴＰの組込み
のために及び「異常なヌクレオチド」と称されるヌクレ
オチド類似体の組込みに対抗して、非常に強い偏向（バ
イアス）を有する。ＤＮＡ合成の場合、リボヌクレオチ
ド（ｒＮＴＰ）は、ｄｄＮＴＰのように、ＤＮＡポリメ
ラーゼの正常なインビボ基質ではないので、異常なヌク
レオチドと思われる。細胞においては、この性質は、成
長するＤＮＡ鎖における、異常な塩基、たとえばデオキ
シイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）又はｒＮＴＰの組込み
を抑制する。

【０００５】２種の頻繁に使用される自動配列決定法
は、色素プライマー及び色素ターミネーター配列決定で
ある。それらの方法は、螢光ラベルされた成分と共に使
用するために適切である。配列決定はまた、放射性ラベ
ルされた成分を用いて行なわられ得るが、螢光に基づく
配列決定が、ますます好ましくなっている。手短に言及
すれば、色素−プライマー配列決定においては、螢光ラ
ベルされたプライマーがラベルされていないｄｄＮＴＰ
と組合して使用される。この方法は４種の合成反応、及
び配列決定されるべき個々の鋳型のためにゲル上に４種
までのレーン（１つが、塩基特異的終結生成物の個々に
対応する）を必要とする。プライマー伸長に続いて、ジ
デオキシヌクレオチドが組込まれた終結生成物を含む配
列決定反応混合物は通常、ＤＮＡ配列決定ゲル上での電
気泳動により分析される。

【０００６】電気泳動による分離に続いて、螢光ラベル
された生成物がゲルの底部でレーザーにより励起され、
そして螢光が適切なモニターにより検出される。自動化
されたシステムにおいては、検出器は、反応混合物がゲ
ルマトリックスを通過するにつれて、どのラベル成分が
使用されたかを検出するために、電気泳動の間、ゲルの
底部を走査する（Ｓｉｍｔｈなど．，１９８６，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２１：６７４〜６７９）。この方法の変法に
おいては、４種のプライマーが異なった螢光マーカーに
より個々にラベルされる。４種の別々の配列決定反応が
完結した後、反応混合物が組合され、そしてその組合さ
れた反応混合物が単一のレーンにおいてゲル分析にゆだ
ねられ、それにより、異なった螢光標識（１つが、４種
の異なった塩基特異的終結生成物の個々に対応する）が
個々に検出される。

【０００７】あるいは、色素−ターミネーター配列決定
法が使用される。この方法においては、ＤＮＡポリメラ
ーゼがＤＮＡプライマーの成長端上にｄＮＴＰ及び螢光
ラベルされたｄｄＮＴＰを組込むために使用される（Ｌ
ｅｅなど．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ ２０：２４７１）。この方法は、色素
ラベルされたプライマーを合成しない利点を提供する。
さらに、色素−ターミネーター反応は、すべての４種の
反応が同じ管において行なわれ得ることにおいてより便
利である。ｄｄＮＴＰに対しての低下した識別性を有す
る修飾された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが記載されて
いる（ヨーロッパ特許出願、公開番号、ＥＰ−Ａ−６５
５，５０６号及びアメリカ特許出願０８／４４８，２２
３号を参照のこと）。

【０００８】典型的な修飾された熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼは、位置６６７でチロシン残基（フェニルアラニ
ン残基の代わりに）を有するＴ．アクアチカスからのＤ
ＮＡポリメラーゼの変異形、すなわちＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼのＦ６６７Ｙ変異形である。Ｈｏｆｆｍａｎ
ｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅにより製造され、そしてＰｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販されているＡｍｐｌｉＴａｑ
（登録商標）ＦＳは、標的の効果的な核酸配列決定のた
めに必要とされるｄｄＮＴＰの量を数百〜数千部、減じ
る。ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＦＳは、Ｆ６６７Ｙ
変異及びさらに、位置４６にアスパラギン酸残基（グリ
シン残基の代わりに；Ｇ４６Ｄ変異）を有するＴ．アク
アチカスからのＤＮＡポリメラーゼの変異形である。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】精密且つ費用効果的な
核酸ＤＮＡ配列分析のためのもう１つの核酸合成法を可
能にする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについての必要性
が存在する。ジデオキシヌクレオチドの使用を必要とし
ない、螢光に基づく方法が所望される。本発明はそれら
の必要性と取り組む。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、アミノ酸配列
モチーフ Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa（配列番号１）
〔ここで、この配列の位置４の“Xaa ”はいづれのアミ
ノ酸残基でも良いが、しかしグルタミン酸残基（Glu ）
ではなく、そしてこの配列の位置７の“Xaa ”はバリン
残基（Val ）又はイソロイシン残基（Ile ）である〕を
含んで成る、鋳型依存性熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵
素を供給する。アミノ酸について一文字のコードで表わ
される場合、この配列モチーフは、ＳＱＩＸＬＲＶ／Ｉ
〔ここで、この配列の位置４の“Ｘ”はいづれのアミノ
酸配列でも良いが、しかしグルタミン酸残基ではない〕
として表わされ得る。前記配列モチーフ〔ここで、この
配列モチーフの位置４の“Ｘ”はグルタミン酸残基では
ない〕を含んで成るアミノ酸配列を有する熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼ酵素は、これまで知られている熱安定性
ポリメラーゼに比較してリボヌクレオチドの組込みに対
して低下した識別性を有する。成長するＤＮＡ鎖におい
て、リボヌクレオチドは異常なヌクレオチドである。

【００１１】従って、第１の観点において、本発明の新
規酵素は、これまでに同定された熱安定性ＤＮＡ合成酵
素よりも数オーダー、より効果的に、異常な塩基類似
体、たとえばリボヌクレオチドを、成長するＤＮＡ鎖中
に組込む。それらの酵素をコードする遺伝子、組換え発
現ベクター及びそのようなベクターを含んで成る宿主細
胞がまた、本発明により供給される。そのような形質転
換された宿主細胞により、多量の精製された熱安定性ポ
リメラーゼ酵素が供給され得る。

【００１２】本発明によれば、デオキシリボヌクレオチ
ドを正確に組込む能力を保持しながら、リボヌクレオチ
ドを組込むポリメラーゼの能力の効率を増強する、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列内の領域又は配
列モチーフが同定される。この領域における変更、たと
えば１又は複数のアミノ酸の交換（たとえば、特定部位
の突然変異誘発により導入される）は、ＤＮＡ鋳型上で
ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡキメラもしくはハイブリッド
鎖を合成することができる熱安定性ポリメラーゼ酵素を
供給する。

【００１３】もう１つの観点においては、本発明は、鎖
−終結性ｄｄＮＴＰの必要性が排除される、標的核酸の
配列を決定するための改良された方法及び組成物を提供
する。本発明において提供される改良された方法によれ
ば、リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）がプライマー伸長生
成物中に組込まれる。本発明の酵素はｒＮＴＰ又はｄＮ
ＴＰのいづれかを正確且つ効果的に組込むので、配列決
定反応は両ヌクレオチドの混合物を使用することができ
る。

【００１４】プライマー伸長に続いて、新たに合成され
たオリゴヌクレオチド生成物は、当業界において知られ
ている方法、たとえば加水分解により、組込まれたｒＮ
ＴＰにおいて切断され得、それにより、常用の手段、た
とえばゲル電気泳動による分画及び配列分析のための適
切なフラグメントの集団を提供する。それらの方法は、
本発明において提供される新規の熱安定性ポリメラーゼ
酵素を利用する。従って、この観点において、本発明
は、決定的なモチーフ Ser Gln Ile Xaa Leu ArgXaa
（配列番号１）〔ここで、位置４の“Xaa ”はいづれの
アミノ酸残基でも良いが、しかしグルタミン酸残基（Gl
u ）ではなく、そして位置７の“Xaa ”はバリン（Val
）又はイソロイシン残基（Ile ）である〕を含んで成
ることを特徴とする熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を
提供する。

【００１５】本発明のもう１つの観点においては、本明
細書に記載される修飾されたポリメラーゼは、従来のデ
オキシリボヌクレオチドに不在である、２’位置にヒド
ロキシル基又は他の置換基を含むリボヌクレオチド又は
類似体を組込むための手段を提供する。それらのヌクレ
オチドは、特異的にラベルされ、ＤＮＡ配列決定への適
用のためへのジデオキシヌクレオチドの従来の使用に代
わるものを提供する。

【００１６】本発明の変異型熱安定性ポリメラーゼ酵素
は、その対応する野生型酵素よりも一層効果的に異常な
ヌクレオチド、特にリボヌクレオチドを組込む能力によ
り特徴づけられる。本発明の好ましい態様においては、
組込まれるべきその異常なヌクレオチドは、鎖−終結塩
基類似体、たとえば２’−ヒドロキシ−３’デオキシＡ
ＴＰ（コルジセピン三リン酸）、ＡＴＰの“リボターミ
ネーター”類似体、又は非−鎖−終結ヌクレオチド、た
とえばｒＮＴＰであり得る。

【００１７】本発明のもう１つの観点においては、その
対応する野生型酵素よりも一層効果的に、異常なヌクレ
オチド、たとえばリボヌクレオチドを組込む能力により
特徴づけられる変異型熱安定性ポリメラーゼ酵素が提供
される。従って、この観点において、本発明は、（ａ）
の生来形において、ポリメラーゼがアミノ酸配列 SerGl
n Ile Glu Leu Arg Xaa（配列番号２）〔ここで、この
配列の位置７の“Xaa”はバリン残基（Val ）又はイソ
ロイシン残基（Ile ）である〕を含んで成り；（ｂ）ア
ミノ酸配列が好ましくは、該配列の位置４で、組換え酵
素において変異され、その結果、位置４のグルタミン酸
残基が他のアミノ酸残基、好ましくはグリシン残基であ
り；そして（ｃ）その組換え酵素が前記酵素の生来形に
比較して、リボヌクレオチド及びリボヌクレオチド類似
体の組込みに対して低められた識別性を有することによ
りそれぞれ特徴づけられる組換え熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼ酵素を提供する。

【００１８】本発明のもう１つの観点においては、本発
明のポリメラーゼは、増幅生成物及びプライマー伸長生
成物を断片化する便利な手段を提供し、そのような断片
化された生成物はハイブリダイゼーションに基づく方法
及び種々の配列検出法において有用である。

【００１９】本発明の酵素及びそれらをコードする遺伝
子は、通常のヌクレオチド及び少なくとも１つのリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチド類似体の混合物を含ん
で成るＤＮＡ配列決定反応への使用のための組成物を提
供するために使用され得る。本発明の好ましい態様にお
いては、異常なヌクレオチドはリボヌクレオチドであ
り、そしてそのリボヌクレオチドの濃度はその対応する
デオキシリボヌクレオチドの濃度よりも低く、すなわち
ｒＮＴＰ：ｄＮＴＰの比は１：１又はそれより小であ
る。本発明の酵素はまた、キットの型での商品化のため
にも適切であり、このキットはまた、核酸配列決定反応
のために必要な次の追加の成分、たとえばｄＮＴＰ，ｒ
ＮＴＰ、緩衝液及び／又はプライマーのいづれかを包含
する。

【００２０】本発明は、特許請求の範囲において定義さ
れるような新規且つ改良された修飾熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼ酵素を供給する。本発明の酵素は、それらの新
規ポリメラーゼが由来するその対応する野生型ポリメラ
ーゼ酵素又はこれまで知られているポリメラーゼよりも
異常なヌクレオシド三リン酸をより効果的に組込む。そ
れらの修飾された酵素をコードするＤＮＡ配列、変性さ
れた酵素を発現するベクター及びそのようなベクターに
より形質転換された細胞もまた、提供される。本発明の
酵素は、従来技術から知られているＤＮＡ配列決定法よ
りも好都合な新規なＤＮＡ配列決定法の実施を可能にす
る。

【００２１】本発明の理解を促進するために、多くの用
語が下記に定義される。用語“通常の”とは、核酸塩
基、ヌクレオシド三リン酸、又はヌクレオチドに言及す
る場合、記載されるポリヌクレオチド中に天然に存在す
るものを意味する（すなわち、ＤＮＡに関しては、それ
らはｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰであ
る）。さらに、ｃ７ｄＧＴＰ及びｄＩＴＰは、ｄＧＴＰ
の代わりに（低い効率で組込まれるけれども）、インビ
トロＤＮＡ合成反応、たとえば配列決定に頻繁に使用さ
れる。集合的には、それらはデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（ｄＮＴＰ）として言及される。

【００２２】用語“発現系”とは、所望のコード配列及
び制御配列を作用可能な結合で含むＤＮＡ配列を意味
し、その結果、それらの配列により形質転換された宿主
はそのコードされたタンパク質を生成することができ
る。形質転換をもたらすためには、発現系はベクターに
含まれ得るが、その対応するＤＮＡはまた、宿主染色体
中に組込まれてもよい。

【００２３】用語“遺伝子”とは、回収できる生物活性
ポリペプチド又は前駆体の生成のために必要な制御及び
コード配列を含んで成るＤＮＡ配列を意味する。ポリペ
プチドは、その酵素活性が保持される限り、十分な長さ
の遺伝子配列又はコード配列のいづれかの部分によりコ
ードされ得る。用語“宿主細胞”とは、単一細胞の原核
生物及び真核生物の両者、たとえば細菌、酵母及び放線
菌、並びに細胞培養物において増殖されるような、高等
植物又は動物からの単一の細胞を意味する。

【００２４】本明細書において使用される場合、用語
“ＤＮＡ配列決定反応混合物”とは、ＤＮＡ配列決定反
応のために必要な要素を含んで成る反応混合物を意味す
る。従って、ＤＮＡ配列決定反応混合物は、その反応混
合物は初期においては不完全であるが、配列決定反応の
開始が使用者により調節され、標的の核酸配列を決定す
るためのＤＮＡ配列決定法への使用のために適切であ
る。この態様においては、最終要素たとえば酵素が、完
全なＤＮＡ配列決定反応混合物を提供するために添加さ
れると、反応が開始され得る。

【００２５】典型的には、ＤＮＡ配列決定反応は、重合
化活性のために適切な緩衝液、ヌクレオシド三リン酸及
び少なくとも１つの異常なヌクレオチドを含むであろ
う。その反応混合物はまた、ポリメラーゼ酵素による標
的上での伸長のために適切なプライマー、ポリメラーゼ
及び標的核酸も含むことができる。プライマー、又はヌ
クレオチドのいづれか１つは一般的に、検出可能な成
分、たとえば螢光ラベルによりラベルされる。一般的
に、反応物は、４種の通常のヌクレオチド及び少なくと
も１つの異常なヌクレオチドを含んで成る混合物であ
る。本発明の好ましい態様においては、ポリメラーゼは
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、そして異常なヌク
レオチドはリボヌクレオチドである。

【００２６】用語“オリゴヌクレオチド”は、本明細書
において使用される場合、複数の、好ましくは３以上
の、そして通常、10以上のデオキシリボヌクレオチド又
はリボヌクレオチドから成る分子として言及される。オ
リゴヌクレオチドの正確な大きさは、多くの要因、たと
えばオリゴヌクレオチドの究極的な機能又は使用に依存
するであろう。

【００２７】オリゴヌクレオチドは、いづれかの適切な
方法、たとえば適切な配列のクローニング及び制限酵素
処理により、並びにＮａｒａｎｇなど．，１９７９，Ｍ
ｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０〜９９のホスホト
リエステル法；Ｂｒｏｗｎなど．，１９７９，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９〜１５１のホスホジ
エステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅなど．，１９８１，Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９〜１８
６２のジエチルホスホラミジット法；Ｍａｔｔｅｕｃｃ
ｉなど．，１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
０３：３１８５〜３１９１のトリエステル法；自動合成
法；又はアメリカ特許第４，４５８，０６６号の固体支
持法による直接的な化学合成により調製され得る。

【００２８】用語“プライマー”とは、本明細書で使用
される場合、プライマー伸長が開始される条件下に置か
れる場合に合成の開始の点として作用することができ
る、天然又は合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プ
ライマーは、好ましくは、一本鎖オリゴデオキシリボヌ
クレオチドである。プライマーの適切な長さは、プライ
マーの意図された使用に依存するが、しかし典型的に
は、１５〜３５個のヌクレオチドの範囲である。短いプ
ライマー分子が一般的には、鋳型との十分に安定したハ
イブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要
とする。プライマーは鋳型の正確な配列反映し、又はプ
ライマー伸長のための鋳型とハイブリダイズするために
十分に相補的であるべきである。

【００２９】プライマーは、所望には、分光、光化学、
生化学、免疫化学又は化学手段により検出できるラベル
を組込むことによりラベルされる。たとえば、有用なラ
ベルは、³²Ｐ、螢光色素、電子−密集試薬、酵素（ＥＬ
ＩＳに通常使用されるような）、ビオチン又はハプテ
ン、及びそれに対する抗血清又はモノクローナル抗体が
手段可能なタンパク質を包含する。

【００３０】用語“熱安定性ポリメラーゼ”とは、二本
鎖核酸の変性をもたらすために必要な時間及び高温にゆ
だねられる場合、それに続くプライマー伸長反応をもた
らすために、熱に対して安定性であり、耐熱性であり、
そして十分な活性を保持する酵素を言及する。本明細書
で使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、温度循環
反応、たとえばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）への使用
のために適切である。熱安定性ポリメラーゼに関して
は、酵素活性は、鋳型の核酸鎖に対して相補的であるプ
ライマー伸長生成物を形成するために正しい態様でのヌ
クレオチドの組合せの触媒を意味する。

【００３１】核酸変性のために必要な加熱条件は、たと
えば緩衝液塩濃度、及び変性される核酸の組成及び長さ
に依存するが、しかし典型的には、約９０℃〜約１０５
℃、好ましくは９０℃〜１００℃の範囲であり、そして
その温度及び核酸の長さに主に依存して時間は、典型的
には、数秒〜４分までである。

【００３２】用語“異常な”又は“修飾された”とは、
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸、又はヌクレオチドに
言及する場合、ＤＮＡ中に天然に存在する通常の塩基又
はヌクレオチドの修飾、誘導体又は類似体を包含する。
より具体的には、本明細書において使用される場合、異
常なヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰに比較してリボー
ス糖の２’位置で修飾されている。従って、ＲＮＡに関
しては、リボヌクレオチド（すなわちＡＴＰ，ＧＴＰ，
ＣＴＰ，ＵＴＰ、集合的にはｒＮＴＰ）は天然に存在す
るヌクレオチドであるが、それらのヌクレオチドは、本
明細書に使用される場合、糖の２’位置に、比較すれば
ｄＮＴＰに存在しないヒドロキシル基を有するので、リ
ボヌクレオチドは異常なヌクレオチドである。

【００３３】位置２’に置換基を含むリボヌクレオチド
類似体、たとえば２’−フルオロ−又は２’−アミノ−
置換された類似体は、本発明の範囲内である。さらに、
リボヌクレオチド類似体は、水素基による正常なヒドロ
キシル基の置換（３’デオキシ）によりその３’位置で
修飾され、リボヌクレオチド類似ターミネーターが提供
される。そのようなヌクレオチドもまた、用語“異常な
ヌクレオチド”の範囲内に含まれる。

【００３４】ＤＮＡは従来、ｄＮＴＰから構成されるの
で、ｒＮＴＰの組込みは異常であり、そしてそれ故に、
ｒＮＴＰは異常な塩基であろう。結果的に、本発明の好
ましい態様においては、ＤＮＡ配列決定法を包含するＤ
ＮＡプライマー伸長法に関しては、核酸生成物は通常の
及び異常なヌクレオチドの両者を含み、そして主とし
て、ｄＮＴＰである通常のヌクレオチドを含んで成る。
異例な塩基は、たとえばフルオレセイン又はローダミン
により螢光的にラベルされ得；たとえばビオチンにより
非螢光的にラベルされ得；たとえば³²Ｐ，³³Ｐ又は³⁵Ｓ
によりアイソトープ的にラベルされ得；又はラベルされ
なくても良い。

【００３５】本発明の理解をさらに促進するために、特
定の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素が本発明を例示す
るために明細書に言及されているが、しかしながら、そ
れらの言及は本発明の範囲を制限するものではない。好
ましい態様において、本発明の熱安定性酵素は、種々の
核酸配列決定法に利用され得るが、但し、本明細書に記
載される新規の熱安定性ポリメラーゼは、そのような酵
素活性が必要であり又は所望されるいづれの目的のため
にも使用され得る。酵素はまた、増幅反応、たとえばＰ
ＣＲにも使用され得る。

【００３６】本発明の熱安定性ポリメラーゼは、それぞ
れが決定的なモチーフ Ser Gln IleXaa Leu Arg Xaa
（配列番号１）〔ここで、この配列の位置４の“Xaa ”
はいづれの残基でも良いが、但しグルタミン酸残基（Gl
u ）ではなく、そしてこの配列の位置７での“Xaa ”は
バリン残基（Val ）又はイソロイシン残基（Ile ）であ
る〕を含むことによって特徴づけられる。前記モチーフ
の位置４でグルタミン酸残基を有する熱安定性ポリメラ
ーゼをコードする遺伝子は、適切な修飾されたポリメラ
ーゼ酵素を提供するために、本明細書に記載されるよう
にして修飾され得る。

【００３７】前記修飾された熱安定性ポリメラーゼ酵素
は、その対応する生来の又は野生型酵素に比較して、ア
ミノ酸配列モチーフ Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa（配
列番号２）〔ここで、この配列の位置７での“Xaa ”は
バリン残基（Val ）又はイソロイシン残基（Ile ）であ
る〕中に修飾を有し、すなわちそれらが他のアミノ酸残
基による位置４でのグルタミン酸の置換により修飾され
ていることにより特徴づけられる。本発明により提供さ
れる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの決定的モチーフは、
従来の一文字アミノ酸コードを用いて下記に示される
（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．，１９７０，ｐ６７）：

【００３８】配列番号１ Ser Gln Ile Xaa Leu Arg X
aa〔ここで、位置４の“Xaa ”はいづれのアミノ酸残基
でも良いが、但し、グルタミン酸残基（Glu ）ではな
く、そして位置７での“Xaa ”はバリン残基（Val ）又
はイソロイシン残基（Ile ）である〕。決定的なアミノ
酸配列（ここで、位置４でのXaa がグルタミン酸残基
（Glu ）である）をコードする遺伝子配列及びそれを含
むタンパク質の両者は、ｒＮＴＰに対する低められた識
別性を有するポリメラーゼを提供し、そして本発明の範
囲内にある。その決定的なモチーフ内で、追加の修飾は
この決定的なモチーフ中の他のアミノ酸残基に対して、
好ましくは、グルタミン（Gln 又はＱ）、ロイシン（Le
u 又はＬ）、又はアルギニン（Arg 又はＲ）の群から選
択されたアミノ酸残基に対して行なわれ得る。

【００３９】本発明は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを
コードする遺伝子配列の特定の修飾により好都合な性質
を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を製造するた
めに適切である。本発明の好ましい態様においては、遺
伝子配列及びコードされた酵素は、サーマス属の種に由
来するが、但し、非サーマス細菌も下記に記載されるよ
うに本発明の範囲内に包含される。同様に、ここに同定
された決定的なモチーフの非常に保存的な性質の観点か
ら、新規の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、たとえばＴ
ａｑポリメラーゼに対するそれらの相同性に基づいて同
定され得る。

【００４０】そのような熱安定性ポリメラーゼは、それ
らのアミノ酸配列がＳＱＩＸＬＲＶ／Ｉ型〔ここで、Ｘ
はいづれのアミノ酸残基でも良いが、しかしグルタミン
酸残基ではない〕を含んで成り、そしてアミノ酸配列が
生来のＴａｑポリメラーゼのアミノ酸配列に比較して、
少なくとも約３９％、好ましくは少なくとも約６０％、
より好ましくは少なくとも約８０％の全体的相同性（配
列の同一性）を示す限り、本発明の範囲内である。前記
Ｔａｑポリメラーゼの完全な長さの配列は、ＷＯ８９／
０６６９１に提供され、そしてＧＥＮＥＳＥＱ配列デー
タバンクにおいてアクセス番号Ｐ９０５５６として、又
はＥＭＢＬ配列データバンクにおいてアクセス番号Ｍ２
６４８０として及びＰＩＲ配列データバンクにおいてア
クセス番号Ａ３３５３０としてアクセス可能である。

【００４１】本発明の代表的な熱安定性ＤＮＡポリメラ
ーゼは、下記表１に列挙される生物からの生来のポリメ
ラーゼの組換え誘導体である。表１はそれらの生来のポ
リメラーゼの個々についての決定的型の特定の配列及び
“Ｘ”残基の位置を示す。個々の熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼはユニークであるので、決定的モチーフのアミノ
酸位置は個々の酵素について異る。下記に列挙されるそ
れらのポリメラーゼについては、決定的モチーフＳＱＩ
ＸＬＲＶ／Ｉの“Ｘ”位置のアミノ酸残基はグルタミン
酸である。本発明の好ましいポリメラーゼは、８５’０
００〜１０５’０００、より好ましくは９０’０００〜
９５’０００の範囲の分子量を有する。それらのポリメ
ラーゼのアミノ酸配列は、約７５０〜９５０個のアミノ
酸残基、好ましくは８００〜８５０個のアミノ酸残基か
ら成る。

【００４２】本発明のポリメラーゼはまた、約５４０個
又はそれよりも多くのアミノ酸から成り、そして少なく
ともポリメラーゼドメイン、及び３’側から５’側への
エキソヌクレアーゼドメインに対応する部分（その得ら
れるポリメラーゼは３’側から５’側のエキソヌクレア
ーゼ活性を有しても又は有さなくてもよい）、並びに多
くの完全な長さの熱安定性ポリメラーゼ酵素のアミノ酸
配列の初めの１／３を含む、５’側から３’側へのエキ
ソヌクレアーゼドメインの可能な部分を含んで成る。表
１に示されない熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに関して
は、修飾のための適切なグルタミン酸の同定は、一旦、
そのアミノ酸配列における決定的なモチーフ又はコンセ
ンサスモチーフが同定されると簡単である。

【００４３】熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ内の正確な位
置にかかわらず、配列モチーフ SerGln Ile Glu Leu Ar
g Xaa（配列番号２）〔ここで、この配列の位置７の“X
aa”はポリメラーゼドメインのバリン残基（Val ）又は
イソロイシン（Ile ）である〕内での他のアミノ酸残基
によるグルタミン酸（Glu ）残基の置換は、異例のヌク
レオチドを効果的に組込む能力を有する熱安定性ポリメ
ラーゼを提供するように作用する。好ましい態様におい
て、グルタミン酸は、荷電されていない極性Ｒ基を有す
るアミノ酸、たとえばグリシン、セリン、システイン、
トレオニン、又は小さな非極性Ｒ基を有するアミノ酸、
たとえばアラニンにより置換される。

【００４４】最とも好ましい態様においては、グルタミ
ン酸残基はグリシン残基（Ｇ）により置換される。アミ
ノ酸及び核酸配列の並列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）プログ
ラムは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ
ｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉ
ｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎから容易に入手できる。本
明細書において特定される特定のモチーフが与えられる
場合、たとえばＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＴＴ及びＰＩＬＥＵ
Ｐを包含するそれらのプログラムは、修飾されるべき正
確な配列領域の同定を助けるよう作用する。

【００４５】下記表１から明らかなように、好熱性生物
からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素のポリメラーゼ
ドメイン内に保存される配列モチーフ Ser Gln Ile Glu
LeuArg Xaa（配列番号２）の実質的に２種の形が存在
する。配列モチーフ Ser GlnIle Glu Leu Arg Val（配
列番号３）が、サーマス種、たとえばサーマス・アクア
チカス、サーマス・カルドフィラス、サーマス・サーモ
フィラス、サーマス・フラバス及びサーマス・フィリホ
ルミス、並びにサーマス種ｓｐｓ１７及びＺＯ５からの
生来の熱安定性ポリメラーゼに存在する。

【００４６】配列モチーフ Ser Gln Ile Glu Leu Arg V
al（配列番号３）はまた、たとえばサーモシフォ・アフ
リカナス及び種々のバシラス株、たとえばバシラス・カ
ルドテナックス及びバシラス・ステアロサーモフィラス
からの他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素のポリメラ
ーゼドメインに存在する。配列モチーフ Ser Gln IleGl
u Leu Arg Ile（配列番号４）は、たとえば、サーモト
ガ・マリチナ、サーモトガ・ネオポリタナ及びアナエロ
セラム・サーモフィラムからの活性熱安定性ポリメラー
ゼに存在する。

【００４７】

【表１】

【００４８】Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＺＯ５、ｓｐｓ１７、Ｔ
ｍａ、及びＴａｆポリメラーゼの個々のための完全な核
酸及びアミノ酸配列は、アメリカ特許第５，４６６，５
９１号に開示されており、そしてそれらは引用により本
明細書に組込まれる。Ｔｃａ、Ｔｆ１、Ｔｎｅ、Ａｔ
ｈ、Ｂｃａ及びＢｓｔからのＤＮＡポリメラーゼの配列
は次の通りに開示されている：アクセス番号Ｕ６２５８
４としてのＥＭＢＬ配列データバンクにおけるＴｃａ
（また、Ｋｗｏｎ，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ７
（２）：２６４〜２７１も参照のこと）；Ａｋｈｍｅｔ
ｚｊａｎｏｗ ａｎｄ Ｖａｋｈｉｔｏｖ，１９９２，
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０
（２１）：５８３９におけるＴｆ１；ＷＯ９７／０９４
５１及びＷＯ９６／４１０１４におけるＴｎｅ；アクセ
ス番号Ｘ９８５７５としてのＥＭＢＬ配列データバンク
におけるＡｔｈ（Ａｔｈ株に関する詳細については、Ｒ
ａｉｎｅｙなど．，１９９３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．１７５（１５）：４７７２〜２７７９を参照のこ
と）；Ｕｅｍｏｒｉなど．，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１１３：４０１〜４１０及びアクセス番号Ｕ２３
１４９としてのＥＭＢＬ配列データバンクにおけるＢｓ
ｔ（また、Ｐｈａｎｇなど．，１９９５ Ｇｅｎｅ１６
３：６５〜６８も参照のこと）。

【００４９】決定的モチーフ中の位置６５８にＥを含ん
で成るＢｓｔポリメラーゼアミノ酸配列はまた、特開平
０５−３０４９６４号公報、ヨーロッパ特許公開ＥＰ−
Ａ−６９９，７６０、及びＡｌｉｏｔｔａなど．，１９
９６，Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．１２：１８５〜１９５に
より提供されており；その配列はまた、アクセス番号Ｕ
３３５３６としてＥＭＢＬ配列データバンクからも入手
できる。Ｇｅｎｅ １６３：６５〜６８（１９９５）に
開示される配列は、残基番号６６１にその決定的モチー
フの“Ｅ”を含む。Ｂｃａは、Ｕｅｍｏｒｉなど．，１
９９３，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：４０１〜４１０
及びアクセス番号Ｄ１２９８２としてのＥＭＢＬ配列デ
ータバンクにより提供される。サーマス・フィルホルミ
スからの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（ＦＥＭＳ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．２２：１４９〜１５３，１
９９４を参照のこと；また、ＡＴＣＣ受託番号第４３２
８０号からも入手できる）は、アメリカ特許第４，８８
９，８１８号に記載されている方法を用いて、及び表１
に提供される配列情報に基づいて再現され得る。

【００５０】上記配列及び出版物のそれぞれは引用によ
り本明細書に組込まれる。ＷＯ８９／０６６９１に記載
されるようなＴａｑポリメラーゼの生来形のアミノ酸配
列と上記Ｔｆ１ポリメラーゼのそれとの間の配列相同性
（配列の同一性）は８７．４％である。Ｔｔｈポリメラ
ーゼに対するその対応する相同性は８７．４％であり、
そしてＴｃａポリメラーゼに対する相同性は８６．６％
であり、そしてＢｓｔポリメラーゼ（アクセス番号Ｕ２
３１４９）に対するその相同性は４２．０％であり、そ
してＢｃａポリメラーゼに対するその相同性は４２．６
％であり、そしてＡｔｈポリメラーゼに対するその相同
性は３９．７％である。

【００５１】表１が示すように、前記決定的モチーフ
は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ間に著しく保存されて
いる。“Ｘ”がグルタミン酸である場合、ポリメラーゼ
をコードする遺伝子の修飾は、たとえば、その決定的モ
チーフが修飾されていないＴａｑポリメラーゼに比較し
て、ｒＮＴＰを容易に組込む本発明の酵素を提供する。
結果的に、本発明は、サーマス・オスヒマイ（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓなど．，１９６６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ．４６（２）：４０３〜４０８）；サ
ーマス・シルバナス及びサーマス・クリアロフィラス
（Ｔｅｎｒｅｉｒｏなど．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓ
ｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４５（４）：６３３〜６
３９）；サーマス・スコトダクタス（Ｔｅｎｒｅｉｒｏ
など．，１９９５，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４
６（４）：３１５〜３２４）；サーマス・ブロキアナス
（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）（Ｍｕｎｓ
ｔｅｒ，１９８６，Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３
２：１６７７）、及びサーマス・ルベル（Ｌｏｇｉｎｏ
ｖなど．，１９８４，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．３４：４９８〜４９９）；また、ＡＴＣＣ
寄託番号第３５９４８号からの、たとえば熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼ、及びその対応する遺伝子及び発現ベク
ターを包含する種類の酵素に関する。

【００５２】さらに、本発明は、たとえば、サーモトガ
・エルフィ（Ｔｈｅｍｏｔｏｇａｅｌｆｉｉ）（Ｒａｖ
ｏｔなど．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．４５：３１２；またはＤＳＭ寄託番号第
９４４２号から入手できる）及びサーモトガ・サーマラ
ム（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）（Ｗ
ｉｎｄｂｅｒｇｅｒなど．，１９９２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓ
ｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４２：３２７；また、Ｄ
ＳＭ寄託番号第５０６９号から入手できる）からの、熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼの修飾形、及び対応する遺伝
子及び発現ベクターを包含する。上記配列及び出版物の
個々は、引用により本明細書に組込まれる。

【００５３】本発明の好ましい態様においては、修飾さ
れるべき決定的モチーフは、アミノ酸配列 Leu Asp Tyr
Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Sen
（配列番号５）内に存在する。従って、本発明の１つの
観点は、鋳型−依存性態様で異常なヌクレオチドを組込
むために非常に高められた効率を示す熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼ修飾体の生成を包含する。特に好ましい態様
において、そのポリメラーゼ配列は、 Leu Asp Tyr Ser
Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser（配列
番号６）を含んで成る。そのような熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼは、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡにより指示された
ＲＮＡ合成、及びｒＮＴＰ置換されたＤＮＡのインビト
ロ合成のような工程に特に適切である。

【００５４】異常な塩基を組込むための高められた効率
を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの生成は、部位特
定突然変異誘発のような工程により達成され得る。たと
えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８
９、第２版、チャプター１５．５１．，“Ｏｌｉｇｎｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＭｅｄｉａｔｅｄ Ｍａｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ”を参照のこと（これは引用により本明細書
に組込まれる）。たとえば、サーマス・アクアチカス
（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列（配列番号７
を参照のこと）における残基６１５のグルタミン酸をコ
ードするコドンの第２位置における“Ａ”の“Ｇ”への
突然変異は、通常のヌクレオチド、すなちわｄＮＴＰの
存在下でＰＣＲを仲介する酵素の能力を保持しながら、
本明細書に定義されるような異例のヌクレオチドの組込
みの効率の５００倍以上の上昇をもたらす。

【００５５】Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼにおいて、こ
の特定の突然変異は、Ｅ（グルタミン酸）からＧ（グリ
シン）へのアミノ酸変更をもたらす。この特定のアミノ
酸の変更は、異常なヌクレオチドを組込む酵素の能力を
変更するが、いづれかの他のアミノ酸残基、たとえばセ
リン、システイン、トレオニン、アラニン、バリン又は
ロイシン残基によるグルタミン酸残基の置換も同じ効果
を有することが予測される。Ｅ６１５を置換する他のア
ミノ酸置換は本発明の範囲内であるが、但し、Ｅ６１５
Ｇは好ましい態様である。従って、本発明の決定的な観
点は、配列番号１のモチーフにおける４番目のアミノ酸
がグルタミン酸残基でないことである。

【００５６】部位特定突然変異誘発はまた、部位特異的
プライマー指示突然変異誘発により達成され得る。この
技法は当業界において現在、標準のものであり、そして
所望する突然変異を表わす限定されたミスマッチを除い
て、突然変異誘発される一本鎖ファージＤＮＡに対して
相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて行
なわれる。手短に言及すれば、合成オリゴヌクレオチド
がプラスミド又はファージに対して相補的な鎖の合成を
指図するためのプライマーとして使用され、そしてその
得られる二本鎖ＤＮＡを用いて、ファージ−支援宿主細
菌が形質転換される。

【００５７】得られる細菌は、たとえば、所望する突然
変異誘発された遺伝子配列を担持するそれらのプラーク
を同定するために、ＤＮＡ配列の分析又はプローブハイ
ブリダイゼーションによりアッセイされ得る。あるい
は、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇ
ｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｎｉｓなど．
編集者、１９９０，Ｃｈａｐｔｅｚ ２２，“Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＲ”の標題、Ｈｉｇｕｃｈｉによ
る、ｐ１７７〜１８３に記載される“組換えＰＣＲ”法
が使用され得る。

【００５８】表１に示されるように、Ｔａｑポリメラー
ゼの決定的モチーフ内のグルタミン酸は他の熱安定性Ｄ
ＮＡポリメラーゼに保存されるが、しかしそのアミノ酸
配列中で異なっているが、しかし近くに位置するかも知
れない。サーマス種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及び
関連するサーモトガ、サーモシフォ及びアナエロセラム
種のＤＮＡポリメラーゼの配列番号２内の保存されたグ
ルタミン酸の突然変異は、配列番号２を含んで成るＴａ
ｑポリメラーゼに比較して、異常なヌクレオチドを効果
的に組込むポリメラーゼの能力に対して類似する増強効
果を有するであろう。

【００５９】他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにおける
決定的モチーフ内のグルタミン酸残基の突然変異は、部
位特定突然変異誘発のために使用される原理及び技法を
用いて達成され得る。ＧｅｎｅＢａｎｋ又はＳｗｉｓｓ
Ｐｒｏｔ／ＰＩＲデータバンクにバシラス・ステアロサ
ーモフィラスＤＮＡポリメラーゼについてのいくつかの
配列が提出されている。それらの配列は非常に関連して
いるが、しかしいく分、お互い異なっており、そして個
々は、同一の決定的型の配列 Ser Gln Ile GluLeu Arg
Xaa（配列番号２）〔ここで、この配列の位置７での“X
aa ”はバリン残基（Val ）又はイソロイシン残基（Ile
）〕を含むが、但し、配列における異なった位置で含
む。

【００６０】本明細書に記載されるような熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼについての出版物から入手できるアミノ
酸及び核酸配列情報に基づけば、従来の組換え法によ
り、異なった熱安定性ＤＮＡポリメラーゼに由来するド
メインから構成されるキメラ性ポリメラーゼを構成する
こともまた可能である。アメリカ特許第５，４６６，５
９１号及び第５，３７４，５５３号は、新規の酵素を供
給するために熱安定性ポリメラーゼの種々の機能的セグ
メント、たとえば５’から３’側へのエキソヌクレアー
ゼドメイン、３’から５’側へのエキソヌクレアーゼド
メイン及びポリメラーゼドメインを交換するための方法
を記載する。

【００６１】好ましいキメラ性熱安定性ポリメラーゼ酵
素は、５’から３’側へのエキソヌクレアーゼドメイ
ン、３’から５’側へのエキソヌクレアーゼドメイン及
びポリメラーゼドメインを含んで成り、それにより、１
つのドメインは異なったポリメラーゼに由来し、そして
それにより、ポリメラーゼドメインは、決定的モチーフ
の配列 Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa（配列番号１）
〔ここで、この配列の位置４での“Xaa ”はいづれのア
ミノ酸でも良いが、しかしグルタミン酸残基（Glu）で
はなく、そしてこの配列の位置７での“Xaa ”はバリン
残基（Val ）又はイソロイシン残基（Ile ）である〕を
含んで成る。そのようなキメラ分子についての例は、表
２に特定されるようにして構成されるＴａｑ／Ｔｍａキ
メラ酵素である。この表に示されるように、それらのＴ
ａｑ／Ｔｍａキメラ酵素のポリメラーゼドメインは、上
記特定された決定的モチーフでの突然変異を含む。

【００６２】

【表２】

【００６３】プラスミドｐＣ１は、１９９６年７月１７
日、ＡＴＣＣにブダペスト条約の下で寄託され、そして
受託番号第９８１０７号を得た。このプラスミドｐＣ１
は生来のＴａｑポリメラーゼのアミノ酸配列の位置６１
５でグルタミン酸残基をコードするコドンで突然変異さ
れた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を
含み、位置６１５でグリシン残基を有するＴａｑポリメ
ラーゼの突然変異形をもたらす（Ｅ６１５Ｇ変異Ｔａｑ
ポリメラーゼ）。この寄託は、異常なヌクレオチド類似
体を組込むための増強された効率を有する熱安定性ＤＮ
Ａポリメラーゼを提供するためのもう１つの手段を提供
する。

【００６４】例１は、他の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ
酵素を創造するためにＥ６１５Ｇ突然変異をサブクロー
ニングするための適切なフランキング制限部位の使用を
例示する。多くの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼについて
の完全な遺伝子配列が知られているので、たとえば制限
消化及びフラグメント置換による、又は部位特異的イン
ビトロ突然変異誘発による、Ｅ６１５をコードするコド
ンで突然変異を導入するための他の手段は、本明細書に
提供される決定的モチーフに対する配列情報に基づいて
当業者に容易に手用できる。

【００６５】特定部位の突然変異誘発により調製され
た、修飾された遺伝子又は遺伝子フラグメントは、従来
の手段によりプラスミド又はファージから回収され、そ
して続く培養及び得られる酵素の精製のために発現ベク
ター中に連結される。多くのクローニング及び発現ベク
ター、たとえば哺乳類及び細菌系が、本発明の実施のた
めに適切であり、そしてたとえば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈｏｒｂｏｒ，１９８９に記載されてい
る。便利には、本発明は、λ由来のＰＬプロモーター
（Ｓｈｉｍａｔａｋｅなど．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ
２９２：１２８）の利用を例示される。このプロモー
ターの使用は、アメリカ特許第４，７１１，８４５号及
び第５，０７９，３５２号に特に記載される。

【００６６】本発明の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは一
般的に、微生物、たとえば野生型又は修飾された熱安定
性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子に作用可能的
に連結された発現ベクターにより形質転換されたＥ．コ
リから精製される。適切な宿主微生物についての例は、
Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２７５〜
２８７により記載されるＥ．コリ株ＤＧ１１６であり、
この株は受託番号第５３６０１号としてＡＴＣＣから入
手できる。熱安定性ポリメラーゼを精製するための方法
はまた、たとえばＬａｗｙｅｒなど．，１９９３，ＰＣ
Ｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ２：２７５〜２８７にも記載される。

【００６７】当業者は、異常なヌクレオチドを組込むた
めの増強された効率を有する上記熱安定性ＤＮＡポリメ
ラーゼが組換えＤＮＡ技法を用いることにより最とも容
易に調製されることを認識するであろう。本発明の酵素
の１つ、又はそれらの酵素の誘導体又は類似体の生成を
所望する場合、酵素の組換え形の生成は典型的には、発
現ベクターの構成、そのベクターによる宿主細胞の形質
転換、及び発現が生じる条件下で前記形質転換された宿
主細胞の培養を包含する。発現ベクターを調製し、宿主
細胞を形質転換し、そしてその細胞を培養するための手
段は、当業界において良く知られており、そしてたとえ
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど．，１９８９、前記に詳細に
記載されている。

【００６８】本発明は、多くの用途、たとえば核酸増
幅、検出及びＤＮＡ配列決定法に、リボヌクレオシド三
リン酸と共に使用するために適切な熱安定性ＤＮＡポリ
メラーゼを提供する。配列決定へのリボヌクレオチドの
使用は、鎖−終結類似体、たとえばｄｄＮＴＰの高い費
用を回避し、そして重要なことには、続くＤＮＡ配列決
定反応を実施する必要性を伴わないで、ＤＮＡ配列分析
のためだけでなく、また電気泳動又はハイブリダイゼー
ションのような他のタイプの分析のためにも適切な新規
の増幅生成物の調製を促進する。

【００６９】ピロホスファターゼは、伸長生成物が蓄積
するにつれてピロリン酸分解の量を低めることによっ
て、常温性ポリメラーゼ及び熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼの両者を用いての配列決定結果を増強することが知ら
れている。実際、従来の循環配列決定法は、追加の酵素
がその配列決定反応に包含されることを必要とする。し
かしながら、本発明の非常に有用且つ好都合な観点は、
ピロホスファターゼがＤＮＡ配列決定のために必要とさ
れないことである。従って、本明細書に提供される新規
の酵素の使用は、配列決定反応混合物中に第２の酵素を
添加することの追加の費用の必要性を排除する。

【００７０】本発明の酵素を用いることにより、増幅及
び配列決定反応は合併され、時間及び材料を節約し、そ
して全体の分析を単純にする。それらの利点及び他の利
点は、プライマー伸長生成物中への通常のヌクレオチ
ド、並びにリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド類似
体の両者の組込みがＲＮＡの加水分解に対して敏感であ
るＲＮＡ／ＤＮＡキメラ性鎖を提供するので、主として
利用できる。処理はＤＮＡ主鎖に影響を及ぼさず、そし
てリボヌクレオチドがその対応するｄＮＴＰの代わりに
挿入される位置でそれぞれ終結する核酸フラグメントの
集団を提供する。

【００７１】加水分解は種々の手段、たとえばアルカリ
（たとえば、下記例６に示されるように０．２Ｍの最終
濃度でのＮａＯＨによる処理による）、熱又はＲＮアー
ゼによる酵素処理（Ｖｏｇｅｌなど．，編集者、Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９６３，Ｂｅｒｇなどによるチャプター、標題
“Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｏｓｉｓ ｏｆ Ｍｉｘｅｄ Ｐ
ｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
Ｒｉｂｏ−ａｎｄ Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ ｂｙ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｐｒｅｐａｒａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｏｒ
Ｅ．ｃｏｌｉ”，４６７〜４８３ページ）（但し、これ
らだけには限定されない）により容易に達成される。

【００７２】好ましい態様においては、本発明は、ＤＮ
Ａ配列決定法のために特に有用な、新規且つ改良された
組成物を提供する。本明細書に記載される新規酵素は、
色素−ターミネーター又は色素−プライマーのいづれか
を用いての核酸配列決定法、及び他の配列決定法に好都
合である。前に記載されたように、鎖終結法は一般的
に、鎖−終結ヌクレオチドの存在下での鋳型−依存性プ
ライマー伸長を必要とし、続いて大きさにより分離され
る部分フラグメントの分布をもたらす。標準のジデオキ
シ配列決定は、鎖終結のためのジデオキシヌクレオシド
三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＥ．コリ
ＰｏｌＩ（Ｓａｎｇｅｒなど．，前記を参照のこと）の
クレノウフラグメントを利用する。

【００７３】従って、基本的なジデオキシ配列決定法
は、（ｉ）鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーのア
ニーリング；（ii）４つの別々の反応におけるＤＮＡポ
リメラーゼによるプライマーの伸長、ここで個々の反応
は、１つのラベルされたヌクレオチド又はラベルされた
プライマー、ラベルされていないｄＮＴＰの混合物、及
び１つの鎖−終結ｄｄＮＴＰを含み；（iii ）たとえ
ば、高分離能変性ポリアクリルアミド／ウレアゲル電気
泳動、細管分離、又は他の分離手段による４組の反応生
成物の分離；及び（iv）配列を推定するために試験され
得るゲルの放射能写真像の生成を包含する。他方では、
螢光ラベルされたプライマー又はヌクレオチドを用いて
の、質量分析法又はハイブリダイゼーションに基づく方
法が、ＤＮＡ配列の情報を導びくために使用され得る。

【００７４】耐熱性ポリメラーゼ、たとえばＴａｑポリ
メラーゼの有効性は、配列決定のための改良された方法
（アメリカ特許第５，０７５，２１６号を参照のこと）
及び“循環配列決定”として言及されるその改変をもた
らした。循環配列決定においては、加熱及び冷却の循環
が反復され、個々の標的分子からの多くの伸長生成物の
生成を可能にされる（Ｍｕｒｒａｙ，１９８９，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ １７：８５８
９）。ジデオキシ鎖ターミネーターの存在下での、鋳型
配列に対して相補的な標的配列のこの不斉性増幅は、す
べての可能な長さの種類の伸長生成物を生成する。

【００７５】ＤＮＡ鋳型からの伸長反応生成物の変性に
続いて、プライマーアニーリング及びプライマー伸長の
複数回の循環が、ジデオキシターミネーターの存在下で
生じる。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは循環配列決定に
おいていくつかの利点を有し；それらは核酸へのプライ
マーの特異的なハイブリダイゼーションのために必要と
される緊縮アニーリング温度に対して耐性があり、そし
て個々の循環において生じる高い温度、すなわち９０〜
９５℃の複数回の循環に対して耐性を有する。この理由
のために、種々の形のＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）
ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎ
ｏｒｗａｌｋ，ＣＴにより市販されているＴａｑ循環配
列決定キットに含まれている。

【００７６】それにもかかわらず、異常なヌクレオチ
ド、たとえばｄｄＮＴＰの組込みに対して識別するＴａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼの性質は、それが、ｄｄＮＴＰ
又は螢光ラベルされたｄｄＮＴＰが鎖ターミネーターと
して組込まれるべき循環配列決定のために使用される場
合、問題を提供する。一般的に、本発明の前、熱安定性
ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定は、数百の塩
基の距離にわたってすべての可能なフラグメントの長さ
を表わす伸長生成物の集団が生成されることを確かめる
ために、鎖−終結ヌクレオチド、一般的にはジデオキシ
ヌクレオチドの混合物を高濃度で必要とした。時折り、
この費用論点と取り組むための手段は、その反応を不十
分にする非常に低い濃度の従来のｄＮＴＰを利用した。
低いｄＮＴＰ濃度及び高いｄｄＮＴＰ濃度を有するそれ
らの反応混合物は、熱安定性ポリメラーゼがヌクレオチ
ド基質を実質的に切望する環境を創造する。

【００７７】ｄＮＴＰの濃度のより最適なレベルへの上
昇を可能にする、修飾された酵素、たとえばＡｍｐｌｉ
Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼＦＳの出現に
よってさえ、従来の酵素はなおＤＮＡ配列決定のために
高価なｄｄＮＴＰの存在に依存する。対照的に、本発明
は、ｄＮＴＰの濃度の上昇を可能にするのみならず、ま
た成長する鎖中への組込みのためにｒＮＴＰを代わりに
用いることによって、高価なｄｄＮＴＰの使用を回避す
る酵素を供給する。部分的なリボヌクレオチド置換を効
果的にもたらす新規酵素の能力は、終結ヌクレオチドを
組込むために別々の反応の不在下でＤＮＡ配列決定ラダ
ー（ｌａｄｄｅｒ）の生成を促進する。

【００７８】ＤＮＡ配列決定法への使用のために適切な
異常なヌクレオチド類似体の選択は、熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼの前記類似体を組込む能力によりすでに指図
されている。不都合なことには、前記ヌクレオチド類似
体は、かなり高価である。たとえば、ｄｄＮＴＰの費用
は、ｒＮＴＰ又はｄＮＴＰのいづれの費用よりも約２５
倍、高い。従来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは成長す
るＤＮＡ鎖中に鋳型により指示される態様でｒＮＴＰを
効果的に組込むことができないので、容易に入手でき、
そして安価であるそのようなリボヌクレオチドは、熱安
定性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ配列決定への使用
のために選択可能なものではなかった。本発明は、ＤＮ
Ａ配列決定反応へのｄｄＮＴＰの必要性を排除する。従
って、１つの観点において、本発明は、従来の鎖終結法
よりも有意に安価であるＤＮＡ配列決定分析のための方
法を提供する。

【００７９】プライマー伸長反応におけるマンガンの存
在は、正しく塩基対合されたヌクレオチドを正確に挿入
するポリメラーゼの能力に影響を及ぼすことがある。マ
ンガンは、正しくない塩基の対合化を強制し、又はヌク
レオチド類似体の挿入に対する識別性を容易にするため
に使用され得る。マンガンは、ＤＮＡの複製又は増幅工
程における突然変異を誘発するために研究者により使用
されて来た。従って、マンガンは、重合反応の適合度、
及び反応の収率に影響を及ぼすことができる。

【００８０】その得られる配列は正しくなく、又はＤＮ
Ａ配列決定法においては、その得られる情報はあいまい
である。本発明の方法は、マンガンが、異常なヌクレオ
チドを挿入するようにポリメラーゼを強制するために配
列決定反応混合物において二価のカチオンとして含まれ
ることを必要としない。従来のＤＮＡポリメラーゼに比
較して、本発明の方法は、マンガンの必要性を伴わない
で、２つの置換されたヌクレオチドと置換されていない
ヌクレオチドとの間を識別する酵素の能力を調節するた
めにポリメラーゼドメイン内の決定的モチーフを同定す
る。

【００８１】本発明の酵素は、配列決定のために高い濃
度の異常な塩基類似体を必要としない。本発明の前、異
常な塩基類似体：その対応する通常の塩基は一般的に、
鎖終結ＤＮＡ配列決定法のために約１．３〜２４：１の
範囲の比（たとえばｄｄＡＴＰ：ｄＡＴＰ）で存在した
（また、アメリカ特許第５，０７５，２１６号（Ｉｎｎ
ｉｓなど）を参照のこと）。比較として、本発明により
提供される熱安定性ポリメラーゼは、通常の塩基に対す
る異常な塩基類似体の比の１００〜数千倍の低下を可能
にする。本明細書に提供される新規酵素と組合される場
合、１：１又はそれより小さい比のｒＮＴＰ：ｄＮＴＰ
がＤＮＡ配列分析のために十分である。本発明の好まし
い態様においては、ｒＮＴＰ：ｄＮＴＰの比は１：８以
下に減じられる。２’置換されたヌクレオチド：その対
応する天然のｄＮＴＰの比は、特定の実験企画及び所望
する長さのフラグメントに依存して、１：８０又は１：
２００ほど低い。

【００８２】従って、本発明の酵素は異常なヌクレオチ
ド、たとえば２’置換されたヌクレオチドを容易に組込
むので、高濃度のｒＮＴＰ及び限定された濃度のその対
応するｄＮＴＰを用いることによってｒＮＴＰの組込み
を強制することは必要ではない。従って、本発明の方法
は、低濃度のｒＮＴＰと組み合せての最適濃度ｄＮＴＰ
の使用を可能にする。

【００８３】本発明の修飾されたポリメラーゼ酵素が適
切な配列決定法、たとえば色素−プライマー配列決定に
使用される場合、良好なＤＮＡ配列決定結果が５０〜５
００μＭの範囲でのｄＮＴＰ濃度の個々のｄＮＴＰによ
り得られる。好ましくは、ｄＮＴＰ濃度は１００〜３０
０μＭである。それらの範囲において、その対応するｒ
ＮＴＰは、ｄＮＴＰとほぼ同じか又はそれより低い濃度
で存在することができる。好ましくは、ｒＮＴＰは約
０．１μＭ〜１００μＭで存在し、最とも好ましくは、
ｒＮＴＰは約２．５μＭ〜２５μＭで存在する。

【００８４】本発明の修飾された酵素と共に使用するの
に適切なｒＮＴＰの濃度は、当業者により、タイトレー
ション及び最適化実験により容易に決定され得る。必要
とされるｒＮＴＰ又は類似体の量は、実験のタイプによ
り影響され、そして標的のサイズ及び純度、並びに緩衝
液の選択及び酵素の特定種により影響され得る。ｒＮＴ
Ｐ：ｄＮＴＰの比は、ｒＮＴＰが成長オリゴヌクレオチ
ド中に挿入される頻度を決定するであろう。加水分解は
個々の組込まれたｒＮＴＰで生じるので、ｒＮＴＰ：ｄ
ＮＴＰの比は、得られるフラグメントのサイズを大きく
し又は小さくするよう使用者に柔軟性を付与するために
調節され得る。

【００８５】十分に理解されるように、ＤＮＡはｄＮＴ
Ｐから合成されるポリマーである。個々のデオキシヌク
レオシド三リン酸は、３’位置でヒドロキシル基及び
２’位置で水素を含むリボース糖を含んで成る。リボヌ
クレオチドはまた、前記糖の３’位置でヒドロキシル基
を含む。しかしながら、ｒＮＴＰは、糖の２’位置でｄ
ＮＴＰとは区別され、ここで第２ヒドロキシル基が水素
原子を置換している。本発明の場合、ｒＮＴＰ’は、
２’置換されたヌクレオチドを正確に組込む本発明の酵
素の能力を例示する。しかしながら、本発明の化合物
は、リボヌクレオチドである異常なヌクレオチドの使用
に限定されない。本発明において同定される決定的なド
メインでの熱安定性ポリメラーゼ配列の修飾は、２’置
換されたヌクレオチド、たとえば２’−ヒドロキシル，
３’デオキシヌクレオチド及び置換された２’−フルオ
ロ又はアミノヌクレオチドの鋳型指図された組込みを可
能にする。

【００８６】本明細書の例に記載されるように、コルジ
セピン三リン酸として本明細書において言及される、
３’−デオキシ，２’−ヒドロキシＡＴＰの組込みは、
リボースの３’位置でデオキシを含むヌクレオチドの組
込みに対する識別を低める熱安定性ポリメラーゼにおけ
る第２の突然変異の存在により促進される。そのような
酵素は、たとえばＥＰ−Ａ−６５５，５０６及びＵ．
Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ No. ０８／４４８，２２３（１９９
５年５月２３日に出願された）においてこれまで記載さ
れている。

【００８７】１９９５年５月１０日、ブダペスト条約下
で寄託されたＡＴＣＣ寄託番号第６９８２０号は、組込
む類似体、たとえばｄｄＮＴＰに対しての低められた識
別性を有する、サーマス・アクアチカスの修飾された熱
安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を提供す
る。ジデオキシヌクレオチドは、従来のｄＮＴＰに比較
して置換された３’位置を有する。従って、本発明と組
み合わせれば、Ｅ６１５Ｇ，Ｆ６０７Ｙ Ｔａｑポリメ
ラーゼ変異体により本明細書において例示される二重突
然変異は、ｄＮＴＰに比較して、リボースの３’及び
２’位置で置換されるヌクレオチド類似体を用いるため
の手段を提供する（例３及び５を参照のこと）。

【００８８】本発明の特定の用途は、ｒＮＴＰ配列決定
法であり、ここで配列決定プライマーが区別できる螢光
又は放射性標識により検出可能的にラベルされる。ｄｄ
ＮＴＰとは異なって、変性されていないｒＮＴＰの組込
みは、鎖終結出事象をもたらさない。本発明の酵素と共
にｒＮＴＰ及びｄＮＴＰの両者を含んで成るＤＮＡ配列
決定反応は、リボヌクレオチドと隣接するデオキシリボ
ヌクレオチドとの間の３’−５’ホスホジエステル結合
での分解に対して敏感なランダムに置換されたプライマ
ー伸長生成物の混合物を生成する。

【００８９】たとえばＰＣＲ増幅又は循環配列決定にお
けるプライマー伸長に続いて、及びたとえばゲル電気泳
動による前記プライマー伸長生成物の分離の前、反応混
合物は、リボヌクレオチドの個々の発生でその伸長生成
物を加水分解するために、アルカリ、熱、リボヌクレア
ーゼ、又は他の手段のいづれかにより処理される。個々
のラベルされたプライマー伸長生成物のためには、ラベ
ルされたプライマーの直接の伸長生成物であるほとんど
の５’フラグメントのみが、配列決定ゲル上で検出でき
る。

【００９０】与えられた標的のためには、得られる配列
決定ゲルの分析は、配列決定段階、すなわち標的の核酸
配列に対応するＧ，Ａ，Ｔ及びＣレーンにおける一連の
同定可能なシグナルを提供する。その得られる配列決定
段階は、その方法が従来の手段によりｄｄＮＴＰ、又は
ｒＮＴＰ及び本明細書に記載される新規の熱安定性ポリ
メラーゼを用いるかどうかにかかわらず同じ情報を提供
する。従って、本発明の使用により、高価なｄｄＮＴＰ
は、ＤＮＡ配列決定のためには必要とされない（例６を
参照のこと）。

【００９１】他の配列決定法においては、鎖−終結リボ
ヌクレオチドが使用される。本発明のこの態様において
は、２’−ヒドロキシ，３’−デオキシヌクレオチド、
たとえばコルジセピン三リン酸がターミネーターとして
使用される。それらのｒＮＴＰ類似体は、螢光ラベルさ
れ、そしてＤＮＡ配列決定のために使用され得る。Ｌｅ
ｅなど．（前記）は、色素−ターミネーターｄｄＮＴＰ
の使用を記載する。ＥＰ−Ａ−６５５，５０６及び米国
出願No. ０８／４４８，２２３（１９９５年５月２３日
に出願）は、ｄｄＮＴＰと共に使用するための修飾され
た酵素を記載する。

【００９２】Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポ
リメラーゼＦＳ（上記参照のこと）に存在する修飾及び
本明細書に記載されるような、配列番号１（ここでＸは
グルタミン酸（Ｅ）ではない）で特定されるものの両者
を含んで成る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、鎖終結配
列決定反応へのラベルされたｒＮＴＰ類似体の効果的な
組込みのために使用され得る。この工程は自動化され
得、そして色素ラベルされたプライマーの合成を必要と
しない。さらに、色素−ターミネーター反応は同じ管に
おけるすべての４種の反応の実施を可能にするので、そ
れらは色素−プライマー法よりも一層、便利である。

【００９３】２’−ヒドロキシ、３’−デオキシヌクレ
オチドは、市販の３’ヌクレオチド（たとえばＳｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手できる３’ｄＡ，３’ｄ
Ｃ，３’ｄＧ及び３’ｄＴ）から合成され、そしてＬｕ
ｄｗｉｇ，Ｂｉｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈ
ｅｉｒ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｔｒａｃｔｕｒｅ，Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｙ、編集
者、Ｂｒｕｚｉｋ ａｎｄ Ｓｔｅｃ，Ａｍｓｔｅｒｄ
ａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ，１９８７，ｐ２０１〜２０４に記載される
ようにして５’三リン酸が付加される。

【００９４】新規配列決定法への本発明の酵素の有用性
の他に、本明細書に記載される修飾された酵素は多くの
分子生物学用途においても有用である。１つの態様にお
いて、その修飾された酵素は、従来の及び異常なヌクレ
オチド、たとえばｄＮＴＰ及び少なくとも１つの検出可
能的にラベルされたｒＮＴＰ（このラベルは、螢光ラベ
ル又は放射性同位体を包含する）を含んで成る増幅反応
混合物に使用される。相補的鎖の鋳型指図された合成
は、その長さにそって種々の位置でリボヌクレオチド−
リン酸を含むＤＮＡ生成物を提供する。熱及び／又はア
ルカリ処理は、個々のリボヌクレオチドで核酸伸長生成
物を加水分解する。従って、個々のフラグメントがその
３’端で１つのラベル成分を含むＤＮＡセグメントの種
類が供給される。得られる核酸フラグメントのサイズ
は、その反応に包含されるｒＮＴＰの割合及び量を調節
することによって変性され得る。

【００９５】ｒＮＴＰ及び本発明の酵素を用いての標的
の増幅は、特定の用途に依存して多くの利点を提供す
る。ラベルされたｒＮＴＰを用いる上記方法において
は、その得られる種類のフラグメントは、等しい強度で
すべてラベルされる；オリゴヌクレオチドフラグメント
当たり１つのラベル。珪素チップに固定されたオリゴヌ
クレオチドプローブ配列を用いての核酸検出の方法は、
その増幅された標的がハイブリダイゼーション動力学を
調節するために二次構造体の形成を制限するために固定
された再生可能なサイズ範囲内でランダムに断片化され
ることを、最適には必要とする。

【００９６】さらに、チップ上での多くのプローブへの
ハイブリダイゼーションを検出するためには、好ましく
は、核酸フラグメントが等しい強度でラベルされる。本
発明は、この基準を満たすフラグメントの種類を生成す
るための手段を提供し、そしてそれにより、他の検出
型、たとえばＣｒｏｎｉｎなど．，１９９６，Ｈｕｍａ
ｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ７：２４４〜２５５に記載され
るチップに基づく方法の使用を促進せしめる。

【００９７】もう１つの態様においては、本発明の熱安
定性ポリメラーゼ、及びｒＮＴＰ及びｄＮＴＰを含んで
成る増幅反応における、１つのラベルされたプライマー
及び１つのラベルされていないプライマーの使用は、同
時に実施する増幅及び配列決定反応の手段を提供する。
この方法は、４種の別々の増幅反応が行なわれることを
必要とする（個々のｒＮＴＰのために１つの反応）。従
って、本発明の酵素はたとえばＰＣＲ又は他の増幅手段
による標的の増幅のために適切であるので、その得られ
る生成物は、存在するなら、従来の方法、たとえば反応
生成物の一部を用いての電気泳動又はプローブハイブリ
ダイゼーションにより検出され得る。

【００９８】それらの検出方法は、組込まれたリボヌク
レオチドの加水分解をもたらさず、そしてＲＮＡ／ＤＮ
Ａプライマー鎖は、従来の核酸増幅生成物のために予測
されるように挙動するであろう。所望する生成物が検出
される場合、同じ反応混合物の残りの部分は、アルカリ
により処理され、そして核酸配列決定のためにゲル電気
泳動により分析され得る。従って、生成物の検出に続い
て、続く配列決定反応は不必要である。この単純化され
た方法は時間及び材料を節約し、そして段階を除去する
ことによって高められた精度を提供し、すなわち検出さ
れた生成物がその配列決定された生成物である。

【００９９】４種のラベルされたｒＮＴＰ及び１つのビ
オチン化されたプライマーを用いての類似する方法もま
た使用され得る。増幅の後、生成物はアルカリにより分
解され、そしてプライマー関連の生成物が、ストレパビ
ジン被覆されたビーズこの反応により除去される。その
捕獲された生成物が、続いて、配列決定ゲル上で分析さ
れる。この変法は、１つの管においての配列決定反応の
実施を可能にし、従って、４種の別々の増幅のための必
要性を排除する。

【０１００】本発明のもう１つの観点においては、本明
細書に記載される酵素は、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを調製
するために、又は国際特許出願ＷＯ９２／０１８１４に
記載されるように、従来の滅菌剤、たとえばウラシル−
Ｎ−グリコールシラーゼ（ＵＮＧ）を使用しないで、ア
ルカリ介在の滅菌のために置換されたＤＮＡを製造する
ために有用である。

【０１０１】例示される態様においては、熱安定性ポリ
メラーゼはまた、このエキソヌクレアーゼ活性を非常に
低下させるよう作用する５’−３’エキソヌクレアーゼ
ドメインにおける突然変異を含む。Ｔａｑポリメラーゼ
の修飾された形は、アメリカ特許第５，４６６，５９１
号に記載されている。その発明の１つの態様において
は、アミノ酸位置４６でグリシン残基（Ｇ）をコードす
るコドンがアスパラギン酸（Ｄ）をコードするコドンに
より置換されている。得られる酵素は、低められた５’
−３’エキソヌクレアーゼ活性により循環配列決定反応
において高い有用性を有し、そして本発明と共に使用す
るための好ましいバックグラウンドである。ポリメラー
ゼドメインアミノ酸配列及びポリメラーゼ活性は、野生
型酵素に比較して（Ｇ４６Ｄ）突然変異体の存在により
影響されない。

【０１０２】本発明の商業的な態様においては、本発明
の熱安定性ポリメラーゼを含んで成る、核酸配列決定の
ためのキットは、本発明の商業的な態様を示す。そのよ
うなキットは典型的には、ＤＮＡ配列決定のための追加
の試薬、たとえばｒＮＴＰ，ｄＮＴＰ、及び適切な緩衝
液を含む。ｒＮＴＰがラベルされていない場合、ラベル
されたプライマーがまた、含まれ得る。次の例は、例示
目的のためであって、本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【０１０３】

【実施例】例１ ．異常なヌクレオチドに対して低められた識別性を
有する変性されたＴａｑポリメラーゼ遺伝子の発現 Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＣ−末端アミノ酸部分
は、ポリメラーゼ活性部位ドメインをコードする（Ｌａ
ｗｙｅｒなど．，１９９３，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２：２７５〜２８
７；引用により本明細書に組込まれる）。この領域を含
むＤＮＡフラグメントを、完全な長さのＴａｑ遺伝子か
ら単離し、そしてマンガンの存在下でＰＣＲ増幅により
変異誘発した（Ｌｅｕｎｇなど．，１９８９，Ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅ １（１）：１１〜１５）。この例に関して
は、すべての制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから購入された。

【０１０４】変異誘発されたフラグメントを、ＰｓｔＩ
及びＢｇｌIIにより消化し、そしてＴａｑ発現プラスミ
ド、ＰｓｔＩ及びＢｇｌIIにより消化されているプラス
ミド、本明細書においては、ｐＬＫ１０２中にクローン
化した。プラスミドｐＬＫ１０２は、Ｔａｑ発現プラス
ミドｐＳＹＣ１５７８（Ｌａｗｙｅｒなど．，前記）の
修飾された形である。ポリメラーゼコード領域の３’側
に位置するＨｉｎｃII／ＥｃｏＲＶフラグメントを欠失
させ、プラスミドｐＬＫ１０１を創造した。続いて、８
９８個の塩基対のＰｓｔＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐ
ＬＫ１０１から除去し、そして短いＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ
Ｖ−ＢｇｌIIオリゴヌクレオチド複合体により置換し、
プラスミドｐＬＫ１０２を創造した。従って、この欠失
はＴａｑＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子の３’端から９００個の
塩基対を除去し、そしてそれを短いＤＮＡ断片により置
換する。

【０１０５】得られる発現プラスミドを、Ｅ．コリ株Ｎ
１６２４中に形質転換し（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，１９７
３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７７：５３１に記載され；
また、株番号ＣＧＳＣ＃５０６６としてエル大学のＥ．
コリＧｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒから入
手できる）、そして得られる形質転換体を、野生型酵素
に比較して、ｒＮＴＰを効果的に組込む能力についてス
クリーンした。この方法を用いて、変異体Ｃ１を、ｒＮ
ＴＰをより効果的に組込む能力を有するものとして同定
した。

【０１０６】Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子の一部が変更さ
れた表現型を担当することができることを決定するため
に、変異体Ｃ１から単離された、突然変異誘発されたＴ
ａｑ発現プラスミド、すなわちｐＣ１を種々の制限酵素
により消化し、そしてその得られる制限フラグメントを
ｐＬＫ１０１の野生型Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子中にサブクローン化し、突然変異されていない制限フ
ラグメントを置換した。その得られるサブクローンの分
析は、その表現型を担当する突然変異が２６５塩基対の
ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメント内に含まれるこ
とを示した。

【０１０７】ＤＮＡ配列分析を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡから
の、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラー
ゼＦＳを含むＡＢＩＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｄｙｅ Ｔ
ｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ、及びＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍを用いてｐＣ１のこの領
域に対して行なった。その配列分析は、ＮｈｅＩとＢａ
ｍＨＩ部位との間のＴａｑポリメラーゼ遺伝子において
２つのミスセンス突然変異を同定した。

【０１０８】アミノ酸位置６１５での突然変異は、グル
タミン酸残基（Ｅ）のグリシン残基（Ｇ）による置換を
引き起こし、そして位置６５３でのもう１つの突然変異
はトレオニン（Ｔ）によりアラニン（Ａ）残基を置換し
た。番号付けは、アメリカ特許第５，０７９，３５２号
におけるように、成熟タンパク質の最初のメチオニン残
基をコードするコドンで開始される。Ｅ６１５Ｇ突然変
異は、コドン６１５におけるＧＡＧからＧＧＧへの変更
により引き起こされた。Ａ６５３Ｔ突然変異は、コドン
６５３でのＧＣＣからＡＣＣへの変更により引き起こさ
れた。Ｅ．コリ宿主株Ｎ１６２４におけるプラスミドＣ
１は、１９９６年７月１７日、ＡＴＣＣにブダペスト条
約下で寄託され、そして受託番号第９８１０７号を付与
された。

【０１０９】２つの点突然変異を、組換えＰＣＲを用い
て、野生型Ｔａｑポリメラーゼ遺伝子中にそれぞれ別々
にサブクローン化することによって別々に分析した（Ｉ
ｎｎｉｓなど．，編集者、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，１９９０，Ｃｈａｐｔｅｒ ２２、標題“Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＲ”，Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｐ１７７
〜１８３）。その得られる発現生成物を分析し、Ｅ６１
５Ｇ又はＡ６５３Ｔ又は両突然変異がリボヌクレオチド
を組込む表現型を担当するかどうかを決定した。この実
験の結果は、Ｅ６１５Ｇ突然変異が変異体表現型を単独
で担当することを示した。

【０１１０】ヌクレオチド類似体の組込み効率のさらな
る分析及び定量化のために、Ｅ６１５Ｇを含む、２６５
塩基対のＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ ＰＣＲフラグメント
を、Ｔａｑ発現ベクター、すなわちｐＲＤＡ３−２中に
クローン化した。発現ベクターｐＲＤＡ３−２は、ファ
ージλ ＰＬプロモーターに操作可能的に連結される完
全な長さのＴａｑ遺伝子を含む。このベクター中のＴａ
ｑ遺伝子のエキソヌクレアーゼドメインは、５’−３’
側エキソヌクレアーゼ活性を低める、グリシン、すなわ
ちアミノ酸４６をコードするコドンでの点突然変異を含
む。

【０１１１】しかしながら、発現ベクターｐＲＤＡ３−
２のポリメラーゼドメイン内の遺伝子配列は、野生型Ｔ
ａｑ遺伝子配列に同一である。プラスミドＲＤＡ３−２
は、引用により本明細書に組込まれるアメリカ特許第
５，４６６，５９１号に十分に記載されており、ここ
で、プラスミドは“クローン３−２”として言及されて
いる。プラスミドｐＲＤＡ３−２をＢａｍＨＩ及びＮｈ
ｅＩにより消化し、そして２６５個の塩基対のＰＣＲフ
ラグメントを、従来の手段によりベクター中に連結し
た。

【０１１２】得られるプラスミド、ｐＬＫ１０８を用い
て、Ｅ．コリ株ＤＧ１１６（Ｌａｗｙｅｒなど．，１９
９３、前記、またＡＴＣＣ第５３６０６号としてＡＴＣ
Ｃから入手できる）を形質転換した。プラスミドｐＬＫ
１０８は、Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑとして本明細
書において言及される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコ
ードする。変異体Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ
Ｔａｑを、ＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩフラグメント中に組換
えＰＣＲによりＥ６１５Ｇ及びＦ６６７Ｙ突然変異を組
合すことにより創造した。

【０１１３】このフラグメントをプラスミドｐＲＤＡ３
−２中にクローン化し、プラスミドｐＬＫ１０９を創造
した。プラスミドｐＬＫ１０８及びｐＬＫ１０９からの
発現された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼタンパク質を、
Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３、前記により記載される
方法に従って精製した。但し、クロマトグラフィー処理
段階は除外された。挿入体の配列を、ＤＮＡ配列分析に
より確かめた。その配列における追加の突然変異がｐＬ
Ｋ１０８挿入体に検出され；しかしながら、この突然変
異はタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。

【０１１４】部分的な精製に続いて、修飾された酵素の
活性を、引用により本明細書に組込まれる、Ｌａｗｙｅ
ｒなど．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
４：６４２７〜６４３７に記載される活性のアッセイに
より決定した。修飾された酵素の活性を次の通りに計算
した：１単位の酵素は３０分で合成される１０ｎモルの
生成物に対応する。野生型酵素のＤＮＡポリメラーゼ活
性は、組込まれる８０〜１００ｐモルまでのｄＣＭＰの
酵素濃度に直接的に比例する（反応当たり０．１２〜
０．１５単位での希釈された酵素）。Ｅ６１５Ｇ，Ｇ４
６Ｄ及びＥ６１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ，Ｇ４６Ｄ変異体の活
性は、組込まれる０．２５〜３ｐモルまでのｄＣＭＰの
酵素濃度に直接的に比例する（反応当たり６×１０^-4〜
５×１０^-3単位での希釈された酵素）。この酵素調製物
は、例３〜５に記載される組込み及び配列決定反応に利
用された。例２及び６に関しては、酵素は、Ｌａｗｙｅ
ｒなど．（前記）に記載のようにして精製された。

【０１１５】例２． 組込みの効率を比較するためのア
ッセイ ｒＮＴＰを組込むＧ４６Ｇ及びＧ４６Ｄ，Ｅ６１５ Ｔ
ａｑの相対的能力を、活性化されたサケ精子ＤＮＡ鋳型
中に制限される酵素濃度で個々の酵素が組込む〔α−³²
Ｐ〕ｒＮＴＰの量を測定することによって決定した。ｒ
ＡＴＰの組込みを測定するために、反応混合物を、５０
μｌの反応物における最終濃度が次のようになるように
調製した：下記のようにして調製された１２．１５μｇ
の活性化されたサケ精子ＤＮＡ、２００μＭの個々のｄ
ＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍ
ｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）、１００μＭの〔α−³²
Ｐ〕ｒＡＴＰ，１mMのβ−メルカプトエタノール、２５
mMのＮ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−３−アミ
ノ−プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、pH９．５，２０
℃，５０mMのＫＣｌ、及び２．２５mMのＭｇＣｌ₂ 。

【０１１６】類似するアッセイ混合物を、ｒＣＴＰ、ｒ
ＧＴＰ及びｒＵＴＰの組込みを測定するために調製し
た。個々の場合、ｒＮＴＰが放射性ラベルされ、そして
１００μＭで存在し、そして３種の残るｄＮＴＰ（ｒＣ
ＴＰのためのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、ｒＧＴ
ＰのためのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、並びにｒ
ＵＴＰのためのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ）がそ
れぞれ２０μＭで存在した。対照として、個々の酵素に
よるその対応する〔α−³²Ｐ〕ｄＮＴＰの組込みをまた
測定した。

【０１１７】それらのアッセイのためのアッセイ混合物
は、上記ｒＮＴＰ組込みアッセイのものに類似するが、
但し、個々の〔α−³²Ｐ〕ｒＮＴＰが１００μＭのその
対応する〔α−³²Ｐ〕ｄＮＴＰにより置換された。Ｗｏ
ｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，（Ｆｒ
ｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）からの粗サケ精子ＤＮＡ（１ｇ／
ｌ）を、１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．２，５mMのＭ
ｇＣｌ₂ において２〜８℃で９６時間インキュベートす
ることにより活性化した。次に、ＥＤＴＡ及びＮａＣｌ
を添加し、それぞれ１２．５mM及び０．１Ｍにした。次
に、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムにより抽出し、
そして次にエタノール沈殿せしめ、そして１０mMのトリ
ス、１mMのＥＤＴＡ，pH７．５に再懸濁した。次に、活
性化されたＤＮＡ調製物を同じ緩衝液に対して透析し
た。

【０１１８】４５μｌの個々の反応混合物を、５’−ラ
ベルされたヌクレオチド前駆体の個々のために５つの
０．５ml管（たとえば、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中にアリ
コートした。従って、Ｇ４６Ｄ Ｔａｑ及びＧ４６Ｄ，
Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑの個々を、負の対照のために残る１
つの管に関して二重反復アッセイした。個々のアッセイ
混合物の２つの管における重合反応を、５μｌのＧ４６
Ｄ Ｔａｑポリメラーゼ（０．０２単位）又はＧ４６
Ｄ，Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ（０．００２単位）により開始
せしめた。バックグラウンドのレベルのための対照とし
て、酵素よりもむしろ５μｌの酵素希釈溶液を、負の対
照の反応物に添加した。

【０１１９】個々の反応物を短時間振盪し、そして７５
℃で１０分間インキュベートした。反応を、６０mMのＥ
ＤＴＡ １０μｌの添加により停止せしめ、そして氷上
に貯蔵した。個々のサンプルのために、６０μｌの反応
物の５０μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ，５０μｇ
／mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ溶液１mlにより希釈し
た。ＤＮＡを標準の方法を用いてＴＣＡにより沈殿せし
め、そしてＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａ
ｎ，Ｋｅｎｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上に収集した。組込ま
れた〔α−³²Ｐ〕ラベルされたヌクレオチド又はリボヌ
クレオチドの量を、液体シンチレーション分光計により
定量化し、そして組込まれたｐモルの数を計算した。個
々の酵素により組込まれた個々のｒＮＴＰのｐモルの数
を、個々の酵素により組込まれたその対応する〔α−³²
Ｐ〕ｄＮＴＰのｐモルの数に標準化した。その得られる
データは下記に示される。

【０１２０】

【表３】

【０１２１】それらの結果は、Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇが
Ｇ４６Ｄよりも５００倍以上、より効果的にリボヌクレ
オチドを組込むことを示す（たとえば、ｒＧＴＰに関し
ては、１８１：０．３６＝５０２倍、ｒＣＴＰに関して
は、１８９：０．２２＝８５９倍、そしてｒＡＴＰに関
しては、２１０：０．１８＝１１６６倍効果的であ
る）。従って、コドン６１５でのポリメラーゼ遺伝子に
おけるミスセンス突然変異は、新規の表現型、すなわち
デオキシリボヌクレオチドの他に、リボヌクレオチドを
効果的に組込むことができる熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼを提供する。

【０１２２】例３．３’デオキシＡＴＰ（コルジセピ
ン）の組込みの有効性を比較するためのアッセイ ３’−デオキシアデノシン５’−三リン酸（コルジセピ
ン三リン酸）を組込むＧ４６Ｄ；Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５
Ｇ；Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ及びＧ４６Ｄ，
Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑの相対的能力を、活性化されたサケ
精子ＤＮＡ鋳型中に制限酵素濃度で個々の酵素が組込む
〔α−³²Ｐ〕コルジセピン三リン酸の量を測定すること
によって決定した。〔α−³²Ｐ〕コルジセピン三リン酸
の組込みを測定するために、アッセイを、５０μｌの反
応物における最終濃度が次のようになるように構成し
た：１２μｇの活性化されたサケ精子ＤＮＡ，２００μ
Ｍの個々のｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ，５０μＭ
のｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、５０μＭの
〔α−³²Ｐ〕−３’ｄＡＴＰ／３’ｄＡＴＰ（ＮｅｗＥ
ｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｓｉｇｍａ），１mMの
β−メルカプトエタノール、２５mMのＮ−トリス〔ヒド
ロキシメチル〕メチル−３−アミノ−プロパンスルホン
酸（ＴＡＰＳ）、pH９．５，２０℃，５５mMのＫＣｌ及
び２．２５mMのＭｇＣｌ₂ 。

【０１２３】４５μｌの個々の反応混合物を、９個の
０．５mlの管中にアリコートし、従って、個々の反応
を、Ｇ４６Ｄ；Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ；Ｇ４６Ｄ，Ｅ６
１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ又はＧ４６Ｄ，Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ
のいづれかと共に二重反復で実施し、そして１つの管は
酵素を含まない対照の管として残した。アッセイ混合物
の２つの管における重合反応を、Ｇ４６Ｄ Ｔａｑポリ
メラーゼ５μｌ（０．０５８単位）により開始せしめ
た。同じことを、Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ（０．
００２５単位）、Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ
Ｔａｑ（０．００３４単位）、又はＧ４６Ｄ，Ｆ６６７
Ｙ Ｔａｑ（０．０８３単位）に関して行なった。バッ
クグラウンドのレベルのための対照として、１つの残る
管を、酵素よりもむしろ酵素希釈緩衝液により開始せし
めた。

【０１２４】個々の反応物を短時間振盪し、そして７５
℃で１０分間インキュベートした。反応を、６０mMのＥ
ＤＴＡ１０μｌの添加により停止せしめ、そして氷上に
貯蔵した。個々のサンプルのために、６０μｌの反応物
の５０μｌアリコートを、２mMのＥＤＴＡ，５０μｇ／
mlの剪断されたサケ精子ＤＮＡ溶液１mlにより希釈し
た。ＤＮＡを標準の方法を用いてＴＣＡにより沈殿せし
め、そしてＧＦ／Ｃフィルターディスク（Ｗｈａｔｍａ
ｎ，Ｋｅｎｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上に収集した。組込ま
れた〔α−³²Ｐ〕ラベルされたヌクレオチドの量を、液
体シンチレーション分光計により定量化し、そして組込
まれたｐモルの数を計算した。個々の酵素により組込ま
れた〔α−³²Ｐ〕コルジセピン三リン酸のｐモルの数
を、アッセイに使用される個々の酵素の単位数により割
り算し、単位酵素当たりの組込まれたｐモル数を得た。
このデータのチャートは、下記に示される。

【０１２５】

【表４】 それらの結果は、Ｅ６１５Ｇ及びＦ６６７Ｙ突然変異の
両者がＤＮＡ中へのコルジセピン分子の効果的組込みの
ために必要とされることを示す。

【０１２６】例４．Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼを用いてのアルカリ分解ＤＮＡ配列決
定 この例は、部分的ｒＮＴＰ置換されたＤＮＡを用いて
の、本発明の修飾されたポリメラーゼのアルカリ分解配
列決定への適用を示す。反応混合物中のｒＮＴＰ：ｄＮ
ＴＰの比は、１：８０〜１：８であった。プライマー伸
長反応を、５０mMのビシン（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）グリシン；pH８．３）、２５mMのＫＯＡｃ
及び２．５mMのＭｇＣｌ₂ から成る緩衝液において行な
った。４種の個々の反応（４種のｒＮＴＰの個々のため
の反応）を行なった。

【０１２７】個々の反応（５０μｌ）は、２００μＭの
個々のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、及び５’−〔³²Ｐ〕ラベル
されたＤＣ４８にアニールされた０．０９ｐモルのＭＢ
ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ）を含んだ（Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３，ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
２：２７５〜２８７）。その反応はまた、それぞれ、
２．５，２．５，２．５又は２５μＭのｒＡＴＰ，ｒＣ
ＴＰ，ｒＧＴＰ又はｒＵＴＰを含んで。

【０１２８】４種の反応の個々を、７単位のＧ４６Ｄ，
Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの添加により
開始せしめ、そして７５℃で１０分間インキュベートし
た。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加により
停止せしめ、そして氷上に置いた。個々の反応物２０μ
ｌを、５０mMのビシン（pH８．３）、２５mMのＫＯＡｃ
及び２．５mMのＭｇＣｌ₂ の溶液８０μｌに添加した。
分解生成物を、１ＮのＮａＯＨ ７μｌの添加及び９８
℃で１５分間のインキュベーションにより生成した。そ
の反応物を１ＮのＨＣｌ ７μｌの添加により中和し
た。個々の反応物を、９５％エタノール３１２μｌ及び
３Ｍの酢酸ナトリウム（pH４．８）１０μｌの添加によ
り沈殿せしめた。

【０１２９】その反応物を１５分間、超遠心分離し、沈
殿物を収集し、上清物を除去し、ペレットを７０％エタ
ノール５００μｌにより洗浄し、そして乾燥せしめた。
個々のペレットを５μｌの０．５Ｘ Ｓｔｏｐ緩衝液
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ ＣＴか
ら入手できる、９５％ホルムアミド、２０mMのＥＤＴＡ
及び０．０５％のブロモフェノールブルを含む）に再懸
濁し、９８℃で３分間加熱し、そして予備電気泳動され
た６％ポリアクリルアミド／８ＭのウレアＤＮＡ配列決
定ゲル上に直接的に負荷し、そして電気泳動した。ゲル
を乾燥せしめ、そしてＸ−線フィルムに暴露した。得ら
れたフィルムは、１００塩基以上の正しい配列を提供す
る明白な配列決定段階を表わした。

【０１３０】例５．Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び３’デオキシヌクレ
オチド三リン酸を用いてのＤＮＡ配列決定 この例は、３’デオキシヌクレオチド三リン酸を用いて
のＤＮＡ配列決定への変性されたポリメラーゼ、Ｇ４６
Ｄ，Ｅ６１５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑの適用を示す。こ
の実験は、３’デオキシＡＴＰを用いて実施されるが；
しかしながら、それは他の３’デオキシヌクレオチドに
よる使用へも拡張され得る。プライマー伸長反応を、５
０mMのビシン（pH８．３）、２５mMのＫＯＡｃ及び２．
５mMのＭｇＣｌ₂ から成る緩衝液において行なった。

【０１３１】個々の反応物（５０μｌ）は、それぞれ２
００μＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ
（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）及び５’−〔³²Ｐ〕ラベ
ルされたＤＧ４８にアニールされた０．０９ｐモルのＭ
Ｂｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ鋳型（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ
ｒ）を含んだ（Ｌａｗｙｅｒなど．，１９９３，ＰＣＲ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ
２：２７５〜２８７）。その反応物はまた、０，０．
１，０．２５，０．５，１又は５μＭの３’デオキシＡ
ＴＰを含んだ。

【０１３２】個々の反応は、７単位のＧ４６Ｄ，Ｅ６１
５Ｇ，Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの添加
により開始され、そして７５℃で１０分間インキュベー
トされた。反応を、６０mMのＥＤＴＡ １０μｌの添加
により停止し、そして氷上に置いた。個々の反応物３０
μｌをエタノール沈殿し、そして停止緩衝液に再懸濁
し、９８℃で３分間加熱し、そして予備電気泳動された
６％ポリアクリルアミド／８ＭのウレアＤＮＡ配列決定
ゲル上に直接的に負荷し、そして電気泳動した。ゲルを
乾燥せしめ、そしてＸ−線フィルムに暴露した。

【０１３３】コルジセピンの存在下で行なわれた反応物
を含むレーンは、明確に識別できる停止段階を含んだ。
ほとんど、すなわち５μＭのコルジセピンを含むレーン
は、停止段階を示し、ここで、平均的には、バンドはコ
ルジセピンレベルが低いレーンよりも長さが短かかっ
た。コルジセピンの不在下で行なわれた反応物を含むレ
ーンは、ほとんど完全な長さの生成物を示すが、しかし
停止段階を示さなかった。それらの結果は、変異体酵素
がまた、コルジセピンを組込むことができ、そしてこの
分子のプライマー伸長生成物中への組込みが終結を引き
起こすことを示す。この方法はまた、３’デオキシＣＴ
Ｐ，３’デオキシＧＴＰ及び３’デオキシＵＴＰにより
ＤＮＡ配列決定段階を創造するためにも使用され得る。

【０１３４】例６．Ｇ４６Ｄ，Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ Ｄ
ＮＡポリメラーゼによる色素プライマーＰＣＲ配列決定 この例は、ＰＣＲにおけるリボヌクレオチド三リン酸
（ｒＮＴＰ）及びわずか１：３０の比のｒＮＴＰ：ｄＮ
ＴＰを用いて、色素プライマー配列決定への変性された
ポリメラーゼの適用を示す。４種の個々の反応（個々の
ｒＮＴＰのための反応）を行なった。ＰＣＲ配列決定反
応を、２５mMのトリス−ＨＣｌ（pH９），５．０mMのＭ
ｇＣｌ₂ 及び１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールから成る
緩衝液において行なった。

【０１３５】個々の反応物はまた、それぞれ５００μＭ
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ），５×１０⁶ 個のコピー／μｌのｐ
ＢＳＭ１３＋ ＸｍｎＩ制限エンドヌクレアーゼにより
線状化されたプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）鋳
型、及び０．０５単位／μｌのＧ４６Ｄ，Ｅ６１５ＧＴ
ａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。リボ−ＡＴＰ反応
物（１０μｌ）は、２．５μＭのＡＴＰ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），０．１μＭのＪＯＥ Ｍ１
３逆色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及
び０．１μＭのプライマーＡＳＣ４６（５’−CGCCATTC
GCCATTCAG ）を含んだ。

【０１３６】リボ−ＣＴＰ反応物（１０μｌ）は、２．
５μＭのＣＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ），０．１μＭのＦＡＭ Ｍ１３逆色素プライマー
（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及び０．１μＭのプラ
イマーＡＳＣ４６を含んだ。リボ−ＧＴＰ反応物（２０
μｌ）は、２．５μＭのＧＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ），０．１μＭのＴＡＭＲＡ Ｍ１３逆
色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及び
０．１μＭのプライマーＡＳＣ４６を含んだ。リボ−Ｕ
ＴＰ反応物（２０μｌ）は、１６μＭのＵＴＰ（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ），０．１μＭのＲＯＸ
Ｍ１３逆色素プライマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ）及び０．１μＭのプライマーＡＳＣ４６を含んだ。

【０１３７】４種の反応の個々を、予備加熱された（７
５℃）Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐ登録商
標ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００熱サイクラーに配置
し、そして９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、６５℃へ
の１分間のランプ及び６５℃で５分間の３０回のサイク
ルにゆだねた。ｒＡＴＰ及びｒＣＴＰはそれぞれ、色素
ラベルされ、増幅された３００個の塩基対生成物の６×
１０¹¹個のコピーを生成し、そしてｒＧＴＰ及びＵＴＰ
反応はそれぞれ、色素ラベルされ、増幅された３００個
の塩基対生成物の１．２×１０¹²個のコピーを生成し
た。

【０１３８】別の酵素ＤＮＡ配列決定反応の必要性を伴
わないで、増幅されたＰＣＲ生成物のＤＮＡ配列を決定
するために、反応物をプールし、塩基及び熱により処理
し、中和し、そして次の通りにして沈殿せしめた。個々
のＡＴＰ及びＣＴＰ反応物４μｌ及び個々のＧＴＰ及び
ＵＴＰ反応物８μｌをプールした。０．２５ＭのＥＤＴ
Ａ（pH８．０）（最終１０mM）２μｌ，１ＭのＮａＯＨ
（最終２００mM）１０μｌ及び１４μｌの水を、プール
された反応物に添加し、そして次に、ＧｅｎｅＡｍｐ登
録商標ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００熱サイクラーに
おいて９５℃で５分間インキュベートし、そして１Ｍの
ＨＣｌ １０μｌにより中和した。

【０１３９】次に、プールされた反応物を、９５％エタ
ノール１５０μｌの添加により沈殿せしめ、続いて４℃
で１５分間インキュベートした。次に、それを４℃で１
５分間、超遠心分離し、沈殿物を収集し、そして上清液
を吸込みにより除去した。ペレットを７０％エタノール
３００μｌにより洗浄し、５分間、超遠心分離し、上清
液を吸込みにより除去し、そしてペレットを乾燥せしめ
た。ペレットを６μｌのホルムアミド及び５０mg／mlの
ブルーデキストラン（２５mMのＥＤＴＡにおける）
（５：１；ｖ／ｖ）に再懸濁し、そして９０℃で３分
間、加熱した。

【０１４０】再懸濁されたペレット１．５μｌを、予備
電気泳動された５％ Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ（ＦＭＣ
ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）、すなわち６Ｍのウレア配
列決定ゲル上に直接的に負荷した。次に、それを電気泳
動し、そして製造業者の説明書に従って、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^TM ３７７ ＤＮＡ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上で分析した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅ
ｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^TM Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ
ｇ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアによる自動化された
塩基−コーリングは、ＰＣＲ増幅された３００個の塩基
対生成物のＤＮＡ配列決定について９９％以上の精度を
もたらした。

【０１４１】

【配列表】

（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ペプチド （Ｂ）位置：４ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaa／注＝“ここでXaa は
いづれのアミノ酸でも良いが、しかしGlu ではない” （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ペプチド （Ｂ）位置：７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaa／注＝“ここでXaa はI
le 又はVal である” （xi）配列：配列番号１： Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa 1 5

【０１４２】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ペプチド （Ｂ）位置：７ （Ｄ）他の情報：／ラベル＝Xaa／注＝“ここでXaa はI
le 又はVal である” （xi）配列：配列番号２： Ser Gln Ile Glu Leu Arg Xaa 1 5

【０１４３】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号３： Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val 1 5

【０１４４】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号４： Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile 1 5

【０１４５】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号５： Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 1 5 10 15

【０１４６】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１５個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （xi）配列：配列番号６： Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 1 5 10 15

【０１４７】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６２６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （iii ）ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物：サーマス アクアチカス （ix）特徴： （Ａ）名称／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１２１．．２６１６ （xi）配列：配列番号７： AAGCTCAGAT CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC GAGGGGGAGA 60 GGGAGGCGTT TCTAAAAGCC CTTCAGGACG CTACCCGGGG GCGGGTGGTG GAAGGGTAAC 120 ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC CTG 168 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG AAG GGC 216 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC 264 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC GCG GTG ATC GTG 312 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GGG GGG 360 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG GAC TTT CCC CGG CAA CTC 408 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG 456 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG 504 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC 552 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 CTT TAC CAG CTC CTT TCC GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG 600 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 TAC CTC ATC ACC CCG GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC 648 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 GAC CAG TGG GCC GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC 696 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 CTT CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG 744 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 GAG GAG TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG 792 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 AAG CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG 840 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG 888 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG AGG CTT AGG GCC TTT 936 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG 984 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG 1032 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG CCC ATG TGG GCC GAT 1080 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 CTT CTG GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC CGG GTC CAC CGG GCC CCC 1128 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC 1176 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC CTG AGG GAA GGC CTT GGC CTC CCG 1224 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC 1272 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG 1320 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 GAG GCG GGG GAG CGG GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG 1368 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 TGG GGG AGG CTT GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG 1416 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 GTG GAG AGG CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG 1464 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 GTG CGC CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC 1512 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 GAG GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC 1560 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT GAC 1608 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC AAG CGC 1656 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC CAC CCC ATC 1704 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG CTG AAG AGC ACC 1752 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC AGG ACG GGC CGC CTC 1800 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGC AGG CTA AGT AGC 1848 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG 1896 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC 1944 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GGG CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC 1992 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 GAC GAG AAC CTG ATC CGG GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG 2040 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 GAG ACC GCC AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC 2088 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC 2136 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCG GCC CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG 2184 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 GCC CAG GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG 2232 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 GCC TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG 2280 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC CGG 2328 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC 2376 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT ATG GTG AAG CTC 2424 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC CTT CAG GTC CAC 2472 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG GCG GAG GCC GTG GCC 2520 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG TAT CCC CTG GCC GTG CCC 2568 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG 2616 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 TGATACCACC 2626

【０１４８】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８３２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号８： Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リザ ビビアン カルマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94131，サンフランシスコ，パノラマ ドライブ 202 (72)発明者 フレド ローレンス レイチャート アメリカ合衆国，カリフォルニア 94610，オークランド，ウォーフィール ド アベニュ 859 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 9/12 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (22)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリメラーゼドメイン内に存在するアミ
   ノ酸配列 Ser Gln Ile Xaa Leu Arg Xaa（配列番号１）
   〔ここで、この配列の位置４の“Xaa ”はいづれのアミ
   ノ酸残基でも良いが、しかしグルタミン酸残基（Glu ）
   ではなく、そしてこの配列の位置７の“Xaa ”はバリン
   残基（Val ）又はイソロイシン残基（Ile ）である〕を
   含む熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
2. 【請求項２】 天然に存在する熱安定性ＤＮＡポリメラ
   ーゼの組換え誘導体であり、ここで前記天然に存在する
   熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがアミノ酸配列型 Ser Gln
   Ile Glu Leu Arg Xaa（配列番号２）〔ここで、この配
   列の位置７の“Xaa ”はバリン残基（Val ）又はイソロ
   イシン残基（Ile ）である〕を含むことを特徴とする請
   求項１記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
3. 【請求項３】 前記天然に存在する熱安定性ＤＮＡポリ
   メラーゼに比較して、異常なヌクレオチドの組込みに対
   して低下した識別性を示すことを特徴とする請求項２記
   載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
4. 【請求項４】 前記異常なヌクレオチドを組込む前記対
   応する天然型ポリメラーゼの能力に比べて、異常なヌク
   レオチドを組込む前記ポリメラーゼの能力が、少なくと
   も２０倍、高められることをさらに特徴とする請求項３
   記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
5. 【請求項５】 前記ポリメラーゼが、好ましくはリボヌ
   クレオシド三リン酸である異常なヌクレオチドと対応す
   る通常のヌクレオチドとを１：１以下の比率で含んで成
   るＤＮＡ配列決定反応への使用のために十分な活性を有
   することを特徴とする請求項１〜４のいづれか１項記載
   の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
6. 【請求項６】 前記ポリメラーゼが、約１００μＭ未満
   の濃度で存在するリボヌクレオシド三リン酸である異常
   なヌクレオチドと約１００μＭより高い濃度で存在する
   対応する通常のヌクレオチドを含んで成るＤＮＡ配列決
   定反応への使用のために十分な活性を有することを特徴
   とする請求項１〜４のいづれか１項記載の熱安定性ＤＮ
   Ａポリメラーゼ酵素。
7. 【請求項７】 サーマス・アクアチカス（Ｔｈｅｒｍｕ
   ｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・カルドフィラス
   （Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマ
   ス・クリアロフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒ
   ｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリホルミス（Ｔｈｅ
   ｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・フラバ
   ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・オス
   ヒマイ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ）、サーマス
   ・ルベル（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ）、サーマス・
   スコトダクタス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔ
   ｕｓ）、サーマス・シルバナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉ
   ｌｖａｎｕｓ）、サーマス・スペーシスＺＯ５、サーマ
   ス・スペーシスｓｐｓ１７、サーマス・サーモフィラス
   （Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サー
   モトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔ
   ｉｍａ）、サーモトガ・ネオポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔ
   ｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）、サーモシフォ・ア
   フリカナス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎ
   ｕｓ）、アナエロセラム・サーモフィラム（Ａｎａｅｒ
   ｏｃｅｌｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、バシラ
   ス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏ
   ｔｅｎａｘ）及びバシラス・ステアロサーモフィラス
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
   ｌｕｓ）から成る群から選択された生物からの天然に存
   在する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の組換え誘導体
   である請求項２〜６のいづれか１項記載の熱安定性ＤＮ
   Ａポリメラーゼ酵素。
8. 【請求項８】 天然に存在する熱安定性サーマス種ＤＮ
   Ａポリメラーゼ、好ましくはＴａｑ ＤＮＡポリメラー
   ゼ又はその相同ポリメラーゼ、最とも好ましくは、アミ
   ノ酸配列 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val L
   eu Ala His Leu Ser（配列番号５）を含んで成る熱安定
   性ＤＮＡポリメラーゼの組換え誘導体である請求項２〜
   ６のいづれか１項記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵
   素。
9. 【請求項９】 前記Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのアミ
   ノ酸配列（配列番号７）に対して少なくとも約３９％、
   好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なく
   とも約８０％の配列相同性を有する請求項１〜６のいづ
   れか１項記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸配列。
11. 【請求項１１】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸配列を
    含んで成るベクター。
12. 【請求項１２】 請求項１〜９のいづれか１項記載の熱
    安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸配列を
    含んで成る宿主細胞。
13. 【請求項１３】 熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の製
    造方法であって； （ａ）前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素の発現を促
    進する条件下で請求項１２記載の宿主細胞を培養し；そ
    して （ｂ）前記宿主細胞又は培養培地から熱安定性ＤＮＡポ
    リメラーゼ酵素を単離することを含んで成る方法。
14. 【請求項１４】 請求項１３記載の方法により製造され
    る熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素。
15. 【請求項１５】 核酸増幅又は配列決定反応への請求項
    １〜９のいづれか１項記載の熱安定性ＤＮＡポリメラー
    ゼ酵素の使用。
16. 【請求項１６】 ＤＮＡ配列決定反応への使用のための
    組成物であって、核酸鋳型；前記鋳型に対して相補的な
    オリゴヌクレオチドプライマー；請求項１〜９のいづれ
    か１項記載の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；通常のｄＮ
    ＴＰの混合物；及び少なくとも１つの異常なヌクレオチ
    ドを含んで成り、ここで前記異常なヌクレオチド：前記
    対応する通常のヌクレオチドの比が１：１又はそれより
    小である組成物。
17. 【請求項１７】 前記異常なヌクレオチドがリボヌクレ
    オチドであり、それにより前記リボヌクレオチドが好ま
    しくは、約１００μＭ未満の濃度で存在し、そしてその
    対応する通常のヌクレオチドが約１００μＭより高い濃
    度で存在する請求項１６記載の組成物。
18. 【請求項１８】 前記異常なヌクレオチドがラベルされ
    ていないことをさらに特徴とする請求項１７記載の組成
    物。
19. 【請求項１９】 核酸標的の配列を決定するための方法
    であって、 （ａ）異常なヌクレオチド及び対応する通常のヌクレオ
    チドを用意し、ここで前記異常な及び対応する通常のヌ
    クレオチドは約１：１よい小い比で存在し； （ｂ）前記異常なヌクレオチドを含んで成るプライマー
    伸長生成物を供給するために、プライマー伸長のための
    条件下で請求項１〜９のいづれか１項記載の熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメラーゼの存在下で前記段階（ａ）の反応を処
    理し； （ｃ）前記プライマー伸長生成物を加水分解するための
    条件下で段階（ｂ）のプライマー伸長生成物を処理し； （ｄ）段階（ｃ）からの反応生成物を分離し；そして （ｅ）前記核酸標的の配列を決定する； ことを含んで成る方法。
20. 【請求項２０】 前記異常なヌクレオチドが、好ましく
    は約０．１μＭ〜１００μＭの濃度で存在するリボヌク
    レオチドである請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 前記対応する通常のヌクレオチドが約
    ５０μＭ〜５００μＭの濃度で存在する請求項１９記載
    の方法。
22. 【請求項２２】 核酸の配列を決定するためのキットで
    あって、請求項１〜９のいづれか１項記載の熱安定性Ｄ
    ＮＡポリメラーゼ、及び場合によっては、そのような配
    列決定方法に有用な追加の試薬、たとえば１又は複数の
    オリゴヌクレオチドプライマー、通常のｄＮＴＰの混合
    物、及び少なくとも１つの異常なヌクレオチドを含んで
    成り、ここで前記対応する通常のヌクレオチドに対する
    前記異常なヌクレオチドの比が好ましくは、１以下であ
    ることを特徴とするキット。